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CN108588200A - 一种R-Loop高通量测序文库构建方法 - Google Patents

一种R-Loop高通量测序文库构建方法 Download PDF

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CN108588200A CN201810423700.XA CN201810423700A CN108588200A CN 108588200 A CN108588200 A CN 108588200A CN 201810423700 A CN201810423700 A CN 201810423700A CN 108588200 A CN108588200 A CN 108588200A
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秦闯华
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徐根明
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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种R‑Loop高通量测序文库构建方法。通过单链DNA建库的DNA/RNA杂合链免疫共沉淀及高通量测序技术，可以特异性的对基因组中DNA/RNA杂合链进行捕获和富集并进行文库构建，具有精准、高效、灵敏、重复性好，操作简单等优点。

Description

一种R-Loop高通量测序文库构建方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种R-Loop高通量测序文库构建方法。
背景技术
R-loop，是指当一条RNA分子与其双链DNA分子中的一条互补链配对，同时将另一条DNA链排除而形成的环状结构。R-loop是一种特殊的三链核酸结构，由一条RNA/DNA杂合链和一条单链DNA所组成。目前越来越多的证据发现这种独特的染色质结构在原核和真核生物中普遍存在，在很多关键的生物学过程中发挥重要功能，包括染色质修饰、转录调控、DNA损伤修复以及基因组稳定性等。
近年来已在多种生物体中发现稳定存在的R-loop结构，并且越来越多研究表明R-loop的积累与许多人类疾病有关，例如神经变性疾病，核苷酸扩增疾病以及癌症等。R-loop的清除受多种因素调节，其中核糖核酸酶RNase H可以特异地清除DNA/RNA杂合链中的RNA，是去除R-loop结构的主要因子之一。
已有的R-Loop全基因组检测方法存在严重的技术缺陷，其数据质量不佳，对结果产生不可忽视的影响。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种R-Loop高通量测序文库构建方法，通过单链DNA建库的DNA/RNA杂合链免疫共沉淀及高通量测序技术，可以特异性的对基因组中DNA/RNA杂合链进行捕获和富集并进行文库构建，具有精准，高效，灵敏，重复性好，操作简单等优点。
本发明的R-Loop高通量测序文库构建方法，按照以下步骤进行：
(1)提取基因组DNA对其进行片段化处理；
(2)在步骤(1)后加入磁珠进行片段化产物纯化；
(3)在步骤(2)后加入捕获磁珠，特异性捕获DNA-RNA杂合链；
(4)在步骤(3)后加入磁珠进行捕获产物纯化；
(5)在步骤(4)后加入酶1反应体系，进行末端修复；
(6)在步骤(5)后加入酶2反应体系，进行接头连接反应；
(7)在步骤(6)后加入磁珠进行接头连接产物纯化；
(8)在步骤(7)后加入PCR扩增体系，进行文库的放大；
(9)在步骤(8)后加入磁珠对扩增后的文库进行纯化，纯化后的产物即为上机文库。
其中所述的片段化采用物理法或酶法，提取的基因组DNA含量至少为50ng，将基因组DNA打断成200-500bp。
所述的捕获磁珠包含三个部分，分别是[S9.6]Antibody，Protein A和特异性修饰的磁珠，其中磁珠表面特异性修饰的基团可以和Protein A紧密结合。
所述的酶1体系包含T4PNK，T4DNA Polymerase，dNTP和T4DNA ligase Buffer，末端修复条件是37℃，30min后72℃，20min。
