CN108567981A - 白细胞介素-6的拮抗剂在制备抑制Notch-1蛋白表达、治疗胰腺癌的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种白细胞介素‑6的拮抗剂在制备抑制Notch‑1蛋白表达、治疗胰腺癌的药物中的应用。研究探讨了细胞因子白介素‑6（IL‑6）对人胰腺癌细胞增殖和迁移的影响。采用CCK‑8法检测细胞的增殖活性并绘制生长曲线，克隆形成实验检测细胞克隆形成率，细胞划痕实验检测细胞迁移情况，蛋白质免疫印迹实验检测细胞IL‑6、Notch‑1蛋白的表达。结果显示，随着IL‑6浓度增加，细胞增殖能力显著增强，克隆形成率及细胞迁移率升高；抑制IL‑6的表达，Notch‑1蛋白的表达也随之降低。细胞因子IL‑6可能通过调节Notch‑1通路活性影响胰腺癌细胞Mia‑paca‑2的增殖和迁移。当前结果为进一步研究IL‑6与Notch通路的相互作用机制奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种白细胞介素-6的拮抗剂在制备抑制Notch-1蛋白表达、治疗胰腺癌的药物中的应用。
背景技术
胰腺癌是一种常见的恶性肿瘤，死亡率高、预后差，位居全球癌症死因的第七，西方国家的第四位，其死亡率在我国位居第四位，发病人数较10年前有明显增加的趋势。目前对于胰腺癌的治疗既没有早期的诊断标志物，也没有有效的治疗手段，除早期手术治疗外，其他治疗方法收效甚微，但是胰腺癌一般确诊时就是晚期。而且由于术后辅助治疗的效果不佳等因素，胰腺癌的五年生存率仅为不足5%。慢性炎症恶性转化中的分子标记物筛选在人类出现的部分肿瘤中已经开展并取得成功。同其它实体瘤一样，胰腺癌治疗成功与否，在很大程度上取决于胰腺癌的早期诊断与治疗。由于缺少特异的体征和早期诊断的生物标记物，给胰腺癌的诊断与治疗带来很大困难。发现高效、敏感、特异性生物标志物对早期发现、早期诊断胰腺癌、改善患者预后相当重要。
研究表明微环境的慢性炎症状态与胰腺癌的发生发展密切相关，间质成分中浸润着多种免疫细胞。然而，在肿瘤诱导的微环境下，机体的正常免疫功能转化为适合肿瘤生长的免疫抑制状态，阻碍了免疫监视系统杀灭肿瘤细胞。抗肿瘤免疫应答及肿瘤细胞相关的免疫抑制状态之间的平衡对于肿瘤的增殖、侵袭和转移产生重要的作用。因此针对胰腺癌免疫微环境的研究，逆转免疫抑制状态，激活宿主免疫功能是胰腺癌免疫治疗的新希望。
白细胞介素6（Interleukin-6，IL-6）是一种多功能细胞因子，也是机体复杂的细胞因子网络中的关键因子，主要由单核巨噬细胞、内皮细胞及淋巴样细胞产生，是一种多效应细胞因子，IL-6主要以自分泌或旁分泌方式发挥效应，它可以调节其他细胞因子的作用，主要介导炎症反应。
发明内容
本发明的目的是提供一种白细胞介素-6的拮抗剂在制备抑制Notch-1蛋白表达、治疗胰腺癌的药物中的应用。
所述的药物是由白细胞介素-6的拮抗剂和药学上可接受的载体或赋形剂制成的。
优选的，所述白细胞介素-6的拮抗剂为购自于艾博抗（上海）贸易有限公司的IL-6抗体（Abcam, ab6672)。
本发明产生的有益效果是：本发明测定了IL-6对Mia-paca-2胰腺癌细胞的体外增殖能力影响。结果发现随着IL-6浓度的增加，细胞生长的增值率逐渐升高。进一步采用克隆形成实验检测细胞增殖变化，细胞划痕实验检测细胞迁移能力变化。结果再次表明加入IL-6，Mia-paca-2细胞的增殖和迁移能力明显增加，说明IL-6对于胰腺癌细胞的增殖和迁移作用有明显影响，而加入IL-6抗体后，随着IL-6抗体剂量的增加，细胞活力显著下降。
附图说明
图1为 IL-6对胰腺癌细胞活力的影响；
图2为IL-6、DAPT对胰腺癌细胞增殖活力的影响；
图3不同浓度IL-6对胰腺癌细胞克隆形成能力的影响；
图4为不同浓度IL-6对胰腺癌细胞Mia-paca-2迁移的影响；
图5为不同浓度 IL-6对胰腺癌细胞Notch1蛋白表达的影响；
图6为不同浓度白细胞介素-6的抗体对胰腺癌细胞增殖的影响。
具体实施方式
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
人胰腺癌细胞株Mia-capa-2购自武汉普诺赛生命科技有限公司。胎牛血清FBS购自Gibco公司，DMEM培养基HyClone公司，兔抗人IL-6、Notch1、3、4抗体购自abcam公司，兔抗人Myh9抗体、β-actin抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，细胞因子Human IL-6购自美国peprotech公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
Mia-capa-2在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5% CO2培养箱培养，每2 d换培养基1次，观察细胞至对数生长期进行下一步实验。
