CN108472404A

CN108472404A - 止血组合物

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Publication number: CN108472404A
Application number: CN201680078269.9A
Authority: CN
Inventors: E.伊兰; O.法英戈尔德; N.弗赖朱斯; R.埃阿夫里; D.卢尼; S.达纳拉吉; J.加洛威; W.丹克
Original assignee: Omrix Biopharmaceuticals Ltd; Ethicon Inc
Current assignee: Omrix Biopharmaceuticals Ltd; Ethicon Inc
Priority date: 2015-11-08
Filing date: 2016-11-08
Publication date: 2018-08-31
Anticipated expiration: 2036-11-08
Also published as: US20190054203A1; EP3868414B1; CO2018005753A2; EP3370786B1; CN108430526B; JP2018532516A; EP3868414C0; CN108472404B; BR112018009313B1; US20170128616A1; AU2016350051B2; WO2017077525A1; US20170128619A1; EP3370785B1; JP6816140B2; MX378590B; KR102665892B1; KR102708805B1; IL259203B; US10960105B2

Abstract

本发明涉及改进的止血组合物，其制备和用途，这些改进的止血组合物包含补充有化合物的纤维素基纤维。

Description

止血组合物

技术领域

本发明涉及改善的止血组合物，这些止血组合物包含补充有化合物的纤维素基纤维。

背景技术

在广泛多样的情况下，包括人在内的动物可遭受由于伤口或外科手术期间产生的出血。在一些情况下，出血是相对少量的，并且除施加简单急救之外的正常凝血是所需要的全部。在其它情况下，可发生大量出血。这些情况通常需要专门的设备和材料以及受过训练的施用适当援助的人员。外科手术期间的出血可能以多种形式出现。出血可以是离散的或从大表面积扩散。其可以是来自大血管或小血管、动脉(高压)或静脉(低压)的大量或低量的出血。它可易于接触，或者可源自难以接触的部位。

实现止血的常规方法包括使用外科技术、缝合线、结扎线或夹子以及基于能量的凝聚或烧灼。当这些常规措施无效或不切实际时，通常利用辅助止血技术和产品。

对于用于控制出血的适当方法或产品的选择取决于许多因素，包括但不限于出血的严重程度、来源的解剖学定位、来源与相邻关键结构的邻近程度、出血是离散来源的还是来自更广泛的表面区域、来源的可见性和精确识别以及来源的接触性。

许多产品已被开发为止血助剂。这些产品包括局部可吸收止血剂(TAH)，诸如氧化再生纤维素、具有或不具有凝血酶溶液的各种形式的明胶、胶原粉末、生物活性局部止血产品(局部凝血酶溶液，纤维蛋白密封剂等)和多种合成局部密封剂。

局部可吸收止血剂(TAH)广泛用于外科应用中。TAH涵盖基于氧化纤维素(OC)、氧化再生纤维素(ORC)、明胶、胶原、甲壳质、脱乙酰壳多糖等的产品。为了改善止血性能，可将基于上述材料的支架与生物来源的凝结因子(诸如凝血酶和纤维蛋白原)组合。

最常用的局部止血剂之一是Original可吸收止血剂，其由氧化再生纤维素(ORC)制成。ORC于1960年推出，作为许多外科手术的安全有效的止血剂。Original是松散针织的ORC织物，其快速地适应周围的环境并且比其它可吸收剂更容易管理，因为它不粘附于外科器械并且其尺寸可容易地修剪。这允许外科医生将纤维素牢固地保持就位，直到出血完全停止。

在外科手术中，控制出血对于使失血最小化、减少术后并发症、和缩短手术室中外科手术的持续时间是至关重要和关键的。由于其可生物降解性和其杀菌和止血特性，氧化纤维素以及氧化再生纤维素已长期在多种外科手术(包括神经外科手术、腹部外科手术、心血管外科手术、胸外科手术、头颈外科手术、骨盆外科手术以及皮肤和皮下组织手术)中用作局部止血伤口敷料。基于氧化纤维素材料形成各种类型的止血剂的多种方法是以已知的，而无论止血剂制成粉末、织造、非织造、针织和其它形式。目前利用的止血伤口敷料包括包含氧化再生纤维素(ORC)的针织、织造或非织造织物，该氧化再生纤维素是纤维素纤维均质性增加的氧化纤维素。

当结扎或其它常规控制方法不切实际或无效时，可吸收止血剂用于辅助控制外科手术中毛细血管、静脉和小动脉出血。系列可吸收止血剂由四个主要产品组组成，其中所有止血伤口敷料均可从Johnson&Johnson公司、新泽西州萨默维尔的Ethicon公司(Ethicon,Inc.,Somerville,N.J.)商购获得：Original止血剂是一种白色织物，具有浅黄色模和淡淡的焦糖般的芳香。该材料坚固并且可缝合或切割而不会磨损；

可吸收止血剂类似于Original，但针织密度更高并且因此抗张强度更高，该材料特别推荐用于创伤和移植手术，因为它可缠绕或缝合保持在适当位置以控制出血；

FIBRILLAR^TM可吸收止血剂产品形式具有层状结构，该层状结构允许外科医生用镊子剥离并抓住在特定出血部位处实现止血所需的任何量的材料，并且因此，对于难以到达或不规则形状的出血部位而言可能比针织形式更方便。其特别推荐用于骨科/脊柱和神经外科手术。

SNoW^TM可吸收止血剂产品形式是结构化的非织造织物，其由于结构化的非织造织物，对于内窥镜使用而言可能比其它形式更方便，并且具有高度的适应性并推荐用于开放和微创手术。

含有氧化纤维素的市售可吸收止血剂的另一个示例是得自荷兰阿姆斯特丹的Gelita Medical BV公司(Gelita Medical BV,Amsterdam,The Netherlands)的可吸收纤维素外科敷料。上述可商购获得的氧化纤维素止血剂可以是针织、非织造织物或粉末形式。另外的止血产品，诸如由微孔多糖颗粒和基于植物淀粉的颗粒组成的粉末也可作为和ARISTA^TM商购获得。

其它背景相关的参考文献包括：

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发明内容

本发明涉及改进的止血组合物，这些止血组合物包含源自纤维素源材料并补充有化合物的纤维。

在一个方面，本发明提供了一种止血组合物，该止血组合物包含：具有D90小于350μm且D50小于167μm的尺寸分布的纤维素基纤维，这些纤维的浓度范围为整个组合物的83.5％-90.0％w/w；ω氨基羧酸，其浓度范围为整个组合物的2.5％-5.0％w/w；鱼精蛋白盐，其浓度范围为整个组合物的2.5％-5.0％w/w；二价阳离子，阳离子浓度为整个组合物的1.3％-1.8％w/w，其中该组合物为粉末和/或聚集体的形式。