所述的酶2反应体系包含T4DNA ligase，T4DNA ligase Buffer，PEG6000和RNAAdapter，接头连接反应条件是20℃，15min；65℃，10min；所述接头包括Universal Adapter和RNA Adapter，其中Universal Adapter即为P5端接头，包括P5结合序列和Read1阅读序列，RNA Adapter即为P7端接头，包括P7结合序列，Index序列和Read2阅读序列。
所述的扩增体系包含缓冲液，DNA聚合酶，dNTPs以及一对上下游引物，上游引物P5，是文库P5端接头特异性引物序列，下游引物P7，是文库P7端接头特异性引物序列。
所述的文库大小为400-500bp。
所述的上机文库适用于Roche、Illumina、ThermoFisher、Pacific Biosciences、华大基因、Oxford Nanopore Technologies、华因康、瀚海基因高通量测序平台。
与现有技术相比，本发明的特点和有益效果是：
本发明提供了一种R-Loop文库构建方法，在建库过程中，控制反应各试剂组分的用量以及反应温度和时间，采用特别的Enzyme 1和Buffer 1，Enzyme 2和Buffer 2的配方，并设计各引物的碱基序列，包括Universal Adapter，RNA Adapter，P5和P7。
本发明R-Loop文库构建方法构建的文库质量更高，数据更佳，适应于不同的物种和多种样本类型，具有精准，高效，灵敏，重复性好，操作简单等优点，有利于实现自动化操作和大规模文库集中构建，提供的建库方法，可以用于不同类型的测序平台，适用性广，易于推广。
附图说明
图1是本发明的建立R-Loop高通量测序文库的原理图；
图2是本发明的建立R-Loop高通量测序文库的流程图；
图3是2％琼脂糖凝胶电泳检测文库图；
其中：M:100bp DNA ladder(宝生物工程(大连)有限公司)；1:R-loop文库。
具体实施方式
现以Illumina平台为例，结合实施例对本发明进一步说明。
本实施例中涉及的核苷酸序列如序列表所示。
实施例1：
本实施例的基于单链DNA构建R-loop高通量测序文库的方法，按照以下步骤进行：
Universal Adapter核酸序列如序列表序列1所示，为：
5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCG
ATCT-3’；
RNA Adapter核酸序列如序列表序列2所示为：
5'-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'；
P5核酸序列如序列表序列3所示为：5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3'；
P7核酸序列如序列表序列4所示为：5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3'。
(1)提取乳腺癌患者癌变组织基因组DNA进行片段化处理；
按照血液/组织/细胞基因组提取试剂盒提取步骤进行该患者癌变组织基因组的提取(天根，货号：DP304)；对提取的基因组进行片段化处理，打断到200-500bp；
(2)在步骤(1)后加入磁珠进行片段化产物纯化；
用NF-H2O将片段化产物补足至50μL，加入90μL AMPure XP beads，混匀并室温静置5min。反应管置于磁力架上，静置3-5min。弃上清，加200μL 80％乙醇进行洗脱，重复2～3次，用70μL NF-H2O进行洗脱；
(3)在步骤(2)后加入捕获磁珠，特异性捕获DNA-RNA杂合链；
在步骤(2)洗脱产物中，加入10μL预处理的[S9.6]/Protein A磁珠，NF-H2O补至100μL，室温混匀20min。磁吸后，去上清，用1mL 1X Bind/Wash Buffer清洗三次，30μL NF-H2O洗脱，65℃孵育15min，磁吸后，转移上清，即为捕获的DNA-RNA杂合链；
(4)在步骤(3)后加入磁珠进行捕获产物纯化；
步骤(3)反应结束后，用NF-H2O将捕获产物补足至50μL，加入90μL AMPure XPbeads，混匀并室温静置5min。反应管置于磁力架上，静置3-5min。弃上清，加200μL 80％乙醇进行洗脱，重复2～3次，用30μL NF-H2O进行洗脱；
