CN108601810A - 用于修复心脏组织的心外膜衍生的旁分泌因子 - Google Patents

Abstract

格外地，本文中提供的是用于治疗和修复由心血管疾病，心肌梗死(MI)，其它缺血性事件，或心脏生长缺陷引起的对心脏组织的损伤的包含心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的卵泡抑素样1(FSTL1))的组合物和试剂盒，以及使用它们的方法。

Description

用于修复心脏组织的心外膜衍生的旁分泌因子

对相关申请的交叉援引

本申请要求2015年4月9日提交的美国临时专利申请No.62/145,480和2015年7月24日提交的美国临时专利申请No.62/196,766的优先权，通过援引将其公开内容完整收入本文中。

发明领域

格外地，本发明涉及包含心外膜衍生的旁分泌因子的组合物以及它们治疗或预防在缺血性事件(诸如心肌梗死)后对心脏(例如心肌)组织的损伤的用途。

发明背景

急性心肌梗死(AMI)是西方世界的首要死亡原因之一，而且许多风险因子(环境的和遗传的二者)对它的发病机制有贡献。心脏一般缺乏足以在损害之后进行修复的内源再生能力。在心肌梗死(MI)或其它缺血性事件之后相应的左心室(LV)再造引起LV扩张并最终引起心力衰竭(Holmes et al.，2005，Annu Rev Biomed Eng.；7：223-53)。冠状动脉阻塞之后，阻塞下游缺血肌细胞立即变成坏死和/或经历凋亡。嗜中性粒细胞立即浸润组织，同时白细胞(主要是巨噬细胞)其后不久到达并参与坏死细胞残骸的消化。缺血组织中的嗜中性粒细胞对于周围的肌细胞可能是有毒的，因为它们释放反应性氧种类和蛋白水解酶，它们进一步损害周围的肌细胞(Nah&Rhee，Korean Circ J.；Oct；39(10)：393-82009)。一旦发生损伤，就形成细胞减少性瘢痕，其引起收缩功能障碍和最终的心力衰竭。

为了降低与侵袭心肌的缺血性事件有关的流行病学和财政负担，势在必行的是开发新的组合物和策略用于在由缺血性事件(诸如心肌梗死)引起的损害后保持心肌细胞存活或刺激心肌细胞生长。需要能在损害后处理和/或治疗心脏(例如心肌)组织的疗法。本文中公开的发明处理这些需要并提供另外的好处。

发明概述

格外地，本文中提供的是用于治疗和修复由心血管疾病，心肌梗死(MI)，或其它缺血性事件引起的对心脏(例如心肌)组织的损伤包含心外膜衍生的旁分泌因子(例如低糖基化的卵泡抑素样1(FSTL1))的组合物和试剂盒以及使用它们的方法。

因而，在一些方面，本文中提供的是用于在有所需要的受试者中在损害后修复心脏(例如心肌)组织的方法，该方法包括使该心脏(例如心肌)组织与心外膜衍生的旁分泌因子接触。在一些实施方案中，该心外膜衍生的旁分泌因子是低糖基化的卵泡抑素样1(FSTL1)多肽。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，该损害是缺血再灌注心脏(例如心肌)损害，是由于缺血性心脏疾病，和/或是由于心脏发育不良。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，该损害是心肌梗死和/或该心脏含有瘢痕组织。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，修复心脏(例如心肌)组织包含增加该心脏(例如心肌)组织中心肌细胞的数目。在一些实施方案中，心肌细胞的数目与在损害后未接触心外膜衍生的旁分泌因子的受损害的瘢痕组织中心肌细胞的数目相比增加至少两倍。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，修复心脏(例如心肌)组织包含与在损害后未接触心外膜衍生的旁分泌因子的心脏(例如心肌)组织中缩短百分比分数的量相比改善的心脏(例如心肌)组织的缩短百分比分数。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，修复心脏(例如心肌)组织包含与治疗前的相同受试者相比改善壁运动。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，修复心脏(例如心肌)组织包含与治疗前的相同受试者相比改善血液灌注面积。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，修复心脏(例如心肌)组织包含与不治疗的相似受试者相比减少心脏(例如心肌)事故和住院治疗。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，修复心脏(例如心肌)组织包含该心脏(例如心肌)组织中心肌细胞胞质分裂的量与在损害后未接触心外膜衍生的旁分泌因子的心脏(例如心肌)组织中心肌细胞胞质分裂的量相比增多。在一些实施方案中，心肌细胞胞质分裂的量的增多是通过Aurora B激酶的表达测定的。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，修复心脏(例如心肌)组织包含降低的心肌细胞凋亡。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，所述方法导致心肌细胞中编码心脏(例如心肌)特异性收缩蛋白质的转录物的水平升高。在一些实施方案中，所述方法导致心肌细胞中编码心脏(例如心肌)特异性收缩蛋白质的转录物的水平升高2倍。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，该心脏(例如心肌)特异性收缩蛋白质选自由myh6，mlc2v，和mlc2a组成的组。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，所述方法导致心肌细胞中具有节律性可收缩Ca²⁺的辅肌动蛋白⁺细胞增多。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，在该损害后立即使该心脏(例如心肌)组织与所述心外膜衍生的旁分泌因子接触。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，所述方法增加在该损害后该受试者的存活。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，所述方法削弱在该损害后该心脏(例如心肌)组织中的纤维化。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，所述方法导致该心脏(例如心肌)组织的受损害区域的血管形成升高。在一些实施方案中，所述升高的血管形成是通过血管细胞中vonWillebrand因子(vWF)或平滑肌肌动蛋白的表达测定的。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，所述方法诱导心肌细胞进入细胞周期。在一些实施方案中，所述心肌细胞进入细胞周期是通过磷酸-组蛋白H3的表达评估的。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，所述方法导致心肌细胞进入细胞周期与在损害后未接触心外膜衍生的旁分泌因子的心脏(例如心肌)组织中心肌细胞进入细胞周期的量相比升高至少2倍。在一些实施方案中，所述低糖基化的FSTL1多肽是在原核细胞中合成的。在一些实施方案中，所述原核细胞是细菌细胞。在一些实施方案中，所述低糖基化的FSTL1多肽是在用糖基化的抑制剂处理的真核细胞中合成的。在一些实施方案中，所述糖基化的抑制剂是衣霉素。在一些实施方案中，该低糖基化的FSTL1多肽是通过将一个或多个糖基化的氨基酸用一个或多个糖基化无能力的氨基酸替代而生成的。在一些实施方案中，所述一个或多个糖基化的氨基酸选自由N144，N175，N180，和N223组成的组。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，所述低糖基化的FSTL1多肽不保护心肌细胞免于损害后的凋亡。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，该低糖基化的FSTL1多肽直接注射入受损害的心肌组织中。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，系统投递该低糖基化的FSTL1多肽。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，心脏内投递该低糖基化的FSTL1多肽。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，该低糖基化的FSTL1多肽包埋或接种入三维胶原贴中。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，该低糖基化的FSTL1多肽包埋或接种入水凝胶中。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，自心外膜部位，心脏内部位，和/或经由直接注射入心肌中的一项或多项接触该心脏(例如心肌)组织。

在另一个方面，本文中提供的是药物组合物，其包含低糖基化的卵泡抑素样1(FSTL1)多肽和一种或多种药学可接受赋形剂。在一些实施方案中，所述低糖基化的FSTL1多肽是在原核细胞中合成的。在一些实施方案中，所述原核细胞是细菌细胞。在一些实施方案中，所述低糖基化的FSTL1多肽是在用糖基化的抑制剂处理的真核细胞中合成的。在一些实施方案中，所述糖基化的抑制剂是衣霉素。在一些实施方案中，所述低糖基化的FSTL1多肽是通过基因组编辑获得的。在一些实施方案中，所述低糖基化的FSTL1多肽是通过插入经过修饰的RNA获得的。在一些实施方案中，所述低糖基化的FSTL1多肽是通过药物处理受试者(例如，使得处理抑制内源FSTL1多肽的糖基化)获得的。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，该组合物配制用于直接注射入受损害的心脏(例如心肌)组织中。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，该组合物配制用于系统施用。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，该低糖基化的FSTL1多肽包埋或接种入三维(3D)胶原贴中。在一些实施方案中，该3D胶原贴具有12±4kPa的弹性模数。

在又一些方面，本文中提供的是试剂盒，其包含(i)低糖基化的卵泡抑素样1(FSTL1)多肽；和(ii)一种或多种药学可接受赋形剂。在一些实施方案中，该试剂盒进一步包含(iii)三维(3D)胶原贴。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，该低糖基化的FSTL1多肽包埋或接种入三维(3D)胶原贴中。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，该3D胶原贴具有12±4kPa的弹性模数。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，该试剂盒进一步包含(iv)用于将该3D胶原贴粘附至受损害的心脏的心外膜或心肌的粘附手段。在一些实施方案中，所述粘附手段是缝合线。

在还有其它方面，本文中提供的是用于在有所需要的受试者中在损害后修复心脏(例如心肌)组织的方法，该方法包括使该心脏(例如心肌)组织与接种或灌输有重组低糖基化的卵泡抑素样1(FSTL1)多肽的三维(3D)胶原贴接触。在一些实施方案中，该损害是缺血再灌注损害。在一些实施方案中，该损害是心肌梗死。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，将该3D胶原贴缝合至该心脏(例如心肌)组织。

在另一个方面，本文中提供的是三维(3D)胶原贴，其灌输或接种有重组低糖基化的卵泡抑素样1(FSTL1)多肽的。在一些实施方案中，所述重组低糖基化的FSTL1多肽是在原核细胞中合成的。在一些实施方案中，所述原核细胞是细菌细胞。在一些实施方案中，所述重组低糖基化的FSTL1多肽是在用糖基化的抑制剂处理的真核细胞中合成的。在一些实施方案中，所述糖基化的抑制剂是衣霉素。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，该3D胶原贴具有12±4kPa的弹性模数。

除非明确或清楚地自实施方案或方面的上下文排除，本文中描述的每一个方面和实施方案能够一起使用。

贯穿本说明书提到了多份专利，专利申请和其它类型的出版物(例如期刊论文，电子数据库条目，等)。据此通过援引完整收录本文中引用的所有专利，专利申请，和其它出版物的公开内容用于所有目的。

附图简述

图1描绘心外膜分泌组中的心脏发生性活性。a-d)共培养ESC衍生的心肌细胞(mCM^ESC)与心外膜(EMC)细胞系的心脏发生性效果。a，b)仅mCM^ESC(a)和与EMC共培养4天的mCM^ESC(b)。通过α-辅肌动蛋白免疫荧光(绿色)显现心肌细胞及通过H2B-mCherry荧光(红色)显现EMC。c)表述为倍数变化的心肌细胞数目(如a和b中的)的量化(n＝3)。d)mCM^ESC的心脏发生性应答，相对于添加至共培养物的EMC数目而言(+：1X 10⁵个EMC每孔，++：5X 10⁵个EMC每孔)，使用肌细胞标志物Myh6，Myh7，Mlc2a和Mlc2v量化(n＝3)，针对Gapdh基因表达标准化。*：与对照相比(p<0.05)，■：与“+”条件相比(p<0.05)的统计学显著差异。e-i)心外膜EMC条件化培养基对心脏发生的影响。e，f)用对照(e)或EMC条件化培养基(f)处理8天之后mCM^ESC的α-辅肌动蛋白染色(绿色)。g)心肌细胞数目的量化。h)mCM^ESC中心脏特异性标志物的量化，针对Gapdh表达标准化。i)具有节律性钙瞬变的心肌细胞数目的量化，使用KineticImage Cytometer(Vala Sciences)自动测量。g-i中的量化以倍数变化呈现。在所有实验中n＝3。*与对照相比的统计学显著差异(p<0.05)。j-m)来自成年心外膜衍生的细胞(EPDC)的条件化培养基在胚胎心肌细胞中促进胞质分裂。j)自E12.5GFP阳性心脏(Tnnt2-Cre；Rosa26^mTmG/+)分离胚胎心肌细胞。k)EPDC条件化培养基促进心肌细胞增殖，而且煮沸条件化培养基(煮沸的)消除生长促进效果。l，m)通过Aurora B和心脏标志物Tnnt2的免疫染色进行的胞质分裂分析显示用成年EPDC培养基处理之后升高的心肌细胞胞质分裂(媒介组：19668中的38个阳性细胞；条件性培养基组：74/22143)；*P<0.05；n＝5。

图2描绘在永久性LAD结扎之后胚胎心外膜样贴改善心脏功能。a)胶原贴生成的示意图(塑料压缩规程，自³⁰重建)。b)工程化贴的机械特性的评估，通过原子力显微术测量。测得的贴的微劲度分布的柱形图以红色显示。将这些值相对于对常见支架生物材料报告的弹性范围³¹绘图。灰色区域描绘先前描述的³²，使肌细胞收缩性最大化的最佳弹性范围。c，d)心外膜模拟贴植入。在永久性LAD结扎以诱导心肌梗死(c)之后，以两个点将心外膜贴缝合到缺血性心肌的表面上(d)。小图中的插图展现在植入之前将制备的贴浸泡在培养培养基中。e-g)加载有心外膜条件化培养基的贴在心肌梗死(MI)之后的生理学效果。在贴植入之后第2周收集所有样品。e)在梗死之后2周进行的回波心动描计术分析的汇总，包括：假(假对照)，没有处理的梗死小鼠(仅MI)，用仅贴处理的MI(MI+贴)，和用加载有心外膜条件化培养基的贴处理的梗死动物(MI+贴+CM)。所有数据针对个体手术前基线值标准化。f)来自e的缩短分数(FS％)的绝对值。g)：Masson氏三色染色心脏的总体组织学分析；样品如标注的那样。使用每个实验组8只小鼠的最小数目(n)。*：与假对照相比p<0.05，●：与仅MI相比p<0.05，和■：与MI+贴相比p<0.05。

图3描绘了FSTL1是一种在损害之后具有动态表达的心外膜心脏发生性因子。a)鉴定为FSTL1的R.GLCVDALIELSDENADWK.L的MS/MS谱。肽概率＝1.0，Xcorr＝6.276，ΔCn＝0.471。b-f)在用单独的对照培养基(对照)或含有人FSTL1的培养基(FSTL1，10ng/ml)处理8天之后重组FSTL1对小鼠胚胎干细胞衍生的心肌细胞(mCM^ESC)的影响。每2天更换所有实验和条件中的培养基。b，c)通过α-辅肌动蛋白免疫染色(绿色)来鉴定心肌细胞。d)b，c中心肌细胞(n＝8)数目的量化，表述为倍数变化。e)b，c中心脏特异性标志物的表达，针对Gapdh表达标准化(n＝3)，作为倍数变化。f)有或无FSTL1处理的情况中具有节律性钙瞬变的心肌细胞数目的量化(相对于对照的倍数变化)，使用Kinetic Image Cytometer(KIC)分析(n＝6)。g)在标注浓度的FSTL1中培养2天之后个体心肌细胞细胞尺寸的测量(以像素计)(n＝5)。*：与对照的统计学显著差异(p<0.05)。h)妊娠中期之后FSTL1的心外膜表达。使用FSTL1抗体(红色)的直接蛋白质显现证明了在胚胎第E12.5，E15.5和E17.5天FSTL1在小鼠心外膜中表达。还检测到一些间质性表达。E12.5的图像显示FSTL1与心外膜转录因子Wilm氏肿瘤1(Wt1，绿色核染色，白色箭头)的共定位。E15.5和E17.5的图像与肌细胞标志物α-辅肌动蛋白(绿色)共染色且展示与FSTL1(白色箭头)和肌细胞标志物(黄色箭头)不交叠。i-l)受损害的成年心外膜中FSTL1的动态表达。i)上部小图：在心肌梗死(MI)之后的顺序时间时所诱导的纤维化组织的组织学(Masson氏三色染色)评估。下部小图：在MI之后的顺序时间时的FSTL1免疫组织化学(褐色)。插图展现假操作心脏的心外膜中的FSTL1表达和受损害的心脏的心外膜中FSTL1的消减。FSTL1在纤维化组织中也检测不到，而它在MI之后在心肌中变成上调(观察MI后心肌中的褐色FSTL1免疫染色)。j-l)高分辨率免疫荧光图像：未受损害的(假)成年心脏中FSTL1(红色)与心外膜标志物Wt1(绿色)的共定位(j)。成年假心脏中FSTL1(红色)的选择性心外膜定位(k)。在MI之后FSTL1在心外膜细胞和它们的衍生物中缺失(1)。Wt1-CreER；Rosa26^RFP/+小鼠中口服投递他莫昔芬后的心外膜谱系标记(绿色)(投递6次，持续时间3周并在MI之前停止1周)。在MI之后2周收集心脏。Wt1谱系细胞的RFP(灰色)，FSTL1(红色)和Tnni3(绿色)的免疫染色显示在MI之后FSTL1在心外膜细胞和它们的衍生物(灰色)中缺失，但是在心肌(绿色)中丰富。

