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CN108473408B - 壳二孢氯素衍生物及其作为ampk激活剂的用途 - Google Patents

壳二孢氯素衍生物及其作为ampk激活剂的用途 Download PDF

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CN108473408B CN201780005837.7A CN201780005837A CN108473408B CN 108473408 B CN108473408 B CN 108473408B CN 201780005837 A CN201780005837 A CN 201780005837A CN 108473408 B CN108473408 B CN 108473408B
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Abstract

本发明的一个目的是提供一种新型壳二孢氯素(ascochlorin)衍生物，其激活单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)，并且可用于治疗或预防涉及AMPK失调的疾病或病况。本发明提供了由式I表示的化合物、其药学上可接受的盐或溶剂合物。

Description

壳二孢氯素衍生物及其作为AMPK激活剂的用途
技术领域
本发明涉及一种新型壳二孢氯素(ascochlorin)衍生物，其激活单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)，并且可用于治疗或预防涉及AMPK失调的疾病或病况，例如癌症、2型糖尿病、代谢综合征相关疾病和阿尔茨海默病。本发明还涉及一种药物组合物，其包含用于治疗或预防涉及AMPK失调的疾病或病况的化合物。
背景技术
单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)是细胞能量平衡的重要调节蛋白，并被认为是各种器官中(特别是骨骼肌、肝脏和脂肪组织中)葡萄糖和脂质代谢的主要开关。
已知AMPK通过抑制m-TOR以及线粒体生物发生而在调节细胞生长和自噬方面具有关键作用[Physiological Rev.2009，第89卷，第1025页，Nature Reviews/Molecular CellBiology，2012，第13卷第251页，Nature Cell Biology，2011，第13(9)卷1016，Molecularand Cellular Endocrinology，2013第366卷，第152页，J.Physiol.，2006，第574.1卷，第33页。]。
当细胞内ATP水平变得较低时，AMP或ADP可直接结合AMPK的γ调节亚基，导致构象改变，促进LKB1(被认为是肿瘤抑制剂)或CAMKK2(Ca++依赖性激酶)在ThR172处的AMPK磷酸化。此外，构象变化还保护AMPK免于被蛋白磷酸酶2A和C去磷酸化，从而使AMPK保持激活状态。
AMPK失调被认为是例如癌症、2型糖尿病、代谢综合征相关疾病(血脂异常、肥胖症、动脉粥样硬化性心血管疾病、高血压和非酒精性脂肪肝病(NAFLD))、炎症和阿尔茨海默病等疾病的致病因素，因此AMPK被认为是预防和治疗这些疾病的靶标[代谢综合征：TheJournal of Clinical Investigation，2013，第123(7)卷第2764页，Molecular andCellular Endocrinology，2013，第366卷第135页；癌症和炎症：Oncotarget，2015，第6(10)卷，第7365页；心血管疾病：Circ Res.，2009第104(3)卷，第282页；炎症，Diabetologia，2010第53卷，第2406页，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.，2010，第42卷，第676页；阿尔兹海默病：J Alzheimers Dis.2009，第16(4)卷第731页]。
二甲双胍已知是一种抗高血糖剂，其通过抑制呼吸链复合物1间接激活AMPK[Clinical Science，2012，第122卷，第253页]。然而，据报道，在体外细胞实验中，仅在极高的mM浓度水平，二甲双胍才激活HepG2细胞中的AMPK。
5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸(AICAR)已知是一种AMP模拟物。AICAR通过结合调节性γ-亚基而直接激活AMPK，以促进AMPK的磷酸化并保护AMPK免于去磷酸化。据报道，A-769662是一种具有不同结合模式的直接AMPK激活剂[Cell Metabolism，2006第3卷，第403页]。在文献中还报道了其他AMPK激活剂，但是至今没有一个被临床使用，部分原因是体内功效和/或安全性不足。因此，具有良好功效和安全性的新型AMPK激活剂将为患有涉及AMPK失调的疾病的患者提供治疗益处。
4-O-甲基-壳二孢氯素(MAC)是壳二孢氯素的真菌代谢物的衍生物，据报道，其具有激活HepG2细胞中AMPK的能力[Biochemical and Biophysical ResearchCommunications，2011，第406卷，第353页]。在JP H06-305959A(1994年公布)中描述了作为抗糖尿病剂的包括MAC的4-O-取代的壳二孢氯素衍生物，并且在WO2004/074236中描述了MAC的前药，该MAC的前药是与天然氨基酸形成的席夫(Schiff)碱衍生物。然而，任何壳二孢氯素衍生物的发展均尚未成功。
引文列表
专利文件
专利文献1：JP H06-305959 A；
专利文献2：WO 2004/074236
非专利文件
非专利文献1：Physiological Rev.2009，第89卷，第1025页，
非专利文献2：Nature Reviews/Molecular Cell Biology，2012，第13卷第251页，
非专利文献3：Nature Cell Biology，2011，第13(9)卷，1016，
非专利文献4：Molecular and Cellular Endocrinology，2013第366卷，第152页，
非专利文献5：J.Physiol.，2006，第574.1卷第33页
非专利文献6：The Journal of Clinical Investigation,2013,123(7),2764；
非专利文献7：Mol.Cell.Endocrinol.,2013,366；135；
非专利文献8：Oncotarget,2015,6(10),7365；
非专利文献9：Circ Res.,2009,104(3)，第282页；
非专利文献10：Diabetologia,2010,53,2406；
非专利文献11：Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.,2010,42,676；
非专利文献12：J Alzheimers Dis.2009,16(4),731；
非专利文献13：Clinical Science,2012,122,253；
非专利文献14：Cell Metabolism,2006,3,403。
非专利文献15：Biochemical and Biophysical Research Communications,2011，第406卷，第353页
发明内容
技术问题
本发明人已经发现，MAC作为治疗剂在物理化学和药代动力学特征方面具有严重缺陷。即，MAC具有非常低的水溶性(在pH7.4磷酸盐缓冲液为0.07mM)和极低的代谢稳定性，这在使用人和小鼠的肝微粒体在存在NADPH的体外测定中被证实(孵育1小时后仅保留6％的MAC)。
关于WO2004/074236中描述的MAC的席夫碱衍生物，发明人发现这些化合物在酸性pH溶液中极不稳定。已证实了在室温下，在pH4.0的磷酸盐缓冲溶液(pH值与餐后人胃pH值相似)中，代表性化合物(MAC与甘氨酰胺的席夫碱，WO2004/074236中的化合物#13)几乎立即水解为MAC。因此，MAC的席夫碱衍生物与母体化合物MAC具有相同的代谢稳定性问题。
问题的解决方案
鉴于上述问题，本发明人进行了勤勉的研究，并因此完成了本发明，其发现了许多壳二孢氯素衍生物，这些壳二孢氯素衍生物被证实具有AMPK激活特性，并且与MAC相比显著改善了代谢稳定性。特别地，本发明的化合物还在几种疾病模型中显示出良好的体内功效，特别是对于肿瘤学和代谢疾病。
本发明涉及一种壳二孢氯素衍生物，其激活单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)，并且可用于治疗或预防涉及AMPK失调的疾病或病况，例如癌症、2型糖尿病、代谢综合征相关疾病和阿尔茨海默病。本发明还涉及一种包含该化合物的药物组合物，以及该化合物用于治疗或预防涉及AMPK失调的疾病或病况的用途。
本发明涉及一种新型壳二孢氯素衍生物，其可用作AMP激活的蛋白激酶的激活剂。
根据本发明的一个方面，提供了以下发明：
(1)由式I表示的化合物、其药学上可接受的盐或溶剂合物：
Figure GDA0002990583800000041
其中
R1为甲酰基，或-CH＝N-O-Y，其中Y为氢原子或C1-6烷基；
R2为C1-6烷基，其中烷基可被1至5个氟原子取代；
R3为氢原子或C1-6烷基；
R4为羟基，C1-6烷基氨基，C3-7环烷基氨基，或含有-O-、-S-、-NR6-、-SO-或-SO2-作为环原子的3元至7元杂环烷基氨基，或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成>C＝N-O-Z；
Z是氢原子，C1-6烷基，-CO(CH2)n-R5或-(CH2)n-R5；
n是选自1至4的整数；
R5是-CO2R6，-CONR7R8，-OCONR7R8，-SO2NR7R8，-SO2R9，羟基，-NHSO2R9，或-NR7R8；
R6、R7和R8各自独立地选自由氢原子、C1-6烷基和C3-7环烷基组成的组；或者R7和R8与它们所连接的氮原子一起形成含氮杂环，所述含氮杂环还可以包含-O-，-S-，-NR6-，-SO-或-SO2作为环原子，其中杂环可以被一个或多个选自羟基和C1-6烷基的取代基取代，并且
R9是C1-6烷基，或C3-7环烷基。
(2)根据(1)的化合物、其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中R4选自由以下组成的组：羟基，甲基氨基，乙基氨基，环丙基氨基，和氧杂环丁烷-3-基氨基(oxetan-3-ylamino)。
(3)根据(1)的化合物、其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成>C＝N-O-Z，其中Z选自由以下组成的组：氢原子，C1-6烷基，-CH2CO2H，-CH2CO2R5，吗啉代乙基，哌嗪基乙基，N-甲基-哌嗪基乙基，和N,N-二甲基氨基-乙基。
(4)根据(2)或(3)的化合物、其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中R1是甲酰基。
(5)根据(2)或(3)的化合物、其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中R1是-CH＝N-OH。
(6)根据(2)或(3)的化合物、其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中R1是-CH＝N-OMe。
(7)根据(1)的化合物、其药学上可接受的盐或溶剂合物，其选自由以下组成的组：
3-氯-6-羟基-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,6R)-3-羟基-1,2,3,6-四甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛，
3-氯-6-羟基-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,6R,E)-3-(羟基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛，
(E)-3-氯-6-羟基-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,6R,E)-3-(羟基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛肟，
3-氯-4-(氟甲氧基)-6-羟基-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,6R,E)-3-(羟基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-2-甲基苯甲醛肟，
3-氯-4-(氟甲氧基)-6-羟基-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,6R,E)-3-(羟基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-2-甲基苯甲醛，
[(1E,2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-(3-氯-5-甲酰基-6-羟基-2-甲氧基-4-甲基苯基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基亚环己基]氨基2-(二甲基氨基)乙酸酯，
(E)-3-氯-6-羟基-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,3S,6R)-3-羟基-1,2,3,6-四甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛肟，
(E)-3-氯-6-羟基-4-甲氧基-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,6R,E)-3-(甲氧亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-2-甲基苯甲醛O-甲基肟，
(E)-3-氯-4-(氟甲氧基)-6-羟基-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,6R,E)-3-(甲氧亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-2-甲基苯甲醛O-甲基肟，
(E)-3-氯-6-羟基-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,6R,E)-3-(羟基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛O-甲基肟，
(E)-3-氯-4-(氟甲氧基)-6-羟基-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,6R,E)-3-(羟基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-2-甲基苯甲醛O-甲基肟，
3-氯-4-(氟甲氧基)-6-羟基-2-甲基-5-((2E,4E)-3-甲基-5-((1R,2R,6R,E)-1,2,6-三甲基-3-(2-吗啉代乙氧基亚氨基)环己基)戊-2,4-二烯-1-基)苯甲醛，
3-氯-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,6R)-3-(环丙基氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-4-(氟甲氧基)-6-羟基-2-甲基苯甲醛，
(E)-3-氯-6-羟基-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,3S,6R)-3-羟基-1,2,3,6-四甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛O-甲基肟，
(E)-3-氯-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,6R,E)-3-(2-(二甲基氨基)乙氧基亚氨基-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-6-羟基-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛O-甲基肟，
(E)-3-氯-6-羟基-4-甲氧基-2-甲基-5-((2E,4E)-3-甲基-5-((1R,2R,6R,E)-1,2,6-三甲基-3-(2-吗啉代乙氧基亚氨基)环己基)戊-2,4-二烯-1-基)苯甲醛O-甲基肟，
(E)-3-氯-6-羟基-4-甲氧基-2-甲基-5-((2E,4E)-3-甲基-5-((1R,2R,6R,E)-1,2,6-三甲基-3-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基亚氨基)-环己基)戊-2,4-二烯-1-基)苯甲醛O-甲基肟，
2-([[(1E,2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-[3-氯-6-羟基-2-甲氧基-5-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基亚环己基]氨基]氧)乙酸乙酯，
2-([[(1E,2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-[(3-氯-6-羟基-2-甲氧基-5-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基亚环己基]氨基]氧)乙酸，
3-氯-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,6R)-3-(乙基氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-6-羟基-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛，
(E)-3-氯-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,6R)-3-(乙基氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-6-羟基-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛O-甲基肟，
3-氯-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,6R)-3-(环丙基氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-6-羟基-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛，
(E)-3-氯-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,6R)-3-(环丙基氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-6-羟基-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛O-甲基肟，
2-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,6R)-3-氨基-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-4-氯-3-甲氧基-6-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-5-甲基苯酚,
(E)-3-氯-6-羟基-4-甲氧基-2-甲基-5-((2E,4E)-3-甲基-5-((1R,2R,6R)-1,2,6-三甲基-3-(氧杂环丁烷-3-基氨基)环己基)戊-2,4-二烯-1-基)苯甲醛O-甲基肟，
2-([[(1E,2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-[3-氯-6-羟基-2-氟甲氧基-5-甲酰基-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基亚环己基]-氨基]氧)乙酸，
