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CN108588003B - 一种建立昆虫细胞系的方法 - Google Patents

一种建立昆虫细胞系的方法 Download PDF

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CN108588003B CN201810390678.3A CN201810390678A CN108588003B CN 108588003 B CN108588003 B CN 108588003B CN 201810390678 A CN201810390678 A CN 201810390678A CN 108588003 B CN108588003 B CN 108588003B
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Abstract

本发明提供了一种建立昆虫细胞系的方法，所述方法包括以下步骤：1)在昆虫细胞培养液中培养昆虫组织，以获得分散的原代昆虫细胞；2)物理性低氧诱导或化学性低氧诱导步骤1)所获得的原代细胞；3)半量更换昆虫细胞培养液后，对步骤2)的原代细胞进行复氧，直至观察到细胞不断增殖布满整个瓶底；所述复氧条件为：在25‑28℃、复氧诱导10‑30天；4)传代培养步骤3)获得的细胞，获得能够连续传代的细胞，从而建立昆虫细胞系；整个过程都是在无菌条件下进行。与现有技术相比，本发明的方法显著提升了昆虫原代细胞建系成功率以及缩短了昆虫建系前所需的培养时间。

Description

一种建立昆虫细胞系的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种建立昆虫细胞系的方法，具体地，本发明涉及通过低氧-复氧诱导促进原代昆虫细胞转化，从而建立昆虫细胞系的方法。
背景技术
昆虫是世界上种类最多的生物群体，有着丰富的细胞遗传学系统。在农业、医学、生物学等领域中，昆虫细胞系的使用越来越普遍。昆虫细胞系是生理学、发育生物学、细胞生物学、分子生物学、生物化学和遗传学等学科的重要研究工具；作为昆虫细胞/杆状病毒表达载体中的一部分，可以表达具有重大经济价值和科学意义的重组蛋白质，用于生物杀虫剂的合成以及作为研究细胞自噬等的模型。
昆虫细胞系近年来虽然得到了很大的发展，但是大部分细胞系的建立都是依靠体外培养的细胞自发发生转化形成，并且在长期的培养过程中容易因污染而导致建系失败。虽然，也有少部分人工诱导体外培养细胞转化获得昆虫细胞系的一种重要手段，包括：化学(MNNG等诱变剂)、物理(射线)、生物(病毒)等，但此类方法具有随机性和建系成功率低等缺点。
因此，当前对高效、快速地建立昆虫细胞系的方法存在需求。
发明内容
基于此，本发明的目的是针对当前传统的建立昆虫细胞系的方法费时费力、成功率较低的不足，提供一种高效、快速地建立昆虫细胞系的方法。本发明提供的方法可快速诱导细胞转化，可操作性强，简单易行，细胞转化效率显著高于通常采用的自然转化方法。
一方面，本发明提供了一种建立昆虫细胞系的方法，所述方法包括以下步骤：
1)在昆虫细胞培养液中培养昆虫组织，以获得分散的原代昆虫细胞；
2)物理性低氧诱导或化学性低氧诱导步骤1)所获得的原代细胞；
所述物理性低氧诱导的条件为：
25-28℃，0.5-10％的氧气浓度下诱导3-15天；
所述化学性低氧诱导的条件为：
25-28℃，诱导3h～48h；
3)半量更换昆虫细胞培养液后，对步骤2)的原代细胞进行复氧，直至观察到细胞不断增殖布满整个瓶底；
所述复氧条件为：
在25-28℃、通入空气诱导10-30天；
4)传代培养步骤3)获得的细胞，获得能够连续传代的细胞，从而建立昆虫细胞系；
整个过程都是在无菌条件下进行。