图4描绘了FSTL1重演工程化心外膜贴中的心外膜条件化培养基的体内恢复效果。a-c)生理学分析。a)使用Kaplan-Meier方法分析每一种条件的存活时间过程。b)标注处理的头3个月期间缩短分数[FS(％)]的动力学，如通过回波心动描计术测量的。作为FS的绝对值提供的数据：假(假对照)，无处理的梗死小鼠(仅MI)，用仅贴处理的MI(MI+贴)，和用加载有FSTL1的贴处理的梗死动物(MI+贴+FSTL1)。c)FSTL1-TG小鼠中MI后2和4周时的FS％，比较MI+贴和MI+贴+FSTL1。*：与假对照相比p<0.05，●：与仅MI相比p<0.05，和■：与MI+贴相比p<0.05。d-e)形态计量术分析。d)MI后4周心脏的代表性Masson氏三色染色和纤维化面积作为总LV壁的百分比的量化(n>4)。e)左心室形态学的回波心动描计术评估。缩写指示：LVIDd(舒张末期左心室内径)；LVIDs(收缩末期左心室内径)；LVPWd(舒张末期左心室后壁尺寸)；LVPWs(收缩期左心室后壁厚度)。*：与假相比p<0.05，●：与仅MI相比p<0.05，和■：与MI+贴相比p<0.05。f-i)MI后第4周时脉管系统的分析。f)内皮标志物(vWF)的免疫染色。g)通过相对于组织学切面的总体面积测量个体血管的均值腔面积量化的血管面积。h)平滑肌标志物(αSMA)的免疫染色。i)每面积单位的血管数目的量化。*：与假对照相比p<0.05，●：与仅MI相比p<0.05，和■：与MI+贴相比p<0.05。j)MI后第4周时贴-边界区带的显现。梗死和标注处理的边界区带的三色染色展现贴与宿主组织的整合和天然心脏细胞对贴的大量细胞化(cellularization)。观察贴+FSTL1处理的动物的贴内部和边界区带中丰富的肌肉(红色)(三幅右边小图，绿色箭头)。

图5描绘了所恢复的心外膜FSTL1表达促进心肌细胞增殖。在永久性LAD结扎后实施所有实验。在处理第4周时分析样品，除非另外指明。a-h)免疫染色。与假操作动物(a，e)相比，MI后4周分析的4个处理组中梗死区域中心肌细胞标志物α-辅肌动蛋白(红色)的免疫染色(b-d)和边界区带中DNA复制标志物磷酸-组蛋白3Ser10(pH3，绿色)和α-辅肌动蛋白(红色)的共免疫荧光染色(f-h)。(a-d)中的插图显示较低放大倍数图像，虚线划分贴和宿主组织之间的边界。(g，h)中的箭头指示具有pH3⁺核的α-辅肌动蛋白⁺心肌细胞。i-o)心肌细胞增殖的量化。i)用于量化分析的横切面的图示，每一个切面覆盖梗死，贴，并相隔250μm，距顶点1-2mm之间。j)pH3(绿色)和α-辅肌动蛋白(红色)的高放大倍数图像，3D呈现显示心肌细胞核与pH3染色的共定位。k)4个实验组中pH3⁺，α-辅肌动蛋白⁺双重阳性细胞的发生率的量化。自每一个组中的5-7个心脏收集数据，针对每一个心脏中的总pH3⁺，α-辅肌动蛋白⁺细胞对3个不同横切面计数。l-m)胞质分裂确定。l)贴+FSTL1队列中心肌细胞(α-辅肌动蛋白，绿色)和胞质分裂标志物Aurora B激酶(红色)的共免疫荧光，3D呈现显示Z轴中α-辅肌动蛋白⁺心肌细胞之间的Aurora B激酶⁺卵裂沟。m)4个实验组中Aurora B⁺/α-辅肌动蛋白⁺细胞的发生率的量化。自每一个组中的5-7个心脏收集数据，针对每一个心脏中的总AuroraB⁺/α-辅肌动蛋白⁺细胞对3个不同横切面计数。n-o)使用心肌细胞核标志物确定增殖。n)贴+FSTL1队列中心肌细胞核标志物PCM1(红色)和pH3(绿色)的共免疫荧光，3D呈现显示心肌细胞核与pH3染色的共定位。o)4个实验组中PCM1⁺/pH3⁺细胞的发生率的量化。自每一个组中的5-7个心脏收集数据，针对每一个心脏中的总PCM1⁺/pH3⁺细胞对3个不同横切面计数。*：与假的统计学差异，P<0.05。**：与所有其它组的统计学差异，P<0.05。p-v)新生成的肌细胞的谱系追踪。4-OH-他莫昔芬(OH-Tam)处理αMHC-mERCremER；Rosa26^Z/EG/+(MCM⁺/ZEG+)小鼠在预先存在的心肌细胞中诱导eGFP表达(在p中图示)。与冠状动脉结扎(MI)同时应用加载有FSTL1的胶原贴。MI后4周解剖心脏，固定并染色。q)显示有效心肌细胞标记的假操作心脏的LV区域(α-辅肌动蛋白白色；eGFP绿色)。r-t)整个区域中(r)，梗死区域中(s)，和边界区带中(t，u)手术后4周时显示eGFP⁺(预先存在的，绿色)心肌细胞的梗死心脏的LV区域。白色箭头指示pH3⁺非心肌细胞。黄色箭头显示pH3⁺，eGFP⁺双重阳性细胞，指示细胞周期中期时预先存在的心肌细胞。观察边界区带和梗死区域中的pH3⁺，eGFP⁺双重阳性细胞簇。

图6描绘了FSTL1对早期心肌细胞的增殖活性依赖于细胞选择性转录后FSTL1修饰。a-f)FSTL1促进自mESC衍生的未成熟心肌细胞的增殖。a，d)与10μg/ml EdU一起将mCM^ESC用标注浓度的FSTL1刺激24小时，并针对α-辅肌动蛋白(红色)和EdU(绿色)染色。量化所有α-辅肌动蛋白⁺心肌细胞中EdU⁺，α-辅肌动蛋白⁺心肌细胞的百分比(d)。b，e)将mCM^ESC用10ng/ml FSTL1刺激48小时并针对α-辅肌动蛋白(红色)和磷酸-组蛋白3(绿色)染色。量化所有α-辅肌动蛋白⁺心肌细胞中pH3⁺，α-辅肌动蛋白⁺心肌细胞的百分比(e)。c，f)将mCM^ESC用标注浓度的FSTL1刺激48小时，并针对α-辅肌动蛋白(红色)和胞质分裂标志物Aurora B(绿色)染色。量化所有α-辅肌动蛋白⁺心肌细胞中Aurora B⁺，α-辅肌动蛋白⁺心肌细胞的百分比(f)。g，h)哺乳动物细胞中表达的FSTL1是糖基化的。g)在+/-FSTL1过表达和+/-阻断蛋白质糖基化的衣霉素(Tuni.)的情况中，HEK293细胞条件化培养基的针对FSTL1的Western印迹，其显示FSTL1是糖基化的。h)哺乳动物细胞中或细菌中表达的重组人FSTL1的针对FSTL1的Western印迹，其显示糖基化的差异(红色箭：糖基化形式；黑色箭：未糖基化形式)。i)将mCM^ESC用10nM H₂O₂和10ng/ml细菌和哺乳动物生成的FSTL1刺激24小时，并针对α-辅肌动蛋白和TUNEL(细胞死亡)染色。量化所有α-辅肌动蛋白⁺心肌细胞中TUNEL⁺，α-辅肌动蛋白⁺心肌细胞的百分比(i)，显示哺乳动物生成的FSTL1能够削弱H₂O₂诱导的凋亡，而细菌生成的FSTL1不能，同时在没有H₂O₂刺激的情况中这两种蛋白质均对凋亡没有影响。j，k)EdU掺入和Aurora B量化(测定法与a，c，d，f相同)，比较细菌和哺乳动物生成的FSTL1，显示细菌生成的FSTL1促进mCM^ESC增殖，而哺乳动物生成的FSTL1不能。l)FSTL1在心肌细胞和心外膜细胞中差异糖基化。用或未用衣霉素处理的受到Adeno-FSTL1感染的NRVC的条件化培养基和EMC的条件化培养基的针对FSTL1的Western印迹，显示未糖基化的蛋白质具有相同大小而糖基化的FSTL1具有不同大小，提示心肌细胞和心外膜细胞差异修饰FSTL1。m，n)EdU掺入测定法，比较受到Adeno-FSTL1感染的NRVC的条件化培养基和EMC的条件化培养基的效果。使用Western印迹针对相同量的FSTL1浓度标准化，EMC条件化培养基以与细菌生成的FSTL1相似的程度诱导mCM^ESC增殖，而受到Adeno-FSTL1感染的NRVC的条件化培养基不能，提示糖基化状态决定FSTL1的功能。所有实验n＝5。*：与对照的统计学差异，P<0.05。o)FSTL1在心脏损害期间的作用，工作模型。在缺血性心脏疾病中，FSTL1变成在心肌中很高表达。心肌分泌的FSTL1是高度糖基化的(glycoFSTL1)且针对凋亡给予保护，而且并不展示增殖活性。FSTL1在受损害的心脏的心外膜中并不表达。低糖基化形式(或是由完整心外膜分泌的或是在心外膜贴中投递的)在位于心外膜下空间中的有复制能力的心肌细胞前体细胞中激活增殖。

图7描绘了在缺血性心脏损害的临床前模型中心外膜FSTL1投递激活心脏再生。a-d)在缺血再灌注(I/R)的猪实验模型中进入心外膜的FSTL1贴投递的生理学效果。MRI测量到～50％的基线射血分数(EF)，它在1周后降低至～30％(a-b)。在I/R之后1周用贴+FSTL1处理的猪到处理2周时恢复收缩性，EF为～40％。EF在后面的2周里保持稳定，所分析的最长时间(a，b)。这与未处理动物(I/R无处理)中或用单独的贴处理的动物(I/R+贴)中心脏功能的稳定下降形成对比(b)。c-d)：贴+FSTL1处理的猪(c)展现包括I/R+贴动物在内的所有研究组中最小的瘢痕尺寸(面积)(d)。绿色线和箭突显瘢痕周界。e-o)植入后第4周时贴与宿主心脏组织的整合，血管发生，和细胞化和再生的评估。e)猪心脏的Masson氏三色染色展现贴+FSTL1对缺血组织的附着和有限的纤维化。f-h)平滑肌标志物(αSMA，红色)和EdU(绿色)的免疫染色，显示新形成的动脉平滑肌。用贴+FSTL1处理的猪心脏显示缺血区域(f，g)和具有加载有FSTL1的贴的边界区带(h)二者中血管平滑肌细胞中新DNA形成的证据。小图h中的白色线和箭划分贴与宿主组织的大致边界。i-m)用贴+FSTL1处理的猪心脏中梗死和边界区带中驻留的心肌细胞的EdU掺入分析，展现条纹心肌细胞(α辅肌动蛋白⁺，红色)，其中一些(i中的箭)还对DNA合成呈染色阳性(EdU，绿色，j-m中的高放大倍数中的例子)。n)贴+FSTL1心脏中心肌细胞(α-辅肌动蛋白，绿色)和胞质分裂标志物Aurora B激酶(红色)的共免疫荧光，3D呈现显示Z轴中的α-辅肌动蛋白⁺心肌细胞之间的Aurora B激酶⁺中间体。

图8描绘此研究中使用的mCM^ESC细胞的表征。a)细胞制备和处理的示意性时间线。b-d)mCM^ESC的α-辅肌动蛋白的免疫染色，显示了大多数细胞是α-辅肌动蛋白⁺的(b)，而且α-辅肌动蛋白缺乏条纹结构(c)。d)mCM^ESC的α-平滑肌肌动蛋白(αSMA)的免疫染色，显示大多数细胞是αSMA⁺的，与没有SMA表达的成熟心肌细胞不同⁴²。e-f)mCM^ESC中的EdU掺入的自动检测。用10μg/ml EdU处理24小时的mCM^ESC的捕获图像，用EdU，α-辅肌动蛋白和DAPI染色，使用InCell 1000(General Electric)(e)。用自动检测软件进行的EdU，α-辅肌动蛋白和DAPI通道的掩蔽的覆盖图(f)。g)mCM^ESC随时间的EdU掺入概况。在时间0小时，24小时，48小时，和144小时将mCM^ESC用10μg/ml EdU处理24小时。为每一个时间段计算所有α-辅肌动蛋白⁺心肌细胞中EdU⁺/α-辅肌动蛋白⁺心肌细胞的百分比。注意EdU掺入随时间的降低。h，i)mCM^ESC的Fluo 4钙图像，及基线背景图像(h)和峰图像(i)。j)mCM^ESC(红色)和新生大鼠心室心肌细胞(NRVC，蓝色)的代表性钙瞬变的比较。注意与NRVC相比mCM^ESC中降低的幅度，较慢的上下击打速率，和延长的钙瞬变持续时间，提示mCM^ESC中未成熟的钙操作。在所有实验中，在涂布mCM^ESC之后1天添加FSTL1(此图中的时间0-24)。

图9描绘工程化心外膜贴的原子力显微术(AFM)分析。定制平坦尖端用于贴的原子力显微术(a)，使用电子束沉积制造，并用于在扫描90μm×90μm的面积中探查凝胶的劲度(b，c)。

图10描绘永久性LAD结扎之后FSTL1(FSTL1-TG)小鼠的心肌过表达。a-d)心肌梗死之后的FSTL1蛋白质表达动力学。FSTL1-TG小鼠(C57/Bl6背景)和同窝野生型(WT)小鼠经历LAD结扎。在基线，手术之后第1天，第3天，第7天和第28天时收集心脏组织和血清。通过Western印迹分析心脏的缺血区域(IA)和远端区域(RM)中的FSTL1蛋白质水平(a)。报告相对于微管蛋白水平表述的FSTL1表达(b)。通过Western印迹分析FSTL1血清水平(c)。还显示Ponceau-S染色以指示血清的相等加载。血清FSTL1水平的量化显示于(d)。所有组中n>3。*：与WT基线相比P<0.05，#：与FSTL1-TG基线相比P<0.05。ANOVA用于统计学显著性(P<0.05)。e-j)FSTL1-TG小鼠对永久性LAD结扎的长期形态计量和功能应答。在MI之后4周WT(e)和FSTL1-TG(f)的代表性Masson氏三色染色。在MI之后第4周时纤维化组织中内容的量化(g)。在MI之后第2,4周时收缩期左心室内部尺寸(LVIDs)(h)，和舒张期左心室内径(LIVDd)(i)的回波心动描计测量。在MI之后2和4周时标注基因型中缩短分数(FS％)的回波心动描计测定(j)。(k-n)FSTL1-TG和WT小鼠中α-辅肌动蛋白(心肌细胞)和pH3(有丝分裂)(k)和α-辅肌动蛋白(心肌细胞)和vonWillebrand因子(血管内皮细胞)(m)的双重免疫荧光染色，在(l，n)中量化。n＝5，*，与WT的显著差异(P<0.05)。

图11显示在心肌梗死之后FSTL1自心外膜缺失且在心肌中表达。a-c)谱系标记的Wt1-CreER；Rosa26^RFP/+小鼠中MI之后FSTL1的检测。Wt1-CreER；Rosa26^RFP/+小鼠中口服投递他莫昔芬后的心外膜谱系标记(绿色)(投递6次，持续时间3周并在MI之前停止1周)。在MI之后2周时收集心脏。Wt1谱系细胞的RFP(绿色)，FSTL1(红色)和Tnni3(白色)的免疫染色，显示在MI之后FSTL1在心外膜细胞和它们的衍生物(绿色)中缺失，但是在心肌(灰色)中丰富(c中显示a，b中的高放大倍数图像)。

图12描绘在体外和在体内贴中的FSTL1保留。a，b)用于测量在体外暴露于PBS达不同时间间隔(0-21天)的胶原支架内保留的FSTL1的量的酶联免疫吸附测定法(a)。表列出了最初和最终的FSTL1浓度，以及头24小时内的相对值(b)。c-f)在体内贴中的FSTL1保留。标注动物处理组中的FSTL1免疫染色的代表性图像，手术之后第4周。注意，虽然FSTL1在未受损害的心外膜中表达(c中的插图中的箭)，但是它的表达在MI之后在梗死区域中变成检测不到(d)。类似地，在MI+贴动物中没有检测到FSTL1(e)，虽然它在MI+贴+FSTL1组的贴区域中仍然坚持(红色染色)(f)。

图13描绘在MI之后贴+FSTL1削弱纤维化。在MI之后4周在4种条件下(假，仅MI，MI+贴和MI+贴+FSTL1)心脏的系列横切面的代表性Masson氏三色染色。注意仅MI条件中的严重纤维化，和MI+贴条件中降低的纤维化，和MI+贴+FSTL1条件中的进一步降低，在图4d中量化。

图14描绘处理后的MRI成像。来自小鼠仅MI，MI+贴和MI+贴+FSTL1处理组的代表性MRI图像，显示3D-FSPGR(快速损坏梯度回波)图像和利用钆对比剂的延迟增强图像，确认梗死区域的缩小(以绿色划分)和保留的收缩性。

图15描绘具有延迟贴移植的缺血/再灌注(I/R)的小鼠模型中贴+FSTL1功能的分析。a-c)舒张和收缩末期，移植前(a，损害后1周)，贴植入后2周(b)，和移植后4周(c)时假，I/R，和用贴+FSTL1处理的I/R的心脏功能评估。对于每一个个体动物通过除以手术前基线值将值标准化。d)来自a-c的小鼠的I/R前和后的不同时间时的缩短分数的绝对值(FS，％)，通过回波心动描计术评估。缩写与图4中的相同。*：与假相比p<0.05和●：与I/R相比p<0.05。e)MI之后4周贴+FSTL1处理的心脏的边界区带中DNA复制标志物磷酸-组蛋白3Ser10(pH3，绿色)和α-辅肌动蛋白(红色)的共免疫荧光染色。f)3个实验组中pH3⁺，α-辅肌动蛋白⁺双重阳性细胞的发生率的量化。自每一个组中的3个心脏收集数据，针对每一个心脏中的总pH3⁺，α-辅肌动蛋白⁺细胞对3个不同横切面计数。*：与所有其它组统计学差异，P<0.05。