2-([[(1E,2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-[3-氯-6-羟基-2-甲氧基-5-[(1E)-(羟基亚氨基)甲基]-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基亚环己基]氨基]氧)乙酸，
2-([[(1E,2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-[3-氯-2-甲氧基-6-羟基-5-[(1E)-(羟基亚氨基)甲基]-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基亚环己基]氨基]氧)乙酸，
及其药学上可接受的盐。
(8)一种制备由式I表示的化合物、其药学上可接受的盐或溶剂合物的方法，
Figure GDA0002990583800000081
其中R1是甲酰基，并且R2、R3和R4如(1)中所定义，所述方法包括：
i)将由式VIII表示的化合物转化为由式XXII表示的化合物：
Figure GDA0002990583800000082
其中R10独立地选自C1-6烷基，并且R2如上所定义，
Figure GDA0002990583800000091
其中R10独立地选自C1-6烷基，并且R2如上所定义；以及
ii)将由式VIII表示的化合物转化为由式I表示的化合物。
(9)一种制备由式I表示的化合物、其药学上可接受的盐或溶剂合物的方法，
Figure GDA0002990583800000092
其中R1是-CH＝N-O-Y，并且R2、R3、R4和Y如(1)中所定义，所述方法包括：
i)将由式IV表示的化合物转化为由式I表示的化合物：
Figure GDA0002990583800000093
其中R10独立地选自C1-6烷基，并且R2和Y如上所定义。
(10)由式VIII表示的化合物：
Figure GDA0002990583800000094
其中R10独立地选自C1-6烷基，并且R2为被1至5个氟原子取代的C1-6烷基。
(11)由式IV表示的化合物：
Figure GDA0002990583800000101
其中R2是氢原子或可以被1-5个氟原子取代的C1-6烷基；并且Y是氢原子或C1-6烷基。
(12)一种药物组合物，其包含根据(1)至(7)中任一项的化合物和药学上可接受的载体。
(13)根据(12)所述的药物组合物，其用于治疗癌症、糖尿病、血脂异常、高胆固醇血症、肥胖症和脂肪肝病况、心血管疾病、动脉粥样硬化或阿尔茨海默病。
(14)根据(12)或(13)所述的药物组合物，其进一步包含用于治疗癌症、糖尿病、血脂异常、高胆固醇血症、肥胖症和脂肪肝病况、心血管疾病、动脉粥样硬化或阿尔茨海默病的治疗剂。
(15)一种治疗需要其的受试者中涉及AMPK失调的疾病的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的根据(1)至(7)中任一项的化合物。
(16)根据(15)所述的方法，其中所述疾病选自癌症、2型糖尿病和血脂异常。
本发明的有益效果
本发明的化合物可用作AMPK失调疾病的预防或治疗剂；例如代谢综合征，2型糖尿病，血脂异常，肥胖症，动脉粥样硬化性心血管疾病，高血压和非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)，炎症和阿尔茨海默病。此外，本发明化合物可用作癌症，例如肝细胞瘤、神经胶质瘤、乳腺癌、前列腺癌和非小细胞肺癌，以及癌症相关炎症的预防或治疗剂。癌症的实例包括涉及PI3K/AKT/mTOR途径的激活和/或肿瘤抑制因子LKB1的丧失的癌症，例如乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)，肝细胞瘤(尤其是索拉非尼(sorafenib)耐药性HCC)，结肠癌，前列腺癌，神经胶质瘤和非小细胞肺癌[Oncotarget，第6(10)卷，第7365页，2015]。
附图说明
图1示出了Western印迹分析的结果，以指示HepG2细胞中的AMPK激活和下游信号ACC。
图2示出了化合物19在SD大鼠中的药代动力学特征。
图3示出了指示化合物5对HFD-STZ模型小鼠的血液中甘油三酯水平的影响的测定结果。
图4示出了指示本发明化合物对小鼠血液中总胆固醇水平的影响的测定结果。
图5示出了指示化合物5对空腹状态下小鼠(HFD-STZ模型)的血糖水平的影响的测定结果。
图6示出了使用人胶质瘤U87MG异种移植模型评估化合物5的抗癌活性的体内测定结果。
图7示出了使用人肝细胞癌Hep3B异种移植模型评估化合物5与索拉非尼组合的抗癌活性的体内测定结果。
具体实施方式
在本说明书中，术语“C1-6烷基”是指具有1至6个碳原子的直链或支链饱和烃基。其实例包括甲基，乙基，正丙基，异丙基，丁基，异丁基，叔丁基，正戊基，戊烷-3-基等。
术语“C1-6烷基氨基”是指基团：-NH-(C1-6烷基)，其中C1-6烷基如上所定义。
术语“C3-7环烷基”是指具有3至7个碳原子的饱和碳环基团。其实例包括环丙基(cPr)，环丁基，环戊基，环己基，环庚基等。
术语“C3-7环烷基氨基”是指基团：-NH-(C3-7环烷基)，其中“C3-7环烷基”如上所定义。其实例包括环丙基氨基，环丁基氨基，环戊基氨基，环己基氨基，环庚基氨基等。
术语“3元至7元杂环烷基氨基”是指被具有3至7个环原子的饱和杂环基团取代的氨基，所述饱和杂环基团包含一个或多个选自-O-、-S-、-NR6-、-SO-和-SO2-的杂原子。其实例包括吡咯烷基氨基，哌啶基氨基，哌嗪基氨基，N-甲基哌嗪基氨基，吗啉基氨基，硫代吗啉基氨基，咪唑烷基氨基，高哌啶基氨基(homopiperizynylamino)，高哌嗪基氨基(homopiperazinylamino)等。
术语“含氮的3至7元杂环”是指具有3至7个环原子的杂环，其包含至少一个氮原子和一个或多个选自-O-、-S-、-NR6-、-SO-和-SO2的杂原子。其实例包括吡咯烷，哌啶，哌嗪，N-甲基哌嗪，吗啉，硫代吗啉，咪唑烷，咪唑啉，高哌啶，高哌嗪等。
在本发明的一个实施方案中，R1选自醛，-CH＝N-OH，-CH＝N-OMe，和-CH＝N-OEt。
在本发明的另一个实施方案中，R2为可以被1至3个氟原子取代的C1-6烷基，例如CH3，CH2CH3，CHF2，CH2F，CF3和CH2CF3，优选CH3或CH2F。
在本发明的另一个实施方案中，R3选自氢、甲基和乙基。
在本发明的另一个实施方案中，R4选自由以下组成的组：羟基，甲基氨基，乙基氨基，环丙基氨基，氧杂环丁烷-3-基氨基，(3-吗啉代丙基)氨基，吡咯烷-3-基氨基或(3-(2-甲基哌啶-1-基)丙基)氨基。优选地，R4选自羟基、乙基氨基、环丙基氨基和氧杂环丁烷-3-基氨基。
在本发明的另一个实施方案中，R3和R4形成基团＝N-O-Z，其中Z是氢原子、C1-6烷基或-(CH2)n-R5，并且R5如上所定义。基团＝N-O-Z的实例包括羟基亚氨基，甲氧基亚氨基，(2-(N,N-二甲基氨基)乙氧基)亚氨基，(2-吗啉代乙氧基)亚氨基，(2-(4-甲基哌嗪基)乙氧基)亚氨基，(乙氧基羰基甲氧基)亚氨基，(羧基甲氧基)亚氨基，((N,N-二甲基氨基)乙酰氧基)亚氨基。
具体而言，本发明的实例包括表1中所示的化合物(化合物1至28)。
[表1]
Figure GDA0002990583800000131
Figure GDA0002990583800000132
Figure GDA0002990583800000141
更具体地，本发明的实例包括下列化合物：
1)3-氯-6-羟基-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,6R)-3-羟基-1,2,3,6-四甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛；
2)3-氯-6-羟基-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,6R,E)-3-(羟基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛；
3)(E)-3-氯-6-羟基-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,6R,E)-3-(羟基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛肟；
4)(E)-3-氯-4-(氟甲氧基)-6-羟基-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,6R,E)-3-(羟基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-2-甲基苯甲醛肟；
5)3-氯-4-(氟甲氧基)-6-羟基-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,6R,E)-3-(羟基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-2-甲基苯甲醛；
6)[(1E,2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-(3-氯-5-甲酰基-6-羟基-2-甲氧基-4-甲基苯基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基亚环己基]氨基2-(二甲基氨基)乙酸酯；
7)(E)-3-氯-6-羟基-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,6R)-3-羟基-1,2,3,6-四甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛肟；
8)(E)-3-氯-6-羟基-4-甲氧基-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,6R,E)-3-(甲氧亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-2-甲基苯甲醛O-甲基肟；
9)(E)-3-氯-4-(氟甲氧基)-6-羟基-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,6R,E)-3-(甲氧亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-2-甲基苯甲醛O-甲基肟；
10)(E)-3-氯-6-羟基-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,6R,E)-3-(羟基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛O-甲基肟；
11)(E)-3-氯-4-(氟甲氧基)-6-羟基-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,6R,E)-3-(羟基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-2-甲基苯甲醛O-甲基肟；
12)3-氯-4-(氟甲氧基)-6-羟基-2-甲基-5-((2E,4E)-3-甲基-5-((1R,2R,6R,E)-1,2,6-三甲基-3-(2-吗啉代乙氧基亚氨基)环己基)戊-2,4-二烯-1-基)苯甲醛；
13)3-氯-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,6R)-3-(环丙基氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-4-(氟甲氧基)-6-羟基-2-甲基苯甲醛；
14)(E)-3-氯-6-羟基-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,6R)-3-羟基-1,2,3,6-四甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛O-甲基肟；
15)(E)-3-氯-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,6R,E)-3-(2-(二甲基氨基)乙氧基亚氨基-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-6-羟基-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛O-甲基肟；
16)(E)-3-氯-6-羟基-4-甲氧基-2-甲基-5-((2E,4E)-3-甲基-5-((1R,2R,6R,E)-1,2,6-三甲基-3-(2-吗啉代乙氧基亚氨基)环己基)戊-2,4-二烯-1-基)苯甲醛O-甲基肟；
17)(E)-3-氯-6-羟基-4-甲氧基-2-甲基-5-((2E,4E)-3-甲基-5-((1R,2R,6R,E)-1,2,6-三甲基-3-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基亚氨基)-环己基)戊-2,4-二烯-1-基)苯甲醛O-甲基肟；
18)2-([[(1E,2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-[3-氯-6-羟基-2-甲氧基-5-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基亚环己基]氨基]氧)乙酸乙酯；
19)2-([[(1E,2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-[3-氯-6-羟基-2-甲氧基-5-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基亚环己基]氨基]氧)乙酸；
20)3-氯-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,6R)-3-(乙基氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-6-羟基-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛；
21)(E)-3-氯-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,6R)-3-(乙基氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-6-羟基-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛O-甲基肟；
22)3-氯-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,6R)-3-(环丙基氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-6-羟基-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛；
23)(E)-3-氯-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,6R)-3-(环丙基氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-6-羟基-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛O-甲基肟；
24)2-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,6R)-3-氨基-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-4-氯-3-甲氧基-6-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-5-甲基苯酚；
25)(E)-3-氯-6-羟基-4-甲氧基-2-甲基-5-((2E,4E)-3-甲基-5-((1R,2R,6R)-1,2,6-三甲基-3-(氧杂环丁烷-3-基氨基)环己基)戊-2,4-二烯-1-基)苯甲醛O-甲基肟；
26)2-([[(1E,2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-[3-氯-6-羟基-2-氟甲氧基-5-甲酰基-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基亚环己基]-氨基]氧)乙酸；
27)2-([[(1E,2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-[3-氯-6-羟基-2-氟甲氧基-5-[(1E)-(羟基亚氨基)甲基]-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基亚环己基]氨基]氧)乙酸；
28)2-([[(1E,2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-[3-氯-2-甲氧基-6-羟基-5-[(1E)-(羟基亚氨基)甲基]-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基亚环己基]氨基]氧)乙酸；
及其药学上可接受的盐。
本发明的实例还包括下列化合物：
7-1)(E)-3-氯-6-羟基-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,3S,6R)-3-羟基-1,2,3,6-四甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛肟；
7-2)(E)-3-氯-6-羟基-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,3R,6R)-3-羟基-1,2,3,6-四甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛肟；
13-1)3-氯-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,3S,6R)-3-(环丙基氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-4-(氟甲氧基)-6-羟基-2-甲基苯甲醛；
13-2)3-氯-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,3R,6R)-3-(环丙基氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-4-(氟甲氧基)-6-羟基-2-甲基苯甲醛；
14-1)(E)-3-氯-6-羟基-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,3S,6R)-3-羟基-1,2,3,6-四甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛O-甲基肟；
14-2)(E)-3-氯-6-羟基-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,3R,6R)-3-羟基-1,2,3,6-四甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛O-甲基肟；
20-1)3-氯-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,3S,6R)-3-(乙基氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-6-羟基-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛；
20-2)3-氯-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,3R,6R)-3-(乙基氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-6-羟基-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛；