在一些实施方案中，本发明的组合物还包含尺寸为350μm的纤维。

尺寸分布D50也被称为粉末/聚集体尺寸分布中单位的中值直径或中值，其为累积分布中单位直径在50％时的值。例如，如果D50为Xμm，则样品中50％的单位大于Xμm，并且50％小于Xμm。尺寸分布是落入各种尺寸范围中每一个的单位的数量，以感兴趣的样品中所有单位尺寸总数量的百分比给出。因此，D90值是指90％的单位具有小于D90值的尺寸。在适用的情况下，本文所公开的所有范围包括上限和下限。

在一个实施方案中，纤维素基纤维具有D90小于177μm且D50小于95μm的尺寸分布。

在另一个实施方案中，纤维素基纤维是氧化再生纤维素(ORC)纤维。

在另一个实施方案中，ω氨基羧酸是ε氨基己酸(εACA)。

在一些实施方案中，鱼精蛋白盐是鱼精蛋白硫酸盐。

在一些实施方案中，二价阳离子盐由氯化钙提供。

在一些实施方案中，εACA、鱼精蛋白硫酸盐和氯化钙的浓度范围分别为2.5％-5.0％、2.5％-5.0％、5.0％-6.5％w/w，并且其中剩余重量由纤维素基纤维贡献至100％w/w的总重量。

在一些实施方案中，由粉末组合物在与血液接触时形成的凝胶的具有阻力等于或高于由氧化再生纤维素(ORC)组成的比较粉末组合物在与血液接触时形成的凝胶的阻力的10倍；并且/或者其中由聚集体组合物形成的凝胶具有的止血能力等于或高于由ORC组成的比较聚集体组合物在与血液接触时形成的凝胶的止血能力的1.5倍。

在一些实施方案中，该组合物为尺寸在75μm-420μm范围内的聚集体形式。

在另一方面，本发明提供了一种用于制备止血组合物的方法，该方法包括以下步骤：将具有D90小于350μm且D50小于167μm的尺寸分布的纤维素纤维与以下粉末化合物混合，这些纤维的浓度范围为整个组合物的83.5％-90％w/w：

i-ω氨基羧酸，其浓度范围为整个组合物的2.5％-5.0％w/w；

ii-鱼精蛋白盐，其浓度范围为整个组合物的2.5％-5.0％w/w；以及

iii-二价阳离子，阳离子浓度为整个组合物的1.3％-1.8％w/w。

在一些实施方案中，这些纤维具有D90小于177μm且D50小于95μm的尺寸分布。

在另一方面，本发明提供了一种能够根据本发明方法获得的止血组合物。

在一些实施方案中，该方法还包括以下步骤：压实该止血组合物；并且任选地，使压实的组合物经受干燥和尺寸减小，从而获得止血聚集体。

在另一方面，本发明提供了一种能够根据本发明方法获得的止血聚集体组合物。

在另一方面，本发明提供了一种形成凝胶的方法，该方法包括以下步骤：

使根据本发明的止血粉末和/或聚集体组合物与血液接触，从而形成凝胶。

在一个实施方案中，当与粉末组合物进行接触时，形成的凝胶的阻力等于或高于由氧化再生纤维素(ORC)组成的比较粉末组合物在与血液接触时形成的凝胶的阻力的10倍；

并且/或者其中当与聚集体组合物进行接触时，形成的凝胶具有的止血能力等于或高于由ORC组成的比较聚集体组合物在与血液接触时形成的凝胶的止血能力的1.5倍。

在另一方面，本发明提供了一种能够通过根据本发明方法获得的凝胶。

在另一方面，本发明提供了一种包括容器和任选的涂敷器、载体和/或使用说明的试剂盒，该容器包括根据本发明的止血组合物。

在另一方面，本发明提供了一种在有需要的受试者中处理出血伤口；伤口部位处的细菌感染，最小化或防止吻合部位的渗漏；密封一个部位处的渗漏和/或防止手术部位的粘连的方法，该方法包括将有效量的根据本发明的止血组合物施用到受试者的伤口和/或部位上和/或中。

受治者可为人患者或动物。

在另一方面，本发明提供了根据本发明的止血组合物的以下用途：用于处理出血伤口；伤口部位处的细菌感染，最小化或防止吻合部位的渗漏；密封一个部位处的渗漏和/或防止粘连。

在一个实施方案中，该用途是用于最小化或防止冠状动脉旁路移植(CABG)手术中的渗漏。

在一个实施方案中，施用在不对组合物施加压力的情况下朝向伤口和/或部位进行。例如，使用纱布进行手动压缩不是必需的。在各种产品中，产品在施用过程中需要手动压缩至少一分钟。在没有压缩的情况下使用止血组合物的优点是止血组合物可施用在难以到达的区域中/上。

附图说明

图1和图2是示出使用改进的Bloom测试从不同粉末组合物获得的阻力/内聚强度的条形图。将从未补充的细ORC纤维获得的阻力用作整个实验的基线。

图3是示出离体缝合模型的未压实和压实粉末组合物(即为聚集体形式的组合物)的止血功效以及钙离子在压实组合物中的影响的条形图。

具体实施方式

本发明涉及呈粉末和/或聚集体形式的改进的止血组合物，这些止血组合物包含补充有化合物的纤维素基纤维。

本发明涉及在凝胶或凝块形成时具有令人惊奇的物理特性和高度有益效果的粉末和/或聚集体组合物；涉及其制备和用途。例如，粉末和/或聚集体组合物引起具有有益物理特性(诸如増加的内聚强度和有益的止血能力)的凝胶或凝块形成。

止血组合物包含源自纤维素基材料并补充有化合物的纤维；该组合物为粉末和/或聚集体的形式。

术语“纤维素基纤维”涉及包含纤维素主链的纤维。纤维素主链可被修饰，例如其可包括羧化或氧化水平的改变。纤维素基材料的非限制性示例包括氧化纤维素或氧化再生纤维素、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素和甲基纤维素。