图16描绘贴+FSTL1处理的心脏的一个切面中检测到的所有pH3⁺心肌细胞的一个代表。在MI之后用贴+FSTL1处理4周的心脏的Masson氏三色染色(a)。在(b)中对临近的切片针对α-辅肌动蛋白染色，对应于(a)中的具有梗死的黑色框区域和贴。(b)中的点线指示心脏和贴之间的边界。对临近切片针对α-辅肌动蛋白和pH3染色，而且找到的所有α-辅肌动蛋白⁺，pH3⁺双重阳性心肌细胞显示于(c)(白色箭头)，每一幅图像对应于(b)中的编号白色框的区域。

图17描绘植入贴+FSTL1对凋亡和炎症的影响。a)所有4个组(假，MI，MI+贴，MI+贴+FSTL1)MI/贴处理后第2天的代表性TTC染色。b)处于风险的面积的量化，比较所有4个组。自每一个组中的4个心脏收集数据，4个横切面，每一个大约2mm后，涵盖每一个心脏。*：与假的统计学差异，P<0.05。c，d)TUNEL测定法的代表性图像(TUNEL，绿色，α-辅肌动蛋白，红色)，比较MI之后2天的心脏与单独的贴和贴+FSTL1。e)梗死区域中TUNEL⁺，α-辅肌动蛋白⁺的量化，作为心肌细胞总数目的百分比。在MI+贴和MI+贴+FSTL1条件之间没有观察到差异。自每一个组中的3个心脏收集数据，3个不同横切面(与图5i中的相同)。自每一个切面的梗死区域取得10幅0.09mm²图像并针对TUNEL⁺，α-辅肌动蛋白⁺和总α-辅肌动蛋白⁺细胞计数。a-e)在MI之后第4天和第8天对用仅贴和贴+FSTL1处理的心脏实施针对细胞死亡的TUNEL染色和针对心肌细胞的α-辅肌动蛋白染色(a-d)。检测到最小限度的TUNEL⁺，α-辅肌动蛋白⁺细胞，而有显著量的TUNEL⁺，α-辅肌动蛋白细胞。所有TUNEL⁺核的量化显示贴和贴+FSTL1处理的心脏之间在这两个时间点均没有显著差异(e)。f-j)对小图a-d中相同的心脏实施F4/80(用于巨噬细胞)和α-辅肌动蛋白(用于心肌细胞)的免疫染色(f-i)。F4/80⁺细胞的量化显示贴和贴+FSTL1处理的心脏之间在这两个时间点均没有显著差异(j)。

图18显示FSTL1在成年和新生心肌细胞，或心脏祖细胞中不诱导增殖。a-f)自小鼠原代分离物衍生的成年心肌细胞。a)3D胶原贴中自用4-OH-他莫昔芬(OH-Tam)处理的MCM⁺/ZEG⁺小鼠分离的GFP⁺心肌细胞的显现。b-d)用FSTL1处理的成年心肌细胞中的基因表达变化，包括增殖(b)，心脏特异性(c)，和肥大(d)标志物。注意，心脏特异性基因的表达没有变化，细胞周期标志物没有升高(与检测不到的Ki67免疫染色一致)，和肥大标志物降低。包埋在3D贴内的心肌细胞用FSTL1(10ng/ml)处理7天持续时间，每2天更换培养基。e，f)3D培养的成年心肌细胞中的FUCCI测定法，在3D培养之后1周进行。e)FSTL1处理实施7天，每2天更换培养基。f)在FSTL1缺失下3D培养的成年心肌细胞对照。注意，在任一条件中没有处于S/G2/M期(GFP⁺)的心肌细胞的可检测迹象。紫色箭指向着紫色的核，源自Hoechst(蓝色)和G1期FUCCI(红色)标记的共定位。(g-j)原代新生大鼠心室心肌细胞(NRVC)。g，h)与10μg/mlEdU一起新鲜分离的NRVC用FSTL1刺激48小时，并针对α-辅肌动蛋白(红色)和EdU(绿色)染色。量化所有α-辅肌动蛋白⁺心肌细胞中EdU⁺/α-辅肌动蛋白⁺心肌细胞的百分比(h)。i，j)NRVC用FSTL1刺激48小时，并针对α-辅肌动蛋白(红色)和pH3(绿色)染色。量化所有α-辅肌动蛋白⁺心肌细胞中pH3⁺/α-辅肌动蛋白⁺心肌细胞的百分比(j)。在FSTL1处理后没有发现增殖升高。(n＝4)*：与对照的统计学差异，P<0.05。k-m)将Sca1⁺祖细胞¹⁹饥饿-同步化48小时并在EdU存在下用FSTL1或对照生长培养基刺激72小时。通过来自Lin-Sca1⁺SP级分的克隆生长获得克隆3。自没有克隆生长的lin-Sca1⁺获得Sca1集合。k)处理72小时之后Sca1⁺细胞的EdU和DAPI染色。l)处理72小时之后EdU⁺Sca1⁺细胞的百分比。FSTL1浓度：0，1，10，100ng/ml。缩写：SS，血清饥饿；CGM，对照生长培养基。m)FSTL1处理72小时之后Sca1⁺细胞的数目(n＝5)。FSTL1处理后没有发现显著变化。

图19描绘NRVC和EMC条件化培养基中的FSTL1检测。有或无衣霉素处理的情况中，NRVC的条件化培养基和EMC的条件化培养基的针对FSTL1的Western印迹，显示EMC但非NRVC中糖基化FSTL1的分泌。

图20描绘FSTL1处理之后mCM^ESC中的磷酸-Akt和PCNA检测。10ng/ml和50ng/mlFSTL1处理1小时和24小时之后，针对磷酸-Akt(Ser473和Thr308，均在心肌细胞中存活应答中指示)，和PCNA(增殖标志物)的Western印迹显示FSTL1处理后磷酸-Akt以及PCNA无变化。

发明详述

本文中公开的发明部分基于发明人的观察结果，即自心外膜样细胞培养物获得的条件化培养基在体外和在成年受损害的心脏中增强心肌发生。心脏的心外膜是通过提供祖细胞^1,2以及丝裂原(包括FGF，IGF2，和PDGF^3-5)在发育期间对心肌生长有贡献的外部上皮层。最近的研究提示心外膜可能还在损害后保持成年心肌的功能，有可能作为肌发生性祖先的来源^6,7。然而，迄今为止，尚无心外膜衍生的旁分泌因子显示在哺乳动物中在损害后支持心肌再生，尽管此类因子的鉴定以及它们的作用机制会提供关于这个了解较少且内在低效的过程的见解⁸。

正如下文进一步详述的，在将条件化培养基提交质谱术，接着是后续分析之后，卵泡抑素样1(FSTL1)鉴定为观察到的心肌发生活性的一种成分。看到FSTL1在成年心外膜中表达但在心肌梗死(MI)后引人注目地下降，其中然后它被心肌表达替换。正如下文在非限制性实施例中例示的，虽然心肌中的内源心肌或转基因过表达没有再生效果，但是通过压缩的胶原贴将FSTL1应用于心脏的心外膜表面重演心外膜条件化培养基的活性。在一些实施方案中，工程化FSTL1心外膜处理在MI之后降低病理性再造，恢复血管形成，及诱导预先存在的αMHC⁺细胞进入细胞周期，从而改善心脏功能。正如下文描述的非限制性实施例中进一步显示的，体外研究指示FSTL1刺激未成熟肌细胞而非祖细胞的增殖。在一些实施方案中，FSTL1的促增殖特性与该蛋白质的组织特异性转录后修饰有关，诸如它的糖基化状态。在本发明的其它实施方案中，施用低糖基化的FSTL1并不激活Akt-1信号传导活性。在下文描述的又一个非限制性实施例中，心外膜贴投递低糖基化的FSTL1在心肌梗死的临床前猪模型中也是有效的，突显这种再生机制在哺乳动物中的进化保守性。照此，不受理论束缚，工程化心外膜投递FSTL1具有成为在缺血性损害后实现心肌细胞的治疗性再生的一个吸引人的选项的潜力。

I.定义

如本文中使用的，短语“心脏组织”指心脏的任何组织。心脏组织包括心肌组织，心外膜组织，和心内膜组织。心脏组织包含在心脏内找到的任何细胞类型。

如本文中使用的，短语“心外膜衍生的旁分泌因子”指由心脏的外部上皮层的细胞生成的能够在心血管疾病，心肌梗死，或其它缺血性事件所致损害后在心脏(例如心肌)组织中引发一种或多种生理，保护，增殖，和/或修复应答的任何蛋白质，多肽，或其片段。在一个实施方案中，心外膜衍生的旁分泌因子是自心外膜细胞培养物获得的条件化培养基的一种成分。

如本发明的语境中使用的，术语“低糖基化”指蛋白质用最小数目的碳水化合物模块翻译后修饰或完全缺乏碳水化合物模块。在一些实施方案中，低糖基化指蛋白质完全缺乏任何碳水化合物修饰，无论什么(例如N连接的聚糖，O连接的聚糖，或磷酸-聚糖)。在另一个实施方案中，此术语指蛋白质具有相对于在哺乳动物细胞中在正常生理条件下在体内发生的糖基化的量降低的碳水化合物修饰(诸如约至少1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或100％任一)。在另一个实施方案中，此术语指蛋白质具有相对于在哺乳动物细胞中在正常生理条件下在体内发生的糖基化的量降低的碳水化合物修饰(诸如约至多1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或100％任一)。在另一个实施方案中，此术语指蛋白质具有相对于在哺乳动物细胞中在正常生理条件下在体内发生的糖基化的量降低的碳水化合物修饰(诸如约至少1-100％，5-95％，10-90％，20-80％，30-70％，5-10％，10-20％，20-30％，30-40％，40-50％，50-60％，60-70％，70-80％，80-90％，90-100％任一降低的碳水化合物修饰)。在另一个实施方案中，此术语指蛋白质具有相对于在哺乳动物细胞中在正常生理条件下在体内发生的糖基化的量降低的碳水化合物修饰(诸如约至多1-100％，5-95％，10-90％，20-80％，30-70％，5-10％，10-20％，20-30％，30-40％，40-50％，50-60％，60-70％，70-80％，80-90％，90-100％任一降低的碳水化合物修饰)。在还有其它实施方案中，低糖基化蛋白质是工程化改造的，使得所有有糖基化能力的氨基酸残基(诸如有N连接，O连接，或磷酸-聚糖能力的氨基酸残基)用无糖基化能力的氨基酸残基替代。

如本文中使用的，短语“在损害后修复心脏组织”指减轻，最小化，或甚至维持心血管疾病，心肌梗死，或其它缺血性事件所致损害的水平的任何类型的作用或处理。因而，修复损害指示与在本文中描述的用于减轻损害的处理或作用缺失下损害的水平相比受试者的状况就关注的损害而言没有变坏且可以是改善的。

如本文中使用的，“心血管疾病”或“心脏疾病”是用于描述侵袭心脏和/或脉管系统的一系列疾病或事件的术语。心脏疾病的类型包括但不限于冠状动脉心脏疾病，心肌病，缺血性心脏疾病，心力衰竭，炎症性心脏疾病，瓣膜性心脏疾病和动脉瘤。心脏疾病可以使用临床参数和/或诊断和/或治疗心脏疾病的领域的技术人员知道的评估(例如体格检查，检测心血管疾病的体征和症状，心电图，心回波图，胸部X射线，检测心脏生物标志物的血液测试，等)来评估。临床设置中典型使用的生物标志物包括但不限于心脏肌钙蛋白(C，T，和I)，CK和CK-MB，和肌红蛋白。

如本文中使用的，“心肌梗死”或“MI”指发生心肌坏死，它可以是由对心脏的血供中断，导致心肌的氧供应和需求之间危急的不平衡引起的。这可源自冠状动脉血管中的斑破裂及血栓形成，导致对部分心肌的血供急性降低；也就是，易感的动脉粥样硬化斑破裂后冠状动脉的闭塞或阻断。如果足够的时间段不治疗的话，所致缺血或血供限制和氧短缺能引起损伤或死亡，即心脏梗死。一般而言，此损伤很大程度上是不可逆的，而且迄今的临床疗法主要瞄准延迟心力衰竭的进展以延长存活。心肌梗死可以使用临床参数和/或诊断和/或治疗心肌梗死的领域的技术人员知道的评估(例如体格检查，检测心肌梗死的体征和症状，心电图，心回波图，胸部X射线，检测心脏生物标志物(包括肌钙蛋白，CK，和CK-MB)的血液测试，等)来评估。

如本文中使用的，“再灌注”指对变成缺血或低氧的心脏或心脏(例如心肌)组织的血流或血供的恢复。再灌注的模态包括但不限于化学分解闭塞血栓(即溶栓)，施用血管扩张剂，血管成形术，经皮冠状动脉干预(PCI)，导管插入和冠状动脉旁路移植物(CABG)手术。

“受试者”或“个体”可以是脊椎动物，哺乳动物，或人。哺乳动物包括但不限于农场动物，运动动物，宠物，灵长类动物，小鼠和大鼠。在一个方面，受试者是人。

除非本文中另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员的共同理解相同的含义。

如本文中使用的，单数术语“一个”，“一种”，和“该/所述”包括复数提及物，除非上下文另外清楚指明。

II.本发明的组合物

本文中提供的是药物组合物，其含有心外膜衍生的旁分泌因子(例如FSTL1，诸如低糖基化的FSTL1)和一种或多种药学可接受赋形剂或载剂。

在一些实施方案中，该心外膜衍生的旁分泌因子是卵泡抑素样蛋白1(FSTL1；也称作卵泡抑素相关蛋白1)。FSTL1是在人中由FSTL1基因编码的一种蛋白质。此基因编码与卵泡抑素具有相似性的一种蛋白质，是一种活化素结合蛋白。FSTL1含有一个FS模块(含有10个保守半胱氨酸残基的卵泡抑素样序列)，一个Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制域，两个EF手域，和一个Von Willebrand因子型C域(Entrez基因：FSTL1卵泡抑素样1)。在其它实施方案中，FSTL1包含SEQ ID NO：1(NCBI参照序列：NP_009016.1)的氨基酸序列：

MWKRWLALALALVAVAWVRAEEELRSKSKICANVFCGAGRECAVTEKGEPTCLCIEQCKPHKRPVCGSNGKTYLNHCELHRDACLTGSKIQVDYDGHCKEKKSVSPSASPVVCYQSNRDELRRRIIQWLEAEIIPDGWFSKGSNYSEILDKYFKNFDNGDSRLDSSEFLKFVEQNETAINITTYPDQENNKLLRGLCVDALIELSDENADWKLSFQEFLKCLNPSFNPPEKKCALEDETYADGAETEVDCNRCVCACGNWVCTAMTCDGKNQKGAQTQTEEEMTRYVQELQKHQETAEKTKRVSTKEI(SEQ ID NO：1)

本发明的范围内提供且涵盖编码FSTL1的核酸。在各个实施方案中，该核酸是重组核酸。在一些实施方案中，FSTL1是由SEQ ID NO：2(NCBI参照序列：NM_007085.4)的核酸编码的：

可以使用本领域技术人员知道的标准技术将FSTL1核酸掺入载体，诸如表达载体。用于连接包含感兴趣核酸诸如FSTL1，启动子，终止子，和其它序列的DNA构建物及将它们插入合适载体的方法是本领域熟知的。另外，可以使用已知的重组技术(例如InvitrogenLife Technologies，Gateway Technology)来构建载体。

在一些实施方案中，可能想要以远比当前在天然发生细胞中找到的要高的水平过表达FSTL1核酸。此结果可以通过将编码那些多肽的核酸选择性克隆入多拷贝质粒或将那些核酸置于强诱导型或组成性启动子下来实现。用于过表达期望多肽的方法是分子生物学领域常规且熟知的，而且例子可以见Sambrook et al.,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,2nd ed.,Cold Spring Harbor,2001。

可以使用多种宿主细胞来生成能表达FSTL1的重组宿主细胞。该宿主细胞可以是天然生成FSTL1的细胞或并非天然生成FSTL1的细胞。例如，可以使用哺乳动物细胞，诸如但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或心外膜衍生的细胞培养物来生成FSTL1。然而，在其它实施方案中，使用自并不在翻译后糖基化蛋白质的生物体衍生的细胞(即并不用一个或多个碳水化合物模块翻译后修饰蛋白质的细胞)来生成重组FSTL1。

并不在翻译后糖基化蛋白质的细胞的非限制性例子包括细菌细胞。因此，在一个实施方案中，该宿主细胞是细菌细胞。在另一个实施方案中，该细菌细胞是革兰氏阳性细菌细胞或革兰氏阴性细菌细胞。在另一个实施方案中，该细菌细胞选自由大肠埃希氏菌/大肠杆菌(E.coli)，嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)，柠檬泛菌(P.citrea)，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)，迟缓芽孢杆菌(B.lentus)，短芽孢杆菌(B.brevis)，嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)，嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)，解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)，克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)，(B.halodurans)，巨大芽孢杆菌(B.megaterium)，凝结芽孢杆菌(B.coagulans)，环状芽孢杆菌(B.circulans)，灿烂芽孢杆菌(B.lautus)，苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)，白色链霉菌(S.albus)，浅青紫链霉菌(S.lividans)，天蓝色链霉菌(S.coelicolor)，灰色链霉菌(S.griseus)，假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)，产碱假单胞菌(P.alcaligenes)，梭菌属物种(Clostridium sp.)，棒杆菌属物种(Corynebacteriumsp.)，和谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)细胞组成的组。