(5)在步骤(4)后加入酶1反应体系，进行末端修复；
配制表1反应体系。混匀，热循环仪中37℃反应30min，72℃反应20min。结束后立即进行下一步操作。
表1末端修复反应体系
组分 体积(μL)
上步产物 30
Buffer 1 7
Enzyme 1 2
NF-H2O 11
(6)在步骤(5)后加入酶2反应体系，进行接头连接反应；
配制表2反应体系。混匀，热循环仪中20℃反应15min，65℃反应10min。结束后立即进行下一步操作。
表2接头连接反应体系
组分 体积(μL)
上步产物 50
RNA Adapter 2
Buffer 2 27
Enzyme 2 1
(7)在步骤(6)后加入磁珠进行接头连接产物纯化；
步骤(6)反应结束后，加入30μL AMPure XP beads，混匀并室温静置5min。反应管置于磁力架上，静置3-5min。弃上清，加200μL 80％乙醇进行洗脱，重复2～3次，用50μL NF-H2O进行洗脱，紧接着用1X XP beads纯化，用23μL NF-H2O进行洗脱；
(8)在步骤(7)后加入PCR扩增体系，进行文库的放大；
按表3配制反应体系，按下面程序进行文库扩增。
表3 PCR反应体系
组分 体积(μL)
上步产物 23
2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix 25
P5 1
P7 1
PCR扩增程序：
(9)在步骤(8)后加入磁珠对扩增后的文库进行纯化，纯化后的产物即为上机文库。
步骤(8)反应结束后，用10mM Tris-HCl将捕获产物补足至50μL，加入45μL AMPureXP beads，混匀并室温静置5min。反应管置于磁力架上，静置3-5min。弃上清，加200μL 80％乙醇进行洗脱，重复2～3次，用25μL DB进行洗脱，纯化后的产物即为上机文库。
对上机文库进行qPCR质检：
按照KAPA Library Quantifcation Kit(Kapabiosystems,Cat No.KK4854)说明书进行操作，使用Roche Light Cycler 480实时荧光定量PCR仪检测，参照试剂盒里的标准品进行文库浓度的绝对定量。
qPCR定量分析结果如表4所示：
表4 qPCR检测结果
样品 qPCR浓度(nM)
R-Loop文库 112
构建的文库达到上机要求浓度，可用于上机测序。
对上机文库进行上机测序：
按照NextSeq测序仪操作流程进行文库变性、稀释以及测序，结果如表5所示。
表5测序数据质控
对上机文库进行电泳检测分析：电泳分析结果如图3所示，文库主带清楚且主要分布在450bp左右，条带亮度明亮，与预期结果一致。
实施例2
本实施例通过PCR和一代测序的方法，对[S9.6]捕获产物中的RNA进行扩增和测序并与建库测序结果作对比，以验证实施例1的测序结果。
(1)对实施例1中[S9.6]捕获产物进行DNaseⅠ消化处理；
(2)随机选取实施例1中测序结果的2个reads，依次是RL1，RL2；
详细序列如下所示：
RL1序列如序列表序列5所示：
5’-GGGCGGCCGAGGGAGAGGGGAGGGGGCGGCCTCACCTGCGCCACTGCGATGCCCGCCGCCGCCGCCGCCGAGTCATTATCTCGGGCGGAAGCGAGAAGGGCGGCGAGGGAGGGGGTGGAAGCCCGCAGAGACAAGGGTGGGGATGGATCGC-3’
RL2序列如序列表序列6所示：
5’-GACGGAGCAGAGACACGGGACGGGGCAGAGACACGGGACGGAGCAGAGACACGGGACGGAGCAGAGACACGGGGGACGGAGGAGAGACAGGGGGGACGGAAGAGAGACGCGGGGCGGGGCAGAGACCGGGGACGGAGCAGAGACACGGGAC-3’；
(3)根据其核酸序列，分别设计上下游引物，依次命名F-RL1和R-RL1，F-RL2和R-RL2；
详细序列如下所示：
F-RL1如序列表序列7所示：5’-GCCGCCGAGTCATTATCT-3’
R-RL1如序列表序列8所示：5’-ATCCATCCCCACCCTTGT-3’
F-RL2如序列表序列9所示：5’-AGACACGGGACGGGGCAGAG-3’