纤维素基纤维的非限制性示例是ORC纤维、棉纤维、人造丝纤维和粘胶纤维。

纤维素基纤维可由纤维素基材料制成。纤维素基材料的非限制性示例是织造、非织造、针织和/或其它形式的织物。

术语“纤维”涉及具有细长螺线状形式的结构。

术语“粉末”涉及分散的干燥固体颗粒。

在一个实施方案中，根据本发明的粉末组合物包括呈颗粒形式的纤维和补充化合物。

术语“聚集体”涉及具有目标尺寸范围的压实的纤维素基材料，诸如粉末和/或纤维，例如压实的材料经受了诸如研磨和任选筛分的尺寸减小。在一个实施方案中，聚集体是经受尺寸减小诸如研磨的压实粉末组合物。

尺寸减小的非限制性示例是研磨、碾磨、粉碎和/或撕裂。

术语“止血”涉及降低出血强度或抑制出血的能力。

止血组合物可通过在根据本发明的范围内将纤维素基纤维与ω氨基羧酸、鱼精蛋白盐和二价阳离子混合来制备。

ω氨基羧酸可以是具有可变链长的ω-羧酸，包括但不限于2-氨基乙酸(甘氨酸)、3-氨基丙酸、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸、7-氨基庚酸、8-氨基辛酸、9-氨基壬酸、10-氨基癸酸和ε氨基己酸。

在本发明的一个实施方案中，组合物中的鱼精蛋白盐是鱼精蛋白硫酸盐。鱼精蛋白盐的其它示例包括但不限于鱼精蛋白胺。

在本发明的一个实施方案中，组合物中的二价阳离子由氯化钙提供。二价阳离子盐的其它示例包括但不限于氯化镁、乙酸钙和氯化铁(II)。

在本发明的一个实施方案中，εACA、鱼精蛋白硫酸盐和氯化钙的浓度范围分别为2.5％-5.0％、2.5％-5.0％、5.0％-6.5％w/w，并且组合物的剩余重量由纤维素基纤维贡献至100％w/w的总重量。

止血组合物还可包含添加剂，该添加剂选自由以下项组成的组：羧甲基纤维素、抗感染剂、另一种止血促进剂、明胶、胶原或其组合。

在本发明的一些实施方案中，止血组合物还包括羧甲基纤维素(CMC)或其它多糖、抗感染剂、止血促进剂、明胶、胶原或其组合。

用作制造用于组合物的纤维的起始材料的纤维源材料或纤维素基材料的非限制性示例包括：氧化再生纤维素织物、氧化再生纤维素(ORC)、织造、针织、非织造织物、粉碎的氧化再生纤维素材料或其组合。

根据本发明，发现由ORC纤维引起的凝胶的内聚强度通过补充化合物而受到影响，如通过改进的Bloom测试所测量的。

改进的bloom测试的结果表明当以5mm/min的速度移动时金属棒穿过凝胶在7mm延伸长度处所需的力。该力反映凝胶的阻力水平(该力越大，凝胶的阻力越大)，并且继而指示凝胶的内聚强度水平。内聚强度表示组合物的分子结合在一起的强度。棒继续其平稳移动所需的力越大，则凝胶的阻力越大。

还发现，用3％或6％氯化钙(CaCl₂)补充ORC纤维以剂量依赖性方式改善了阻力。

根据本发明的发现表明，用3％氯化铁(FeCl₃)补充ORC纤维对形成的凝块的阻力具有显著的积极效果。

当比较3％CaCl₂补充与进一步补充有3％PS；或3％PS和3％εACA；或3％PS和3％脱乙酰壳多糖的具有正电荷的组合物的功效时，结果表明进一步补充的组合物的阻力有所改善。然而，发现包括3％赖氨酸(Lys)(其是在组合物中具有正电荷的另一种化合物)具有负面效应并降低获得的阻力。

不受机制的束缚，用特定的带正电的化合物(例如不同的阳离子(例如由CaCl₂提供的二价阳离子)、鱼精蛋白盐(例如鱼精蛋白硫酸盐)或带正电的多糖(例如脱乙酰壳多糖)和ω氨基羧酸(例如εACA))补充ORC纤维可增加由止血粉末组合物形成的凝胶的内聚强度。

还发现，用3％脱乙酰壳多糖或3％PS补充ORC纤维，再加上6％CaCl₂补充，显示了凝块的阻力增加。

另外，用3％εACA进一步补充6％CaCl₂ORC组合物降低了凝块的阻力。

此外，发现由补充6％CaCl₂形成的凝块中显示的改善的阻力在由用赖氨酸(Lys)补充6％CaCl₂混合物形成的凝块中消失了。另外，用精氨酸(Arg)补充6％CaCl₂-ORC具有相同的负面效应。

已发现，用补充有5.0％CaCl₂、2.5％PS和2.5％εACA的ORC获得了内聚强度的优异结果。

这些令人惊讶的发现表明，用特定阳性化合物以及其特定组合和浓度补充ORC纤维改善了凝胶的内聚强度特性。

另外，发现呈聚集体形式的补充的-ORC纤维(具有5.0％CaCl₂、2.5％PS和2.5％εACA，是表现出优异内聚强度的组合)具有优异的止血能力。观察到氯化钙对补充的ORC聚集体的止血功效的积极贡献。

ORC纤维的聚集体，在补充或未补充有不同浓度化合物的情况下，在体内探索其止血效果。测试的补充化合物的聚集体包括10.0％(最终混合物重量的w/w)长ORC纤维和77.5％-80.0％细ORC纤维的纤维组合。在每个实验中，将细ORC聚集体(没有任何补充)用作比较组合物以检查化合物补充到ORC纤维的止血功效。测量完全出血抑制/完全止血的成功率。体内结果再次证实，所有三种化合物(氯化钙、PS和εACA)对于改善ORC纤维的止血功效均是必需的，并且对于PS和εACA两者而言，优异的补充范围为2.5％至5.0％，且对于氯化钙为5.0％至6.5％(阳离子浓度范围为1.363％-1.636％w/w)。

结果显示，补充的ORC可比ORC比较组合物效率高至少1.5倍(补充的ORC的37.5％完全止血率相对于仅ORC的25％完全止血率)。在本发明的一个方面，组合物包含具有D90小于350μm且D50小于167μm的尺寸分布的纤维素基纤维，这些纤维的浓度范围为整个组合物的83.5％-90.0％w/w并且补充有以下化合物：ω氨基羧酸，其浓度范围为整个组合物的2.5％-5.0％w/w；鱼精蛋白盐，其浓度范围为整个组合物的2.5％-5.0％w/w；二价阳离子盐，盐中的阳离子浓度为整个组合物的1.3％-1.8％w/w。该组合物可为粉末和/或聚集体的形式。