可以使用标准技术将FSTL1编码核酸或含有它们的载体插入宿主细胞(例如细菌细胞)来表达所编码的FSTL1多肽。将DNA构建物或载体导入宿主细胞可以使用诸如转化，电穿孔，核显微注射，转导，转染(例如Lipofection介导的或DEAE-Dextrin介导的转染或使用重组噬菌体病毒的转染)，与磷酸钙DNA沉淀物一起温育，DNA包被的微射弹的高速轰击，和原生质体融合等技术来实施。通用转化技术是本领域熟知的(参见例如Current Protocolsin Molecular Biology(F.M.Ausubel et al.(eds)Chapter 9,1987；Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.,Cold Spring Harbor,2001；和Campbell et al.,Curr Genet,16:53-56,1989，据此通过援引完整收录它们每一篇，特别是就转化方法而言)。导入的核酸可以整合入宿主细胞的染色体DNA或作为染色体外复制序列维持。在还有另一个实施方案中，可以经由投递编码突变型FSTL1糖基化缺陷多肽的经过化学修饰的mRNA，在宿主细胞中生成FSTL1多肽(参见Modified mRNA directs the fateof heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardialinfarction.Zangi L,et al.Nat Biotechnol.2013Oct；31(10):898-907，通过援引将其完整收入本文)。经过化学修饰的RNA(在本文中也称作modRNA)可包括例如磷酸酯修饰成硫代磷酸酯核苷酸间连接，核糖的2’-羟基基团的修饰，或对mRNA的磷酸酯主链或糖模块的其它修饰。

在一些实施方案中，FSTL1是低糖基化的FSTL1。低糖基化的FSTL1可以通过在天然地并不用碳水化合物模块翻译后修饰蛋白质(诸如细菌，例如大肠杆菌)或工程化改造成不能用碳水化合物模块翻译后修饰蛋白质的宿主细胞中生成重组FSTL1来获得。或者，可以在正常情况下用碳水化合物模块翻译后修饰蛋白质但已经用一种或多种糖基化抑制剂处理的哺乳动物或其它真核细胞中生成低糖基化的FSTL1。合适的糖基化抑制剂包括但不限于衣霉素(其阻断所有蛋白质N-糖基化)，链病菌毒素，杀枝孢菌素，双霉素/安福霉素，津枝霉素，抗生素24010，抗生素MM 19290，杆菌肽，棒杆菌毒素(corynetoxin)，焦土霉素，金霉素(duimycin)，1-脱氧甘露糖野尻霉素，脱氧野尻霉素，N-甲基-1-脱氧甘露糖野尻霉素，弗雷菲尔德菌素A，葡萄糖类似物，甘露糖类似物，2-脱氧-D-葡萄糖，2-脱氧葡萄糖，D-(+)-甘露糖，D-(+)-半乳糖，2-脱氧-2-氟-D-葡萄糖，1,4-双脱氧-1,4-亚氨基-D-甘露醇(DIM)，氟代葡萄糖，氟代甘露糖，UDP-2-脱氧葡萄糖，GDP-2-脱氧葡萄糖，羟基甲基戊二酰基-CoA还原酶抑制剂，25-羟基胆固醇，羟基胆固醇，苦马豆素，环己酰亚胺，嘌呤霉素，放线菌素D，莫能菌素，m-氯羰基-氰化物苯基腙(CCCP)，密实菌素，多萜醇-磷酰基-2-脱氧葡萄糖，N-乙酰基-D-葡萄糖胺，次黄嘌呤，胸苷，胆固醇，葡萄糖胺，甘露糖胺，栗精胺，谷氨酰胺，溴代牛弥菜醇，牛弥菜醇环氧化物，牛弥菜醇衍生物，无糖基甲基-p-硝基苯基三氮烯，β-羟基正缬氨酸，苏型-β-氟代天冬酰胺，D-(+)-葡萄糖酸δ-内酯，二(2-乙基己基)磷酸酯，磷酸三丁酯，磷酸十二烷基酯，(二苯基甲基)-磷酸的2-二甲基氨基乙基酯，[2-(二苯基氧膦基氧基)乙基]三甲基铵碘化物，碘乙酸酯/盐，2-脱氧-D-葡萄糖，和氟乙酸酯/盐。

或者，在其它实施方案中，重组FSTL1是工程化改造的，使得它在使用真核或其它有糖基化能力的宿主细胞生成时不能糖基化。在大多数生物学背景中，糖基化或是N连接的或是O连接的。N连接的糖基化过程在真核生物中及广泛地在古细菌中，但非常罕见在真细菌中发生。在N连接的糖基化中，聚糖(即含有碳水化合物的模块)附着至天冬酰胺或精氨酸氨基酸侧链的氮原子。N连接的聚糖几乎总是附着于作为Asn-X-Ser/Thr共有序列一部分存在的天冬酰胺(Asn)侧链的氮原子，其中X是除脯氨酸(Pro)，丝氨酸(Ser)，和苏氨酸(Thr)以外的任何氨基酸。O连接的糖基化是在真核生物的高尔基体中发生的一种形式的糖基化。在O连接的糖基化中，聚糖附着于丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，羟基赖氨酸，或羟基脯氨酸氨基酸侧链的羟基氧。

因而，在一些实施方案中，重组FSTL1是工程化改造的，使得它不能N连接的糖基化。在这种情况中，可以将多肽序列中的一些或所有有糖基化能力的精氨酸或天冬酰胺氨基酸用无糖基化能力的氨基酸(例如谷氨酰胺)替代。在其它实施方案中，重组FSTL1是工程化改造的，使得它不能O连接的糖基化。在这种情况中，可以将多肽序列中的所有有糖基化能力的丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，羟基赖氨酸，或羟基脯氨酸残基用无糖基化能力的氨基酸(例如丙氨酸)替代。在还有又一些实施方案中，重组FSTL1是工程化改造的，使得它不能或是O连接的糖基化或是N连接的糖基化，通过将所有有糖基化能力的氨基酸用无糖基化能力的氨基酸替代进行。在又一个实施方案中，将一个或多个位于FSTL1氨基酸序列中位置X144，X180，X175，和/或X223的天冬酰胺(N)残基用无糖基化能力的氨基酸(诸如但不限于谷氨酰胺(Q))替代。可以经由转染携带编码无糖基化能力的FSTL1的基因的病毒载体，质粒或化学合成的mRNA或mRNA模拟物在宿主细胞中生成工程化无糖基化能力的FSTL1。或者，可以将在诱导型或组成性表达启动子的控制下的编码无糖基化能力的FSTL1的基因整合入宿主细胞的染色体。在还有另一个实施方案中，可以经由投递编码无糖基化能力的FSTL1多肽的经过修饰的mRNA在宿主细胞中生成无糖基化能力的FSTL1多肽。

当前描述的发明涵盖掺入含有一种或多种药学可接受载剂的药物组合物(例如无菌药物组合物)中的FSTL1。如本文中使用的，依照本发明的“药学可接受载剂”或“药学可接受赋形剂”是组合物中与该组合物中其它组分相容(即它可以与本发明的药剂和/或组合物组合，不消除该药剂或组合物(例如FSTL1，诸如低糖基化的FSTL1)的生物学活性)，而且如本文中提供的那样适合在受试者中使用，没有过度的不良副作用(诸如毒性，刺激，变态反应，和死亡)的诸如载剂，稀释剂，或赋形剂成分。当副作用的风险重过由药物组合物提供的好处时，它们是“过度”的。药学可接受成分的非限制性例子包括但不限于任何标准药物载剂，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液，水，无菌水，聚乙二醇，聚乙烯吡咯烷酮，卵磷脂，花生油，芝麻油，乳状液诸如油/水乳状液或水/油乳状液，微乳液，纳米载体和各种类型的润湿剂。添加剂诸如水，醇，油，二醇，防腐剂，芳香剂，着色剂，悬浮剂，等等也可以连同载剂，稀释剂，或赋形剂包括在该组合物中。在一个实施方案中，适宜在本文中公开的组合物中使用的药学可接受载剂是无菌的，无病原体的，和/或其它方面对于施用于受试者安全的，没有相关感染和其它过度不良副作用的风险。

可以配制本文中公开的任何含有FSTL1(诸如含有低糖基化的FSTL1)的药物组合物来使用任意数目的本领域可得的施用方法施用。施用可以通过多种路径，包括贴，导管，支架，口服，直肠，经皮，皮下，静脉内，肌肉内，鼻内，等等。在一些实施方案中，可以使用上述施用方法来投递包含FSTL1的悬浮液(例如与明胶海绵颗粒混合的低糖基化的FSTL1)。这些组合物作为可注射和口服组合物二者是有效的。此类组合物以制药学领域熟知的方式制备且包含至少一种活性化合物。当作为口服组合物采用时，通过药学可接受保护剂保护该多肽组合物免于胃中的酸消化。

在一些实施方案中，本文中公开的任何含有FSTL1(诸如含有低糖基化的FSTL1)的药物组合物可以掺入工程化贴中来直接施用至心外膜或受损伤心肌组织。在一个实施方案中，使用压缩的胶原凝胶来生成三维(3D)胶原贴以将低糖基化的FSTL1直接投递至心外膜。在一些实施方案中，可以压缩高度水合的胶原凝胶以去除过量的水及生成具有改良的生物学和机械特性的致密的生物材料。

如下文实施例2中描述的，高度水合的胶原凝胶经由应用静态压缩应力～1,400Pa达5分钟而经历无限制压缩，导致～98-99％体积缩小。该压缩的胶原的弹性模数接近胚胎心外膜的，对于未成熟心肌细胞的收缩性是最佳的。压缩的胶原贴的弹性可以通过原子力显微术(AFM)以纳米压痕模式来评估，使用导致小于约10％(诸如小于约9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％1％，或0.5％任一，包含落在这些百分比之间的所有值)的最小限度局部应变的强行触发且具有～100nm的压痕以最小化底物相关假象的影响。该3D胶原贴可以接种重组生成的FSTL1(诸如低糖基化的FSTL1)，接着直接施用于心外膜或受损伤或受损害的心肌区域，例如通过缝合。在一些实施方案中，该3D胶原贴具有与胚胎心外膜所报告的(E～12±4kPa，诸如约8kDa，9kDa，10kDa，11kDa，12kDa，13kDa，14kDa，15kDa，或16kDa任一)相当的弹性模数。在其它实施方案中，该3D胶原贴具有比成熟心外膜的那些(E>30-40kPa)要低的弹性模数。在其它实施方案中，该3D胶原贴具有比纤维化心脏组织的那些(E>100kPa)要低，但比大多数当前使用的支架生物材料的那些(E≤1kPa)要高的弹性模数。在另一个实施方案中，该3D胶原贴具有约1kPa，2kPa，3kPa，4kPa，5kPa，6kPa，7kPa，8kPa，9kPa，10kPa，11kPa，12kPa，13kPa，14kPa，15kPa，16kPa，17kPa，18kPa，19kPa，20kPa，21kPa，22kPa，23kPa，24kPa，25kPa，26kPa，27kPa，28kPa，或29kPa任一的弹性模数。

关于构建和使用基于3D胶原的贴来将物质直接投递至心脏的进一步信息可见Serpooshan,V.et al.,ActaBiomater,2010；6,3978-3987；Serpooshan,V.et al.,JBiomed Mater Res A,2011；96,609-620；和Abou Neel et al.,Soft Matter,2006；2,986-992，通过援引将其公开内容收入本文。

用于将低糖基化的FSTL1多肽投递至心脏组织的另一个选项是作为通过导管技术投递的自聚合水凝胶的一种成分。关于这种类型的投递的进一步信息可见Koudstaal etal.,J.of Cardiovasc.Trans.Res.(2014)7:232-241，通过援引将其公开内容收入本文。也可以对包含FSTL1的悬浮液(例如与明胶海绵颗粒混合的低糖基化的FSTL1)采用导管投递。

III.本发明的方法

本文中提供的是用于在有所需要的受试者中在损害后修复心脏(例如心肌)组织的方法，该方法包括使该心脏(例如心肌)组织与心外膜衍生的旁分泌因子接触。在一些实施方案中，该心外膜衍生的旁分泌因子是低糖基化的卵泡抑素样1(FSTL1)多肽。在本发明的其它实施方案中，施用低糖基化的FSTL1并不激活Akt-1信号传导活性(见图20)。在本发明的其它实施方案中，施用低糖基化的FSTL1并不导致心肌细胞凋亡降低(见图6)。

对心脏(例如心肌)组织的损害可以与任意数目的已知侵袭心脏或循环系统的疾病或状况相关，而且包括但不限于冠状动脉心脏疾病，心肌病，缺血性心脏疾病，心力衰竭，炎症性心脏疾病，瓣膜性心脏疾病和动脉瘤。在一个实施方案中，该损害是由心肌梗死(MI；诸如急性心肌梗死(AMI))引起的。在另一个实施方案中，该损害是由缺血性事件，接着是再灌注引起的。

修复受损害的心脏(例如心肌)组织可以包含增加心肌细胞的数目，这可以通过数种成像方法(像延迟增强型MRI，DE-MRI)在活着的受试者中间接测量，如心肌梗死尺寸的缩小。见例如Hendel RC et al,JACC48(7)；1475-97和Sardella G et al,JACC 2009；53(4):309-15，通过援引完整收入本文。在一些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织与心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1)接触导致失去的肌肉恢复及梗死尺寸缩小约2％，5％，10％，15％，20％，30％，40％50％，60％，90％，100％，或约5-10％，10-20％，20-30％，30-40％，40-50％，50-60％，60-70％，70-80％，80-90％，90-100％任一。在其它实施方案中，使心脏(例如心肌)组织与心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1)接触导致失去的肌肉恢复及梗死尺寸缩小至少约2％，5％，10％，15％，20％，30％，40％50％，60％，90％，100％，或约5-10％，10-20％，20-30％，30-40％，40-50％，50-60％，60-70％，70-80％，80-90％，90-100％任一。在其它实施方案中，使心脏(例如心肌)组织与心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1)接触导致失去的肌肉恢复及梗死尺寸缩小至多约2％，5％，10％，15％，20％，30％，40％50％，60％，90％，100％，或约5-10％，10-20％，20-30％，30-40％，40-50％，50-60％，60-70％，70-80％，80-90％，90-100％任一。

在本文中公开的任何方法的一些实施方案中，将该心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1)灌输，接种，或包埋入基于3D胶原的贴(诸如本文中描述的那些任一)中。然后可以使该基于胶原的贴直接接触心外膜或受损害的心肌区域(诸如暴露于缺血性事件，诸如心肌梗死的心肌区域)。可以经由缝合或通过本领域知道的任何其它手段将该3D胶原贴应用于心外膜或心肌来使该贴接触受损害的组织。

在还有其它实施方案中，该心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1)是投递至心外膜，心内膜，或受损害的心肌区域的水凝胶的一种成分(通过例如导管技术；Koudstaal et al.,J.of Cardiovasc.Trans.Res.(2014)7:232-241，通过援引完整收入本文)。

在本文中公开的任何方法的一些实施方案中，与在损害后未接触心外膜衍生的旁分泌因子的心脏(例如心肌)组织中心肌细胞的数目相比实现心肌细胞的数目增多约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，或更多倍。心肌细胞复制的评估是本领域例行的且可以通过例如测定来自受试者的心脏(例如心肌)组织样品中α-辅肌动蛋白阳性细胞的数目来测量。在一些其它实施方案中，对心脏(例如心肌)组织的效果可以以将低糖基化的FSTL1放置于心脏内隔室(即心内膜)近端来实现，这例如通过经由导管技术的投递。在一些实施方案中，合适的导管可以是NOGA导管(Johnson&Johnson)。

在一些实施方案中，对心脏(例如心肌)组织的效果可以以将低糖基化的FSTL1心脏内放置入心脏中来实现，这通过经皮导管投递系统，例如由BioCardia开发可得的系统(www.biocardia.com)。

在一些实施方案中，对心脏(例如心肌)组织的效果可以以将低糖基化的FSTL1心外放置入心脏中来实现，这使用与其它应用中使用的那些(例如Epicardial CatheterSystem^TM，St.Jude Medical)相似的导管装置。

在一些实施方案中，对心脏(例如心肌)组织的效果可以以当浸渍(impregnate)在药物稀释支架(例如自Abbott Laboratories或Biosensors International，等等可得的那些)中时放置低糖基化的FSTL1来实现。

在一些实施方案中，对心脏(例如心肌)组织的效果可以以系统性放置低糖基化的FSTL1来实现，这使用得到批准的配制剂。

在一些实施方案中，对心脏(例如心肌)组织的效果可以以可如下实现放置低糖基化的FSTL1来实现，即通过使用抑制内源糖基化的FSTL1蛋白质糖基化的化合物或药物，它们是本领域技术人员容易获得且知道的。

在一些实施方案中，对心脏(例如心肌)组织的效果可以以可如下实现放置低糖基化的FSTL1来实现，即通过导入编码靶向FSTL1mRNA序列中的N-糖基化位点的特定诱变的modRNA。

在一些实施方案中，对心脏(例如心肌)组织的效果可以以可如下实现放置低糖基化的FSTL1来实现，即使用CRISPR/Cas9技术或相似技术(见例如Genome editing withCas9in adult mice corrects a disease mutation and phenotype.Hao Yin,etal.Nature Biotechnology 32,551-553(2014)doi:10.1038/nbt.2884，通过援引完整收入本文)的基因组编辑。