1.2.2 CCK-8法检测胰腺癌细胞的增殖能力
1.2.2.1 CCK-8法检测细胞因子IL-6对胰腺癌细胞增殖的影响
将对数生长期的贴壁细胞用0.5%胰蛋白酶消化，1000rpm离心5min，1×磷酸盐缓冲液（PBS）清洗1次，以2×103/孔接种于96孔板中，每空接入100μL的无胎牛血清的培养基，培养24h，加入不同浓度的IL-6（0、12.5、25、50、100ng/mL）作用24h，同时设空白对照（不加细胞），每孔加入5μL的CCK-8溶液，CO2细胞培养箱孵育40min，在酶联免疫检测仪450nm处测量各孔的光密度（OD）值。每孔设3个重复取平均值，根据下列公式计算细胞增殖活力。细胞增殖活力（%）=（处理组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）×100%。
1.2.2.2 CCK-8法检测DAPT对胰腺癌细胞增殖的影响
将对数生长期的贴壁细胞用0.5%胰蛋白酶消化，1000rpm离心5min，以2×103/孔接种于96孔板中，接种两板，每孔接入100uL的无胎牛血清的培养基，培养24h，换成含血清的正常培养基，加入不同浓度的DAPT（0、1、10、100、1000uM/mL），另一板30min后加入100ng/mLIL-6，同时设空白对照（不加细胞），24好后每孔加入5μL的CCK-8溶液，CO2细胞培养箱孵育40min，在酶联免疫检测仪450nm处测量各空的光密度（OD）值。每孔设3个重复取平均值，根据下列公式计算细胞增殖活力。细胞增殖活力（%）=（处理组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）×100%。
1.2.3 细胞克隆形成实验检测克隆形成能力
消化对数生长期的细胞，每皿约200个细胞，铺4个皿，加入10mL含10%FBS培养基，使细胞均匀分散。其中两个皿先加入不同浓度DAPT（5、10uM/mL）作用30min，然后每个皿中加入100ng/mL IL-6，同时设空白对照（不加入任何药物）。置37℃、5%CO2细胞培养箱中培养7d，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时终止培养。采用4%多聚甲醛溶液固定细胞，风干后0.1%结晶紫染色，用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。观察并计数细胞克隆数。
1.2.4 细胞划痕实验检测IL-6对胰腺癌细胞迁移的影响
取6孔板，并在6孔板背后划线，消化对数生长期细胞，接种于6孔板中，每孔约5×105个细胞，过夜培养至铺满小孔，用白色枪头垂直于背后横线划痕，1×PBS清洗细胞3次，加入含不同IL-6浓度的无胎牛血清培养基，CO2细胞培养箱培养，0h，6h，24h观察拍照。
1.2.5 Western blotting检测notch蛋白的表达水平
消化对数生长期人胰腺癌Mia-paca-2细胞，铺8个皿，分两组，每组4个，在第一组中分别加入不同浓度IL-6（0、50、100、200ng/mL）；第二组（A、B、C、D）在A、B两皿中加入10uM DAPT作用30min，接着在A、C两皿中加入100ng/mL IL-6，细胞培养箱培养24h。收集对数生长期的细胞，提取细胞总蛋白。进行SDS-PAGE后，转移至硝酸纤维素膜（PVDF），4℃封闭过夜，加入人源抗体和内参对照β-actin抗体孵育1h，1×PBS洗3次，加辣根过氧化物酶标记二抗孵育1h，1×PBS洗3次，ECL化学发光检测显影，在凝胶成像系统上拍照并分析。
结果
2.1 细胞因子IL-6对胰腺癌细胞Mia-capa-2的增殖能力影响
不同浓度重组IL-6作用于人胰腺癌细胞株Mia-paca-2，利用CCK-8法检测重组IL-6对胰腺癌细胞的增殖情况，结果如图1所示，图1显示重组IL-6对胰腺癌细胞Mia-paca-2细胞增殖具有促进作用，差异具有统计学意义（p＜0.05）。
2.2 DAPT抑制胰腺癌细胞Mia-paca-2的增殖
为检测Notch通路在IL-6促进胰腺癌细胞增殖中的作用，实验加入了Notch通路抑制剂DAPT，抑制Notch-1通路的激活。胰腺癌细胞株Mia-paca-2培养液中加入DAPT作用30min，接着加入100ng/mL重组IL-6，CCK-8法检测细胞增殖活力。结果如图2所示，图2显示单独加入DAPT对Mia-paca-2细胞增殖有明显的抑制作用；但在IL-6的作用下，细胞增殖抑制率下降，差异具有统计学意义（p＜0.05）。
2.3 IL-6对胰腺癌细胞Mia-paca-2克隆形成能力的影响
细胞克隆形成实验结果如图3所示，图3显示，在不同浓度IL-6（0、100ng/mL）作用下，Mia-paca-2细胞克隆形成数分别为275±9、306±13；随着IL-6浓度的增加，Mia-paca-2细胞克隆形成能力也提高，差异具有统计学意义（p＜0.05）；当加入DAPT（5、10μM）预处理30min情况下，细胞克隆形成显著降低，分别为227±9、194±7。