ω氨基羧酸的非限制性示例包括具有可变链长的ω-羧酸，包括但不限于2-氨基乙酸(甘氨酸)、3-氨基丙酸、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸、7-氨基庚酸、8-氨基辛酸、9-氨基壬酸、10-氨基癸酸和ε氨基己酸。

在本发明的一个实施方案中，ω氨基羧酸是ε氨基己酸(εACA)。

在本发明的一个实施方案中，鱼精蛋白盐是鱼精蛋白硫酸盐。

在本发明的一个实施方案中，二价阳离子盐由氯化钙提供。

在本发明的一些方面，止血组合物还包括羧甲基纤维素(CMC)或其它多糖、抗感染剂、止血促进剂、明胶、胶原或其组合。

在本发明的一个实施方案中，化合物包括鱼精蛋白硫酸盐、钙离子和ε-氨基己酸[5％CaCl₂、2.5％PS和2.5％ε-氨基己酸(εACA)]。

在一个方面，本发明提供用于制备本发明组合物的方法。这些组合物具有有益的止血特性，并且可具有伤口愈合和其它治疗特性。

在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：将具有D90小于350μm且D50小于167μm的尺寸分布或D90小于177μm且D50小于95μm的尺寸分布的纤维素基纤维与以下粉末化合物混合，这些纤维的浓度范围为整个组合物的83.5％-90％w/w：

i-ω氨基羧酸，其浓度范围为整个组合物的2.5％-5.0％w/w；

iii-二价阳离子，阳离子浓度为整个组合物的1.3％-1.8％w/w。

在一个实施方案中，根据本发明的止血组合物中的纤维由氧化的纤维素基纤维材料和/或预粉碎的氧化纤维素基材料制成。在另一个实施方案中，根据本发明的止血组合物中的纤维由氧化再生纤维素基纤维材料和/或预粉碎的氧化再生纤维素基材料制成。

用于制备止血组合物的纤维素基纤维起始材料可包括可吸收织造或针织织物或者包含纤维素基材料，特别是氧化纤维素及其中和衍生物的非织造材料。例如，纤维素基材料可以是羧基氧化或醛基氧化的纤维素。可使用氧化再生多糖，包括但不限于氧化再生纤维素(ORC)。氧化再生纤维素由于其相对仍未再生的纤维素具有较高的均匀度而为有利的。再生纤维素以及如何制备氧化再生氧化纤维素的详细说明如下列专利所示：美国专利3,364,200、5,180,398和4,626,253，这些专利中的每一个的全部内容均据此以引用方式并入本文。

可用于制备组合物的纤维的纤维素基材料的示例包括但不限于可吸收粘连屏障、Original可吸收止血剂、可吸收止血剂、FIBRILLAR^TM可吸收止血剂、SNoW^TM可吸收止血剂。

纤维素基材料(例如纤维素基织物)可被研磨以获得具有D90小于350μm且D50小于167μm的尺寸分布的纤维。如果需要，可重复研磨步骤以获得D90小于177μm且D50小于95μm的尺寸分布。

在一个实施方案中，用于制备止血组合物的纤维通过研磨纤维素源材料来制备；在研磨步骤之前，通过裁切和切割纤维素源材料来形成材料片。在该实施方案中，研磨步骤是其中第二部分在空气分级机中进行的两部分过程，其中第二部分可重复三次。在空气分级机中第一遍经过(次)之后，所得“长纤维”具有D90小于350μm且D50小于167μm的尺寸分布。在空气分级机中第三遍经过(3次)之后，所得细ORC纤维具有D90小于177μm且D50小于95μm的尺寸分布。

在本发明的一个实施方案中，组合物中的“细或短”纤维素基纤维具有D90小于177μm且D50小于95μm的尺寸分布。

纤维素基材料可在研磨步骤之前、期间和/或之后与化合物混合或用化合物补充。

在一个实施方案中，包含纤维和化合物的根据本发明的止血粉末组合物进一步经受压实步骤，以形成聚集体，任选地还包括干燥、研磨/碾磨和筛分步骤。

本发明还涉及呈聚集体形式的止血组合物，这些聚集体例如包括已研磨，任选加湿、压实和干燥的化合物和纤维素基材料。

在一个实施方案中，本发明涉及为由多个相互连接的单独纤维素基纤维和根据本发明的化合物组成的聚集体形式的止血组合物，这些止血组合物为聚集体形式并且例如沿着其最长轴的直径小于约420μm且大于约75μm。

在另一方面，本发明涉及一种制备多种止血聚集体组合物的方法，该方法包括以下步骤：压实止血粉末组合物并形成聚集体。

在本发明的一个实施方案中，该方法还包括以下步骤：压实该止血组合物；使压实的组合物经受干燥、研磨；以及筛分，从而获得止血聚集体。

聚集体可通过以下步骤制成：任选地包括加湿止血粉末组合物；例如通过辊和/或击压法(slugging)压实粉末以形成止血聚集体；除湿；研磨；筛分止血聚集体；以及任选地将所得止血聚集体定量投入到储存容器或递送装置中。

在压实之前，可将粉末加湿至11.0重量％与16.0重量％之间的水含量水平。粉末可以是辊压实的或击压法压实的，并且然后经受预破碎、除湿，并随后接着进行最终研磨和可能筛分的步骤。

在一个实施方案中，粉末在至少130巴的辊压力下压实。粉末可在至少26kN/cm的辊力下压实。

例如通过筛分将所得聚集体选择为目标止血聚集体级分。目标聚集体可具有沿着其最长轴75-500μm诸如75-420μm的尺寸。例如当通过“干燥失重”方法测量时，旨在用于给药的止血聚集体可具有小于约5％，更优选小于2％的含水量。

粉末压实可使用根据本发明的粉末和手动液压机(Specac公司Atlas 15 tons型号GS15011)和合适的可抽空粒料模头进行。粒料模头可具有10mm的直径(Specac公司GS03100)以获得胶囊。可将胶囊从粒料模头中释放并破碎以増加用于下一个干燥步骤的表面积。破碎的胶囊可在37℃的真空烘箱(Cole-Parmer真空烘箱型号05017-05)中干燥大约16小时以除去任何多余的湿度(并达到小于5％w/w的湿度)。可使用管磨机控制9737790，将干燥的破碎的胶囊例如在20,000rpm下碾磨/研磨30秒。在下一步骤中，可使用MRC(制造商)摇筛机(型号LS 200在强度水平2下)将研磨的胶囊通过一组2个筛(例如一个孔径为420μm，并且另一个孔径为75μm)剧烈筛分1分钟。可收集保留在两个筛之间的研磨的胶囊。在收集的颗粒/聚集体中，纤维和化合物均匀分布。