在一些其它实施方案中，对心脏(例如心肌)组织的效果可以以投递低糖基化的FSTL1的小分子模拟物来实现。

在其它实施方案中，修复受损害的心脏(例如心肌)组织包括心脏(例如心肌)组织的缩短百分比分数与在损害后未接触心外膜衍生的旁分泌因子的心脏(例如心肌)组织中缩短百分比分数的量相比的改善。在一些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的Fstl1)导致心脏(例如心肌)组织中的缩短百分比分数与治疗前的相同受试者相比改善至少约1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或100％或更大任一，包含落在这些百分比之间的所有值。在一些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的Fstl1)导致心脏(例如心肌)组织的缩短百分比分数与治疗前的相同受试者相比至多约1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或100％任一的改善，包含落在这些百分比之间的所有值。在一些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的Fstl1)导致心脏(例如心肌)组织的缩短百分比分数与治疗前的相同受试者相比至少约1-100％，5-95％，10-90％，20-80％，30-70％，5-10％，10-20％，20-30％，30-40％，40-50％，50-60％，60-70％，70-80％，80-90％，90-100％任一的改善，包含落在这些百分比之间的所有值。在一些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的Fstl1)导致心脏(例如心肌)组织的缩短百分比分数与治疗前的相同受试者相比至多约1-100％，5-95％，10-90％，20-80％，30-70％，5-10％，10-20％，20-30％，30-40％，40-50％，50-60％，60-70％，70-80％，80-90％，90-100％任一的改善，包含落在这些百分比之间的所有值。修复受损害的心脏(例如心肌)组织还可以包含心肌细胞胞质分裂的量与在损害后未接触心外膜衍生的旁分泌因子的心脏(例如心肌)组织中心肌细胞胞质分裂的量相比升高。在一些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1)导致心肌细胞胞质分裂的量改善约至少1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或100％或更大任一。在一些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1)导致心肌细胞胞质分裂的量改善至多约1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或100％或更大任一。在一些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1)导致心肌细胞胞质分裂的量改善至少约1-100％，5-95％，10-90％，20-80％，30-70％，5-10％，10-20％，20-30％，30-40％，40-50％，50-60％，60-70％，70-80％，80-90％，或90-100％任一。在一些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1)导致心肌细胞胞质分裂的量改善至多约1-100％，5-95％，10-90％，20-80％，30-70％，5-10％，10-20％，20-30％，30-40％，40-50％，50-60％，60-70％，70-80％，80-90％，或90-100％任一。心肌细胞胞质分裂的评估是本领域例行的且可以通过例如测定来自受试者的心脏(例如心肌)组织样品中Aurora B激酶的表达水平测量。当前的方法只容许死后或在活检之后或在移植之后实施这些研究。

在一些实施方案中，修复受损害的心脏(例如心肌)组织可以包含心肌细胞凋亡与在损害后未接触心外膜衍生的旁分泌因子的心脏(例如心肌)组织中心肌细胞凋亡的量相比降低。在一些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1)导致心脏(例如心肌)组织中的心肌细胞凋亡降低至少约1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，100％或更大任一，包含落在这些百分比之间的所有值。在一些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1)导致心脏(例如心肌)组织中的心肌细胞凋亡减少至多约1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或100％任一，包含落在这些百分比之间的所有值。在一些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1)导致心脏(例如心肌)组织中的心肌细胞凋亡降低至少约1-100％，5-95％，10-90％，20-80％，30-70％，5-10％，10-20％，20-30％，30-40％，40-50％，50-60％，60-70％，70-80％，80-90％，90-100％或更大任一，包含落在这些百分比之间的所有值。在一些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1)导致心脏(例如心肌)组织中的心肌细胞凋亡降低至多约1-100％，5-95％，10-90％，20-80％，30-70％，5-10％，10-20％，20-30％，30-40％，40-50％，50-60％，60-70％，70-80％，80-90％，或90-100％任一，包含落在这些百分比之间的所有值。心肌细胞凋亡的评估是本领域例行的(死后或离体，在心脏分离之后)且可以通过例如来自受试者的心脏(例如心肌)组织样品的TUNEL染色来测量。

修复受损害的心脏(例如心肌)组织还可以包含心肌细胞中一种或多种编码心脏特异性收缩蛋白质的转录物的水平与在损害后未接触心外膜衍生的旁分泌因子的心脏(例如心肌)组织中这些收缩蛋白质的转录水平相比升高。在一些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的Fstl1)导致一种或多种编码心脏特异性收缩蛋白质的转录物的水平升高至多约1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，100％或更大任一。在一些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的Fstl1)导致一种或多种编码心脏特异性收缩蛋白质的转录物的水平升高至少约1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或100％任一。在一些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的Fstl1)导致一种或多种编码心脏特异性收缩蛋白质的转录物的水平升高至少约1-100％，5-95％，10-90％，20-80％，30-70％，5-10％，10-20％，20-30％，30-40％，40-50％，50-60％，60-70％，70-80％，80-90％，或90-100％任一。在一些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的Fstl1)导致一种或多种编码心脏特异性收缩蛋白质的转录物的水平升高至多约1-100％，5-95％，10-90％，20-80％，30-70％，5-10％，10-20％，20-30％，30-40％，40-50％，50-60％，60-70％，70-80％，80-90％，或90-100％任一。在一些实施方案中，该心脏特异性收缩蛋白质选自由myh6，mlc2v，和mlc2a组成的组。心脏特异性收缩蛋白质转录物的评估是本领域例行的且可以通过例如Northern印迹，Western印迹，逆转录酶(RT)PCR，FACS分析，免疫组织化学，或原位杂交来测量。

修复受损害的心脏(例如心肌)组织可以包含心肌细胞中具有节律性可收缩Ca²⁺的辅肌动蛋白⁺细胞增多。在一些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的Fstl1)导致心肌细胞中具有节律性可收缩Ca²⁺的辅肌动蛋白⁺细胞的量与在损害后未接触心外膜衍生的旁分泌因子的心脏(例如心肌)组织中具有节律性可收缩Ca²⁺的辅肌动蛋白⁺细胞的数目相比增多约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，或更多倍任一。心肌细胞中具有节律性可收缩Ca²⁺的辅肌动蛋白⁺细胞的评估是本领域例行的(见下文实施例1)。

受损害的心脏(例如心肌)组织可以在对心脏(例如心肌)组织的损害之前，期间，或之后接触本文中公开的任何心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1)组合物(诸如药物组合物)。在一些实施方案中，在认为处于心血管疾病，MI，或另一种心肌缺血性事件风险的受试者中使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子组合物从而减轻或预防该事件对心肌的损害。在其它实施方案中，在由心血管疾病或MI引起的缺血性事件发作后立即使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子组合物，诸如约1分钟，2分钟，3分钟，4分钟，5分钟，6分钟，7分钟，8分钟，9分钟，10分钟，11分钟，12分钟，13分钟，14分钟，15分钟，16分钟，17分钟，18分钟，19分钟，20分钟，21分钟，22分钟，23分钟，24分钟，25分钟，26分钟，27分钟，28分钟，29分钟，30分钟，45分钟，1小时，1.5小时，2小时，2.5小时，3小时，3.5小时，4小时，4.5小时，5小时，5.5小时，6小时，6.5小时，7小时，7.5小时，8小时，8.5小时，9小时，9.5小时，10小时，10.5小时，11小时，11.5小时，或12小时或更多(包含落在这些值之间的所有时间段)。在一些实施方案中，在心脏损害之后少于1分钟施用组合物。或者，在其它实施方案中，在损害后使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子组合物，诸如在由心血管疾病或MI引起的缺血性事件发作后至少12小时，13小时，14小时，15小时，16小时，17小时，18小时，19小时，20小时，21小时，22小时，23小时，24小时或1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天，8天，9天，10天，11天，12天，13天，14天，3周，1个月，2个月，3个月，4个月，6个月，7个月，8个月，9个月，10个月，11个月，或一或多年(包含落在这些值之间的所有时间段)。

本文中公开的治疗对心脏(例如心肌)组织的损害的任何方法可导致在损害后受试者中的存活延长。如本文中使用的，存活延长包括例如受试者的存活与未经受当前描述的方法的受试者中的相对存活相比延长至少约5％(例如至少约10％，15％，20％，25％，30％，40％，45％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，110％，120％，130％，140％，150％或多于200％或更大)。存活时间可以例如以天，周，月，或年来测量。在一些实施方案中，依照本文中描述的任何方法使受损害的心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子能将受试者的存活延长至少6个月，7个月，8个月，9个月，10个月，12个月，18个月，24个月，36个月，或更多。

在一些实施方案中，修复受损害的心脏(例如心肌)组织可以包含心脏(例如心肌)组织中的纤维化与在损害后未接触心外膜衍生的旁分泌因子的心脏(例如心肌)组织中纤维化的量相比降低或削弱。在一些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1)导致心脏(例如心肌)组织中的纤维化降低至少约1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，100％，或更大任一，包含落在这些百分比之间的所有值。在一些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1)导致心脏(例如心肌)组织中的纤维化降低至多约1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或100％任一，包含落在这些百分比之间的所有值。在一些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1)导致心脏(例如心肌)组织中的纤维化降低至少约1-100％，5-95％，10-90％，20-80％，30-70％，5-10％，10-20％，20-30％，30-40％，40-50％，50-60％，60-70％，70-80％，80-90％，或90-100％任一，包含落在这些百分比之间的所有值。心肌细胞纤维化的评估是本领域例行的且可以通过DE-MRI或通过心脏(例如心肌)组织的组织学检测(死后或活检)来测量。在一些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1)导致心脏(例如心肌)组织中的纤维化降低至多约1-100％，5-95％，10-90％，20-80％，30-70％，5-10％，10-20％，20-30％，30-40％，40-50％，50-60％，60-70％，70-80％，80-90％，或90-100％任一，包含落在这些百分比之间的所有值。心肌细胞纤维化的评估是本领域例行的且可以通过DE-MRI或通过心脏(例如心肌)组织的组织学检查(死后或活检)来测量。

修复受损害的心脏(例如心肌)组织可以另外包含心脏(例如心肌)组织的受损害区域的血管形成升高。在一些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1)导致心脏(例如心肌)组织中的血管形成的量与在损害后未接触心外膜衍生的旁分泌因子的心脏(例如心肌)组织中血管形成的相对量相比恢复或血液-灌注升高至少约1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，100％，或更大任一。在一些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1)导致心脏(例如心肌)组织中血管形成的量与在损害后未接触心外膜衍生的旁分泌因子的心脏(例如心肌)组织中血管形成的相对量相比恢复或血液-灌注升高至多约1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或100％任一。在一些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1)导致心脏(例如心肌)组织中血管形成的量与在损害后未接触心外膜衍生的旁分泌因子的心脏(例如心肌)组织中血管形成的相对量相比恢复或血液-灌注升高至少约1-100％，5-95％，10-90％，20-80％，30-70％，5-10％，10-20％，20-30％，30-40％，40-50％，50-60％，60-70％，70-80％，80-90％，或90-100％任一。在一些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1)导致心脏(例如心肌)组织中血管形成的量与在损害后未接触心外膜衍生的旁分泌因子的心脏(例如心肌)组织中血管形成的相对量相比恢复或血液-灌注升高至多约1-100％，5-95％，10-90％，20-80％，30-70％，5-10％，10-20％，20-30％，30-40％，40-50％，50-60％，60-70％，70-80％，80-90％，或90-100％任一。心脏(例如心肌)组织中血管形成的评估是本领域例行的且可以通过测量血管细胞中诸如von Willebrand因子(vWF)或平滑肌肌动蛋白等蛋白质的表达来评估(见下文实施例4)。

在又一些实施方案中，修复受损害的心脏(例如心肌)组织涵盖进入细胞周期的心肌细胞增多。在一些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的Fstl1)导致心脏(例如心肌)组织中进入细胞周期的心肌细胞的量与在损害后未接触心外膜衍生的旁分泌因子的心脏(例如心肌)组织中进入细胞周期的心肌细胞的量相比增多至少约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，或更多倍任一。心脏(例如心肌)组织中进入细胞周期的心肌细胞的评估是本领域例行且可以通过测量例如磷酸-组蛋白H3的表达来评估(见下文实施例5)。

在本文中公开的任何方法的一些实施方案中，将该心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的Fstl1)灌输，接种，或包埋入基于3D胶原的贴(诸如本文中描述的那些任一)中。然后可以使该基于胶原的贴直接接触心外膜或受损害的心肌区域(诸如暴露于缺血性事件，诸如心肌梗死的心肌区域)。可以经由缝合或通过本领域知道的任何其它手段将该3D胶原贴应用于心外膜或心肌来使该贴接触受损害的组织。

在还有其它实施方案中，该心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的Fstl1)是投递至心外膜，心内膜，或受损害的心肌区域的水凝胶的一种成分(通过例如导管技术；Koudstaal et al.,J.of Cardiovasc.Trans.Res.(2014)7:232-241)。

IV.试剂盒

本文中还提供的是试剂盒，其包含(i)心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1多肽)；和(ii)一种或多种药学可接受赋形剂。这些试剂盒成分之一或二者可以做成是无菌的，使得它能施用于有需要的个体(例如具有心脏损害，诸如MI的个体)。该试剂盒可任选含有能在施用于受试者前接种或灌输该心外膜衍生的旁分泌因子的3D胶原贴(诸如本文中公开的这些任一)。或者，预接种或预灌输3D胶原贴可以连同关于其对有所需要的受试者的受损害的心脏(例如心肌)组织或心外膜使用和应用的书面说明书包括在该试剂盒中。该试剂盒可进一步包含用于将该3D胶原贴粘附至心外膜或受损害的心脏(例如心肌)组织的手段或工具，诸如但不限于缝合材料。

本文中公开的任何试剂盒还可包括水凝胶(诸如自聚合水凝胶)，作为心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1多肽)的载体。在一个实施方案中，该试剂盒还包括一根或多根导管，用于将该水凝胶(诸如灌输有低糖基化的FSTL1多肽的水凝胶)投递至心内膜，心外膜，和/或一个或多个受损伤的心肌区域。

该试剂盒还可包括关于使用该试剂盒的书面说明书，诸如关于将心外膜衍生的旁分泌因子灌输入3D胶原贴中，将该贴缝合至心肌或心外膜，将心外膜衍生的旁分泌因子灌输入水凝胶(诸如自聚合水凝胶)中以及经由导管技术将该水凝胶投递至心外膜或一个或多个受损伤的心肌区域的说明书。

意图是，贯穿此说明书给出的每一个最大数值限制包括每一个更低的数值限制，就像本文中明确写出此类更低数值限制。贯穿此说明书给出的每一个最小数值限制会包括每一个更高的数值限制，就像本文中明确写出此类更高数值限制。贯穿此说明书给出的每一个数值范围会包括每一个落在此类更宽的数值范围内的更窄的数值范围，就像本文中明确写出此类更窄数值范围。

通过提交下面的实施例能进一步理解本发明，它们是作为例示提供的，并非意图限制。

实施例

实施例1：心外膜旁分泌信号传导激活心肌细胞扩增

心脏的心外膜是通过提供祖细胞^1,2以及丝裂原(包括FGF，IGF2，和PDGF^3-5)在发育期间对心肌生长有贡献的外部上皮层。最近的研究提示心外膜可能还在损害后保持成年心肌的功能，有可能作为肌发生性祖先的来源^6,7。然而，尚无心外膜衍生的旁分泌因子显示在哺乳动物中支持心肌再生，尽管它们的身份和作用机制会提供关于这个了解较少且内在低效的过程的见解⁸。此实施例描述这样一种心外膜衍生的旁分泌因子的鉴定。

材料和方法

祖细胞Sca1⁺，Myh6^-心肌细胞祖先如描述的那样¹⁹由Schneider实验室获得。

心外膜间皮细胞(EMC)如描述的那样³³在含10％FBS和抗生素/抗真菌剂的DMEM中维持。用H2B-mCherry慢病毒稳定转导EMC进行核标记。

小鼠胚胎干细胞衍生的心肌细胞(mCM^ESC)：通过慢病毒转导和杀稻瘟菌素选择生成用于心肌细胞的药物抗性选择的稳定的小鼠ESC系(Myh6-Puror；Rex-Blastr)，与我们先前报告的人系³⁴相似。

mCM^ESC通过Myh6-Puror；Rex-Blastr mESC在分化培养基中的分化作为胚状体(EB)直至第4天获得，分化培养基含有：Iscove氏改良Dulbecco培养基(IMDM)，补充有10％FBS，2mM谷氨酰胺，4.5x10^-4M单硫代甘油，0.5mM抗坏血酸，200μg/mL运铁蛋白(Roche)，5％无蛋白质的杂交瘤培养基(PFHM-II，Invitrogen)和抗生素/抗真菌剂，并直至9，在自发跳动开始之后一天涂布到贴壁细胞培养板上。为了纯化Myh6⁺心肌细胞，在分化第9天添加嘌呤霉素达24小时。随后，将细胞用胰蛋白酶处理并作为单层心肌细胞涂布。条件化培养基和FSTL1处理典型地在单层涂布之后24小时实施。处理的长度在每幅图的图例中指出。

胚胎心肌细胞。使用荧光活化的细胞分选(FACS)自来自e12.5胚胎的Tnt-Cre；Rosa26^mTmG/+心脏纯化心肌细胞。通过胶原酶IV消化解离心脏并分离GFP⁺细胞用于FACS纯化。培养GFP⁺细胞，并通过它们的心肌细胞特异性标志物α辅肌动蛋白(ACTN2)和心脏肌钙蛋白T(TNNT2)的表达确认是心肌细胞。它们在体外培养时节律性跳动。