21-1)(E)-3-氯-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,3S,6R)-3-(乙基氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-6-羟基-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛O-甲基肟；
21-2)(E)-3-氯-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,3R,6R)-3-(乙基氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-6-羟基-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛O-甲基肟；
22-1)3-氯-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,3S,6R)-3-(环丙基氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-6-羟基-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛；
22-2)3-氯-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,3R,6R)-3-(环丙基氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-6-羟基-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛；
23-1)(E)-3-氯-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,3S,6R)-3-(环丙基氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-6-羟基-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛O-甲基肟；
23-2)(E)-3-氯-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,3R,6R)-3-(环丙基氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-6-羟基-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛O-甲基肟；
24-1)2-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3S,6R)-3-氨基-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-4-氯-3-甲氧基-6-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-5-甲基苯酚；
24-2)2-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3R,6R)-3-氨基-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-4-氯-3-甲氧基-6-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-5-甲基苯酚；
25-1)(E)-3-氯-6-羟基-4-甲氧基-2-甲基-5-((2E,4E)-3-甲基-5-((1R,2R,3S,6R)-1,2,6-三甲基-3-(氧杂环丁烷-3-基氨基)环己基)戊-2,4-二烯-1-基)苯甲醛O-甲基肟；
25-2)(E)-3-氯-6-羟基-4-甲氧基-2-甲基-5-((2E,4E)-3-甲基-5-((1R,2R,3R,6R)-1,2,6-三甲基-3-(氧杂环丁烷-3-基氨基)环己基)戊-2,4-二烯-1-基)苯甲醛O-甲基肟；
根据本发明的一个方面，提供了选自如上所示编号(5)，(8)，(9)，(10)，(11)，(12)，(14)，(15)，(16)，(19)，(21)，(24)，(25)，(26)，(27)，(28)的化合物，特别优选选自如上所示编号(5)，(10)，(12)，(15)，(16)，(19)，(21)和(25)的化合物。
本发明化合物具有增加AMPK及其下游效应子——乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的磷酸化的活性[测试实施例1]。此外，与4-O-甲基-壳二孢氯素(ascoclorin)(MAC)及其前药——MAC与甘氨酰胺的席夫碱(WO2004/074236中的化合物#13)相比，该化合物抗肝脏微粒体(人和小鼠)降解的代谢稳定性显著改善[测试实施例3]，PK特征显著改善，使得能够每天一次口服治疗[测试实施例4]并且溶解度显著改善[测试实施例2]。
本发明的化合物显示出血糖降低活性以及抗高脂血症活性(降低血液甘油三酯和总胆固醇)[测试实施例6]。
由式(I)表示的本发明化合物在低μM浓度下对各种人类癌细胞系显示出抗增殖活性[测试实施例5]，并且通过口服施用还在人类癌症异种移植模型中显示出有效的抗肿瘤活性[测试实施例7]。
本发明的化合物可以以药学上可接受的盐的形式施用。术语“药学上可接受的盐”是指无毒的并且用药学上可接受的碱或酸制备的盐。当本发明化合物为碱性时，其药学上可接受的盐通常通过将化合物与合适的有机酸或无机酸一起加入来制备。酸加成盐的实例包括乙酸盐，苯磺酸盐，苯甲酸盐，柠檬酸盐，富马酸盐，谷氨酸盐，氢溴酸盐，盐酸盐，乳酸盐，马来酸盐，扁桃酸盐，甲磺酸盐，草酸盐，棕榈酸盐，磷酸盐/二磷酸盐，水杨酸盐，硬脂酸盐，硫酸盐，琥珀酸盐，酒石酸盐，和甲苯磺酸盐。
此外，当本发明化合物为酸性时，其药学上可接受的盐通常通过将化合物与合适的有机碱或无机碱一起加入来制备。碱加成盐的实例包括衍生自无机碱的盐，包括铝、铵、钙、钾、钠等。特别优选的是铵盐、钙盐、钾盐和钠盐。碱加成盐的实例还包括衍生自伯胺、仲胺和叔胺的盐，所述伯胺、仲胺和叔胺例如精氨酸，甜菜碱，2-二乙基氨基乙醇，2-二甲基氨基乙醇，乙醇胺，N-乙基吗啉，N-乙基哌啶，葡糖胺(glucamine)，氨基葡萄糖(glucosamine)，组氨酸，赖氨酸，甲基葡糖胺，吗啉，哌嗪，哌啶，三乙胺，三丙胺等。
本发明的化合物可以作为前药施用。前药可以根据本领域技术人员通常可用的技术知识来制备。例如，在本发明化合物中存在羧基(-COOH)或羟基的情况下，前药可通过将羧基转化为药学上可接受的酯基，例如甲基、乙基或新戊酰氧基甲基酯，或者通过将羟基转化为药学上可接受的酯基，例如乙酸酯或马来酸酯来制备。前药的使用对于改变溶解度或水解特性以用作缓释或前药制剂而言，可能是有益的。
在一个实施方案中，本发明的化合物可以以无定形形式或结晶形式使用。结晶形式可以包括溶剂以形成溶剂合物，例如水合物。应该理解的是，本发明涵盖了包含本发明化合物的这样的溶剂合物或任意混合物，例如溶液、悬浮液或固体混合物的任意用途。
根据本发明的一个方面，提供了一种用于治疗或预防涉及AMPK失调的疾病的方法，其包括向需要其的患者施用治疗有效量的由式(I)表示的化合物，或其药学上可接受的盐。如上所述，举例说明了涉及AMPK失调的疾病。本领域技术人员可以确定合适的施用途径。其实例包括口服、直肠内、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、脑池内、阴道、腹膜内、膀胱内、局部(滴注、粉末、软膏、凝胶或乳膏)施用和吸入(口内或鼻腔喷雾)。用于施用的剂型包括用于口服使用的片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、丸剂、水性和非水性溶液或悬浮液，以及装入容器中的肠胃外溶液。
根据本发明的一个方面，提供了一种药物组合物，其包含由式(I)表示的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的赋形剂或添加剂。该组合物可以以合适的途径施用，例如口服、直肠内、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、脑池内、阴道、腹膜内、膀胱内、局部(滴注、粉末、软膏、凝胶或乳膏)施用和吸入(口内或鼻腔喷雾)。用于施用的剂型包括用于口服使用的片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、丸剂、水性和非水性溶液或悬浮液，以及装入容器中的肠胃外溶液。
化合物或药物组合物可以作为药物制剂施用。药物制剂可以通过众所周知的方法，使用添加剂，例如赋形剂、包衣剂润滑剂、粘合剂、崩解剂、稳定剂、矫味剂、稀释剂、溶剂和表面活性剂或乳化剂来生产。
赋形剂的实例包括淀粉例如马铃薯淀粉和玉米淀粉、乳糖、结晶纤维素、和磷酸氢钙。
包衣剂的实例包括乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、虫胶、滑石、巴西棕榈蜡和石蜡。
润滑剂的实例包括硬脂酸镁和硬脂酸。
粘合剂的实例包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇以及与赋形剂例举的物质相同的物质。
崩解剂的实例包括与赋形剂例举的物质相同的物质和交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠和化学改性淀粉或纤维素。
稳定剂的实例包括对羟基苯甲酸酯例如对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯；醇例如氯丁醇、苯甲醇和苯乙醇；苯扎氯铵；酚类例如苯酚和甲酚；硫柳汞；脱氢乙酸；和抗坏血酸。
矫味剂的实例包括常规使用的甜味剂。
稀释剂的实例包括如赋形剂列举的物质。
溶剂的实例包括乙醇、苯酚、氯甲酚、净化水和蒸馏水。
表面活性剂或乳化剂的实例包括聚山梨醇酯80、硬脂酸酯聚烃氧40酯、聚桂醇、大豆油、Maisin 35-1(Gattefosse，法国)和Cremophor(BASF，德国)。
化合物或其药学上可接受的盐的剂量根据症状、年龄、体重、相对健康状况、其他药物的存在、施用方法等而不同。例如，作为活性成分向患者(温血动物，特别是人)施用的口服剂的通常有效剂量为优选每千克体重0.1至1000mg，更优选每千克体重1至30mg的每日剂量。正常体重的成人患者的每日剂量优选在10-1000mg的范围内。对于肠胃外剂而言，每日剂量优选为每千克体重0.1至1000mg，更优选每千克体重10至800mg。优选地，根据症状，这种剂量在同一时间施用或每天以几部分施用，或间歇给药。
本发明化合物还可与一种或多种其他药物组合用于预防或治疗上述疾病、病症和病况的方法。即，本发明化合物可以与一种或多种其他药物组合施用，用于治疗、预防、抑制或改善例如癌症、2型糖尿病、代谢综合征相关疾病和阿尔茨海默病的疾病或病况。其他药物可以以对于其通常已知的途径和量，与式(I)化合物同时或相继施用。当该化合物与一种或多种其他药物同时施用时，这些成分可以包含在单一单位剂型或两种或更多种单独剂型中。然而，在组合治疗中，本发明化合物和一种或多种其他药物以不同的重叠时间表施用。还预期在组合治疗中，本发明化合物和其他活性成分可以以比每种单独施用时更低的剂量施用。因此，除了由式(I)表示的化合物或其药学上可接受的盐之外，本发明的药物组合物还可以包含一种或多种其他活性成分。
可以在组合疗法中施用的其他活性成分的实例包括但不限于：
1)用于糖尿病的药物：a)二肽基肽酶IV(DPP IV)抑制剂，b)PPARγ激动剂，例如吡格列酮，c)双胍类，如二甲双胍，d)胰岛素或胰岛素模拟物，磺酰脲类，d)α-糖苷酶抑制剂，例如阿卡波糖，e)GLP-1、GLP-1类似物或模拟物，和GLP-1受体激动剂例如艾塞那肽(exenatide)，和f)钠-葡萄糖协同转运蛋白-2抑制剂(SGLT-2抑制剂：例如达格列嗪(dapagliflozin))。
2)用于高脂血症的药物：a)胆固醇降低剂，例如i)HMGACoA还原酶抑制剂(例如阿托伐他汀钙(atorvastatin calcium)、辛伐他汀(simvastatin))b)PPARα/γ双重激动剂，c)胆固醇吸收抑制剂，
3)用于癌症的药物：a)细胞毒性剂(例如紫杉烷、蒽环类、CPT-11、5-FU、卡培他滨(capecitabine)、铂剂)，ii)分子靶向剂，例如激酶抑制剂(例如索拉非尼、拉帕替尼(lapatinib)、雷帕霉素(rapamycin)、厄洛替尼(erlotinib)、舒尼替尼(sunitinib)、维罗非尼(vemurafenib))，iii)抗体(曲妥珠单抗(trastuzumab)、利妥昔单抗(rituximab)、西妥昔单抗(cetuximab)、贝伐单抗(bevacizumab)、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体)
4)用于阿尔茨海默病的药物：药剂例如加兰他敏(galantamine)、利凡斯的明(rivastigmine)、多奈哌齐(donepezil)、美金刚(memantine)。
以下方案和实施例说明了制备由式(I)表示的化合物的合成方法。
如1970年公布的JP S45-009832B中所述，可通过Ascochyts viciae Libert的发酵来获得原料壳二孢氯素(ascochhlorin)。在以下方案中，R2，R3，R4，R5，R7，Y和Z如上所述。
方案1
Figure GDA0002990583800000221
方案1示出了用于制备化合物(IV)、(VIa)或(VIb)的方法。其中R2为甲基的化合物(II)(4-O-甲基-壳二孢氯素)可以通过JP H6-305959A中记载的方法来制备。其中R2为氟化的烷基的化合物(II)可以通过在适当溶剂中在碱的存在下用氟烷基化试剂进行O-烷基化获得。碱的实例包括碳酸钾、碳酸铯等。氟烷基化试剂的实例包括溴氟甲烷，双(三氟甲基)-双(三氟甲氧基)-硫烷，5-叔丁基-2'(三氟甲氧基)联苯基-2-重氮六氟锑酸盐，甲基磺酸2,2,2-三氟乙酯，2-重氮-1,1,1-三氟乙烷，三氟甲烷，1-氯-4-[氯-二氟甲基]磺酰基苯等。
化合物(Ⅳ)可以通过使化合物(Ⅱ)与NH2OY(Ⅲ)在例如吡啶、碳酸钠、碳酸氢钠等碱的存在下进行反应来制备。化合物(VIb)可以通过使化合物(IV)与NH2OZ(V)在例如吡啶、碳酸钠、碳酸氢钠等碱的存在下进行反应来制备。化合物(VIa)可以通过在与上述相同的反应条件下使二当量或更多当量的羟胺(III)反应而由化合物(II)直接制备。
其中Z是-(CH2)nCO2H的化合物(VIb)可以通过其中Z是-(CH2)nCO2R6的相应酯衍生物(VIb)的碱性水解来制备。
方案2
Figure GDA0002990583800000231
方案2示出了用于制备化合物(X)的方法。其中R2是甲基或氟化的烷基的化合物(VIII)可以通过JP 2005-225851A中描述的方法经由O-乙酰基衍生物(VII)(其中R2是甲基或氟化的烷基)由壳二孢氯素来制备。中间体(IX)可以通过使中间体(VIII)与NH2O-Z(V)在例如吡啶、碳酸钠、碳酸氢钠等碱的存在下进行反应来制备。化合物(Ⅹ)可通过本领域技术人员已知的方法，通过在合适的溶剂中酸性水解化合物(IX)的缩醛基团来制备。
方案3
Figure GDA0002990583800000232
方案3示出了用于制备化合物(X)的另一种方法。化合物(X)可以通过在100℃下、在THF/H2O中用盐酸处理相应的肟衍生物(VI)来制备。
方案4
Figure GDA0002990583800000241
方案4示出了用于制备化合物XII(XII)和(XIII)的方法。中间体(Ⅺ)可以通过使中间体(Ⅷ)与烷基化剂，例如烷基锂、烷基格氏试剂(alkyl Grignard agent)或烷基铜锂试剂在适当的溶剂中进行反应来制备。化合物(ⅩII)可通过在合适的溶剂中酸性水解中间体(XI)的缩醛基团来制备。
化合物(ⅩⅢ)可以通过使中间体(Ⅳ)与上述烷基化剂在适当的溶剂中反应来制备。化合物(XIII)还可以通过使化合物(XII)与NH2-OY(III)在例如吡啶、碳酸钠、碳酸氢钠等碱的存在下进行反应来制备。化合物(XII)也可以在如方案3所述的类似反应条件下由化合物(XIII)制备。
方案5a
Figure GDA0002990583800000251
方案5a示出了制备化合物(XV)和(XVI)的方法，其中R11是C1-6烷基，C3-7环烷基，或含有-O-、-S-、-NR6-、或-SO2作为环原子的3元至7元杂环烷基。中间体(XIV)可以通过使用还原剂例如氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠等，用伯胺R11-NH2使中间体(VIII)还原胺化而一步制备，或者经由中间体亚胺(XVII)分步制备。
化合物(ⅩV)可通过本领域已知的方法，通过在合适的溶剂中酸性水解化合物(XIV)的缩醛基团来制备。化合物(XVI)可以通过上述相同的方法用伯胺R11-NH2使中间体(IV)还原胺化而直接制备，或者经由中间体(XVIII)分步制备。
化合物(XV)也可以在如方案3中所述的类似反应条件下由式(XVI)表示的肟醚衍生物制备。
方案5b
Figure GDA0002990583800000261
其中R11为C1-6烷基、C3-7环烷基或含有-O-、-S-、-NR6-、-SO-或-SO2-作为环原子的3元至7元杂环烷基氨基(例如氧杂环丁烷)的化合物(XVI)可以由中间体(IV)分两步制备：(i)通过用乙酸铵/氰基硼氢化钠在乙醇中还原胺化，(ii)随后用对应于R11的酮(如氧杂环丁烷-3-酮)和三乙酰氧基硼氢化钠在二氯甲烷中使所得中间体(XIX)进行第二次还原胺化。
方案6
Figure GDA0002990583800000262
方案6示出了制备化合物(XXI)的方法，其中R11是C1-6烷基，C3-7环烷基，或含有-O-、-S-、-NR6-、或-SO2作为环原子的3元至7元杂环烷基。中间体(XX)可通过方案2或3制备。化合物(XXI)可以通过本领域技术人员已知的活性酯方法或缩合剂用式R12CO2H的羧酸对XX进行酯化来制备。
当式(I)表示的本发明化合物以游离形式获得时，其可以通过常规方法转化成盐。
实施例
以下，将使用实施例更具体地描述本发明，然而，不应将其解释为限于此。
使用Brucker、AVANCE 400MHz或300MHz进行NMR分析，并且NMR数据表示为化学位移ppm(百万分率)(δ)，并且参考来自样品溶剂的氘锁定信号。质谱数据使用装备有光电二极管阵列SPD-M20A、ESI-SQD 2020或2010(Shimadzu)的LC-MS、Shimazu LCMS-2020或LCMS-2010获得。
市售试剂不经进一步纯化即可使用。“室温”是指范围自约20℃至25℃的温度。所有非水性反应均在氮气氛下进行。减压下浓缩或蒸馏溶剂意味着使用旋转蒸发器。
在化合物的制备中，根据需要用保护基团来保护官能团以获得目标化合物，然后除去保护基团。例如，根据Greene和Wuts，“Protective groups in Organic Synthesis”(第二版，John Wiley&Sons，1991)中描述的方法，进行保护基团的选择，以及引入或除去保护基团的步骤。
实施例1
3-氯-4-(氟甲氧基)-6-羟基-2-甲基-5-[(2E,4E)-3-甲基-5-[(1R,2R,6R)-1,2,6-三甲基-3-氧代环己基]戊-2,4-二烯-1-基]苯甲醛的合成。
Figure GDA0002990583800000271
将3-氯-4,6-二羟基-2-甲基-5-[(2E,4E)-3-甲基-5-[(1R,2R,6R)-1,2,6-三甲基-3-氧代环己基]戊-2,4-二烯-1-基]苯甲醛(壳二孢氯素(ascochlorine)，6g，14.82mmol)的乙腈(120mL)溶液，溴氟甲烷(过量)，碳酸铯(2.4g，7.38mmol)置于250-mL密封管中。所得混合物在25℃下搅拌16h。过滤混合物，并真空浓缩滤液。所得残余物通过硅胶柱色谱法用石油醚/乙酸乙酯(5:1)纯化。产物从1:5比例的二氯甲烷/己烷中重结晶，得到标题化合物(4.5g，70％)，呈灰白色固体。
LC-MS(ES,m/z):435[M-H]-
H-NMR(400MHz,DMSO,ppm):δ12.60(s,1H),10.30(s,1H),5.86(m,2H),5.72(s,1H),5.42(m,2H),3.50(d,J＝7.2Hz,2H),2.64(s,3H),2.54-2.49(m,2H),2.17(m,1H),2.05(m,1H),1.84(s,4H),1.52(m,1H),0.73-0.67(m,6H),0.59(s,3H)
F-NMR(400MHz,DMSO,ppm):δ-148.31.