R-RL2如序列表序列10所示：5’-GTCTCTGCTCCGTCCCGTGTCT-3’；
(4)分别采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(ThermoFisher，货号：K1622)和AmpliTaq Gold 360DNA Polymerase(Applied Biosystems，货号：4398892)进行cDNA合成和PCR反应。
对扩增结果进行一代测序并分析。
R-Loop建库测序结果和RNA扩增一代测序结果的比较。
表6核酸序列比对结果
名称 RL1 RL2
比对数 100％ 100％
结果显示R-Loop建库测序数据随机2个reads对应的序列和RNA扩增一代测序测得的序列比对数均100％，由此说明本发明构建的R-Loop文库的准确性。
本发明R-Loop文库构建方法和市面常见R-Loop文库构建方法对比如表7所示，
表7测序数据质控
建库方法 常见R-Loop建库法 本发明R-Loop建库法
开盖次数 20 13
转管次数 8 5
实验步骤 8 5
实验用时(h) 6.5 4.5
实验成本 高 低
从表7对比结果可知，本发明R-Loop建库法既简化了实验操作流程和步骤，又缩短了时间，节省了人力成本，同时也可避免样本间污染和样本混样，降低因建库流程复杂引发错误操作风险，提高实验结果的可重复性和准确性。

Claims (8)

1.一种R-Loop高通量测序文库构建方法，其特征在于按照以下步骤进行：
(1)提取基因组DNA对其进行片段化处理；
(2)在步骤(1)后加入磁珠进行片段化产物纯化；
(3)在步骤(2)后加入捕获磁珠，特异性捕获DNA-RNA杂合链；
(4)在步骤(3)后加入磁珠进行捕获产物纯化；
(5)在步骤(4)后加入酶1反应体系，进行末端修复；
(6)在步骤(5)后加入酶2反应体系，进行接头连接反应；
(7)在步骤(6)后加入磁珠进行接头连接产物纯化；
(8)在步骤(7)后加入PCR扩增体系，进行文库的放大；
(9)在步骤(8)后加入磁珠对扩增后的文库进行纯化，纯化后的产物即为上机文库。
2.根据权利要求1所述的一种R-Loop高通量测序文库构建方法，其特征在于所述的片段化采用物理法或酶法，提取的基因组DNA含量至少为50ng，将基因组DNA打断成200-500bp。
3.根据权利要求1所述的一种R-Loop高通量测序文库构建方法，其特征在于所述的捕获磁珠包含三个部分，分别是[S9.6]Antibody，Protein A和特异性修饰的磁珠，其中磁珠表面特异性修饰的基团可以和Protein A紧密结合。
4.根据权利要求1所述的一种R-Loop高通量测序文库构建方法，其特征在于所述的酶1体系包含T4 PNK，T4 DNA Polymerase，dNTP和T4 DNA ligase Buffer，末端修复条件是37℃，30min后72℃，20min。
5.根据权利要求1所述的一种R-Loop高通量测序文库构建方法，其特征在于所述的酶2反应体系包含T4 DNA ligase，T4 DNA ligase Buffer，PEG6000和RNA Adapter，接头连接反应条件是20℃，15min；65℃，10min；所述接头包括Universal Adapter和RNA Adapter，其中Universal Adapter即为P5端接头，包括P5结合序列和Read1阅读序列，RNA Adapter即为P7端接头，包括P7结合序列，Index序列和Read2阅读序列。
6.根据权利要求1所述的一种R-Loop高通量测序文库构建方法，其特征在于所述的扩增体系包含缓冲液，DNA聚合酶，dNTPs以及一对上下游引物，上游引物P5，是文库P5端接头特异性引物序列，下游引物P7，是文库P7端接头特异性引物序列。
7.根据权利要求1所述的一种R-Loop高通量测序文库构建方法，其特征在于所述的文库大小为400-500bp。
8.根据权利要求1所述的一种R-Loop高通量测序文库构建方法，其特征在于所述的上机文库适用于Roche、Illumina、ThermoFisher、Pacific Biosciences、华大基因、OxfordNanopore Technologies、华因康、瀚海基因高通量测序平台。
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