大鼠心外膜间皮细胞(EMC)条件化培养基。在含青霉素/链霉素的10％FBS DMEM中培养EMC 33细胞直至汇合(～1x 10⁶/cm²)，然后用PBS清洗3次并将培养基换成无酚红的含青霉素/链霉素的无血清DMEM，另外培养2天，之后收集培养基作为条件化培养基(为了条件化添加20ml培养基并在2天后收集18ml)。穿过0.22μm孔膜(Millipore)过滤收集的培养基。以相同方式但没有EMC细胞地制备对照条件化培养基。

成年小鼠EPDC条件化培养基在Zhou实验室⁹中生成。简言之，通过强饲法对8周龄成年Wt1^CreERT2/+；Rosa26^mTmG/+心脏小鼠口服注射4mg他莫昔芬，在2周时段期间施用4-5次口服注射。然后通过结扎左前降支冠状动脉对(11周龄)成年小鼠诱发心肌梗死。在损害之后1周，收集Wt1^CreERT2/+；Rosa26^mTmG/+心脏，然后用胶原酶IV消化成单细胞。通过将4ml 1％胶原酶IV和1ml 2.5％胰蛋白酶添加入44.5ml Hank氏平衡盐溶液，并补充0.5ml鸡血清和0.5ml马血清来制备消化溶液。在Hank氏平衡盐溶液中重悬浮细胞，将4ml消化溶液添加至每个管并在37℃摇床中温和摇动6分钟。在去除含有解离的细胞的上清液之后，添加另4ml消化溶液以重复消化6次。在最后一次消化之后，将细胞过滤穿过70μm滤器并通过于4℃以200g离心5分钟使细胞形成团粒。然后通过Hank氏平衡盐溶液重悬浮细胞用于FACS分离。使用来自GFP心脏的解离的细胞作为对照用于FACS中的门设置。通过FACS自GFP⁺Wt1^CreERT2/+；Rosa26^mTmG/+心脏分离GFP+细胞(心外膜衍生的细胞，EPDC)，并且这些GFP⁺纯化群在荧光显微镜下确认是GFP⁺细胞。FSTL1表达(通过PCR测定)在培养的GFP+EDPC中恢复。然后将来自EPDC的完全条件化培养基添加至肌细胞测定法。稀释度如图例中指出的。

心肌细胞的增殖(用条件性培养基处理的)如先前描述的那样⁹使用Celltiter96Aqueous One solution(Promega)通过MTT测定法测量。在将Celltiter 96Aqueous One试剂添加入细胞培养培养基中之后，将板于37℃温育3-4小时，然后使用96孔板读数仪记录490nm处的吸光度。490nm处的吸光度与细胞数紧密相关。如此，标注MTT测定法(A490)的y轴上的MTT读出反映来自处理组之间每个孔的相对细胞数。

钙成像：使用Kinetic Image Cytometer(KIC，Vala Sciences)使用Fluo4NW钙指示剂(Life Science)记录收缩性钙瞬变。如描述的那样³⁸使用含有KIC分析包的Cyteseer软件(Vala Sciences)加工数据。

RNA提取和Q-RT-PCR：用TRIzol(Invitrogen)提取总RNA并用QuantiTect逆转录试剂盒(Qiagen)依照制造商的用法说明书逆转录成cDNA。将自100ng总RNA合成的cDNA样品提交用LightCycler 480实时PCR系统(Roche)实施的用LightCycler 480SYBR Green IMaster试剂盒(Roche)进行的RT-QPCR。下文列出了此实施例以及本文中公开的其它实施例中使用的引物序列：

结果

为了搜索促进心脏发生的心外膜信号，将心外膜间皮细胞(EMC)系与Myh6⁺小鼠胚胎干细胞(ESC)衍生的心肌细胞(称作mCM^ESC)共培养。自分化的Myh6-Puro^r小鼠ESC的嘌呤霉素选择制备mCM^ESC(详情和细胞表型见图8和材料和方法)。与EMC的共培养一致地增加α-辅肌动蛋白⁺肌细胞的数目(图1a-c)和心肌细胞标志物(包括Myh6，Myh7，Mlc2a和Mlc2v)的表达(图1d)。未稀释的EMC条件化培养基通过增加肌细胞的数目(检测到2.4倍α-辅肌动蛋白⁺细胞，图1e-g)及Myh6(1.8倍)，Mlc2v(1.9倍)，和Mlc2a(1.3倍)表达(图1h)而重演共培养的效果。而且，EMC条件化培养基相对于标准培养基增加展现节律性收缩性Ca²⁺瞬变的α-辅肌动蛋白⁺细胞的数目(8.6倍)(图1i)。如此，自心外膜样培养物分泌的因子增加ESC衍生的心肌细胞培养物中可收缩细胞的数目。共培养物没有促进未分化(Myh6-)ESC的心脏发生(未显示)。

为了评估成年心外膜是否也含有这样的活性，制备来自自3-4月龄Wt1^CreERT2/+；Rosa26^mTmG/+小鼠⁹FACS分离的心外膜衍生的细胞(EPDC)的条件化培养基(图1j和材料和方法)。当添加至E12.5胚胎心肌细胞(也是先前基于eGFP荧光自TNT-Cre；Rosa26^mTmG/+小鼠FACS分离的)时，成年EPCD条件化培养基显著增强心肌细胞在无血清培养基中的增殖(p<0.05，图1k)。在温育前煮沸EPDC培养基消除该效果，与本质活性是蛋白质的一致。EPDC条件化培养基使连接邻近Tnnt2⁺细胞的卵裂沟中Aurora B激酶的发生率接近翻倍(0.19至0.33％，P<0.05，图1l,m)，指示成年心外膜中促进胚胎心肌细胞胞质分裂的活性。

实施例2：工程化心外膜削弱再造且改善心脏功能

此实施例描述心外膜分泌的因子在成年心脏中的作用。

材料和方法

成年心室肌细胞如先前公开的那样³⁵自3月龄FVB小鼠分离。简言之，用戊巴比妥钠(100mg/kg静脉内)麻醉小鼠。取出心脏并于37℃用无Ca²⁺溶液(以mM计，120NaCl，14.7KCl，0.6KH₂PO₄，0.6Na₂HPO₄，1.2MgSO₄-7H₂O，4.6NaHCO₃，10Na-HEPES，30牛磺酸，10BDM，5.5葡萄糖)逆行灌注，接着是胶原酶的酶促消化。将心室切成小块并进一步消化。添加终止缓冲液(无Ca²⁺溶液+12.5μM CaCl₂+10％小牛血清)并将细胞悬浮液以40g离心3分钟。将肌细胞在终止缓冲液中重悬浮，提高CaCl₂浓度直至实现1mM。然后将细胞在MEM+5％小牛血清+10mMBDM+2mM L-谷氨酰胺中重悬浮并添加至胶原溶液，预聚合(250,000个细胞每ml或每贴)。在胶原胶凝和塑胶压缩后，将细胞贴在上述(涂布)培养基中培养过夜，然后转移入培养培养基中：MEM+1mg/ml牛血清清蛋白+25μM blebbistatin+2mM L-谷氨酰胺，存在或缺失重组FSTL1(AVISCERA BIOSCIENCE，10ng/ml)。在第7天，如先前描述的那样³⁶对3D培养物标本进行基于荧光遍在蛋白化的细胞周期指示剂(FUCCI，Premo^TM FUCCI Cell Cycle Sensor，Life Technologies，US)测定法。在此测定法中，G1和S/G2/M细胞分别发射红色和绿色荧光。使用下面的方程计算Premo^TM geminin-GFP和Premo^TM Cdt1-RFP的体积：

其中细胞数是细胞标记时的估算总细胞数(等于CM接种密度)，PPC(颗粒每细胞)是每个细胞的病毒颗粒数(在此测定法中＝40)，而1×10⁸是每mL试剂的病毒颗粒数。在完全细胞培养基中将上文计算的体积的试剂直接添加至细胞贴，温和混合，并在培养温箱中温育过夜(≥16小时)。使用常规荧光显微镜，利用GFP和RFP滤光器套组对贴样品成像。

用作工程化心外膜贴的压缩的胶原凝胶：如下生成高度水合的胶原凝胶–在此研究中用作心脏贴–将1.1ml 1X DMEM(Sigma，MO，US)添加至0.9ml乙酸中的无菌大鼠尾I型胶原溶液(3.84mg/ml，Millipore，MA，US)。将所得2ml胶原-DMEM混合物混合均匀并用0.1MNaOH(～50μl)中和。整个过程在冰上进行以避免胶原过早胶凝。在含有心外膜因子的贴的情况中，如上收集EMC培养培养基并取0.6ml与0.5ml DMEM混合。然后将胶原溶液(0.9ml)分发入24孔板(直径15.6mm)的孔中并在组织培养温箱中于37℃放置30分钟进行聚合。如先前描述的那样^39,40实施塑胶压缩以去除过量的水及生成具有改良的生物学和机械特性的致密的生物材料。简言之，作为铸件，高度水合的胶原凝胶(以～0.9ml体积)经由应用静态压缩应力～1,400Pa达5分钟而经历无限制压缩(详情参见^39,41)，导致～98-99％体积缩小。通过原子力显微术(AFM)以纳米压痕模式评估压缩的胶原的弹性模数(目标是近似胚胎心外膜的弹性模数，其对于不成熟心肌细胞的收缩性是最佳的³²)，使用导致小于10％的最小限度局部应变(压痕～100nm)的强行触发以使底物相关假象的影响最小化。使用聚焦离子束研磨制造定制平坦AFM尖端并通过扫描90μm×90μm的面积用于探查凝胶的劲度(图9a-c)。

永久性LAD闭塞(MI)：雄性10-12周龄C57BL/6J小鼠购自Jackson Laboratories(Bar Harbor，ME，USA)。涉及动物使用和手术的规程得到斯坦福科研动物护理和使用委员会(IACUC)批准。依照实验动物福利法提供动物护理和干预。使用异氟烷吸入室麻醉小鼠，使用22号血管导管(Becton，Dickinson Inc.，Sandy，Utah)气管内插管并连接至小动物体积-控制呼吸机(Harvard Apparatus，Holliston，MA)。经由第四肋间隙实施左胸廓切开术并收回肺部以暴露心脏。打开心包膜之后，放置7-0缝合线以在左心房边缘下方～2mm使左前降支动脉(LAD)闭塞。当LV壁变苍白时，认为结扎是成功的。在用贴处理的实验组的情况中，在结扎之后立即将制备的胶原贴缝合(两点)到缺血心肌的表面上。将动物保持在加热垫上直至它们恢复。另一组小鼠经历假结扎；它们有相似的手术规程没有LAD结扎。每个研究组中使用n＝8的最小数目。

TTC染色：在MI/贴处理后的第2天，收获来自所有四组的小鼠心脏并垂直于长轴切片成四个部分(大约2mm厚)。将切片放置在12孔细胞培养板的孔中并与1％氯化2,3,5-三苯基四唑(TTC，Sigma-Aldrich)溶液一起于37℃温育15分钟。随后用PBS清洗切片并用立体显微镜显现并用数码相机拍照。

回波心动描计术：在LAD结扎之后2和4周通过回波心动描计术评估体内心脏功能。使用配有13MHz换能器的GE Vivid 7超声波平台(GE Health Care，Milwaukee，WI)对小鼠实施二维(2D)分析。将小鼠用异氟烷(100mg/kg，吸入)镇静，并对胸部剃毛。将小鼠仰卧或左侧卧体位放置在加热平台上以便于回波心动描计术。在乳头肌顶端自左心室中部以短轴视图记录2D剪辑和M模式图像。在终末舒张和收缩二者时测量LV内径(LVID)和后壁厚度(LVPW)。自2D短轴视图中的LV尺寸计算缩短分数(FS，％)和射血分数(EF，％，经由2D数据外推)。使用每个实验组8只小鼠的最小数目(n)进行回声评估。由两个独立的小组以盲目的方式实施测量。

结果

接下来通过使用心外膜3D胶原贴投递条件化培养基来评估心外膜分泌的因子在成年心脏中的作用。3D胶原贴(图2a)设计成具有与胚胎心外膜报告的弹性模数(E～12±4kPa)¹⁰相当的弹性模数，其低于成熟心外膜的(E>30-40kPa)和纤维化心脏组织的(E>100kPa)，但是高于大多数当前使用的支架生物材料的(E≤1kPa)(图2b和图9)。给工程化贴接种EMC条件化培养基并缝合到梗死的成年鼠心脏的心外膜上(图2c，d)。在左前降支(LAD)冠状动脉的永久结扎(心肌梗死(MI))后立即实施贴植入。2周后，用心外膜-培养基-贴(MI+贴+CM分组)和空贴(MI+贴，无条件化培养基)处理的心脏显示相对于仅MI动物显著更好的形态测量参数，包括终末舒张和收缩时的左心室内径(分别为LVIDd和LVIDs)及终末舒张和收缩时的左心室后壁尺寸(分别为LVPWd和LVPWs)(图2e和表1)，与胶原贴提供抑制病理改造的机械支持的模型一致¹⁰。值得注意的是，MI+贴+CM处理相对于所有其它条件提供另外的好处，具有显著更好的心室收缩性参数(图2e，f和表1)，如此指示功能保持中所涉及的心外膜分泌的活性。

实施例3：FSTL1是一种能够诱导心肌细胞增殖的心外膜因子

此实施例提供提示FSTL1在心外膜-心肌交流中发挥作用以促进心肌发生的数据。

材料和方法

条件化培养基的LC-MS/MS分析：首先，将三(2-羧基乙基)膦(TCEP)添加入1mL条件性培养基中至10mM，并将蛋白质样品于37℃还原30分钟。然后将碘乙酰胺添加至20mM，并将溶液在黑暗中于37℃烷基化40分钟。然后以1:100比率将质谱级胰蛋白酶(Promega)添加至溶液。在于37℃消化过夜之后，然后将样品使用SepPack筒脱盐，使用SpeedVac干燥，并在100μL 5％甲酸中重悬浮。通过LC-MSMS系统在线分析所得肽，该系统由Michrom HPLC，15cmMichrom Magic C18柱，低流ADVANCED Michrom MS源，和LTQ-Orbitrap XL(ThermoScientific，Waltham，MA)组成。使用0-30％B(0.1％甲酸，100％乙腈)的120分钟梯度将肽分开，总LC时间为141分钟。LTQ-Orbitrap XL设置为以60,000的分辨率扫描Orbitrap中的前体，接着是头等4个前体的数据依赖性MS/MS。然后将原始的LC-MSMS数据提交给SorcererEnterprise(Sage-N Research Inc.)，用于针对IPI大鼠蛋白质数据库的蛋白质鉴定，该数据库含有半胰蛋白酶肽序列，允许高达2个错过的切割和50.0ppm的前体质量容差。向所有半胱氨酸添加57Da的分子量以考虑羧酰胺甲基化。差异搜索包括用于甲硫氨酸氧化的16Da。使用PeptideProphet和ProteinProphet(ISB)查看，分选，过滤，和静态分析搜索结果。蛋白质和肽的最小跨蛋白质组管线(TPP)概率得分分别设置为0.95，以确保TPP误差率低于0.01。

重组FSTL1购自AVISCERA BIOSCIENCE(00347-02-100，在大肠杆菌中生成)和R&Dsystem(1694-FN-050，在小鼠骨髓瘤细胞系中生成，NS0衍生的)。

组织学和免疫组织化学：依照石蜡包埋的标准方案实施此实施例和其它实施例的组织学分析。对于免疫组织化学，除非另有描述，以7μm的厚度将包埋的胚胎切片。此实施例和本文中公开的其它实施例中使用的抗体如下：1:200α-辅肌动蛋白(Sigma，A7811)，1:300α-平滑肌肌动蛋白(Sigma A2547)，1:100磷酸-组蛋白3(家兔Millipore 06-570)，1:300磷酸-组蛋白3(小鼠Abcam ab14955)，1:100WT1(Abcam，ab15249)，1:250AuroraB(Millipore04-1036批号221196)，1:200PCM1(Sigma-Aldrich HPA023370)，1:200FSTL1(R&DMAB17381)。每项分别染色至少5个切片用于组织学，3个用于免疫组织化学研究。贴植入的纳入标准是贴覆盖>70％的梗死(由组织学控制)。根据指示在冷冻切片上实施TUNEL测定法(Roche 11684795910)。

结果

为了鉴定生物活性心外膜分泌蛋白，通过质谱术分析EMC条件化培养基。谱与IPI大鼠数据库的比较鉴定出与311个独特蛋白质对应的1596个肽读出，其中95个读出是由于16个离散的分泌蛋白。选择具有最高谱计数的10种蛋白质用于在mCM^ESC测定中进行测试。在这些中，只有卵泡抑素样1(也称作FSTL1，FRP或TSC36)记录到心脏发生性活性(图3a)，其是与卵泡抑素共享单个富半胱氨酸域的BM-40/SPARC/骨连接素(Osteonectin)家族的分泌糖蛋白。与卵泡抑素不同，FSTL1不阻断激活素，而且它的生物化学和生物学功能表征不多¹¹。在心脏中投递FSTL1导致短期抗凋亡作用^12,13，但是没有心肌修复功能归于FSTL1；确实，在急性MI后血流中FSTL1水平升高，而且因为这个原因认为它是急性冠状动脉综合征的生物标志物¹⁴。

用细菌合成的重组人FSTL1(10ng/ml)处理mCM^ESC达8天使心肌细胞的数目增加3倍(图3b-d)，以及将编码心脏特异性收缩蛋白质的转录物的水平升高2倍(myh6，mlc2v，和mlc2a，图3e)和具有节律性收缩性Ca²⁺瞬变的α-辅肌动蛋白⁺细胞的数目增加7倍(图3f)而不诱导肥大。确实，FSTL1以剂量依赖性方式降低心肌细胞细胞大小(图3g)。总之，这些数据提示FSTL1在心外膜-心肌交流中发挥作用以促进心肌发生。