实施例2
(2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-[3-氯-5-(二乙氧基甲基)-2-(氟甲氧基)-6-羟基-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基环己烷-1-酮的合成
Figure GDA0002990583800000281
步骤1
将3-氯-4(氟甲氧基)-6-羟基-2-甲基-5-[(2E,4E)-3-甲基-5-[(1R,2R,6R)-1,2,6-三甲基-3-氧代环己基]戊-2,4-二烯-1-基]苯甲醛[实施例1](600mg，1.37mmol)的吡啶(12mL)溶液置于50-mL圆底烧瓶中，该圆底烧瓶用氮气吹扫并保持在氮气氛下，并在25℃下加入乙酸酐(196mg，1.92mmol)。所得溶液在25℃下搅拌1.5h。然后将混合物用二氯甲烷(50mL)稀释并用盐酸水溶液洗涤(0.3mol/L，20mL×5)。有机层用无水硫酸钠干燥并真空浓缩，得到乙酸4-氯-3-(氟甲氧基)-6-甲酰基-5-甲基-2-[(2E,4E)-3-甲基-5-[(1R,2R,6R)-1,2,6三甲基-3-氧代环己基]戊-2,4-二烯-1-基]苯酯(500mg，76％)，呈白色固体。
步骤2
将乙酸4-氯-3(氟甲氧基)-6-甲酰基-5-甲基-2-[(2E,4E)-3-甲基-5-[(1R,2R,6R)-1,2,6-三甲基-3-氧代环己基]戊-2,4-二烯-1-基]苯酯(500mg，1.04mmol)的乙醇(22.5mL)溶液置于250-mL圆底烧瓶中，该圆底烧瓶被氮气吹扫并保持在氮气氛下，在25℃下加入三乙胺(0.02mL)。溶液在25℃下搅拌5h，真空浓缩得到(2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-[3-氯-5-(二乙氧基甲基)-2-(氟甲氧基)-6-羟基-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基环己烷-1-酮(410mg，77％)，呈黄色油状。
实施例3
3-氯-6-羟基-5-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3S,6R)-3-羟基-1,2,3,6-四甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛(化合物1-1)的合成
Figure GDA0002990583800000291
其中R2是甲基的中间体(VIII)：(4R,5R,6S)-5-[(1E,3E)-5-[3-氯-5-(二乙氧基甲基)-6-羟基-2-甲氧基-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-4,5,6-三甲基四氢吡喃-3-酮(trimethyloxan-3-one)按照JP 2005-225851 A中描述的方法由壳二孢氯素制备。
步骤1
将(2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-[3-氯-5-(二乙氧基甲基)-6-羟基-2-甲氧基-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基环己烷-1-酮(1g，2.03mmol)的四氢呋喃(30mL)溶液置于50-mL三颈圆底烧瓶中，所述烧瓶被氮气吹扫并保持在氮气氛下，随后在-78℃下在搅拌下滴加甲基溴化镁(2mL,3.00equiv,3M)。所得溶液在0℃下搅拌3h。然后通过加入饱和氯化铵水溶液(30mL)来淬灭反应。将所得混合物用乙醚(30mL×3)萃取，将有机层合并，并用饱和氯化钠水溶液(50mL)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。用下列条件通过快速-制备型-HPLC纯化所得残余物，得到4-氯-2-(二乙氧基甲基)-6-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3S,6R)-3-羟基-1,2,3,6-四甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-5-甲氧基-3-甲基苯酚(0.6g，60％)，呈淡黄色固体(mp.39-40℃)。
快速-制备型-HPLC条件(IntelFlash-1)：柱，C18硅胶；流动相，乙腈/水＝70/30，在10分钟内增加至CH3CN/水＝90/10，然后在10分钟内至CH3CN；检测器，UV 210nm。LC-MS(ESI,m/z):507[M-H]-
H-NMR(CD3CN,400MHz,ppm):δ5.91(d,J＝16.4Hz,1H),5.83(s,1H),5.38-5.43(m,1H),5.30(d,J＝16Hz,1H),3.72-3.79(m,5H),3.62-3.68(m,2H),3.46(d,J＝5.6Hz,2H),2.33(s,3H),1.87(s,3H),1.45-1.70(m,3H),1.29-1.35(m,2H),1.20-1.25(m,7H),1.12(s,3H),0.90(s,3H),0.80(d,J＝5.6Hz,3H),0.70(d,J＝5.4Hz,3H).
步骤2
将4-氯-2-(二乙氧基甲基)-6-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3S,6R)-3-羟基-1,2,3,6-四甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-5-甲氧基-3-甲基苯酚(355mg，0.699mmol)的四氢呋喃/水(10mL/20mL)溶液置于50-mL圆底烧瓶中，所述烧瓶被氮气吹扫并保持在氮气氛下，随后加入乙酸(5mL)。所得溶液在25℃下搅拌5h。将所得溶液真空浓缩。用下列条件通过快速-制备型-HPLC纯化所得残余物，得到3-氯-6-羟基-5-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3S,6R)-3-羟基-1,2,3,6-四甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛(0.26g，76％，化合物1)，呈灰白色固体(mp.42-43℃)。
快速-制备型-HPLC条件(IntelFlash-1)：柱，C18硅胶；流动相，CH3CN/水＝70/30，在10分钟内增加至CH3CN/水＝90/10；检测器，UV 210nm。
LC-MS(ESI,m/z):433[M-H]-
H-NMR(CD3CN,400MHz,ppm):δ10.25(s,1H),5.89(d,J＝16.0Hz,1H),5.40(t,J＝1.2Hz,1H),5.29(d,J＝16.0Hz,1H),3.84(s,3H),3.48(d,J＝7.2Hz,2H),2.63(s,3H),1.87(s,3H),1.57-1.78(m,3H),1.33-1.47(m,3H),1.09(s,3H),0.79(d,J＝3.2Hz,3H),0.68(d,J＝6.8Hz,3H).
实施例4
3-氯-6-羟基-5-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3E,6R)-3-(羟基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛(化合物2)的合成；
Figure GDA0002990583800000301
步骤1
将(2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-[3-氯-5-(二乙氧基甲基)-6-羟基-2-甲氧基-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基环己烷-1-酮(1g，2.03mmol)的吡啶(30mL)溶液置于50-mL三颈圆底烧瓶中，所述烧瓶被氮气吹扫并保持在氮气氛下，随后加入盐酸羟胺(200mg，2.88mmol)。混合物在25℃下搅拌16h。反应混合物真空浓缩。用下列条件通过快速-制备型-HPLC纯化残余物，得到4-氯-2-(二乙氧基甲基)-6-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3E,6R)-3-(羟基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-5-甲氧基-3-甲基苯酚(0.40g，39％)，呈灰白色固体(mp.68-70℃)。
快速-制备型-HPLC条件(IntelFlash-1)：柱，C18硅胶；流动相，CH3CN/水＝70/30，在15min内增加至CH3CN/水＝90/10，然后在10min内至乙腈；检测器，UV 210nm。
LC-MS:(ESI,m/z):506[M-H]-
H-NMR:(CD3CN,400MHz,ppm):δ5.95(d,J＝16.0Hz,1H),5.81(s,1H),5.42(q,J＝12.8Hz,4.8Hz,2H),3.69-3.77(m,5H),3.59-3.66(m,2H),3.45(d,J＝7.2Hz,2H),3.27-3.32(m,1H),2.47(s,3H),2.27(d,J＝6.8Hz,1H),1.88(s,3H),1.60-1.72(m,3H),1.19-1.29(m,7H),0.82(d,J＝6.8Hz,3H),0.72(d,J＝6.8Hz,3H),0.67(s,3H).
步骤2
将4-氯-2-(二乙氧基甲基)-6-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3E,6R)-3-(羟基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-5-甲氧基-3-甲基苯酚(370mg，0.726mmol)的四氢呋喃/水(10mL/20mL)溶液置于100-mL双颈圆底烧瓶中，所述烧瓶被氮气吹扫并保持在氮气氛下，随后加入乙酸(10mL)。混合物在25℃下搅拌5h。反应混合物真空浓缩。用下列条件通过快速-制备型-HPLC纯化残余物，得到3-氯-6-羟基-5-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3E,6R)-3-(羟基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛(220mg，70％，化合物2)，呈淡黄色固体(mp.158-160℃)。
快速-制备型-HPLC条件(IntelFlash-1)：柱，C18硅胶；流动相，CH3CN/水＝70/30，在10分钟内增加至CH3CN/水＝90/10；检测器，UV 210nm。
LC-MS(ESI,m/z):432[M-H]-
H-NMR(CD3CN,400MHz,ppm):δ10.25(s,1H),5.94(d,J＝16.4Hz,1H),5.44(q,J＝15.6Hz,6.8Hz,2H),3.85(s,3H),3.50(d,J＝7.2Hz,2H),3.29(t,J＝8.4Hz,1H),2.63(s,3H),2.21(q,J＝13.6Hz,6.8Hz,1H),1.90(s,3H),1.60-1.69(m,3H),1.20-1.33(m,1H),0.81(d,J＝6.8Hz,3H),0.71(d,J＝6.8Hz,3H),0.66(s,3H).
实施例5
4-氯-2-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3E,6R)-3-(羟基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-6-[(1E)-(羟基亚氨基)甲基]-3-甲氧基-5-甲基苯酚(化合物3)的合成
Figure GDA0002990583800000321
将3-氯-6-羟基-4-甲氧基-2-甲基-5-[(2E,4E)-3-甲基-5-[(1R,2R,6R)-1,2,6-三甲基-3-氧代环己基]戊-2,4-二烯-1-基]苯甲醛(700mg，1.67mmol，壳二孢氯素)的吡啶(14mL)溶液置于25-mL圆底烧瓶中，随后在25℃下加入盐酸羟胺(290mg，4.17mmol)。将混合物在25℃下搅拌16h，然后真空浓缩。用二氯甲烷(100mL)稀释后，所得溶液用盐酸水溶液(1N，50mL×2)和盐水(50mL)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。将所得残余物通过快速-制备型-HPLC用下列条件纯化，得到标题化合物(221.8mg，29.6％)，呈白色固体。
快速-制备型-HPLC条件(IntelFlash-1)：柱，硅胶；流动相，CH3CN/水(0.08％碳酸氢铵)＝50/50，在25min内增加至CH3CN/水(0.08％碳酸氢铵)＝80/20；检测器，UV 254nm。
LC-MS(ES,m/z):449[M+H]+
H-NMR(CD3OD,400MHz,ppm):8.56(s,1H),5.92(d,J＝16Hz,1H),5.46(m,2H),3.78(s,3H),3.52(d,J＝7.2Hz,2H),3.41(m,1H),3.31(m,1H),2.43(s,3H),2.20(m,1H),1.91(s,3H),1.67(m,3H),1.33(m,1H),0.91-0.69(m,9H)
实施例6
3-氯-4-(氟甲氧基)-6-羟基-5-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3E,6R)-3-(羟基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2-甲基苯甲醛(化合物5)的合成
Figure GDA0002990583800000331
步骤1
将(2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-[3-氯-5-(二乙氧基甲基)-2-(氟甲氧基)-6-羟基-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基环己烷-1-酮[实施例2](410mg，0.80mmol)的吡啶(12.3mL)溶液置于25-mL圆底烧瓶中，随后在25℃下加入盐酸羟胺(83.7mg，1.20mmol，1.50equiv)。将混合物在25℃下搅拌过夜，然后用二氯甲烷(300mL)稀释。有机层用氯化氢水溶液(0.3mol/L,200mLx5)洗涤。将有机层合并并真空浓缩，得到4-氯-2-(二乙氧基甲基)-5-(氟甲氧基)-6-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3E,6R)-3-(羟基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-3-甲基苯酚(330mg，78％)，呈黄色固体。
步骤2
将4-氯-2-(二乙氧基甲基)-5-(氟甲氧基)-6-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3E,6R)-3-(羟基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-3-甲基苯酚(330mg，0.63mmol)的四氢呋喃(6.6mL)溶液置于250-mL圆底烧瓶中，然后在25℃下加入冰醋酸(6.6mL,5.56equiv)的水(13.2mL)溶液。将混合物在25℃下搅拌4h，然后用二氯甲烷(100mL×5)萃取。将有机层合并，用碳酸氢钠水溶液将溶液的pH值调节至7-8。将所得有机层分离，干燥并在真空下浓缩。用下列条件通过快速-制备型-HPLC纯化所得残余物，得到3-氯-4-(氟甲氧基)-6-羟基-5-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3E,6R)-3-(羟基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2-甲基苯甲醛(200mg，71％，化合物5)，呈黄色固体。
快速-制备型-HPLC条件(IntelFlash-1)：柱，C18硅胶；流动相，CH3CN/H2O＝50/50，在28min内增加至CH3CN/H2O＝80/20；检测器，UV 254nm。
LC-MS(ES,m/z):452[M+H]+
H-NMR(DMSO,300MHz,ppm):12.59(s,1H),10.34(s,1H),10.30(s,1H),5.85-5.90(t,2H),5.70(s,1H),5.43(s,1H),5.38(d,J＝4.5Hz,2H),3.48-3.51(d,J＝7.5Hz,2H),3.31-3.20(m,1H),2.72-2.64(d,J＝24.9Hz,1H),2.26-2.18(m,1H),1.84(s,3H),1.63-1.54(m,3H),1.24-1.19(d,J＝13.2Hz,1H).