在根据本发明的一个实施方案中，为聚集体形式的组合物直接由纤维素基织物制成，在压实之前没有研磨步骤，或者未使用根据本发明的粉末作为起始材料。例如，纤维素基织物经受压实，并且然后如上所述进行干燥、研磨/碾磨和筛分。化合物的补充可在压实之前、期间和/或之后进行。

在一个实施方案中，制备止血聚集体组合物包括以下步骤：混合83.5％-90.0％w/w纤维素基纤维；ω氨基羧酸，其浓度范围为整个组合物的2.5％-5.0％w/w；鱼精蛋白盐，其浓度范围为整个组合物的2.5％-5.0％w/w；以及二价阳离子，阳离子浓度为1.3％-1.8％w/w；使该混合物经受压实；以及任选地干燥、研磨并且筛分该混合物；从而获得所述聚集体。

可将具有正电荷的一种或多种肽进一步添加到根据本发明的组合物中。此类肽的非限制性示例是：蜂毒素(abaecin)、apidaecins、prophenin、吲哚里茨啶(indolicidin)、蜂毒肽、爪蟾抗菌肽、LL-37、牛乳铁蛋白肽、人乳铁蛋白肽、天蚕抗菌肽A1、蟾蜍素II、Thanatin、Polyphemusin 1、爪蟾抗菌肽2、人β-防御素-2、兔肾防御素。穿膜肽/Antenapedia、TAT、SynB1、SynB3、PTD-4、PTD-5、FHV外壳-(35-49)、BMV Gag-(7-25)、HTLV-II、Rex-(4-16)、D-Tat、R9-Tat运输蛋白、MAP、SBP、FBP、MPG、MPG(ΔNLS)、Pep-1、Pep-2。

可将具有正电荷的一种或多种多糖进一步添加到根据本发明的组合物中。具有正电荷的多糖的非限制性示例为脱乙酰壳多糖和阳离子瓜尔胶。

可添加阳离子，诸如来自FeCl₃的阳离子。

在一个实施方案中，制造过程从ORC材料(诸如Original可吸收止血剂)开始，将该ORC材料切成2.54-5.08cm(1-2英寸)宽的部分，然后将其进料到刀片，该刀片将其切成小片。然后通过两个连续的研磨过程(锤磨和空气分级机研磨)将切割的ORC织物片碾磨成ORC细纤维。在另选的实施方案中，将切割的ORC织物片在球磨机中直接转化成细纤维。

然后将所得ORC细纤维加湿到如由Ohaus卤素水分分析仪测量的约11％w/w与约16％w/w之间，并且然后辊压实成大的聚集体。在压实之前，无论是在研磨之前还是之后，以颗粒形式并以合适的浓度用本发明的化合物补充纤维。

术语“颗粒”涉及由分散的固体材料构成的物质。

如果足够量的吸湿性化合物(诸如氯化钙)与ORC纤维混合，则可省略加湿步骤。吸湿性化合物的足够量是例如，允许加湿到如由Ohaus卤素水分分析仪测量的约11％与约16％之间水平的量。

术语“吸湿性材料”涉及通常在正常或室温环境下能够从周围吸引和保持水分子的物质。非限制性示例包括氯化锌、氯化钙、氢氧化钾和氢氧化钠。

水分分析仪以热重原理操作，其中该水分分析仪测定样品的重量；然后通过整体式卤素干燥单元快速加热样品，并使水分蒸发。在干燥操作期间，仪器连续地测定样品的重量并显示结果。在干燥完成后，列表结果显示为含水量百分比、固体百分比、回潮重量或百分比，具体地，分析仪用4分钟升温、90℃最高温度和以下设置测试0.5gr-1.0gr之间的聚合体：测试ID–LOD；配置–标准；干燥温度–90℃；断开开关–A60；结果–水分％；自定义–关闭；目标重量–无。

通常，进行筛分以分离如由筛网筛分确定的尺寸在75μm与420μm之间的目标聚集体/颗粒。

在一个实施方案中，为了压实的目的而引入的过量水分通过除湿或干燥过程除去。在压实、研磨和筛分步骤之后，将组合物定量投入到涂敷器装置中。然后使装置中的组合物经受包装和灭菌。

在一个实施方案中，在定量投入到涂敷器中之前的储存湿度在干燥结束时小于约2％，以在受控环境中实现优选小于6％的含水量(取决于相对湿度(通常为25％-55％的相对湿度)每500克样品湿度增加0.3％-0.6％/小时)以用于定量投入到涂敷器中。

一种用于制造止血聚集体的方法包括，例如以下步骤：

(a)提供纤维素基(纤维素源)材料以及

任选地，裁切并切割纤维素基材料；

任选地，(b)减小来自步骤a)的材料的尺寸(例如，通过在空气分级机中研磨)以获得长纤维；

(c)减小来自步骤a)或b)的材料的尺寸(例如，通过在空气分级机中研磨)以获得细纤维；

任选地，(d)将长纤维和细纤维混合以获得混合纤维；

(e)用化合物补充来自步骤c)或d)的纤维以获得补充化合物的纤维；

任选地，(f)加湿在步骤e)中获得的补充化合物的纤维以获得补充化合物的加湿纤维；

(g)压实步骤f)的补充化合物的加湿纤维(例如，通过击压法或辊压)，包括除湿/干燥以及任选地减小尺寸；

(h)筛分；

任选地，(i)定量投入到储存容器或递送装置中，进行初级包装和次级包装；以及

任选地，(j)灭菌。

在一个实施方案中，如果将足够量的吸湿性化合物(诸如氯化钙)加入到纤维中，则可省略加湿步骤。

可优选地进行裁切和切割以将织物裁切并切割成大约2.54cm×7.62cm或5.08cm×7.62cm(1英寸×3英寸或2英寸×3英寸)之间的适当尺寸的片，尽管还可使用更小的片。进行裁切和切割的主要操作是退绕织物辊、将织物裁切成条、将条切割成一定尺寸并将切割的片递送到第一研磨步骤中。许多切割和裁切机器是已知的并且可商购获得，诸如购自AZCO的AZCO型号FTW 1000。