优选地，所述昆虫组织来自鳞翅目和双翅目的昆虫；优选地，所述昆虫组织选自所述昆虫的卵巢组织、精巢组织、胚胎组织、成虫盘组织、血细胞组织、中肠组织或脂肪体组织中的一种或多种；
更优选地，所述昆虫组织为甜菜夜蛾蛹的卵巢组织或斜纹夜蛾蛹的卵巢组织。
优选地，所述步骤1)包括以下步骤：
解剖昆虫组织，置于含有昆虫细胞培养液的带透气瓶盖的培养瓶中，于27℃培养，以获得分散的原代昆虫细胞；
更优选地，所述步骤1)是通过包括以下步骤的方法完成：
1.1将昆虫表面消毒，用无菌蒸馏水清洗昆虫后，再吸干昆虫表面的水分；
优选地，所述表面消毒为将昆虫浸没在2-4％(体积比)的次氯酸溶液中4-6分钟，然后在75％(体积比)的乙醇溶液中浸没10-20分钟；
更优选地，所述表面消毒为将昆虫浸没在3％(体积比)的次氯酸溶液中5分钟，然后在75％(体积比)的乙醇溶液中浸没15分钟；
优选地，所述昆虫选自鳞翅目和双翅目的昆虫；
1.2解剖昆虫，取出昆虫的组织；
优选地，所述组织为所述昆虫的卵巢组织、精巢组织、胚胎组织、成虫盘组织、血细胞组织、中肠组织和/或脂肪体组织；
1.3将组织放入含有昆虫细胞培养液的细胞培养瓶中，放入细胞培养箱中培养10-40天，优选20天，以获得分散的原代昆虫细胞。
优选地，在步骤2)中，所述物理性低氧诱导的条件为：
在27℃、1％的氧气浓度下诱导4天或者在27℃、5％的氧气浓度下诱导9天。
优选地，所述化学性低氧诱导的条件为：
27℃，诱导24h。
优选地，所述物理性低氧诱导包括以下步骤：
将三气培养箱通入氮气代替氧气，通过氧气传感器检测腔室内氧气浓度，控制和降低腔室内氧气含量，同时采用带透气瓶盖的培养瓶造成培养液中溶解氧含量降低，造成低氧微环境，来对原代细胞进行诱导。
优选地，所述化学性低氧诱导为使用化学试剂造成培养液内溶解氧降低；
优选地，所述化学试剂选自0.1～2g/L亚硫酸钠、1～10mmol/L连二亚硫酸钠、0.1～1mmol/L去铁敏或0.1～10mmol/L叠氮钠中的一种或多种；更优选地，所述化学试剂选自0.5g/L亚硫酸钠、2mmol/L连二亚硫酸钠、0.3mmol/L去铁敏或1mmol/L叠氮钠中的一种或多种。
优选地，在步骤3)中，所述复氧条件为：
优选地，在27℃下，通入空气诱导20天；
优选地，在步骤4)中，继续培养步骤3)的细胞，使活着的细胞不断增殖，再次长满整个细胞培养瓶后，开始传代，从而建立昆虫细胞系。
优选地，所述步骤4)包括以下步骤：
①将新增殖的细胞连同昆虫细胞培养液吸入新的细胞培养瓶中，并加入新鲜的昆虫细胞培养液，含有分散的原代昆虫细胞的培养瓶中再加入新鲜细胞培养液；
②将两个细胞培养瓶均放入细胞培养箱中27℃下培养，细胞传代成功，获得昆虫细胞系。
另一方面，本发明提供一种昆虫细胞系，所述昆虫细胞系使用上述方法建立。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.可快速获得大量分散的原代培养细胞。
2.通过低氧-复氧的模式诱导原代细胞转化，可操作性强，简单易行，细胞转化效率显著高于通常昆虫细胞系建立采用的自然转化方法。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为根据本发明的方法建立的甜菜夜蛾卵巢细胞系IOZCAS-Spex18的细胞形态，图中标尺所示为200μm；
图2为根据本发明的方法建立的斜纹夜蛾卵巢细胞系IOZCAS-Splt1的细胞形态，图中标尺所示为200μm。
具体实施方式
实施例1甜菜夜蛾蛹卵巢细胞系的建立
1)在昆虫细胞培养液中培养昆虫组织，以获得分散的原代昆虫细胞；
1.1取甜菜夜蛾雌性蛹(来源于中国科学院动物研究所)甜菜夜蛾幼虫使用人工饲料在26±1.5％℃，相对湿度65％-75％的条件下饲养，在超净工作台内浸没在3％的次氯酸钠溶液中5分钟，75％乙醇溶液中15分钟，进行表面消毒，然后用无菌蒸馏水清洗昆虫，再吸干蛹表面水分。