实施例7
[(1E,2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-(3-氯-5-甲酰基-6-羟基-2-甲氧基-4-甲基苯基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基亚环己基]氨基2-(二甲基氨基)乙酸酯(化合物6)的合成
Figure GDA0002990583800000341
步骤1
将2-(二甲基氨基)乙酸(15mg，0.15mmol)的二氯甲烷(0.4mL)溶液置于25-mL圆底烧瓶中，随后在25℃下加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺甲碘化物(45mg，0.15mmol)、1-羟基苯并三唑(21mg，0.16mmol)和N-甲基吗啉(15mg，0.15mmol)。混合物在25℃下搅拌30min。然后加入3-氯-6-羟基-5-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3E,6R)-3-(羟基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛[化合物2，实施例3](60mg，0.14mmol)。将所得混合物在25℃下搅拌2h，然后用水(10mL)和盐水(10mL)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。将所得残余物通过制备型-HPLC用下列条件纯化，得到标题化合物(30mg，42％)，呈黄色固体。
制备型-HPLC条件：柱，X Bridge C18，19*150mm 5um；流动相，CH3CN/水(0.05％碳酸氢铵)＝50/50，在30min内增加至CH3CN/水(0.05％碳酸氢铵)＝100/0；检测器，UV254nm。
LC-MS:(ES,m/z):519[M+H]+
H-NMR:(CD3OD,400MHz,ppm):10.30(s,1H),5.96(d,J＝16Hz,1H),5.46(m,2H),3.83(s,3H),3.52(d,J＝7.2Hz,2H),3.34(s,2H),3.31(m,1H),2.64(s,3H),2.47-2.32(m,7H),1.95(m,4H),1.76(m,2H),1.39(m,1H),0.97(d,J＝6.8Hz,3H),0.75-0.88(m,6H).
步骤2
向50-mL圆底烧瓶中的[(1E,2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-(3-氯-5-甲酰基-6-羟基-2-甲氧基-4-甲基苯基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基亚环己基]氨基2-(二甲基氨基)乙酸酯中加入氯化氢的四氢呋喃溶液(0.0225M,13mL)。混合物在25℃下搅拌5min，然后真空浓缩得到[(1E,2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-(3-氯-5-甲酰基-6-羟基-2-甲氧基-4-甲基苯基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基亚环己基]氨基2-(二甲基氨基)乙酸酯盐酸盐(101.6mg，63％)，呈淡黄色固体。
LC-MS:(ES,m/z):519[M+H]+
H-NMR:(CD3OD,300MHz,ppm):10.30(s,1H),5.96(d,J＝17.7Hz,1H),4.34(m,2H),3.83(s,3H),3.52(m,2H),2.81-3.15(m,6H),3.31(m,1H),2.64(s,3H),2.45(m,1H),1.60-2.11(m,7H),1.39(m,1H),0.97(m,3H),0.78(m,6H).
实施例8
4-氯-3-(氟甲氧基)-2-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3E,6R)-3-(羟基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-6-[(1E)-(羟基亚氨基)甲基]-5-甲基苯酚(化合物4)的合成
Figure GDA0002990583800000351
将3-氯-4-(氟甲氧基)-6-羟基-2-甲基-5-[(2E,4E)-3-甲基-5-[(1R,2R,6R)-1,2,6-三甲基-3-氧代环己基]戊-2,4-二烯-1-基]苯甲醛[实施例1](250mg，0.57mmol)的吡啶(7.5mL)溶液置于25-mL圆底烧瓶中，随后在25℃下加入盐酸羟胺(80mg，1.15mmol)。将混合物在25℃下搅拌16h，并真空浓缩。将所得残余物通过快速-制备型-HPLC用下列条件纯化，得到标题化合物(201.7mg，75％，化合物4)，呈白色固体。
快速-制备型-HPLC条件(IntelFlash-1)：柱，硅胶；流动相，CH3CN/水(0.08％碳酸氢铵)＝70/30，在15min内增加至CH3CN/水(0.08％碳酸氢铵)＝90/10；检测器，UV 220nm。
LC-MS:(ES,m/z):467[M+H]+
H-NMR:(CD3OD,400MHz,ppm):8.55(s,1H),5.90(d,J＝16Hz,1H),5.72(s,1H),5.58(s,1H),5.39-5.47(m,1H),3.58(d,J＝7.2Hz,2H),3.36-3.42(m,1H),2.43(s,3H),2.18(t,1H),1.89(s,3H),1.61-1.70(m,3H),1.29-1.35(m,1H).
实施例9
4-氯-2-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3S,6R)-3-羟基-1,2,3,6-四甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-6-[(1E)-(羟基亚氨基)甲基]-3-甲氧基-5-甲基苯酚(化合物7-1)的合成
Figure GDA0002990583800000361
将3-氯-6-羟基-5-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3S,6R)-3-羟基-1,2,3,6-四甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛[化合物1，实施例2](160mg，0.37mmol)的吡啶(9.6mL)溶液置于25-mL圆底烧瓶中，随后在25℃下加入盐酸羟胺(25.6mg，0.37mmol，1.00equiv)。将混合物在25℃下搅拌16h，然后真空浓缩。将所得残余物通过快速-制备型-HPLC用下列条件纯化，得到标题化合物(114.0mg，69％，化合物7-1)，呈白色固体。
快速-制备型-HPLC条件(IntelFlash-1)：柱，硅胶；流动相，CH3CN/水(0.08％NH4HCO3)＝70/30，在15min内增加至CH3CN/水(0.08％NH4HCO3)＝90/10；检测器，UV 254nm。
LC-MS:(ES,m/z):450[M+H]+
H-NMR:(CD3OD,400MHz,ppm):8.55(s,1H),5.87(d,J＝16Hz,1H),5.42(t,1H),5.24(d,J＝16Hz,1H),3.78(s,3H),3.47-3.53(m,2H),2.44(s,3H),1.88(s,3H),1.46-1.72(m,3H),1.30-1.37(m,2H),1.21(m,3H),1.15(s,1H),0.92(s,3H),0.84(d,J＝7.2Hz,3H),0.72(d,J＝6.8Hz,3H).
实施例10
4-氯-3-甲氧基-2-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3E,6R)-3-(甲氧基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-6-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-5-甲基苯酚(化合物8)的合成
Figure GDA0002990583800000371
标题化合物按照实施例4中所述的类似方法由4-O-甲基-壳二孢氯素制备，不同之处在于使用O-甲基羟胺盐酸盐代替盐酸羟胺。
LC-MS:(ES,m/z):477[M+H]+
H-NMR:(DMSO,400MHz,ppm):δ10.80(s,1H),8.64(s,1H),5.89(d,J＝16.1Hz,1H),5.46-5.37(m,2H),3.96(s,3H),3.75(s,3H),3.71(s,3H),3.45(d,J＝7.2Hz,2H),3.15-3.11(m,1H),2.41(s,3H),2.223(q,J＝6.8Hz,1H),1.84(s,3H),1.66(m,3H),1.20(td,J＝14.4,13.1,6.3Hz,1H),0.80(d,J＝6.8Hz,3H),0.65(m,6H).实施例11
4-氯-3-(氟甲氧基)-2-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3E,6R)-3-(甲氧基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-6-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-5-甲基苯酚(化合物9)的合成
Figure GDA0002990583800000372
标题化合物按照实施例8中所述的类似方法由4-O-氟甲基-壳二孢氯素制备，不同之处在于使用O-甲基羟胺盐酸盐代替盐酸羟胺。
LC-MS(ES,m/z):[M+H]+:495.
1H NMR(300MHz,Methanol-d4)δ8.60(s,1H),5.89(d,J＝16.2Hz,1H),5.64(d,J＝54.3Hz,2H),5.42(t,J＝7.2Hz,1H),5.36(d,J＝16.2Hz,1H),3.97(s,3H),3.73(s,3H),3.58(d,J＝7.2Hz,2H),3.23-3.26(m,1H),2.43(s,3H),2.17(q,J＝6.9Hz,1H),1.87(s,3H),1.60-1.71(m,3H),1.30-1.33(m,1H),0.86(d,J＝6.9Hz,3H),0.73(d,J＝6.6Hz,3H),0.67(s,3H).
实施例12
4-氯-2-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3E,6R)-3-(羟基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-3-甲氧基-6-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-5-甲基苯酚(化合物10)的合成
Figure GDA0002990583800000381
步骤1
将3-氯-6-羟基-4-甲氧基-2-甲基-5-[(2E,4E)-3-甲基-5-[(1R,2R,6R)-1,2,6-三甲基-3-氧代环己基]戊-2,4-二烯-1-基]苯甲醛(4-O-甲基-壳二孢氯素，350mg，0.84mmol)和NH2OMe.HCl(69.3mg，0.83mmol)混合物的吡啶(4mL)溶液置于50-mL圆底烧瓶中，所述圆底烧瓶用氩气吹扫并保持在氩气氛下。将混合物在室温下搅拌过夜，并真空浓缩。用下列条件通过制备型-HPLC纯化残余物(400mg)，得到(2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-[3-氯-6-羟基-2-甲氧基-5-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基环己烷-1-酮(200.9mg，54％)，为灰白色固体。
制备型-HPLC条件(2#-Analyse HPLC-SHIMADZU(HPLC-10))：柱，XBridge PrepC18 OBD柱，5um，19*150mm；流动相，含10mmol NH4HCO3和CH3CN的水(12min内保持80.0％CH3CN)；检测器，UV 254nm。
LC-MS(ES,m/z):448[M+H]+
H-NMR(DMSO,300MHz,ppm):δ10.80(s,1H),8.64(s,1H),5.88(d,J＝16.0Hz,1H),5.37-5.51(m,2H),3.96(s,3H),3.75(s,3H),3.46(d,J＝6.9Hz,2H),2.56(m,2H),2.41(s,3H),2.15(m,1H),1.80-2.06(m,4H),1.41-1.59(m,1H),0.70(dd,J＝15.0,6.7Hz,6H),0.60(s,3H).
步骤2
将(2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-[3-氯-6-羟基-2-甲氧基-5-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基环己烷-1-酮(500mg，1.12mmol)和NH2OH.HCl(84.9mg，1.23mmol，1.10equiv)混合物的吡啶(5mL)溶液置于50-mL圆底烧瓶中，所述烧瓶被氩气吹扫并保持在氩气氛下。将混合物在室温下搅拌过夜，然后真空浓缩。用下列条件通过制备型-HPLC纯化残余物，得到4-氯-2-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3E,6R)-3-(羟基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-3-甲氧基-6-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-5-甲基苯酚(246.5mg，48％，化合物10)，呈白色固体。
制备型-HPLC条件：柱：X Bridge C18,19*250mm,5um；流动相A：水/10mm NH4HCO3，流动相B：CH3CN；流速：30mL/min；梯度：8min内88％B至88％B；254nm；检测器。
LC-MS(ES,m/z):463[M+H]+
H-NMR(DMSO,300MHz,ppm):δ10.80(s,1H),10.35(s,1H),8.65(s,1H),5.90(d,J＝16.1Hz,1H),5.42(m,2H),3.96(s,3H),3.75(s,3H),3.46(d,J＝7.1Hz,2H),3.23(m,1H),2.41(s,3H),2.23(t,J＝6.8Hz,1H),1.86(s,3H),1.62(d,J＝11.9Hz,3H),1.18(d,J＝10.5Hz,1H),0.80(d,J＝6.8Hz,3H),0.68(d,J＝6.6Hz,3H),0.61(s,3H).
实施例13
4-氯-3-(氟甲氧基)-2-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3E,6R)-3-(羟基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-6-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-5-甲基苯酚(化合物11)的合成
Figure GDA0002990583800000391
标题化合物按照实施例12中所述的类似方法由4-O-氟甲基-壳二孢氯素制备。
LC-MS(ES,m/z):[M+H]+:481.
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ10.36(s,1H),8.66(s,1H),5.88(d,J＝16.2Hz,1H),5.72(d,J＝54.3Hz,2H)5.42(t,J＝7.5Hz,1H),5.37(d,J＝16.2Hz,1H),3.95(s,3H)3.50(m,2H),3.23(m,2H),2.43(s,3H),2.21(q,J＝6.6Hz,1H),1.84(s,3H),1.59(m,3H),1.25(m,1H),0.80(d,J＝6.6Hz,3H),0.68(d,J＝6.9Hz,3H),0.61(s,3H).
实施例14
4-氯-2-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3E,6R)-3-[[2-(二甲基氨基)乙氧基]亚氨基]-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-3-甲氧基-6-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-5-甲基苯酚(化合物15)的合成
Figure GDA0002990583800000401
标题化合物按照实施例12中所述的类似方法制备，不同之处在于使用O-(2-(二甲基氨基)乙基)羟胺盐酸盐代替盐酸羟胺。
LC-MS(ES,m/z):534[M+H]+
H-NMR(DMSO,400MHz,ppm):δ10.79(s,1H),8.63(s,1H),5.89(d,J＝16.1Hz,1H),5.33–5.48(m,2H),3.98(m,5H),3.74(s,3H),3.45(d,J＝7.2Hz,2H),3.13(m,1H),2.46(m,2H),2.39(s,3H),2.23(q,J＝6.8Hz,1H),2.14(s,6H),1.85(d,J＝1.3Hz,3H),1.57–1.74(m,3H),1.19(m,1H),0.78(d,J＝6.7Hz,3H),0.66(d,J＝6.5Hz,3H),0.61(s,3H).