与组分的补充可在裁切和切割织物之前或之后进行。

在一个实施方案中，在第一研磨步骤中，将纤维素织物的加工片从裁切和切割步骤中产生的粗纤维转化为D90值小于452μm且D50值小于218μm的材料，而对材料的颜色指数和水溶性含量具有最小影响。用于研磨的许多机器可商购获得，诸如由Fitzpatrick制造的型号DASO6和WJ-RS-D6A，它们是锤磨机型研磨机器，配备有497μm圆形筛网和一组刀片，这些刀片将织物分解直到它们通过筛网以产生粗纤维素纤维。在示例性处理运行中，研磨速度可为约7000RPM；处理温度低于80℃；刀片数量为8个(每个叶轮2个)；刀片类型为225刀，冲击型刀片；刀片取向设置为“冲击”。

在该阶段，第一研磨步骤中产生的粗纤维的尺寸可进一步减小至小于177μm的D90值和小于95μm的D50值，同时保持对材料的颜色指数和水溶性含量的最小影响。许多机器可用于第二研磨步骤，诸如来自Quadro的空气分级机/F10Quadro Fine Grind。

来自第一研磨步骤的粗纤维可以受控速率进料到第二研磨机中并且通过两个由研磨筛网分开的研磨室。材料可通过鼓风机被拉动穿过研磨室。粗纤维可通过空气分级机设备三次进行加工以便获得细纤维尺寸。在第二研磨步骤结束时，可收集细纤维。

在示例性处理运行中，Quadro空气分级机F10可用于第二研磨步骤，使用8400rpm的研磨速度、1800rpm的鼓风机速度并且3次通过。ORC细纤维还可通过球磨在一个步骤(而不是如上所述的两个研磨步骤)中产生。在另选的球磨实施方案中，通过将球和样品放置在500mL碾磨罐中将50g预切割的ORC织物(约5.08cm×5.08cm(2英寸×2英寸)的片)与12个高密度氧化锆(二氧化锆ZrO2，直径20mm；美国新泽西州克里夫顿的Glen Mills公司(GlenMills Inc.,Clifton,N.J.,USA))球磨。将该罐夹到闩锁支架中，并且然后在行星式球磨机PM100上进行平衡；美国宾夕法尼亚州新城的Retsch公司(Retsch,Inc.,Newtown,Pa.,USA))。然后以450rpm双向进行研磨20分钟。

在研磨过程之后，可将所得纤维素基细纤维加湿至约11％至约18％，或约11％与约16％之间，或约12％-16％范围内的含水量以用于后续处理，包括例如辊压实过程。适用于加湿步骤的湿度室是可商购获得的，例如由Thermal Product Solutions提供的型号CEO-916-4-B-WF4-QS。室内空气的加湿通过水蒸气注入实现。25℃的典型稳态温度可被利用，而湿度水平可在75％与85％之间循环，其中优选目标为85％空气湿度。根据材料量和空气循环情况，湿度室内材料的加湿时间或停留时间范围可从几小时到几天。在典型的循环中，对于约3,000克纤维素基细纤维布置在多个托盘中并暴露于85％的相对湿度以及加湿后粉末的含水量为12％的目标，材料将具有12-13小时的停留时间。

辊压实机压实加湿细ORC纤维的进料，然后使其经受预破碎、除湿、最终研磨并且在筛选机中筛分以获得所需的止血聚集体尺寸。

通常，在压实之前和/或在产生聚集体之前进行根据本发明的化合物的补充。

压实设备是已知的并且可商购获得。纤维可通过击压机械或本领域已知的任何其它压实技术来压实。示例性压实单元是具有Retsch手动筛分AS200筛选机的FitzpatrickChilsonator IRR220-L1A和具有集成在M5A下的筛选机Sweco振动能量单元的FitzpatrickChilsonator CCS220/M3B&RV-M5A。压实处理可使用两个独立的子系统来进行，这些子系统由共同的电气系统进行约束。例如，第一子系统(辊压实机：主单元)可以是FitzpatrickChilsonator CCS220辊压实机和用于预破碎压实材料的M3B研磨机，而第二子系统(辊压实机：第二研磨单元)是用于最终研磨的M5A研磨机，其具有用于分离的Sweco或Retch筛选机从而获得所需尺寸的聚集体。

加湿的细纤维素基纤维可进料到辊压实单元的料斗中，首先通过主研磨单元，并且然后继续通过第二研磨单元。可提供容器，其捕获由主研磨单元产生的预破碎的纤维素基材料。然后可将纤维素基材料的预破碎的片进料到第二研磨单元中，该第二研磨单元利用筛网网格进行最终研磨和筛选。使用筛网网格(诸如上述的Sweco或Retch筛选机)将所得研磨的纤维素基材料优选地分成“细小”(<75μm)、“目标”(75-420μm)和“过大”(>420μm)。

在除湿或干燥步骤中从在压实和筛分后获得的止血聚集体中除去水分。除湿或干燥步骤优选地不显著影响任何其它产品质量属性，诸如颜色、堆积密度和尺寸。通常，可使用常规的流化空气床将纤维作为批料进行干燥。所得干燥聚集体可装填并储存在密封的箔袋中。除湿设备是已知的并且可商购获得。示例性具有6L容量的台式流化空气床可从Retsch(TG-200)商购获得。另选地，还可使用来自Fluid Air公司(伊利诺伊州奥罗拉(Aurora,IL))的流化床型号0002。

在本发明的另一方面，呈粉末和/或聚集体形式的止血组合物可与各种添加剂组合以进一步改善止血特性、伤口愈合特性和处理特性，包括：止血添加剂，诸如明胶、胶原、纤维素、脱乙酰壳多糖、多糖、淀粉、CMC；基于生物制剂的止血剂诸如凝血酶、纤维蛋白原和纤维蛋白，另外的生物制剂止血剂包括但不限于促凝血酶、蛋白质和肽，每种这样的试剂可以是天然存在的、重组的或合成的，并且还可选自由以下项组成的组：纤粘蛋白、肝素酶、因子X/Xa、因子VII/VIIa、因子IX/IXa、因子XI/XIa、因子XII/XIIa、组织因子、巴曲酶、安克洛酶、蛇静脉酶、von Willebrand因子、白蛋白、血小板表面糖蛋白、加压素和加压素类似物、肾上腺素、选择蛋白、促凝血毒液、纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂、血小板激活剂、具有止血活性的合成肽；抗感染剂，诸如葡萄糖酸氯己定(CHG)、三氯生、银以及本领域已知的类似的抗细菌/微生物剂；増加止血剂粘性的添加剂；稀释剂、盐水溶液、本领域已知的类似添加剂；以上的衍生物及其任何组合。