通过免疫染色的直接显现揭示FSTL1早在妊娠中期就限制于心外膜(图3h)，尽管它更早时存在于原始心脏管的心肌中¹⁵。心外膜表达先前没有记录，尽管它坚持贯穿成年期(图3i-k)。引人注目地，FSTL1局限在缺血性损害后显著变化，使得其在心肌中变得丰富(图3i-1)，并且惊人地在心外膜和梗死区域中缺失(图3i，l和图10)。

实施例4：局部化FSTL1投递改善MI之后的心脏功能

先前的研究显示FSTL1在心肌细胞中的瞬时过表达或直接系统性输注人重组FSTL1在急性缺血/再灌注后是抗凋亡的^12,13。然而，在此实施例中检查它是否赋予任何长期的好处。

材料和方法

体内延迟增强型磁共振成像(DEMRI)：为了准备扫描，用2％异氟烷实现麻醉诱导并用1.25-1.5％异氟烷维持,同时监测呼吸频率。皮下插入ECG导线以监测心率，同时将体温维持于37℃。使用具有专用小鼠线圈(Rapid MR International，Germany)的3T GESigna Excite临床扫描仪，在治疗之后第1和4周记录功能参数。为MRI采集实施以下顺序：(1)以FOV 3.4cm，切片厚度0.9mm，矩阵128x128，TE 5ms，TI 150-240ms，和FA 60°使用门控fGRE-IR序列，在IP注射0.2mmol/kg钆喷酸葡胺(Magnevist，Berlex Laboratories)后实施DEMRI；和(2)以FOV 7cm，切片厚度0.9mm，矩阵256x256，TE 5.5ms和FA 30使用fSPGR实施多个体积的心脏MRI。使用冠状和轴向侦察图像沿着左心室(LV)腔的短轴放置二维成像平面。这项定性研究使用每个实验组2只小鼠的最小数目(n)。

血管计数：自针对作为血管壁中内皮细胞标志物的von Willebrand因子(vWF)染色的心脏样品的组织学切片测量血管密度参数。对每个处理组(每个组中4只小鼠)分析多达60个切片。使用ImageJ实施分析以计算：1)血管的总管腔面积，和2)vWF染色+的血管的数目。在每种情况中，作为所分析的总表面积的分数获得血管参数的直方图，并对每个处理组绘制中值。通过单尾ANOVA确定与假组的差异的统计学显著性(p<0.05)。

酶联免疫吸附测定法：为了评估在体外工程化贴系统内的FSTL1保留，于37℃将加载有FSTL1(5μg/ml)的胶原支架浸泡在PBS中并摇动不同时间(0，12小时，1天，和21天)，并使用酶联免疫吸附测定法试剂盒(USCN Life Science，Inc.，Houston，USA)测定FSTL1浓度。此技术的检出限为0.50ng/ml。支架用溶解在磷酸盐缓冲盐水中的1mg/ml I型胶原酶(Sigma Aldrich，MO，US)和5mg/ml透明质酸酶(Sigma Aldrich，MO，US)预处理5分钟，接着以5,000xg离心20分钟。将收集的样品的100μl等分试样添加至96孔板中，并于37℃温育2小时。然后，将100μL制备的检测试剂A添加至孔中，接着于相同温度温育1小时。在抽吸和清洗3次之后，将100μl制备的检测试剂B添加至孔中，并于37℃温育30分钟。在抽吸和清洗5次之后，将90μL底物溶液添加至孔中，接着于37℃温育25分钟。将50μL终止溶液添加至孔中，并立即于450nm读取每个孔的吸光度。使用标准溶液的标准曲线定义FSTL1的浓度。测试实施4次。

缺血再灌注(I/R)：如上文描述的那样对10-11周龄雄性C57/BL6麻醉和插管。然后实施左侧胸廓切开术。轻轻拉开心包并使用8-0尼龙缝合线(Ethicon，Inc.Johnson&Johnson Co.，USA)针对PE10管道结扎左前降支冠状动脉，在闭塞30分钟后去除PE10管道。通过目测检查(通过注意结扎后远端心肌中苍白色形成)验证冠状动脉闭塞的成功实施。然后使用7-0缝合线围绕邻近的肋骨关闭胸部，并用6-0缝合线封闭皮肤。以BID剂量给药皮下施用丁丙诺啡最少1天。对于用贴处理的动物组，在I/R发生后一周实施第二次胸廓切开术并将制备的胶原贴缝合(以两个点)到缺血心肌的表面上。假操作对照由除LAD结扎以外经历相同手术规程(两次胸廓切开术)的年龄匹配的小鼠组成。在缺血再灌注研究中，在手术前(基线)，在I/R发生之后1周，和在植入后2和4周评估体内心脏功能。

FSTL1-TG小鼠(MI实验中使用的)是C57BL6背景的12-15周龄雌性和雄性小鼠。而且研究方案得到了波士顿大学科研动物护理和使用委员会(IACUC)的批准。

结果

在转基因小鼠(其在纹状肌限制性MCK启动子控制下表达FSTL1)(FSTL1-TG16，图11a，b)中评估心脏功能。FSTL1-TG小鼠展示永久性LAD结扎后小但显著的收缩性改善，然而它们不显示形态计量参数或瘢痕大小的长期改善，尽管有丰富的FSTL1过表达(图11a-j)。如此，FSTL1的心肌过表达不足以重演投递至心外膜表面的心外膜条件化培养基的心脏保护作用。接下来评估心外膜hFSTL1投递对心脏功能的影响。如前制备胶原贴，但是这次在聚合和应用到梗死心脏的心外膜表面上前加载10μg重组细菌合成的hFSTL1/贴(详情见材料和方法)。贴保留免疫可检测的hFSTL1长至体外21天和体内28天，测试的最长时间(图12)。在MI之后立即将新鲜制作的hFSTL1贴(贴+FSTL1)应用到心脏的心外膜表面上。贴+FSTL1导致与具有仅MI和单独贴的动物相比显著改善的动物存活(图4a)。

收缩性的回波心动描计时间-过程测量(％缩短分数，FS％)证明贴+FSTL1在MI后2周至3个月之间引起心脏功能的稳定恢复，此时FS％接近假操作动物的FS％(图4b和表1)。相反，无处理的动物在4周之后显示FS％的严重下降，随后没有改善。用单独的贴处理相对于无处理削弱心脏功能的下降，但是与FSTL1不同，随后心脏功能没有改善(图4b和表1)。

表1。永久性LAD结扎的小鼠模型中处理后第0(基线)，14，和28天时获得的原始回波心动描计术值(平均值±SEM)。与损害同时植入贴。

^*：与假比较的统计学显著差异(P<0.05)。

^●：与仅MI比较的统计学显著差异(P<0.05)。

^▲：与MI+贴比较的统计学显著差异(P<0.05)。

^■：与MI+贴+CM比较的统计学显著差异(P<0.05)。

鉴于在MI之后FSTL1在心肌中上调¹⁶，随后测试心外膜投递FSTL1是否是诱导有益效果必需的。这是通过对心肌梗死FSTL1-TG小鼠植入仅贴或贴+FSTL1实施的¹⁶。与仅贴治疗相比，收缩性参数在接种贴+FSTL1的转基因动物中剧烈且特异性的升高，在治疗第2周有值得注意的变化并到第4周达到高至50％的改善(图4c)。如此，心外膜投递重组FSTL1是有效的，即使在心肌转基因过表达FSTL1的背景中，而且进一步指向心外膜FSTL1投递超越单独的贴或心肌FSTL1过表达的特异性好处。

在贴+FSTL1植入之后改善的心脏功能和存活伴有显著削弱的纤维化(图4d，图13)。贴+FSTL1和仅贴队列中的LV变薄是相似的，相对于仅MI条件，两种处理均显著降低LV变薄(图4d，e和表1)。在一个独立的实验组中，损害后4周的延迟增强型磁共振成像(DEMRI)分析确认MI+贴+FSTL1治疗缩小瘢痕尺寸(图14)。

还调查如果在心脏功能下降之后应用的话贴+FSTL1是否具有相似的有益效果。为此目的，使用缺血-再灌注(I/R)模型并在损害之后1周植入贴。所有动物展示降低的收缩性(自损害前的37％FS至在放置贴前在I/R之后1周的22％)。未处理动物的心脏功能渐进地下降(I/R后1，3和5周时的22％，20％和16％FS)。形成对比，贴+FSTL1队列在I/R后3周恢复至34％并稳定化，对应于完全FS恢复(图15和表2)。与永久性结扎模型相似(图4)，功能恢复伴有形态计量术参数的恢复(图15和表2)。这些数据指示在缺血性损害之后心外膜投递的FSTL1引起损伤的复原。

表2。永久性LAD结扎的小鼠模型中处理后长期(第2和3个月)的原始回波心动描计术值(平均值±SEM)。与损害同时植入贴。

^*：与假比较的统计学显著差异(P<0.05)。

^●：与仅MI比较的统计学显著差异(P<0.05)。

^■：与MI+贴比较的统计学显著差异(P<0.05)。

^▲：与MI+贴+CM比较的统计学显著差异(P<0.05)。

贴中的FSTL1提高梗死区域边界处的底层心肌和胶原贴二者的血管形成，如通过von Willebrand因子(vWF)和平滑肌肌动蛋白(αSMA)免疫染色评估的(图4f-i)。与MI+贴组中的0.9％面积和仅MI组中的0.4％面积相比，MI+贴+FSTL1组中大约1.5％的贴面积和底下的心肌被脉管占据(图4g)。此值指示假操作动物的远端LV壁的相当区域中观察到的脉管系统(3.1％面积)恢复近一半。MI+贴+FSTL1组(82根脉管/mm²)中每个组织学切面的单位表面积的(任何尺寸的)脉管的数目相对于MI+贴(35根脉管/mm²)和仅MI(15根脉管/mm²)处理组也提高(图4i)。形成对比，假操作动物展现136根脉管/mm²，再次指示贴+FSTL1将血管形成恢复至未梗死小鼠的大约一半水平。而且，平滑肌细胞围绕众多脉管，特别是在MI+贴+FSTL1组中(图4h)。Masson氏三色染色显示贴+FSTL1在宿主心肌上的连续移植，而且展现宿主细胞进入贴的迁移，包括到MI和贴放置之后4周时条纹细胞的证据(绿色箭，图4j中的最后两栏)。

实施例5：在体内FSTL1诱导心肌细胞进入细胞周期

此实施例显示心外膜投递的FSTL1可能具有与FSTL1在心肌中产生的功能不同的功能。

材料和方法

实施例5中使用的方法如本文中描述的那样。

结果

贴+FSTL1队列显示贴内α-辅肌动蛋白⁺，条纹肌细胞的证据(图5a-d)。在FSTL1缺失下在贴中罕见观察到条纹细胞。重要的是，FSTL1引起磷酸-组蛋白H3(Ser10)(pH3)也呈阳性的α-辅肌动蛋白⁺心肌细胞的发生率相对于在仅MI动物中看到的升高6.2倍(自仅MI中的2.5每个横切面(图5i)至MI+贴+FSTL1处理组中的15.6每个切面，p<0.05；图5e-k和图16)，提示FSTL1促进进入S期和DNA复制。通过检测到α-辅肌动蛋白染色细胞之间的AuroraB激酶免疫反应性及共焦光学切面的三维重建中与核DAPI染色的不交叠(图51)，和MI+贴+FSTL1心脏中相对于其它条件显著升高的具有中间体定位的Aurora B激酶的心肌细胞的发生率(图5m)，确认了对中间体(它是该连接分裂中的细胞的瞬时桥)的定位，其提示α-辅肌动蛋白⁺细胞受到诱导而经历胞质分裂。使用PCM1作为心肌细胞核的标志物¹⁷，观察到pH3呈阳性的PCM1+核的发生率的显著升高(图5n，o)。在I/R损害之后贴+FSTL1处理的心脏中在移植之后4周还观察到升高的心肌细胞增殖(图15)。FSTL1对MI之后即刻的心肌细胞凋亡或风险面积，或MI后第4天和第8天时的凋亡和炎症没有影响(图17)，虽然FSTL1已经显示出预防凋亡且可能调控缺血性损害后急性的炎症^12,13,16。

与贴FSTL1投递形成对比，FSTL1-TG小鼠中的边界区带心肌中pH3⁺心肌细胞的数目与野生型对照相比没有增多(图10k，l)，尽管血管形成升高(图10m，n和¹⁶)，指示心外膜投递的FSTL1可能具有与FSTL1在心肌中产生的功能不同的功能。

实施例6：增殖中的FSTL1响应性心肌细胞的起源

此实施例显示FSTL1的糖基化状态与它的功能状态的变化有联系。

材料和方法

新生大鼠心室心肌细胞(NRVC)用新生大鼠心肌细胞分离试剂盒(Cellutron)分离并于37℃及5％CO₂培养。简言之，自1-2日龄Hsd:SD大鼠(Sprague Dawley)解剖心室，然后于37℃用酶混合物消化五次，每次15分钟。合并细胞，在未包被的细胞培养皿上预涂布90分钟以去除成纤维细胞，并以3×10⁵个细胞/cm²在高血清培养基(DME/F12[1:1]，0.2％BSA，3mM丙酮酸钠，0.1mM抗坏血酸，4mg/L运铁蛋白，2mM L-谷氨酰胺，和5mg/L环丙沙星，补充有10％马血清和5％胎牛血清(FBS))中在1％明胶包被的细胞培养塑料皿上涂布。24小时之后，将培养基更换成低血清培养基(相同但有0.25％FCS)并培养细胞直至使用。

自动化体外细胞增殖和细胞死亡测定法：以384板格式将细胞(mCM^ESC和NRVC)与EdU一起温育(图例中规定了暴露的剂量和长度的详情)，在4％PFA中固定2小时，在PBS中清洗并使用Click-it EdU测定法试剂盒(Life Technologies)针对EdU染色。然后将细胞在PBS中清洗，用α-辅肌动蛋白抗体(Sigma，A7811)免疫染色以鉴定心肌细胞及用DAPI(4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)染色以鉴定核。然后如描述的那样³⁷使用InCell 1000System(GEHealthcare)对板成像并在Developer Toolbox(GE Healthcare)中自动分析。对于染色体DNA中掺入EdU的心肌细胞的百分比，生成EdU⁺/α-辅肌动蛋白⁺核和α-辅肌动蛋白⁺核的比率。类似地，以384板格式将细胞(mCM^ESC和NRVC)在4％PFA中固定2小时，在PBS中清洗，并用pH3抗体(Millipore06-570)(针对有丝分裂中的核)，或Aurora B(Millipore 04-1036)(针对胞质分裂)，或TUNEL(Roche)(针对细胞死亡)，和α-辅肌动蛋白抗体(Sigma，A7811)(针对心肌细胞)和DAPI(针对核)进行免疫染色。进行与EdU测定法相同的成像和分析。计算pH3⁺，α-辅肌动蛋白⁺双重阳性核，Aurora B⁺，α-辅肌动蛋白⁺双重阳性细胞，和TUNEL⁺，α-辅肌动蛋白⁺双重阳性核相对于α-辅肌动蛋白⁺细胞核总数的百分比以确定分别正在经历有丝分裂，胞质分裂和凋亡的心肌细胞的百分比。

FSTL1过表达和Western印迹：使用lipofectamine 2000用人FSTL1质粒(GEDharmacon，ID：ccsbBroad304_02639pLX304-Blast-V5-FSTL1)瞬时转染Hek293细胞(用lipofectamine和无质粒进行模拟转染)。转染后48小时，用无血清DMEM更换含有血清的培养基并与细胞一起温育24小时。以2ug/ml使用衣霉素。在16小时期间(细胞看上去是健康的)收集来自衣霉素样品的条件化培养基。将条件化培养基以400g旋转7分钟，然后使用Microcon-10kDa截留柱(Millipore)浓缩大约20倍。将样品以1对1比率与含有蛋白酶抑制剂，DTT和5mM EDTA的2x SDS样品缓冲液组合，于95℃煮沸10分钟并在4-15％丙烯酰胺Mini-Protean TGX凝胶中运行，转移至硝酸纤维素膜并与1:1,000稀释的抗V5一抗MAB15253(Pierce)和1:10,000稀释的800nm缀合的抗小鼠二抗(Odyssey)一起温育。以MOI 50用表达不带标签的小鼠FSTL1的腺病毒感染新生大鼠心室心肌细胞。感染后24小时，用无血清培养基更换培养培养基。用受到感染的NRVC和EMC细胞将无血清DMEM/F12青霉素/链霉素培养基条件化24小时。以1ug/ml使用衣霉素并将培养基条件化16小时。将条件化培养基以400g旋转7分钟，然后使用Microcon-10kDa截留柱(Millipore)浓缩。以1对1比率将样品与含有蛋白酶抑制剂，DTT和5mM EDTA的2x SDS样品缓冲液组合，于95℃煮沸10分钟并在AnyKD Mini-Protean TGX凝胶中运行，转移至硝酸纤维素膜并与1:500稀释的抗FSTL1MAB1694(R&D)一抗和1:10,000稀释的800nm缀合的抗大鼠二抗(Odyssey)一起温育。在OdysseyBlocker中进行封闭和抗体温育。以相同方式实施针对重组FSTL1(各100ng)的Western印迹。