实施例15
4-氯-3-甲氧基-6-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-5-甲基-2-[(2E,4E)-3-甲基-5-[(1R,2R,3E,6R)-1,2,6-三甲基-3-[[2-(吗啉-4-基)乙氧基]亚氨基]环己基]戊-2,4-二烯-1-基]苯酚(化合物16)的合成。
Figure GDA0002990583800000402
标题化合物按照实施例12中所述的类似方法制备，不同之处在于使用O-(2-(吗啉-4-基)乙基)羟胺盐酸盐代替盐酸羟胺。
LC-MS(ES,m/z):576[M+H]+
H-NMR(CD3CN,300MHz,ppm):δ8.55(s,1H),5.93(d,J＝16.1Hz,1H),5.36-5.50(m,2H),4.07(t,J＝5.7Hz,2H),3.94(s,3H),3.75(s,3H),3.51(m,6H),3.14-3.28(m,1H),2.55(m,2H),2.46(s,7H),2.20(t,J＝6.8Hz,1H),1.89(d,J＝1.1Hz,3H),1.58-1.72(m,3H),1.25(m,1H),0.81(d,J＝6.8Hz,3H),0.67(m,6H).实施例16
4-氯-3-甲氧基-6-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-5-甲基-2-[(2E,4E)-3-甲基-5-[(1R,2R,3E,6R)-1,2,6-三甲基-3-[[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]亚氨基]环己基]戊-2,4-二烯-1-基]苯酚(化合物17)的合成。
Figure GDA0002990583800000411
标题化合物按照实施例12中所述的类似方法制备，不同之处在于使用O-(2-(N-甲基哌嗪-4-基)乙基)羟胺盐酸盐代替盐酸羟胺。
LC-MS(ES,m/z):589[M+H]+
H-NMR(CDCl3,400MHz,ppm):δ10.80(s,1H),8.50(s,1H),5.92(t,J＝16.0Hz,1H),5.51(m,1H),5.33(m,1H),4.19(m,2H),3.99(s,3H),3.83(s,3H),3.56(d,J＝7.2Hz,2H),3.28(m,1H),2.42-2.70(m,13H),2.32(s,3H),2.14(m,1H),1.93(s,3H),1.63(m,3H),1.29(m,1H),0.88(d,J＝6.8Hz,3H),0.71(m,6H).
实施例17
2-([[(1E,2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-[3-氯-6-羟基-2-甲氧基-5-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基亚环己基]氨基]氧)乙酸乙酯(化合物18)的合成。
Figure GDA0002990583800000421
标题化合物按照实施例12中所述的类似方法制备，不同之处在于使用2-(氨氧基)乙酸乙酯代替盐酸羟胺。
LC-MS(ES,m/z):[M+H]+:549
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ10.74(s,1H),8.60(s,1H),5.86(d,J＝16.2Hz,1H),5.41(t,J＝7.0Hz,1H),5.35(d,J＝16.2Hz,1H),4.51(s,2H),4.06(q,J＝7.1Hz,2H),3.71(s,3H),3.42(d,J＝7.2Hz,2H),3.28(s,1H),3.18(dd,J＝12.9,4.1Hz,1H),2.37(s,3H),2.24(q,J＝6.8Hz,1H),1.81(d,J＝1.3Hz,3H),1.79–1.56(m,3H),1.31–1.17(m,1H),1.14(t,J＝7.1Hz,3H),0.71(d,J＝6.7Hz,3H),0.64(d,J＝6.5Hz,3H),0.58(s,3H).
实施例18
4-氯-2-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3S,6R)-3-羟基-1,2,3,6-四甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-3-甲氧基-6-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-5-甲基苯酚(化合物14-1)的合成。
Figure GDA0002990583800000422
将3-氯-6-羟基-5-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3S,6R)-3-羟基-1,2,3,6-四甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛[化合物1，实施例2](350mg，0.80mmol)和甲氧基胺盐酸盐(85mg，1.02mmol)混合物的吡啶(5mL)溶液置于50-mL圆底烧瓶中。将混合物在10至15℃下搅拌12h，并真空浓缩。将残余物通过制备型HPLC用下列条件纯化，得到标题化合物(209.3mg，55％)，呈浅黄色固体。
制备型-HPLC条件(2#-Analyse HPLC-SHIMADZU(HPLC-10))：柱，XBridge BEH C18OBD Prep柱，5um，19×250mm；流动相，含10mmol NH4HCO3和CH3CN的水(9min内保持90.0％CH3CN)；检测器，uv 254&220nm。
LC-MS(ES,m/z):[M-H]462
H-NMR(DMSO,400MHz ppm):δ10.79(s,1H),8.64(s,1H),5.82(m,1H),5.39(m.1H),5.22(m,1H),3.96(s.3H),3.74(m,4H),3.32-3.45(m,2H),2.50(s,3H),1.81(m,3H),1.47-1.59(m,2H),1.21-1.38(m,3H),1.13(m,1H),1.04(s,3H),0.85(m,3H),0.74(m,3H),0.64(m,3H).
实施例19
2-([[(1E,2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-[3-氯-6-羟基-2-甲氧基-5-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基亚环己基]氨基]氧)乙酸(化合物19)的合成。
Figure GDA0002990583800000431
将2-([[(1E,2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-[3-氯-6-羟基-2-甲氧基-5-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基亚环己基]氨基]氧)乙酸乙酯[化合物18，实施例17](350mg，0.64mmol)的溶液置于25-mL圆底烧瓶中，随后加入氢氧化锂(76mg，3.17mmol)的水/THF(0.5/1mL)溶液。混合物在室温下搅拌过夜。用盐酸水溶液(1N)将混合物的pH值调节至4。用二氯甲烷(2mL×2)萃取反应混合物。将有机层合并，然后真空浓缩。用下列条件通过制备型-HPLC纯化残余物，得到2-([[(1E,2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-[3-氯-6-羟基-2-甲氧基-5-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基亚环己基]氨基]氧基)乙酸(300mg，90％，化合物19)，呈白色固体。
制备型-HPLC(2#-AnalyseHPLC-SHIMADZU(HPLC-10))：柱，XBridge Shield RP18OBD柱，5um，19*150mm；流动相，含0.05％TFA和CH3CN的水(11min内保持72.0％CH3CN)；检测器，UV 254nm。
LC-MS:(ES,m/z):[M+H]+:521.
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ10.76(s,1H),8.60(s,1H),5.86(d,J＝16.2Hz,1H),5.41(t,J＝6.9Hz,1H),5.35(d,J＝16.2Hz,1H),4.42(s,2H),3.92(s,3H),3.42(d,J＝7.1Hz,2H),3.13–3.25(m,1H),2.37(s,3H),2.23(q,J＝6.8Hz,1H),1.82(d,J＝1.4Hz,3H),1.56–1.76(m,3H),1.22(s,1H),0.71(d,J＝6.8Hz,3H),0.64(d,J＝6.5Hz,3H),0.59(s,3H).
实施例20
3-氯-4-(氟甲氧基)-6-羟基-2-甲基-5-[(2E,4E)-3-甲基-5-[(1R,2R,3E,6R)-1,2,6-三甲基-3-[[2-(吗啉-4-基)乙氧基]亚氨基]环己基]戊-2,4-二烯-1-基)苯甲醛(化合物12)的合成
Figure GDA0002990583800000441
标题化合物按照实施例6中所述的类似方法制备，不同之处在于使用O-2-(吗啉-4-基)乙基羟胺盐酸盐代替盐酸羟胺。
LC-MS(ES,m/z):[M+H]+:565
1H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ12.55(s,1H),10.29(s,1H),5.91(d,J＝16.0Hz,1H),5.70(d,J＝54.3Hz,1H),5.46(t,J＝7.4Hz,1H),5.34(d,J＝16.0Hz,1H),4.19(t,J＝5.8Hz,2H),3.72(m,4H),3.61(d,J＝7.3Hz,2H),3.21–3.36(m,1H),2.67(d,J＝9.0Hz,5H),2.55(m,4H),2.15(q,J＝6.7Hz,1H),1.52–1.74(m,3H),1.30(m,1H),0.89(d,J＝6.7Hz,3H),0.73(d,J＝6.4Hz,3H),0.69(s,3H).实施例21
4-氯-2-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,6R)-3-(乙基氨基)-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-3-甲氧基-6-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-5-甲基苯酚(化合物21)的合成。
Figure GDA0002990583800000442
步骤1
将(2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-[3-氯-6-羟基-2-甲氧基-5-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基环己烷-1-酮[实施例12，步骤1](3g，6.70mmol)、Ti(i-PrO)4(15.2g，53.52mmol)、乙胺盐酸盐(2.2g，26.83mmol)和MS 4A(1g)的THF(30mL)溶液置于250-mL圆底烧瓶中。将混合物在油浴中在68℃下搅拌过夜。用200mL乙酸乙酯稀释所得混合物，然后加入10mL饱和氯化铵。过滤混合物，滤液用无水硫酸镁干燥并真空浓缩，得到4-氯-2-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3E,6R)-3-(乙基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-3-甲氧基-6-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-5-甲基苯酚(1.2g，粗产物)，呈褐色固体。
步骤2
将4-氯-2-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3E,6R)-3-(乙基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-3-甲氧基-6-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-5-甲基苯酚(1.2g，2.53mmol)和三乙酰氧基硼氢化钠(1.07g，5.05mmol，2.00equiv)的二氯甲烷(20mL)溶液置于100-mL圆底烧瓶中。混合物在室温下搅拌5h。过滤混合物，并真空浓缩滤液。通过快速-制备型-HPLC用以下条件下纯化残余物，得到粗产物(350mg)，粗产物用下列条件通过手性-制备型-HPLC纯化，得到4-氯-2-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,6R)-3-(乙基氨基)-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-3-甲氧基-6-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-5-甲基苯酚(211.4mg，18％，化合物21)，呈橘色固体。
快速-制备型-HPLC条件(CombiFlash-1)：柱，C18硅胶；流动相，水/乙腈＝1:0，在40min内增加至水/乙腈＝0:1；检测器，UV 254nm。
手性-制备型-HPLC条件：柱：XBridge Shield RP18 OBD柱，5um，19*150mm；流动相A：含10mmol NH4HCO3的水，流动相B：ACN；流速：20mL/min；梯度：10分钟内75％B至95％B；检测器254nm。
LC-MS(ES,m/z):477[M+H]+
H-NMR(DMSO,300MHz,ppm):δ10.71-10.87(br,1H),8.644(s,1H),5.82(t,J＝16.2Hz,1H),5.39(m,1H),5.25(m,1H),3.96(s,3H),3.75(s,3H),3.44(d,J＝6.9Hz,2H),2.57-2.66(m,2H),2.51(s,3H),2.28-2.36(m,1H),1.74-1.82(m,4H),1.12-1.50(m,6H),0.98(m,3H),0.86(m,3H),0.77(m,3H),0.63(m,3H).
实施例22
4-氯-2-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,6R)-3-(环丙基氨基)-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-3-甲氧基-6-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-5-甲基苯酚(化合物23)的合成
Figure GDA0002990583800000461
标题化合物按照实施例21中所述的类似方法制备，不同之处在于使用环丙胺代替乙胺。
LC-MS(ES,m/z):489[M+H]+
H-NMR(DMSO,300MHz,ppm):δ10.79(s,1H),8.64(s,1H),5.80(t,J＝16.2Hz,1H),5.37(m,1H),5.24(m,1H),3.96(s,3H),3.74(s,3H),3.44(d,J＝6.3Hz,2H),2.74(m,1H),2.41(s,3H),1.96(m,2H),1.82(s,3H),1.41-1.57(m,3H),1.15-1.40(m,3H),0.80(s,3H),0.73(m,3H),0.64(m,3H),0.39(m,1H),0.25(m,2H),0.15(m,1H).
实施例23
2-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,6R)-3-氨基-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-4-氯-3-甲氧基-6-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-5-甲基苯酚(化合物24)的合成
Figure GDA0002990583800000462
将(2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-[3-氯-6-羟基-2-甲氧基-5-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基环己烷-1-酮(3g，6.70mmol)[实施例12，步骤1]、NaBH3CN(2.75g，43.76mmol)和NH4OAc(20g，40.00equiv)混合物的乙醇(100mL)溶液置于250-mL圆底烧瓶中，所述烧瓶被氩气吹扫并保持在氩气氛下。将所得混合物在油浴中在70℃下搅拌过夜。将所得混合物真空浓缩。将残余物用H2O(80 mL)稀释。用乙酸乙酯(200 mL×3)萃取混合物，合并有机层，然后真空浓缩。将残余物通过快速-制备型-HPLC用下列条件纯化，得到标题化合物(1.5g，50％，化合物24)，呈黄色固体。
快速-制备型-HPLC条件(IntelFlash-1)：柱，C18硅胶；流动相，CH3CN:H2O＝0:95，在55min内增加至CH3CN:H2O＝95:5；检测器，UV 254nm。
LC-MS:(ES,m/z):[M+H]+449
H-NMR:(CDCl3,400MHzppm)：10.77(s,1H),8.50(s,1H),5.93(d,J＝16.4Hz,1H),5.52(m,1H),5.19(m,1H),3.99(s,3H),3.82(s,3H),3.54(m,2H),2.42(s,3H),2.04-2.23(m,1H),1.90(m,3H),1.25-1.85(m,6H),0.91-1.04(m,5H),0.70-0.78(m,4H).
实施例24
4-氯-3-甲氧基-6-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-5-甲基-2-[(2E,4E)-3-甲基-5-[(1R,2R,6R)-1,2,6-三甲基-3-[(氧杂环丁烷-3-基)氨基]环己基]戊-2,4-二烯-1-基]苯酚(化合物25)的合成
Figure GDA0002990583800000471
向50-mL密封管中放入2-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,6R)-3-氨基-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-4-氯-3-甲氧基-6-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-5-甲基苯酚(化合物24；1g，2.23mmol)、三乙酰氧基硼氢化钠(STAB,709.8mg，3.35mmol)和氧杂环丁烷-3-酮(353.6mg，4.91mmol)的DCM(12mL)溶液。将混合物在室温下搅拌18h，然后真空浓缩。将残余物通过制备型-HPLC用下列条件纯化，得到标题化合物(239.2mg，21％，化合物25)，呈灰白色固体。
制备型-HPLC条件(2#-Analyse HPLC-SHIMADZU(HPLC-10))：柱，XBridge ShieldRP18 OBD柱，5um，19*150mm；流动相，含10mmol NH4HCO3和CH3CN的水(10min内保持82.0％ACN)；检测器，UV 254nm。
LC-MS:(ES,m/z):[M+H]+505
H-NMR:(DMSO,400MHz ppm):δ10.80(s,1H),8.66(s,1H),5.84(d,J＝16.4Hz,1H),5.41(m,1H),5.25(d,J＝15.6Hz,1H),4.60(m,2H),4.27-4.36(m,2H),4.38(s,3H),3.83(m,1H),3.76(s,3H),3.46(d,J＝7.2Hz,2H),2.42(s,3H),1.84(s,3H),1.45-1.58(m,3H),1.35(m,2H),1.21(m,1H),0.89(s,3H),0.81(d,J＝7.2Hz,3H),0.67(m,3H).