1.2解剖取出卵巢组织，操作时尽量保持其完整。
1.3用Ringre’s生理盐水清洗该组织2-3次，再用昆虫细胞培养液(以Insect-Xpress为主，含100U/mL的青霉素、100U/mL的链霉素和10％(v/v)的胎牛血清，pH＝6.5)清洗1次，放入使用1mL细胞培养液润洗过的25cm2的带透气瓶盖的细胞培养瓶中27℃贴壁培养24小时然后加入3mL细胞培养液继续培养20天。可以观察到组织周围游离出大量单个的细胞，并逐渐向外围扩展，直至布满整个培养瓶底。
2)物理性低氧诱导获得的原代昆虫细胞。将培养瓶置于5％氧气含量的三气培养箱中，27℃培养9天，诱导初期，部分细胞死亡。
3)低氧9天后，更换半量细胞培养液，进行复氧，即置于普通培养箱中常氧条件下培养，剩余存活细胞进入转化阶段，在复氧7-10天后逐渐堆积生长，15-20天后细胞增殖铺满整个细胞培养瓶底。
4)传代建立细胞系。首次传代是将细胞连同全部培养液吸出加入新的细胞培养瓶中，并加入3ml新鲜培养液，放入普通细胞培养箱中27℃培养。第二次传代是首次传代6天后开始，半量分瓶传代，以后每6天传代一次。第五代时，取1/3原瓶中的细胞，放入新瓶加入新培养液传代，6天传代一次，细胞生长开始稳定，以后传代时间逐渐缩短。传代第8代时，每4天传代一次。细胞系建立成功，命名为IOZCAS-Spex18，如图1所示。
实施例2斜纹夜蛾蛹卵巢细胞系的建立
1)在昆虫细胞培养液中培养昆虫组织，以获得分散的原代昆虫细胞；
1.1取斜纹夜蛾雌性蛹(来源于中国科学院动物研究所)，斜纹夜蛾幼虫使用人工饲料在26±1.5％℃，相对湿度65％-75％的条件下饲养。在超净工作台内浸没在3％的次氯酸钠溶液中5分钟，75％乙醇溶液中15分钟，进行虫体表面消毒。
1.2解剖取出卵巢组织，操作时尽量保持其完整。
1.3用Ringre’s生理盐水清洗该组织2-3次，再用细胞培养液(以Insect-Xpress为主，含100U/mL的青霉素、100U/mL的链霉素和10％(v/v)的胎牛血清，pH＝6.5)清洗1次，放入使用1mL细胞培养液润洗过的25cm2的带透气瓶盖的细胞培养瓶中27℃贴壁培养24小时然后加入3mL细胞培养液继续培养20天。可以观察到组织周围游离出大量单个的细胞，并逐渐向外围扩展，直至布满整个培养瓶底。
2)物理性低氧诱导获得的原代昆虫细胞。将培养瓶置于1％氧气含量的三气培养箱中，27℃培养4天，诱导初期，部分细胞死亡。
3)低氧4天后，更换半量细胞培养液，进行复氧，即置于普通培养箱中常氧条件下培养，剩余存活细胞进入转化阶段，在复氧7-10天后逐渐堆积生长，15-20天后细胞增殖铺满整个细胞培养瓶底。
4)传代建立细胞系。首次传代是将细胞连同全部培养液吸出加入新的细胞培养瓶中，并加入3ml新鲜培养液，放入普通细胞培养箱中27℃培养。第二次传代是首次传代6天后开始，半量分瓶传代，以后每6天传代一次。第五代时，取1/3原瓶中的细胞，放入新瓶加入新培养液传代，6天传代一次，细胞生长开始稳定，以后传代时间逐渐缩短。传代第8代时，每4天传代一次。细胞系建立成功，命名为IOZCAS-Splt 1，如图2所示。
实施例3甜菜夜蛾蛹卵巢细胞系的建立
1)在昆虫细胞培养液中培养昆虫组织，以获得分散的原代昆虫细胞；
1.1取甜菜夜蛾雄性蛹(来源于中国科学院动物研究所)甜菜夜蛾幼虫使用人工饲料在26±1.5％℃，相对湿度65％-75％的条件下饲养，在超净工作台内浸没在2％的次氯酸钠溶液中6分钟，75％乙醇溶液中10分钟，进行表面消毒，然后用无菌蒸馏水清洗昆虫，再吸干蛹表面水分。
1.2解剖取出精巢组织，操作时尽量保持其完整。