在一个实施方案中，根据本发明的止血粉末和/或聚集体组合物由氧化的纤维素基纤维材料(诸如ORC)或预粉碎的氧化纤维素基材料制成。

在本发明的一个实施方案中，粉末组合物具有在与血液接触时形成凝胶的特性。所形成的凝胶的阻力等于或高于比较组合物在与血液接触时形成的凝胶的阻力的10倍。

在一个实施方案中，比较粉末组合物仅由氧化再生纤维素(ORC)组成。

术语“凝胶”涉及粘性的和/或固体状的材料，其可具有柔软且弱至硬且坚韧范围内的特性。凝胶可以是水凝胶。

通常，水凝胶是亲水性的聚合物链的网络。水凝胶可含有超过90％的水并且包括聚合物网络。

凝胶可以是凝块，该凝块是凝结液体(尤其是血液)的浓稠物质。

术语“进行接触/接触”以其最广义的意义使用，并且例如是指将止血组合物与血液充分紧密接近使得形成凝块或凝胶的任何类型的结合动作。

术语“血液”包括血液级分，诸如血浆。

在一个实施方案中，比较粉末组合物由D90值小于350μm且D50值小于167μm的ORC纤维组成。

在本发明的一个实施方案中，根据本发明的聚集体和/或粉末组合物具有在与血液接触时形成凝胶的特性。所形成的凝胶的止血能力等于或高于比较聚集体组合物在与血液接触时形成的凝胶的止血能力的1.5倍。

在一个实施方案中，比较聚集体组合物由例如，D90值小于350μm且D50值小于167μm的ORC纤维组成。

在一个实施方案中，比较聚集体由例如，D90值小于177μm且D50值小于95μm的ORC纤维组成。

术语“凝胶的阻力”涉及改进的bloom测试(如下文示例)的结果，这些结果表明当以5mm/min的速度移动时金属棒穿过凝胶在7mm延伸长度处所需的力。该力反映凝胶的阻力水平(该力越大，凝胶的阻力越高)，并且继而指示凝胶的内聚强度水平。棒继续其平稳移动所需的力越大，则凝胶的阻力越大。

在另一方面，本发明提供了一种用于形成凝胶的方法，该方法包括以下步骤：使根据本发明的止血组合物与血液接触，从而形成凝胶。

在一个实施方案中，该方法形成所具有的阻力等于或大于比较组合物在与血液接触时形成的凝胶的阻力的10倍或高于12倍的凝胶，并且/或者形成所具有的止血能力等于或大于比较组合物在与血液接触时形成的凝胶的止血能力的1.5倍的凝胶。

在一个实施方案中，比较组合物包含纤维素基纤维并且不含其浓度范围为整个组合物的2.5％-5.0％w/w的ω氨基羧酸；不含其浓度范围为整个组合物的2.5％-5.0％w/w的鱼精蛋白盐；并且不含阳离子浓度为整个组合物的1.3％-1.77％w/w的二价阳离子。

在另一方面，本发明提供了一种包括容器和任选的涂敷器、载体和/或使用说明的试剂盒，该容器包括本发明的止血组合物。术语“载体”涉及包含和/或保持止血组合物的物理基质。载体的示例包括但不限于用于内部和/或外部使用的垫，诸如基于纤维素的垫、基于胶原的垫；植入物诸如正畸和整形外科植入物；可流动的密封剂和/或止血剂，诸如

在一些实施方案中，容器是涂敷器。

在一个实施方案中，具有5.0％CaCl₂、2.5％PS和2.5％εACA的聚集体或粉末组合物相当于：40mg/cm²CaCl₂、20mg/cm²PS、20mg/cm²εACA。

例如，如果将总量为100mg的最终组合物施加在直径为0.4cm的圆形冲头上。则将100mg组合物施加在π*(0.2cm)²＝0.126cm²的冲头表面积上。意味着使用了793.65mg/cm²(由计算：100mg/0.126cm²得到)的最终组合物。

如果CaCl₂以最终组合物的5％的浓度使用，因此793.65*0.05等于约40mg/cm²。

如果PS以最终组合物的2.5％的浓度使用，因此793.65*0.025等于约20mg/cm²。

如果εACA以最终组合物的2.5％的浓度使用，因此793.65*0.025等于约20mg/cm²。

与几种已知产品相比，该止血组合物可具有以下优点中的一个或多个：

1-可阻止例如大血管缝合线处的出血，并且因此可显著减少和阻止来自血管缝合线的出血，这与在实现血管止血方面功效有限的几种已知产品不同；

2-可实现止血而不需要施加压力。几种已知产品需要施加压力以便实现止血(例如用纱布手动压缩)；

3-在血液中被活化。当由水分活化时，止血纤维和/或聚集体增益结构(例如以凝块/凝胶的形式)并且可实现止血。几种已知产品具有预成形的结构完整性；

4-可设置在血液中，不易漂走并且可实现止血。几种已知产品在潮湿环境中的功效有限；

5-可粘附到出血部位，但仍然是可逆的，即粘附到出血部位并抵抗灌洗，但如果需要手术矫正则可被刮除以除去并进入。几种已知产品在潮湿区域中的粘附性有限，或者在施用后不易除去。

止血组合物可用于各种手术和伤口愈合局部施用，诸如抗粘连屏障、止血剂、组织密封剂等。本发明的止血组合物可作为止血剂、干燥组合物或作为具有优异止血特性和良好组织适形能力的糊剂形式的组合物。

止血纤维和/或聚集体组合物可用于各种手术和/或伤口愈合局部施用，诸如用于抗杀菌处理、止血、抗粘连、密封和/或用于最小化或防止渗漏，例如来自吻合部位的渗漏，诸如冠状动脉旁路移植(CABG)期间形成的渗漏。

该组合物可用于在难以到达的区域中(例如在腹腔镜手术期间)、在诸如CABG和/或动静脉吻合术的吻合部位上、在其中施加压力是不应当的程序(诸如脊柱手术或神经元外科手术)中阻止出血。

进行冠状动脉旁路移植(CABG)手术的患者可能会从手术过程中形成的吻合部位发生渗漏。许多这些渗漏在手术期间使用另外的缝合线或各种止血剂处理。在手术期间阻止这些渗漏并防止它们在手术后发展，将有助于外科医生更加确信他们的患者不会有手术后吻合渗漏。在需要输血或再次手术的CABG手术后的出血与发病率和死亡率显著增加相关联。在多达20％的病例中，在再次手术期间可确定特定的出血部位。手术出血的典型来源包括插管部位、近端和远端吻合部位以及ITA和静脉移植物的分支。根据文献，2％-3％的CABG患者需要重新探查出血情况，并且多达20％的患者在术后出血过多从而需要输血。

所有引用的出版物的内容据此全文以引用方式并入。

实施例：

材料和方法.