心肌细胞谱系标记：心肌细胞谱系标记是如下实现的，即以20mg每kg每天的剂量将4-OH他莫昔芬腹膜内注射入8周龄C57BL6背景的Myh6^mERCremER:Rosa26^Z/EG小鼠¹⁸，持续2周，停止1周之后收获心肌细胞(图5p)，或进行MI手术和贴移植。MI之后4周，收集动物进行免疫染色(图5q-u)。

结果

在体内，受到FSTL1诱导而进入细胞周期的心肌细胞可能源自预先存在的肌细胞(Myh6⁺细胞)或从头源自祖先群体。为了区分这些可能性，使用心肌细胞特异性Myh6启动子¹⁸控制下的他莫昔芬可诱导的Cre可遗传地标记预先存在的Myh6⁺心肌细胞并在MI和贴+FSTL1移植之后跟踪它们的命运(图5p)。注射入Myh6^mERCremER:Rosa26^Z/EG小鼠的4-OH他莫昔芬有效标记在MI前具有eGFP的预先存在的心肌细胞(图5q)。在贴移植之后4周，eGFP⁺，pH3⁺细胞在梗死区域和边界区带中清楚可见(图5r-u)，指示贴+FSTL1作用于在LAD结扎和贴移植前表达Myh6的细胞。

处于周期中的α-辅肌动蛋白⁺细胞的来源是什么？成年心肌细胞一般难以进入细胞周期，而且FSTL1在体外并不促进成年或新生鼠心室心肌细胞的DNA复制或细胞分裂(图18a-j)。类似地，FSTL1并不刺激自成年鼠心脏增殖或分化能在再植入成年心脏中时形成心肌细胞的克隆扩充的原代心肌发生性祖细胞(Lin^-，Sca1⁺，SP⁺)¹⁹(图18k-m)。与之形成对比，通过提高5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EdU)掺入α-辅肌动蛋白⁺mCM^ESC(图6a，d)，提高pH3⁺，α-辅肌动蛋白⁺细胞的数目(图6b，e)和卵裂沟/中间体局部化Aurora B激酶(图6c，f)，mCM^ESC细胞以剂量依赖性方式响应FSTL1。与显示Myh6⁺细胞在体内在贴+FSTL1处理之后增殖的谱系追踪结果(图5p-u)组合，这些结果提示位于心外膜近侧，具有响应心外膜FSTL1而增殖的能力的Myh6⁺/α-辅肌动蛋白⁺细胞的存在。

然而，仍然反常的是FSTL1表达的内源心肌诱导和FSTL1的直接转基因过表达均不能激活再生(图4，图10)。如此，鉴于我们先前的实验均是使用细菌合成的人FSTL1实施的，测试FSTL1的细胞特异性修饰是否牵涉其中，特别重要(图4，5，6a-f)。FSTL1在哺乳动物细胞中是高度糖基化的(图6g)，而细菌中生成的重组FSTL1并非如此(图6h)。因此在凋亡和增殖测定法中在mCM^ESC细胞上测试细菌(裸的)和哺乳动物(糖基化的)细胞中生成的重组FSTL1的功能。哺乳动物表达的人FSTL1保护mCM^ESC免于H₂O₂诱导的凋亡，而细菌表达的FSTL1并非如此(图6i)。相反，细菌表达的人FSTL1促进mCM^ESC增殖，而哺乳动物表达的人FSTL1并非如此(图6j，k)，因而，这些关键功能差异与FSTL1糖基化状态有关联。还比较了新生大鼠心室心肌细胞(NRVC)中过表达的FSTL1–NRVC不生成可检测量的内源FSTL1(图19)–与EMC-心外膜细胞中表达的内源FSTL1。Western印迹分析指示心肌和心外膜形式的FSTL1之间显著的尺寸差异，随衣霉素处理(糖基化的抑制剂)“消失”的差异(图6i)，提示FSTL1以细胞特异性方式受到转录后修饰(糖基化)。随后，在增殖测定法中在mCM^ESC上在功能上测试心肌和心外膜细胞中生成的这些Fstl形式。来自用不带标签的FSTL1腺病毒感染的NRVC的心肌条件化培养基显示对mCM^ESC增殖没有影响。与之形成对比，EMC条件化培养基以低糖基化的FSTL1依赖性方式显著促进mCM^ESC增殖(图6m，n)，其程度与细菌合成的hFSTL1相当，证明细胞特异性转录后修饰与FSTL1功能状态的变化有联系。

实施例7：心外膜FSTL1投递在临床前猪模型中激活心脏再生。

此实施例显示贴+FSTL1投递在心外膜中的恢复效果似乎是进化上保守的。

材料和方法

在缺血-再灌注的猪模型中应用贴：如下实施猪研究，在约克郡猪(45日龄)中通过经皮冠状动脉血管成形术扩张导管的膨胀来闭塞LAD。闭塞时间90分钟后是完全再灌注以模拟临床MI疾病模型。在MI之后1周，实施左胸廓切开术并将贴缝合到梗死上。动物组包括：假对照，无处理的I/R治疗(n＝3)，用单独的贴处理的I/R(I/R+贴，n＝1)，和用加载FSTL1的贴处理的I/R(I/R+贴+FSTL1，n＝2)。EdU投递：使用渗透迷你泵在研究的4周时间过程(I/R后第1周至第5周)期间将250mg/wk EdU灌输入循环中。

统计分析：此实施例和所有其它实施例中使用的样品的数目(n)在正文中有记录，在图中有显示。所有体外实验独立进行至少两次。基因表达实验独立进行3次，而EdU增殖测定法和细胞尺寸测量独立进行超过10次。没有预先确定样品量，使用Gpower 3.1对大多数体外研究中的显著差异结果进行的回顾性分析产生>0.8的效力。评估动物研究的样品量。在手术之后存活没有达到4周的动物排除在功能和组织学研究以外。没有应用随机化。在小鼠心肌梗死实验的动物手术和结果分析之间实行对组分配不知情。所呈现的值表述为均值±SEM。使用均值±SEM代替SD的原理在于SEM量化均值评估的不确定性，而SD指示数据自均值的离差。换言之，SEM提供所报告均值数值的评估，而SD给出单次观察结果的变异性的概念。使用单因素ANOVA和Student T检验来检验统计学显著性(P<0.05)。使用PRISM(GraphPad)生成存活曲线并使用时序(Mantel-Cox)检验来检验不同条件中的小鼠的存活之间的显著差异。

结果

在心肌缺血-再灌注损害的猪模型中评估FSTL1的工程化心外膜投递。在梗死前，射血分数(EF)为～50％，如通过磁共振成像(MRI)测定的。在I/R之后1周，EF％降低至～30％，在此之后将贴+FSTL1应用于受损害的组织的心外膜。用贴+FSTL1处理的猪到处理第2周(实验第3周)恢复收缩性，实现大约40％的EF，并保持稳定达2周，所分析的最长时间(图7a，b)。这与无处理动物和用单独的贴处理的动物中心脏功能的稳定下降形成对比(图7b)。贴+FSTL1处理的猪展现包括仅贴动物在内的所有处理中最低的纤维化组织形成含量(瘢痕尺寸)(见代表性MRI图像(图7c，d))。在贴移植后第4周(实验第5周)分析时，猪组织显示贴整合入宿主组织中和有限的纤维化(图7e)及缺血区域的边界区带中血管平滑肌细胞(图7f-h)和心肌细胞(图7i-m)的EdU标记。还在贴+FSTL1处理的心脏的边界区带中检测到具有中间体局部化Aurora B激酶(指示胞质分裂)的心肌细胞(图7n)。如此，贴+FSTL1投递在心外膜中的恢复效果似乎是进化上保守的。

实施例8：低糖基化的FSTL1的施用并不激活Akt-1信号传导活性

此实施例显示用FSTL1处理mCM^ESC并不导致Akt-1的激活。

如上文描述的那样实施用FSTL1处理mCM^ESC以及磷酸-Akt的Western印迹。

结果显示于图20，其描绘了FSTL1处理之后mCM^ESC中的磷酸-Akt和PCNA检测。10ng/ml和50ng/ml FSTL1处理1小时和24小时之后针对磷酸-Akt(Ser473和Thr308，二者均牵涉心肌细胞中的存活应答)和PCNA(增殖标志物)的Western印迹在FSTL1处理后磷酸-Akt或PCNA均没有产生显著变化。

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Claims (72)

1.一种用于在有所需要的受试者中在损害后修复心脏组织的方法，该方法包括使该心脏组织与低糖基化的卵泡抑素样1(FSTL1)多肽接触。

2.权利要求1的方法，其中该损害是缺血再灌注心脏损害，是由于缺血性心脏疾病，和/或是由于心脏发育不良。

3.权利要求1的方法，其中该损害是心肌梗死和/或该心脏含有瘢痕组织。

4.权利要求1-3任一项的方法，其中修复心脏组织包含增加该心脏组织中心肌细胞的数目。

5.权利要求1-3任一项的方法，其中修复心脏组织包含升高的损伤的心脏组织，包括心肌细胞和/或心脏脉管系统的恢复。

6.权利要求4或5的方法，其中心肌细胞的数目与在损害后未接触心外膜衍生的旁分泌因子的心脏组织中心肌细胞的数目相比增加至少三倍。

7.权利要求1-5任一项的方法，其中修复心脏组织包含与在损害后未接触心外膜衍生的旁分泌因子的心脏组织中缩短百分比分数的量相比改善的心脏组织的缩短百分比分数。

8.权利要求1-5任一项的方法，其中修复心脏组织包含瘢痕面积(纤维化)与在损害后在通过心外膜衍生的旁分泌因子的接触，投递或基因组编辑治疗前相同心脏中纤维化的量相比缩小至少2％。

9.权利要求1-5任一项的方法，其中修复心脏组织包含血管灌注面积与在损害后在通过心外膜衍生的旁分泌因子的接触，投递或基因组编辑治疗前相同心脏中灌注面积的量相比增大至少2％。

10.权利要求1-5任一项的方法，其中修复心脏组织包含该心脏组织中心肌细胞胞质分裂的量与在损害后未接触心外膜衍生的旁分泌因子的心脏组织中心肌细胞胞质分裂的量相比增多。

11.权利要求10的方法，其中心肌细胞胞质分裂的量的增多是通过Aurora B激酶的表达测定的。

12.权利要求1-12任一项的方法，其中修复心脏组织包含降低的心肌细胞凋亡。

13.权利要求1-12任一项的方法，其中所述方法导致心肌细胞中编码心脏特异性收缩蛋白质的转录物的水平升高。

14.权利要求13的方法，其中所述方法导致心肌细胞中编码心脏特异性收缩蛋白质的转录物的水平升高2倍。

15.权利要求13或权利要求14的方法，其中该心脏特异性收缩蛋白质选自由myh6，mlc2v，和mlc2a组成的组。

16.权利要求1-10任一项的方法，其中所述方法导致心肌细胞中具有节律性可收缩Ca²⁺的辅肌动蛋白⁺细胞增多。

17.权利要求1-11任一项的方法，其中在该损害后立即使该心脏组织与所述心外膜衍生的旁分泌因子接触。

18.权利要求1-12任一项的方法，其中在该损害之后的任何时间使该心脏组织与所述心外膜衍生的旁分泌因子接触。

19.权利要求1-13任一项的方法，其中所述方法减少心脏事件和住院治疗。

20.权利要求1-15任一项的方法，其中所述方法削弱在该损害后该心脏组织中的纤维化。

21.权利要求2或权利要求3的方法，其中所述方法导致该心脏组织的受损害区域的血管形成升高。

22.权利要求21的方法，其中所述升高的血管形成是通过血管细胞中von Willebrand因子(vWF)或平滑肌肌动蛋白的表达测定的。

23.权利要求1-22任一项的方法，其中所述方法诱导心肌细胞进入细胞周期。

24.权利要求23的方法，其中所述心肌细胞进入细胞周期是通过磷酸-组蛋白H3的表达评估的。

25.权利要求23或权利要求24的方法，其中所述方法导致心肌细胞进入细胞周期与在损害后未接触心外膜衍生的旁分泌因子的心脏组织中心肌细胞进入细胞周期的量相比升高至少2倍。

26.权利要求1的方法，其中所述低糖基化的FSTL1多肽是在原核细胞中合成的。

27.权利要求1的方法，其中所述低糖基化的FSTL1多肽是在用糖基化的抑制剂处理的真核细胞中合成的。

28.权利要求1的方法，其中该低糖基化的FSTL1多肽是通过将一个或多个糖基化的氨基酸用一个或多个糖基化无能力的氨基酸替代而生成的。

29.权利要求1的方法，其中所述一个或多个糖基化的氨基酸选自由N144，N175，N180，和N223组成的组。

30.权利要求26-28任一项的方法，其中所述低糖基化的FSTL1多肽修复心脏组织。

31.权利要求26-28任一项的方法，其中所述低糖基化的FSTL1保护心肌细胞免于损害后的凋亡。

32.权利要求1-31任一项的方法，其中该低糖基化的FSTL1多肽通过胶原贴投递入受损害的心肌组织中。

33.权利要求1-31任一项的方法，其中该低糖基化的FSTL1多肽直接注射入受损害的心肌组织中。

34.权利要求1-31任一项的方法，其中系统投递该低糖基化的FSTL1多肽。

35.权利要求1-31任一项的方法，其中心脏内投递该低糖基化的FSTL1多肽。

36.权利要求35的方法，其中该心脏内投递经由导管。

37.权利要求1-31任一项的方法，其中导管心外膜投递该低糖基化的FSTL1多肽。

38.权利要求1-31任一项的方法，其中使用药物洗脱支架导管投递该低糖基化的FSTL1多肽。

39.权利要求1-38任一项的方法，其中该低糖基化的FSTL1多肽包埋或接种入三维胶原贴中。

40.权利要求1-39任一项的方法，其中自心外膜部位，心脏内部位，和/或经由直接注射入心肌中的一项或多项接触该心脏组织。

41.权利要求1-31任一项的方法，其中该低糖基化的FSTL1多肽是在该心脏中通过使用经过修饰的dRNA(modRNA)表达的。

42.权利要求1-31的任一项的方法，其中该低糖基化的FSTL1多肽是通过基因组编辑表达的。

43.一种用于在有所需要的受试者中在损害后修复心脏组织的方法，该方法包括使该心脏组织与心外膜衍生的旁分泌因子接触。

44.一种无菌药物组合物，其包含低糖基化的卵泡抑素样1(FSTL1)多肽和一种或多种药学可接受赋形剂。

45.权利要求44的无菌药物组合物，其进一步包含FSTL1糖基化的抑制剂。

46.权利要求45的无菌药物组合物，其中所述FSTL1糖基化的抑制剂包含衣霉素。

47.权利要求44的无菌药物组合物，其中所述低糖基化的FSTL1多肽是在原核细胞中合成的。

48.权利要求47的无菌药物组合物，其中所述原核细胞是细菌细胞。

49.权利要求44的无菌药物组合物，其中所述低糖基化的FSTL1多肽是在用糖基化的抑制剂处理的真核细胞中合成的。

50.权利要求49的无菌药物组合物，其中所述糖基化的抑制剂是衣霉素。

51.权利要求44-50任一项的无菌药物组合物，其中该组合物配制用于直接注射入受损害的心脏组织中。

52.权利要求44-50任一项的无菌药物组合物，其中该组合物配制用于系统施用。

53.权利要求44的无菌药物组合物，其中该低糖基化的FSTL1多肽是在包含经过修饰的RNA(modRNA)的细胞中合成的。

54.权利要求44的无菌药物组合物，其中该低糖基化的FSTL1多肽是通过基因组编辑表达的。

55.权利要求44-54任一项的无菌药物组合物，其中该低糖基化的FSTL1多肽包埋或接种入三维(3D)胶原贴中。

56.权利要求55的无菌药物组合物，其中该3D胶原贴具有12±4kPa的弹性模数。

57.一种试剂盒，其包含(i)低糖基化的卵泡抑素样1(FSTL1)多肽；和(ii)一种或多种药学可接受赋形剂。

58.权利要求57的试剂盒，其进一步包含(iii)三维(3D)胶原贴。

59.权利要求57或58的试剂盒，其中该低糖基化的FSTL1多肽包埋或接种入三维(3D)胶原贴中。

60.权利要求57或58的试剂盒，其中该3D胶原贴具有12±4kPa的弹性模数。

61.权利要求57-60任一项的试剂盒，其进一步包含(iv)用于将该3D胶原贴粘附至受损害的心脏的心外膜或心肌的粘附手段。

62.权利要求61的试剂盒，其中所述粘附手段是缝合线。

63.一种用于在有所需要的受试者中在损害后修复心脏组织的方法，该方法包括使该心脏组织或心外膜与接种或灌输有重组低糖基化的卵泡抑素样1(FSTL1)多肽的三维(3D)胶原贴接触。

64.权利要求63的方法，其中该损害是缺血再灌注损害。

65.权利要求63的方法，其中该损害是心肌梗死。

66.权利要求63-65任一项的方法，其中该3D胶原贴缝合至该心脏组织或心外膜。

67.一种三维(3D)胶原贴，其灌输或接种有重组低糖基化的卵泡抑素样1(FSTL1)多肽。

68.权利要求67的胶原贴，其中所述重组低糖基化的FSTL1多肽是在原核细胞中合成的。

69.权利要求68的胶原贴，其中所述原核细胞是细菌细胞。

70.权利要求67的胶原贴，其中所述重组低糖基化的FSTL1多肽是在用糖基化的抑制剂处理的真核细胞中合成的。

71.权利要求70的胶原贴，其中所述糖基化的抑制剂是衣霉素。

72.权利要求67-71任一项的胶原贴，其中该3D胶原贴具有12±4kPa的弹性模数。