1.3用Ringre’s生理盐水清洗该组织2-3次，再用昆虫细胞培养液(以Insect-Xpress为主，含100U/mL的青霉素、100U/mL的链霉素和10％(v/v)的胎牛血清，pH＝6.5)清洗1次，放入使用1mL细胞培养液润洗过的25cm2的带透气瓶盖的细胞培养瓶中27℃贴壁培养24小时然后加入3mL细胞培养液继续培养10天。可以观察到组织周围游离出大量单个的细胞，并逐渐向外围扩展，直至布满整个培养瓶底。
2)化学性低氧诱导获得的原代昆虫细胞。将培养瓶加入0.1g/L亚硫酸钠，诱导初期，部分细胞死亡。
3)低氧48h后，更换半量细胞培养液，进行复氧，即置于普通培养箱中常氧条件下培养，剩余存活细胞进入转化阶段，在复氧7-10天后逐渐堆积生长，15-20天后细胞增殖铺满整个细胞培养瓶底。
4)传代建立细胞系。首次传代是将细胞连同全部培养液吸出加入新的细胞培养瓶中，并加入3ml新鲜培养液，放入普通细胞培养箱中27℃培养。第二次传代是首次传代6天后开始，半量分瓶传代，以后每6天传代一次。第五代时，取1/3原瓶中的细胞，放入新瓶加入新培养液传代，6天传代一次，细胞生长开始稳定，以后传代时间逐渐缩短。传代第8代时，每4天传代一次。细胞系建立成功。
实施例4斜纹夜蛾蛹卵巢细胞系的建立
1)在昆虫细胞培养液中培养昆虫组织，以获得分散的原代昆虫细胞；
1.1取斜纹夜蛾雌性蛹(来源于中国科学院动物研究所)，斜纹夜蛾幼虫使用人工饲料在26±1.5％℃，相对湿度65％-75％的条件下饲养。在超净工作台内浸没在4％的次氯酸钠溶液中4分钟，75％乙醇溶液中20分钟，进行虫体表面消毒。
1.2解剖取出脂肪体组织，操作时尽量保持其完整。
1.3用Ringre’s生理盐水清洗该组织2-3次，再用细胞培养液(以Insect-Xpress为主，含100U/mL的青霉素、100U/mL的链霉素和10％(v/v)的胎牛血清，pH＝6.5)清洗1次，放入使用1mL细胞培养液润洗过的25cm2的带透气瓶盖的细胞培养瓶中27℃贴壁培养24小时然后加入3mL细胞培养液继续培养40天。可以观察到组织周围游离出大量单个的细胞，并逐渐向外围扩展，直至布满整个培养瓶底。
2)物理性低氧诱导获得的原代昆虫细胞。将培养瓶置于0.5％氧气含量的三气培养箱中，28℃培养3天，诱导初期，部分细胞死亡。
3)低氧3天后，更换半量细胞培养液，进行复氧，即置于普通培养箱中常氧条件下培养，剩余存活细胞进入转化阶段，在复氧7-10天后逐渐堆积生长，15-20天后细胞增殖铺满整个细胞培养瓶底。
4)传代建立细胞系。首次传代是将细胞连同全部培养液吸出加入新的细胞培养瓶中，并加入3ml新鲜培养液，放入普通细胞培养箱中27℃培养。第二次传代是首次传代6天后开始，半量分瓶传代，以后每6天传代一次。第五代时，取1/3原瓶中的细胞，放入新瓶加入新培养液传代，6天传代一次，细胞生长开始稳定，以后传代时间逐渐缩短。传代第8代时，每4天传代一次。细胞系建立成功。
实施例5甜菜夜蛾蛹卵巢细胞系的建立
1)在昆虫细胞培养液中培养昆虫组织，以获得分散的原代昆虫细胞；
1.1取甜菜夜蛾雌性蛹(来源于中国科学院动物研究所)甜菜夜蛾幼虫使用人工饲料在26±1.5％℃，相对湿度65％-75％的条件下饲养，在超净工作台内浸没在3％的次氯酸钠溶液中5分钟，75％乙醇溶液中10分钟，进行表面消毒，然后用无菌蒸馏水清洗昆虫，再吸干蛹表面水分。
1.2解剖取出卵巢组织，操作时尽量保持其完整。
1.3用Ringre’s生理盐水清洗该组织2-3次，再用昆虫细胞培养液(以Insect-Xpress为主，含100U/mL的青霉素、100U/mL的链霉素和10％(v/v)的胎牛血清，pH＝6.5)清洗1次，放入使用1mL细胞培养液润洗过的25cm2的带透气瓶盖的细胞培养瓶中27℃贴壁培养24小时然后加入3mL细胞培养液继续培养20天。可以观察到组织周围游离出大量单个的细胞，并逐渐向外围扩展，直至布满整个培养瓶底。