实施例25
3-氯-5-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,6R)-3-(乙基氨基)-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-6-羟基-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛(化合物20)的合成。
Figure GDA0002990583800000481
将4-氯-2-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,6R)-3-(乙基氨基)-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-3-甲氧基-6-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-5-甲基苯酚[化合物21，实施例21](500mg，1.05mmol)、甲醛(425mg，5.25mmol，5.00equiv,37％)和盐酸(500mg，5.3mmol，5.00equiv,38％)的THF/水(20mL/2mL)溶液置于30-mL密封管中。将混合物在100℃下搅拌过夜，然后真空浓缩。将残余物通过制备型-HPLC用下列条件纯化，得到标题化合物(55.4mg，9.4％，化合物20)，呈灰白色固体。
制备型-HPLC条件(2#-AnalyseHPLC-SHIMADZU(HPLC-10))：柱，Gemini-NX 5u C18110A,AXIA Packed,150x 21.2mm；流动相，柱：流动相A：含10mmol CF3COOH的水，流动相B：CH3CN；流速：30mL/min；梯度：10min内60％B至95％B；254nm；检测器，uv 254nm。
LC-MS(ES,m/z):448[M+H]+
H-NMR(DMSO,300MHz,ppm)12.62(br,1H),10.27(br,1H),7.90(br,1H),7.43(br,1H),5.94(d,J＝16.2Hz,1H),5.43(t,J＝7.5Hz,1H),5.34(d,J＝15.9Hz,1H),3.82(s,3H),3.47(d,J＝7.5Hz,2H),3.28(m,1H),2.96(m,2H),2.62(s,3H),1.85(m,5H),1.70(m,1H),1.50(s,3H),1.20(m,3H),0.88(m,3H),0.83(m,3H),0.74(m,3H).
实施例26
3-氯-5-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,6R)-3-(环丙基氨基)-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-6-羟基-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛(化合物22)的合成
Figure GDA0002990583800000491
标题化合物按照实施例25中所述的类似方法由化合物23(实施例22)制备。
LC-MS(ES,m/z):460[M+H]+
H-NMR(DMSO,300MHz,ppm):12.60(br,1H),10.27(s,1H),5.80(d,J＝16.2Hz,1H),5.36(t,J＝7.2Hz,1H),5.25(d,J＝15.9Hz,1H),3.81(s,3H),3.42(d,J＝6.9Hz,2H),2.75(m,1H),2.62(s,3H),1.96(m,2H),1.82(s,3H),1.20-1.61(m,6H),0.80(m,3H),0.71(m,3H),0.63(m,3H),0.35-0.47(m,1H),0.24-0.31(m,2H),0.06-0.18(m,1H).
实施例27
3-氯-5-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,6R)-3-(环丙基氨基)-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-4-(氟甲氧基)-6-羟基-2-甲基苯甲醛(化合物13)的合成
Figure GDA0002990583800000492
步骤1
向50-mL圆底烧瓶中放入(2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-[3-氯-5-(二乙氧基甲基)-2-(氟甲氧基)-6-羟基-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基环己烷-1-酮[实施例2](900mg，1.76mmol)、MS 4A(200mg)和环丙胺(2g，35.03mmol，20.00equiv)的乙醇(10mL)溶液。所得溶液在30℃下搅拌过夜。将所得混合物真空浓缩，得到4-氯-2-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3E,6R)-3-(环丙基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-6-(二乙氧基甲基)-3-(氟甲氧基)-5-甲基苯酚(0.9g，93％)，呈固体。
步骤2
将4-氯-2-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3E,6R)-3-(环丙基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-6-(二乙氧基甲基)-3-(氟甲氧基)-5-甲基苯酚(1.1g，2.00mmol)和乙酸硼氢化钠(464mg，2.19mmol)的乙醇(20mL)溶液置于100-mL圆底烧瓶中。将混合物在室温下搅拌3h，并真空浓缩。残余物通过硅胶柱色谱法用乙酸乙酯/石油醚(1:10)纯化，得到4-氯-2-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,6R)-3-(环丙基氨基)-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-6-(二乙氧基甲基)-3-(氟甲氧基)-5-甲基苯酚(460mg，42％)，呈固体。
步骤3
将4-氯-2-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,6R)-3-(环丙基氨基)-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-6-(二乙氧基甲基)-3-(氟甲氧基)-5-甲基苯酚(460mg，0.83mmol)的THF/水/乙酸(10/20/10mL)溶液置于100-mL圆底烧瓶中。将混合物在室温下搅拌3h，并真空浓缩。将残余物溶于水(10mL)中。用乙酸乙酯(20mL)萃取混合物，合并有机层，然后真空浓缩。用下列条件通过制备型-HPLC纯化残余物，得到3-氯-5-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,6R)-3-(环丙基氨基)-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-4-(氟甲氧基)-6-羟基-2-甲基苯甲醛(206.7mg，52％，化合物13)，呈淡黄色固体。
制备型-HPLC条件(2#-Analyse HPLC-SHIMADZU(HPLC-10))：柱，Gemini-NX C18AXAI Packed,21.2x150mm 5um 11nm；流动相，含10mmol NH4HCO3和CH3CN的水(8min内保持95.0％CH3CN)；检测器，uv 254nm。
LC-MS(ES,m/z):[M+H]+:478.
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ10.26(s,1H),5.79(d,J＝154.3Hz,2H),5.78(d,J＝16.2Hz,1H)5.34(t,J＝7.2Hz,1H),5.25(d,J＝16.2Hz,1H),3.48(d,J＝6.9Hz,2H),2.76(m,1H),2.64(s,3H),1.95-2.08(m,2H),1.80(s,3H),1.20-1.48(m,5H),0.79(s,3H),0.69(d,J＝7.2Hz,3H),0.59(d,J＝6.3Hz,3H),0.35(m,1H),0.24(m,1H),0.11(m,1H).
实施例28
2-([[(1E,2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-[3-氯-2-(氟甲氧基)-5-甲酰基-6-羟基-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基亚环己基]氨基]氧)乙酸(化合物26)的合成
Figure GDA0002990583800000511
步骤1
将(2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-[3-氯-5-(二乙氧基甲基)-2-(氟甲氧基)-6-羟基-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基环己烷-1-酮[实施例2](1.5g，2.94mmol)、Cs2CO3(479mg，1.47mmol)和2-(氨氧基)乙酸乙酯草酸盐(605mg，2.89mmol)的乙醇(10mL)溶液置于100-mL圆底烧瓶中。混合物在室温下搅拌2h。用水(10mL)稀释反应混合物，并用乙酸乙酯(10mL×2)萃取。将有机层合并，然后真空浓缩。用下列条件通过快速-制备型-HPLC纯化残余物，得到2-([[(1E,2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-[3-氯-5-(二乙氧基甲基)-2-(氟甲氧基)-6-羟基-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基亚环己基]氨基]氧)乙酸乙酯(1.0g，56％)，为淡黄色固体。
快速-制备型-HPLC条件(IntelFlash-1)：柱，C18硅胶；流动相，CH3CN/H2O＝60:40，在40min内增加至CH3CN/H2O＝95:5；检测器，UV 254nm。
LC-MS(ES,m/z):612[M+H]+
步骤2
将2-([[(1E,2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-[3-氯-5-(二乙氧基甲基)-2-(氟甲氧基)-6-羟基-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基亚环己基]氨基]氧基)乙酸乙酯(1g，1.63mmol)、氢氧化锂(117mg，3.00equiv)混合物的THF/H2O(1:1，30mL)溶液置于100-mL圆底烧瓶中。混合物在室温下搅拌2h。然后(15mL)加入到该溶液中。所得溶液在室温下再搅拌6h。将所得混合物真空浓缩，并用20mL的水稀释。用乙酸乙酯(20mL×2)萃取混合物。将有机层合并，然后真空浓缩。用下列条件通过快速-制备型-HPLC纯化残余物，得到2-([[(1E,2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-[3-氯-2-(氟甲氧基)-5-甲酰基-6-羟基-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基亚环己基]氨基]氧)乙酸(533.3mg，64％，化合物26)，为淡黄色固体。
快速-制备型-HPLC条件(IntelFlash-1)：柱，C18硅胶；流动相，CH3CN/H2O＝55:45，在45min内增加至CH3CN/H2O＝95:5；检测器，UV 254nm。
LC-MS(ES,m/z):[M+H]+:510.
H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.58(s,2H),10.30(s,1H),5.88(d,J＝16.2Hz,1H),5.79(d,J＝53.7Hz,2H),5.40(d,J＝16.2Hz,1H),5.38(m,1H),4.46(s,2H),3.50(d,J＝7.2Hz,2H),3.23(dd,J＝12.7,4.0Hz,1H),2.64(s,3H),2.27(q,J＝6.7Hz,1H),1.84(s,3H),1.82-1.59(m,3H),1.35-1.19(m,1H),0.75(d,J＝6.6Hz,3H),0.68(d,J＝6.6Hz,3H),0.62(s,3H).
实施例29
2-([[(1E,2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-[3-氯-2-(氟甲氧基)-6-羟基-5-[(1E)-(羟基亚氨基)甲基]-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基亚环己基]氨基]氧)乙酸(化合物27)的合成
Figure GDA0002990583800000521
步骤1
将3-氯-4-(氟甲氧基)-6-羟基-2-甲基-5-[(2E,4E)-3-甲基-5-[(1R,2R,6R)-1,2,6-三甲基-3-氧代环己基]戊-2,4-二烯-1-基]苯甲醛[实施例1](600mg，1.37mmol)和盐酸羟胺(93.5mg，1.35mmol，0.98equiv)的吡啶(6mL)溶液置于100-mL圆底烧瓶中。混合物在室温下搅拌2h。将所得混合物真空浓缩，得到(2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-[3-氯-2-(氟甲氧基)-6-羟基-5-[(1E)-(羟基亚氨基)甲基]-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基环己烷-1-酮(500mg，粗产物)，呈黄色油状。
步骤2
将(2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-[3-氯-2-(氟甲氧基)-6-羟基-5-[(1E)-(羟基亚氨基)甲基]-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基环己烷-1-酮(500mg，1.11mmol)和2-(氨氧基)乙酸乙酯草酸盐(925mg，4.42mmol，4.00equiv)的吡啶(6mL)溶液置于100-mL圆底烧瓶中。混合物在室温下搅拌1h。将所得混合物真空浓缩，得到2-([[(1E,2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-[3-氯-2-(氟甲氧基)-6-羟基-5-[(1E)-(羟基亚氨基)甲基]-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基亚环己基]氨基]氧)乙酸乙酯(550mg，粗产物)，呈黄色固体。
步骤3
将2-([[(1E,2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-[3-氯-2-(氟甲氧基)-6-羟基-5-[(1E)-(羟基亚氨基)甲基]-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基亚环己基]氨基]氧基)乙酸乙酯(550mg，0.99mmol)、氢氧化锂(853mg，35.62mmol)混合物的四氢呋喃(6mL)和水(2mL)溶液置于100-mL圆底烧瓶中。所得溶液在室温下搅拌1h。将混合物真空浓缩。用乙酸乙酯(10mL x3)萃取所得混合物，合并有机层，然后真空浓缩。用下列条件通过制备型-HPLC纯化残余物，得到2-([[(1E,2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-[3-氯-2-(氟甲氧基)-6-羟基-5-[(1E)-(羟基亚氨基)甲基]-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基亚环己基]氨基]氧基)乙酸(242.2mg，46％，化合物27)，呈固体。
制备型-HPLC条件(Prep_HPLC_MC1)：柱：XBridge Shield RP18 OBD柱，5um，19*150mm；流动相A：水(0.1％FA)，流动相B：ACN；流速：20mL/min；梯度：8min内56％B至80％B；检测器254nm。
LC-MS(ES,m/z):[M+H]+:525,[M+Na-H]+:547
H-NMR(300MHz,CD3OD,ppm):δ8.56(S,1H),5.89(d,J＝16.2Hz,1H),5.72(s,1H),5.54(s,1H),5.44-5.33(m,2H),4.48(s,2H),3.56(d,J＝7.2Hz,2H),3.39-3.32(m,1H),2.43(s,3H),2.19(q,J＝6.6Hz,1H),1.86(s,3H),1.77-1.59(m,3H),1.25-1.48(m,1H),0.84(d,J＝6.0Hz,3H),0.74-0.69(m,6H).