2.4 IL-6对胰腺癌细胞Mia-paca-2体外迁移能力的影响
细胞划痕实验结果如图4所示，与空白对照组比较，重组IL-6能提高胰腺癌Mia-paca-2细胞的迁移能力，并呈现浓度依赖关系，差异有统计学意义（p＜0.05）。
2.5 IL-6对人胰腺癌细胞Notch-1蛋白表达的影响
不同浓度重组IL-6作用于人源胰腺癌细胞株Mia-paca-2，提取细胞总蛋白，westernblot检测Notch1蛋白的表达情况。结果如图5所示，随着重组IL-6浓度的增加，Notch1表达也随之增加。细胞株中加入Notch的抑制剂DAPT作用30min，接着加入重组IL-6，提取细胞总蛋白，western blot检测Notch1蛋白的表达情况。结果显示，重组IL-6显著增加Notch1蛋白的表达。
3 白细胞介素-6的抗体对胰腺癌细胞增殖的影响
正常培养人胰腺癌细胞株Mia-paca-2至对数生长期，0.25%胰蛋白酶消化传代后接种至96孔板（103个/孔），待细胞贴壁后加入不同浓度IL-6抗体，作用于人胰腺癌细胞株Mia-paca-2继续培养48h，利用CCK-8法检测IL-6抗体对胰腺癌细胞增殖的作用。结果如图6所示，IL-6抗体可显著抑制Mia-paca-2细胞的增殖，10µg/mL 抑制率达70%，差异具有统计学意义（p＜0.05）。
机体局部慢性炎症的存在导致IL-6的大量释放，进而过度激活了Notch通路，后者参与调节肿瘤干细胞的发生、更新，并最终形成了肿瘤。本发明通过western blotting实验表明随着IL-6浓度的增加，Notch1的含量也随之增加；抑制IL-6的表达，Notch1的含量也随之降低，进一步说明下调IL-6，可以抑制Notch通路，从而抑制肿瘤的形成。
Claims (5)
1.白细胞介素-6的拮抗剂在制备抑制Notch-1蛋白表达的药物中的应用。
2.白细胞介素-6的拮抗剂在制备治疗胰腺癌的药物中的应用。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的药物是由白细胞介素-6的拮抗剂和药学上可接受的载体或赋形剂制成的。
4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述白细胞介素-6的拮抗剂为IL-6抗体。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述IL-6抗体为购自于艾博抗（上海）贸易有限公司的白细胞介素-6抗体（Abcam, ab6672)。
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Citations (2)
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| CN103930443A (zh) * | 2011-11-10 | 2014-07-16 | 瑞泽恩制药公司 | 通过拮抗il-6受体抑制肿瘤生长的方法 |
| CN107249637A (zh) * | 2015-02-27 | 2017-10-13 | 中外制药株式会社 | 用于治疗il‑6相关疾病的组合物 |
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2018
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| CN107249637A (zh) * | 2015-02-27 | 2017-10-13 | 中外制药株式会社 | 用于治疗il‑6相关疾病的组合物 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| GOUMAS F. A.，ET AL.: "Inhibition of IL-6 signaling significantly reduces primary tumor growth and recurrencies in orthotopic xenograft models of pancreatic cancer", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER》 * |
| RAZIDLO G. L.，ET AL.: "Interleukin-6 Promotes Pancreatic Cancer Cell Migration by Rapidly Activating the Small GTPase CDC42", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 * |
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