2)物理性低氧诱导获得的原代昆虫细胞。将培养瓶置于10％氧气含量的三气培养箱中，25℃培养15天，诱导初期，部分细胞死亡。
3)低氧15天后，更换半量细胞培养液，进行复氧，即置于普通培养箱中常氧条件下培养，剩余存活细胞进入转化阶段，在复氧7-10天后逐渐堆积生长，15-20天后细胞增殖铺满整个细胞培养瓶底。
4)传代建立细胞系。首次传代是将细胞连同全部培养液吸出加入新的细胞培养瓶中，并加入3ml新鲜培养液，放入普通细胞培养箱中27℃培养。第二次传代是首次传代6天后开始，半量分瓶传代，以后每6天传代一次。第五代时，取1/3原瓶中的细胞，放入新瓶加入新培养液传代，6天传代一次，细胞生长开始稳定，以后传代时间逐渐缩短。传代第8代时，每4天传代一次。细胞系建立成功。
实施例6斜纹夜蛾蛹卵巢细胞系的建立
1)在昆虫细胞培养液中培养昆虫组织，以获得分散的原代昆虫细胞；
1.1取斜纹夜蛾雌性蛹(来源于中国科学院动物研究所)，斜纹夜蛾幼虫使用人工饲料在26±1.5％℃，相对湿度65％-75％的条件下饲养。在超净工作台内浸没在3％的次氯酸钠溶液中5分钟，75％乙醇溶液中20分钟，进行虫体表面消毒。
1.2解剖取出卵巢组织，操作时尽量保持其完整。
1.3用Ringre’s生理盐水清洗该组织2-3次，再用细胞培养液(以Insect-Xpress为主，含100U/mL的青霉素、100U/mL的链霉素和10％(v/v)的胎牛血清，pH＝6.5)清洗1次，放入使用1mL细胞培养液润洗过的25cm2的带透气瓶盖的细胞培养瓶中27℃贴壁培养24小时然后加入3mL细胞培养液继续培养20天。可以观察到组织周围游离出大量单个的细胞，并逐渐向外围扩展，直至布满整个培养瓶底。
2)化学性低氧诱导获得的原代昆虫细胞。将培养瓶加入0.2g/L亚硫酸钠，诱导初期，部分细胞死亡。
3)低氧3h后，更换半量细胞培养液，进行复氧，即置于普通培养箱中常氧条件下培养，剩余存活细胞进入转化阶段，在复氧7-10天后逐渐堆积生长，15-20天后细胞增殖铺满整个细胞培养瓶底。
4)传代建立细胞系。首次传代是将细胞连同全部培养液吸出加入新的细胞培养瓶中，并加入3ml新鲜培养液，放入普通细胞培养箱中27℃培养。第二次传代是首次传代6天后开始，半量分瓶传代，以后每6天传代一次。第五代时，取1/3原瓶中的细胞，放入新瓶加入新培养液传代，6天传代一次，细胞生长开始稳定，以后传代时间逐渐缩短。传代第8代时，每4天传代一次。细胞系建立成功。

Claims (17)

1.一种建立昆虫细胞系的方法，所述方法包括以下步骤：
1)在昆虫细胞培养液中培养昆虫组织，以获得分散的原代昆虫细胞；
2)物理性低氧诱导或化学性低氧诱导步骤1)所获得的原代细胞；
所述物理性低氧诱导的条件为：
25-28℃，0.5-10％的氧气浓度下诱导3-15天；
所述化学性低氧诱导的条件为：
25-28℃，诱导3h～48h；
3)半量更换昆虫细胞培养液后，对步骤2)的原代细胞进行复氧，直至观察到细胞不断增殖布满整个瓶底；
所述复氧条件为：
在25-28℃、通入空气诱导10-30天；
4)传代培养步骤3)获得的细胞，获得能够连续传代的细胞，从而建立昆虫细胞系；
整个过程都是在无菌条件下进行；
其中，所述昆虫组织来自鳞翅目和双翅目的昆虫；所述昆虫组织选自所述昆虫的卵巢组织、精巢组织、胚胎组织、成虫盘组织、血细胞组织、中肠组织或脂肪体组织中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述昆虫组织为甜菜夜蛾蛹的卵巢组织或斜纹夜蛾蛹的卵巢组织。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)包括以下步骤：