测试实施例1
对HepG2细胞中AMPK和ACC磷酸化水平的影响。
使用针对p-AMPK和p-ACC的抗体，通过Western印迹分析来测量p-AMPK和p-ACC水平。以下试剂从供应商处购买，并使用下面列出的仪器。
试剂：AMPKα(D5A2)兔mAb、磷酸乙酰辅酶A羧化酶(Ser79)(D7D11)兔mAb、抗兔IgG、HRP连接的抗体和β-肌动蛋白(13E5)兔mAb购自Cell Signaling Technology。ECL Western印迹检测试剂(ECL Western Blotting Detection Reagents)购自Thermo。
仪器：Western印迹系统(Invitrogen/Bio-Rad)和成像系统(Cell Biosciences)化合物处理
HepG2细胞在补充有10％FBS的MEM培养基中在37℃和5％CO2条件下培养。将HepG2细胞(1×106个细胞/孔)接种到6孔细胞培养板中24小时。将细胞在无血清MEM培养基(3ml/孔)中饥饿培养24小时。
测试化合物制备：
将化合物溶于DMSO中以分别制备5、25、50mM的储备溶液。在无血清MEM培养基中将化合物稀释至最终浓度为5、25和50μM。
二甲双胍制备：
将二甲双胍溶于在PBS中以得到1M的储备浓度。在无血清MEM培养基中将二甲双胍稀释至最终浓度为5和50mM
去除各孔中的无血清MEM培养基。每孔加入3ml的1×化合物。将细胞在37℃、5％CO2培养箱中孵育6小时(化合物5、化合物19和二甲双胍)。
Western印迹分析
将来自各样品的总蛋白(10μg)加样到SDS-PAGE的样品孔中。电泳在120V恒定电压下运行，直到蓝色标记达到凝胶末端。使用Bio-Rad的Trans印迹在300mA下运行40分钟将蛋白转移至PVDF膜。转移后，用封闭缓冲液在室温下封闭膜2小时。将膜与相应的一抗溶液在4℃下孵育过夜。用1×TBST将膜清洗5min×3，并在室温下使膜与二抗溶液孵育45分钟。用1×TBST将膜清洗5min×3，用化学发光检测试剂进行检测。结果如图1所示。
测试实施例2
测量在pH4.0和pH7.4磷酸盐缓冲溶液中的溶解度
1)储备溶液的制备
制备浓度为30mM的测试化合物和阳性对照化合物的DMSO储备溶液。双氯芬酸钠在试验中用作阳性对照。
2)溶解度测定步骤
将每种化合物的储备溶液(10μL)依次放入其合适的96孔架中，然后向无帽溶解度样品板(Solubility Sample plate)的每个小瓶中加入990μL的pH4.0和pH7.4的PBS。这项研究一式两份进行。向每个小瓶中加入一个搅拌棒，然后使用模制的PTDE/SIL 96孔板盖(PTDE/SIL 96-Well Plate Cover)将小瓶密封。将溶解度样品板转移至舒适型恒温混匀平板振荡器(Thermomixer Comfort plate shaker)并在25℃下以1,100rpm振荡孵育2小时。孵育2小时后，使用大磁铁去除搅拌棒，并将溶解度样品板的所有样品转移到滤板中。所有样品均使用真空歧管进行过滤。过滤后的样品用甲醇稀释。
3)通过LC-MS/MS分析样品：
LC系统包括配备有脱气机DGU-20A3、溶剂输送单元LC-20AD、系统控制器CBM-20A、柱温箱CTO-10ASVP和CTC Analytics HTC PAL系统的Shimadzu液相色谱分离系统。使用AB公司(加拿大)的具有ESI界面的API 4000仪器进行质谱分析。数据采集和控制系统使用ABI公司的Analyst 1.6软件创建。测量结果示于表2中。
[表2]
Figure GDA0002990583800000561
测试实施例3
针对小鼠和人类微粒体的稳定性的测定
汇集的人肝微粒体(Cat.452161；Lot.23418)购自Corning，汇集的雄性小鼠肝微粒体(Cat.M1000；Lot.1210302)购自Xenotech。使用前将微粒体储存在-80℃。在阴性对照中使用40μL的超纯水代替NADPH溶液。阴性对照用于排除化学品本身不稳定导致的误导因素。一式两份制备含有NADPH的样品。阴性对照以单数形式制备。
通过向各主溶液中加入4μL的200μM化合物溶液以得到2μM的最终浓度来使反应开始。在该测定中将维拉帕米(verapamil)用作阳性对照。在0、15、30、45和60min时从反应溶液中取出50μL的等分试样。通过加入4体积的含有IS(200nM丙咪嗪(imipramine)、200nM拉贝洛尔(labetalol)和2μM酮洛芬(ketoprofen))的冷乙腈来使反应终止。样品在3,220g下离心40分钟。将90μL上清液等分试样与90μL超纯水H2O混合，然后用于LC-MS/MS分析。结果示于表3中，指示在NADPH存在下与来自人和小鼠的肝脏微粒体孵育60分钟后，测试化合物的剩余％。
[表3]
Figure GDA0002990583800000571
测试实施例4
SD大鼠单剂量施用测试化合物后，通过LC/MS/MS分析血液中化合物19的PK特征。
测试动物：SD大鼠(n＝3/组)
溶媒：10v/v％DMSO和90v/v％PEG400
剂量(单一)：iv/1和5mg/kg，po/5和25mg/kg
分析仪器和条件：LC/MS/MS仪器[LC：Shimazu，MS：AB API4000(离子源：ESI)]，LC柱：XSELECTTM CSHTM C18 2.5μm(2.1×50mm)，流动相：5％乙腈(0.1％甲酸)和95％乙腈(0.1％甲酸)。
结果示于图2中。
测试实施例5
通过CellTiterGlo测定试剂盒测定化合物对6种人癌细胞系的抗增殖活性。所有细胞均获自ATCC并按供应商推荐培养。在指数生长期测定细胞。由30mM的储液，通过在DMSO中进行3倍系列稀释，制备样品溶液，制成10个剂量。将细胞在37℃、5％CO2培养箱中孵育96小时后，根据方案通过CellTiterGlo测定试剂盒测量抗增殖活性。
在孵育的第4天，i)每孔加入15μl试剂(CelltiterGlo测定试剂盒)，并将平板在平板振荡器上震荡(避光)2分钟，ii)将平板保持(避光)于室温30分钟，和iii)用多板阅读器(Multiplate reader)记录发光值。结果示于4中。
[表4]
Figure GDA0002990583800000581
测试实施例6
HFD-STZ C57BL/6J小鼠模型中的体内功效
饮食诱导的肥胖模型建立：
给C57BL/6J小鼠喂高脂肪饮食(Research Diets，D12492)64天，并在第22天和第29天口服给予链脲佐菌素(streptozotocin)(10mg/kg)。从第36天至第63天进行化合物处理。
分组和处理
基于第5周动物的体重和口服葡萄糖耐受试验(OGTT)，使用计算机生成的随机化程序将小鼠随机分配至各组。
溶媒组：HFD/STZ+溶媒
处理组：HFD/STZ+测试化合物
治疗剂量：化合物5(po.qd×28:0.2mg/kg，1mg/kg和5mg/kg)
吡格列酮，阳性对照(po.qd×28:30mg/kg)
正常饮食组：正常饮食+溶媒
每组动物数量：8
用于化合物5的溶媒：PEG-400(Sigma)/吐温80(Sigma)缓冲液＝95:5
用于吡格列酮的溶媒：生理盐水
测试化合物的施用：
以上述剂量每日一次口服施用化合物5和吡格列酮，持续4周。
葡萄糖测定：
通过使用Accu-Chek Aviva系统，每2周用尾静脉血测定血糖水平。
血液化学分析：
如表2中所列，测试了每2周的血脂特征(lipid profile)和尾血生物化学参数。在第49天和第65天收集血液样品，样品立即在4℃、4,000g离心处理15分钟，然后将它们转移到新的试管中。使用TOSHIBATBA-40FR全自动生化分析仪测量血脂特征和全面血液生物化学参数。
图3和4示出了本发明化合物对小鼠血液中甘油三酯和总胆固醇水平的影响。图5示出了本发明化合物对禁食状态小鼠的血糖水平的影响。
测试实施例7
化合物5(po,qd x14)在BALB/c裸鼠U87MG人成胶质细胞瘤异种移植模型中的抗肿 瘤活性
肿瘤接种方法
每只小鼠在右侧皮下接种在0.1ml MEM-Matrigel混合物(7:3比例)中的U87MG肿瘤细胞(5×106)用于肿瘤发展。当平均肿瘤大小达到约113mm3时开始进行处理。然后将小鼠随机分组。向荷瘤小鼠施用处理。
化合物处理
将化合物5溶于溶媒(95％v/v PEG400+5％吐温80)中并以三个剂量水平(50、100和200mg/kg)向荷瘤小鼠口服施用14天。
使用卡尺每周两次测量肿瘤大小，并使用如下公式估算肿瘤体积(mm3)：TV＝a×b2/2，其中“a”和“b”分别是肿瘤的长直径和短直径。TV用于计算肿瘤生长抑制(TGI，抗肿瘤有效性的指标)值，使用公式：TGI＝(1-T/C)×100％，其中“T”和“C”分别是肿瘤接种后给定一天中处理组和对照组中肿瘤的平均相对体积(％肿瘤生长)。结果示于图6中。
测试实施例8
化合物5(po，qd x14)在BALB/c裸鼠Hep3B人肝癌异种移植模型中的抗肿瘤活性： 单一药剂和与索拉非尼组合。
每只小鼠在右侧皮下接种在0.1ml MEM-Matrigel混合物(1:1比例)中的Hep3B肿瘤细胞(5×106)用于肿瘤发展。当平均肿瘤大小达到约137mm3时开始进行处理。然后将小鼠随机分组。
化合物处理
将化合物5溶解于溶媒(95％v/v PEG400+5％吐温80)中并向荷瘤小鼠口服施用，在前5天每日一次、200mg/kg，然后用100mg/kg处理10天。将阳性对照索拉非尼溶解于溶媒(20％2-羟丙基-β-环糊精(HPBCD))中并向荷瘤小鼠口服施用，80mg/kg，每日一次，持续15天。如上所述用卡尺每周两次测量肿瘤大小。结果示于图7中。结果清楚地显示，通过单独施用化合物或与索拉非尼组合施用，本发明化合物具有降低肝癌细胞增殖的显著效果。
测试实施例9
以与测试实施例6类似的方式，用HFD-STZ C57BL/6J小鼠模型进行化合物19的体内功效研究。结果，化合物19(以0.25至16mg/kg一天一次口服处理28天)显著降低血糖水平(-68％)和HbA1C水平(-31％)。在OGTT测定中，用化合物19处理的组显示葡萄糖吸收有显著改善，具体而言，施用葡萄糖2小时后的血糖水平比对照组(用溶媒处理的组)低30％，葡萄糖AUC比对照组低25％。

Claims (12)

1.由式I表示的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0003081276940000011
其中
R1为甲酰基，或-CH＝N-O-Y，其中Y为氢原子或C1-6烷基；
R2为可被1至5个氟原子取代的C1-6烷基；
R3为氢原子或C1-6烷基；
R4为羟基，C1-6烷基氨基，C3-7环烷基氨基，或含有-O-作为环原子的3元至7元杂环烷基氨基，或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成>C＝N-O-Z；
Z是氢原子，C1-6烷基，或-(CH2)n-R5；
n是选自1至4的整数；
R5是-CO2R6，或-NR7R8；并且
R6、R7和R8各自独立地选自由氢原子和C1-6烷基组成的组；或者R7和R8与它们所连接的氮原子一起形成含氮的3元至7元杂环，所述含氮的3元至7元杂环还可以包含-O-或-NR6-作为环原子，其中杂环可以被一个或多个选自C1-6烷基的取代基取代。
2.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R4选自由以下组成的组：羟基，甲基氨基，乙基氨基，环丙基氨基，和氧杂环丁烷-3-基氨基。
3.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成>C＝N-O-Z，其中Z选自由以下组成的组：氢原子，C1-6烷基，-CH2CO2R6，吗啉代乙基，哌嗪基乙基，N-甲基-哌嗪基乙基，和N,N-二甲基氨基-乙基；R6独立地选自由氢原子和C1-6烷基组成的组。
4.根据权利要求2或3所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1是甲酰基。
5.根据权利要求2或3所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1是-CH＝N-OH。
6.根据权利要求2或3所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1是-CH＝N-OMe。
7.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其选自由以下组成的组：
3-氯-6-羟基-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,3S,6R)-3-羟基-1,2,3,6-四甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛，
3-氯-6-羟基-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,3E,6R)-3-(羟基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛，
4-氯-2-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3E,6R)-3-(羟基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-6-[(1E)-(羟基亚氨基)甲基]-3-甲氧基-5-甲基苯酚，
4-氯-3-(氟甲氧基)-2-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3E,6R)-3-(羟基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-6-[(1E)-(羟基亚氨基)甲基]-5-甲基苯酚，
3-氯-4-(氟甲氧基)-6-羟基-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,3E,6R)-3-(羟基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-2-甲基苯甲醛，
4-氯-2-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3S,6R)-3-羟基-1,2,3,6-四甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-6-[(1E)-(羟基亚氨基)甲基]-3-甲氧基-5-甲基苯酚，
4-氯-3-甲氧基-2-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3E,6R)-3-(甲氧基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-6-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-5-甲基苯酚，
4-氯-3-(氟甲氧基)-2-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3E,6R)-3-(甲氧基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-6-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-5-甲基苯酚，
4-氯-2-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3E,6R)-3-(羟基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-3-甲氧基-6-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-5-甲基苯酚，
4-氯-3-(氟甲氧基)-2-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3E,6R)-3-(羟基亚氨基)-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-6-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-5-甲基苯酚，
3-氯-4-(氟甲氧基)-6-羟基-2-甲基-5-[(2E,4E)-3-甲基-5-[(1R,2R,3E,6R)-1,2,6-三甲基-3-[[2-(吗啉-4-基)乙氧基]亚氨基]环己基]戊-2,4-二烯-1-基)苯甲醛，
3-氯-5-((2E,4E)-5-[(1R,2R,6R)-3-(环丙基氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-4-(氟甲氧基)-6-羟基-2-甲基苯甲醛，
4-氯-2-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3S,6R)-3-羟基-1,2,3,6-四甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-3-甲氧基-6-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-5-甲基苯酚，
4-氯-2-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,3E,6R)-3-[[2-(二甲基氨基)乙氧基]亚氨基]-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-3-甲氧基-6-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-5-甲基苯酚，
4-氯-3-甲氧基-6-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-5-甲基-2-[(2E,4E)-3-甲基-5-[(1R,2R,3E,6R)-1,2,6-三甲基-3-[[2-(吗啉-4-基)乙氧基]亚氨基]环己基]戊-2,4-二烯-1-基]苯酚，
4-氯-3-甲氧基-6-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-5-甲基-2-[(2E,4E)-3-甲基-5-[(1R,2R,3E,6R)-1,2,6-三甲基-3-[[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]亚氨基]环己基]戊-2,4-二烯-1-基]苯酚，
2-([[(1E,2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-[3-氯-6-羟基-2-甲氧基-5-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基亚环己基]氨基]氧)乙酸乙酯，
2-([[(1E,2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-[3-氯-6-羟基-2-甲氧基-5-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基亚环己基]氨基]氧)乙酸，
3-氯-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,6R)-3-(乙基氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-6-羟基-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛，
4-氯-2-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,6R)-3-(乙基氨基)-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-3-甲氧基-6-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-5-甲基苯酚，
3-氯-5-((2E,4E)-5-((1R,2R,6R)-3-(环丙基氨基)-1,2,6-三甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-6-羟基-4-甲氧基-2-甲基苯甲醛，
4-氯-2-[(2E,4E)-5-[(1R,2R,6R)-3-(环丙基氨基)-1,2,6-三甲基环己基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-3-甲氧基-6-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-5-甲基苯酚，
4-氯-3-甲氧基-6-[(1E)-(甲氧基亚氨基)甲基]-5-甲基-2-[(2E,4E)-3-甲基-5-[(1R,2R,6R)-1,2,6-三甲基-3-[(氧杂环丁烷-3-基)氨基]环己基]戊-2,4-二烯-1-基]苯酚，
2-([[(1E,2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-[3-氯-2-(氟甲氧基)-5-甲酰基-6-羟基-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基亚环己基]氨基]氧)乙酸，
2-([[(1E,2R,3R,4R)-3-[(1E,3E)-5-[3-氯-2-(氟甲氧基)-6-羟基-5-[(1E)-(羟基亚氨基)甲基]-4-甲基苯基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基]-2,3,4-三甲基亚环己基]氨基]氧)乙酸，
及其药学上可接受的盐。
8.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至7中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其用于治疗癌症、糖尿病、血脂异常、高胆固醇血症、肥胖症和脂肪肝病况、心血管疾病、动脉粥样硬化或阿尔茨海默病。
10.根据权利要求8或9所述的药物组合物，其进一步包含用于治疗癌症、糖尿病、血脂异常、高胆固醇血症、肥胖症和脂肪肝病况、心血管疾病、动脉粥样硬化或阿尔茨海默病的治疗剂。
11.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗在需要其的受试者中涉及AMPK失调的疾病的药物中的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述疾病选自癌症、治疗2型糖尿病和血脂异常。
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