解剖昆虫组织，置于含有昆虫细胞培养液的带透气瓶盖的培养瓶中，于27℃培养，以获得分散的原代昆虫细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)是通过包括以下步骤的方法完成：
1.1将昆虫表面消毒，用无菌蒸馏水清洗昆虫后，再吸干昆虫表面的水分；
1.2解剖昆虫，取出昆虫的组织；
1.3将组织放入含有昆虫细胞培养液的细胞培养瓶中，放入细胞培养箱中培养10-40天，以获得分散的原代昆虫细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤1.1中，所述表面消毒为将昆虫浸没在2-4％(体积比)的次氯酸溶液中4-6分钟，然后在75％(体积比)的乙醇溶液中浸没10-20分钟。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤1.1中，所述表面消毒为将昆虫浸没在3％(体积比)的次氯酸溶液中5分钟，然后在75％(体积比)的乙醇溶液中浸没15分钟。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤1.3中，将组织放入含有昆虫细胞培养液的细胞培养瓶中，放入细胞培养箱中培养20天，以获得分散的原代昆虫细胞。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述物理性低氧诱导的条件为：
在27℃、1％的氧气浓度下诱导4天或者在27℃、5％的氧气浓度下诱导9天。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述化学性低氧诱导的条件为：
27℃，诱导24h。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述物理性低氧诱导包括以下步骤：
将三气培养箱通入氮气代替氧气，通过氧气传感器检测腔室内氧气浓度，控制和降低腔室内氧气含量，同时采用带透气瓶盖的培养瓶造成培养液中溶解氧含量降低，造成低氧微环境，来对原代细胞进行诱导。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述化学性低氧诱导为使用化学试剂造成培养液内溶解氧降低。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述化学试剂选自0.1～2g/L亚硫酸钠、1～10mmol/L连二亚硫酸钠、0.1～1mmol/L去铁敏或0.1～10mmol/L叠氮钠中的一种或多种。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述化学试剂选自0.5g/L亚硫酸钠、2mmol/L连二亚硫酸钠、0.3mmol/L去铁敏或1mmol/L叠氮钠中的一种或多种。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，所述复氧条件为：在27℃下，通入空气诱导20天。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤4)中，继续培养步骤3)的细胞，使活着的细胞不断增殖，再次长满整个细胞培养瓶后，开始传代，从而建立昆虫细胞系。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)包括以下步骤：
①将新增殖的细胞连同昆虫细胞培养液吸入新的细胞培养瓶中，并加入新鲜的昆虫细胞培养液，含有分散的原代昆虫细胞的培养瓶中再加入新鲜细胞培养液；
②将两个细胞培养瓶均放入细胞培养箱中27℃下培养，细胞传代成功，获得昆虫细胞系。
17.一种昆虫细胞系，所述昆虫细胞系使用如权利要求1-16中任一项所述的方法建立。
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