表1A：氧化再生纤维素(ORC)纤维。

*参见下文关于制备的详细说明。

表1B：用于补充ORC纤维的化合物。

表2：在CaCl₂和FeCl₃中的阳离子浓度当量的％(w/w)。

氧化再生纤维素(ORC)纤维制备：

ORC纤维的制造过程从ORC材料Original可吸收止血剂开始。将ORC材料切割成2.54-5.08cm(1至2英寸)宽的部分，然后将材料进料到刀片，该刀片将织物切割成较小的片。然后通过两个连续的研磨过程(锤磨和空气分级机研磨)将切割的ORC织物片碾磨成ORC细纤维。取出来自不同研磨步骤的纤维用于将来使用，以便在最终聚集体中掺入不同的纤维尺寸。

更具体地，用于制造纤维的方法包括以下步骤：裁切并切割Original织物；使用锤磨研磨所得材料；在空气分级机中进行研磨步骤以用于获得长纤维和细纤维；以及任选地混合不同尺寸的纤维。不同的纤维尺寸是具有不同尺寸分布的纤维。

进行裁切和切割以将织物裁切并切割成大约2.54cm×7.62cm(1英寸×3英寸)的适当尺寸的片。进行裁切和切割的主要操作是退绕织物辊、将织物裁切成条、将条切割成一定尺寸并将切割的片递送到第一研磨步骤中。

在第一研磨步骤中，将纤维素基织物材料的加工片从裁切和切割步骤中产生的中间粗纤维转化为D90值小于452μm且D50值小于218μm的材料，而对材料的颜色指数和水溶性含量具有最小影响。在该步骤中用于研磨的机器是由Fitzpatrick制造的锤磨机型型号WJ-RS-D6A。该锤磨机配备有497μm圆形筛网和一组刀片，这些刀片将织物分解直到它们通过筛网以产生中间粗纤维素基纤维。研磨的参数为：约7000RPM的研磨速度；低于80℃的处理温度；8个(每个叶轮2个)刀片数量；刀片类型为225刀，冲击型刀片；刀片取向设置为“冲击”。

将来自第一研磨步骤的中间粗纤维以受控速率进料到第二研磨机中。使中间粗纤维通过空气分级机设备三次进行加工以便获得所需尺寸。此外，在某些实验中，提取从第一次运行通过空气分级机取出的纤维，以便在最终聚集体中掺入不同的纤维尺寸。

在该步骤中，以8400rpm的研磨速度、1800rpm的鼓风机速度使用Quadro空气分级机F10，并且3次通过。在一次通过后，所得长ORC纤维的D90值小于350μm且D50值小于167μm。在3次通过后，所得细ORC纤维的D90值小于177μm且D50值小于95μm。

粉末组合物制备。

在湿度受控条件下使用分析天平称重所有粉末。整个粉末制备过程中相对湿度不超过20％。所有粉末均由如上所述制备的D90小于350μm且D50小于167μm的ORC纤维组成，并且补充有不同的带正电的化合物。带正电的化合物是其内含有带正电的基团/元素的材料。在实施例1-3中，粉末或聚集体组合物的ORC纤维包含细ORC纤维；例如，如果化合物为3％FeCl₃(从整个组合物重量的w/w)，则ORC细纤维构成97％w/w。(参见表1A中的尺寸分布)；在实施例4中，补充的聚集体的ORC纤维是10.0％(最终混合物重量的w/w)长ORC纤维(参见表1A中的尺寸分布)和77.5％-80.0％(最终混合物重量的w/w)细ORC纤维的组合。ORC纤维中化合物的补充量在体外测试中高达10.0％(w/w)，在体内测试中高达12.5％(w/w)。

表1B中详细说明的所有化合物均以粉末形式提供。

将每种纤维-化合物混合物组合转移到研钵和研杵并充分混合，直到粉末颗粒同样/均匀地分布在组合物内。为了使湿度的吸收最小化，将粉末组合物储存在小瓶中并用塑料石蜡膜密封。

实施例1-2中的组合物为粉末形式。在实施例3中，未压实组合物为粉末形式，而压实组合物为聚集体形式。在实施例4中，所有组合物均为聚集形式(参见下文关于聚集体制备的详细说明)。

聚集体制备。

为了获得含有较高质量/体积比的聚集体/颗粒，进行了两个步骤：

I-粉末压实(胶囊化)；以及

II-胶囊干燥、研磨/碾磨和筛分。

参见下文步骤I和II的详细说明。

粉末压实。

使用手动液压机(Specac Atlas 15tons型号GS15011)和合适的可抽空粒料模头进行压实，该粒料模头具有10mm的直径(Specac GS03100)。将约300mg粉末组合物(如上所述制备)装载到粒料模头中直到大约1.5cm-2.0cm的高度。在下一步骤中，将金属棒(其是手动液压设备的一部分)安装在粉末的顶部，并且用于通过手动液压机达到4吨的压力(约1.3吨/cm²)。在该步骤之后，形成直径为10mm且高度为大约0.3cm-0.5cm的胶囊(压实粉末)。将胶囊从粒料模头中释放并用研钵和研杵破碎成较小的部分以増加用于下一个干燥步骤的表面积。

胶囊干燥、研磨/碾磨和筛分。

将胶囊半体在37℃的真空烘箱(Cole-Parmer真空烘箱型号05017-05)中干燥大约16小时以除去任何多余的湿度(并达到小于5％w/w的湿度)。使用Works公司管磨机控制9737790，将干燥的胶囊部分在20,000rpm下碾磨/研磨30秒。在下一步骤中，使用MRC(筛制造商)摇筛机(型号LS 200在强度水平2下)将聚集体通过一组2个筛(一个孔径为420μm，并且另一个孔径为75μm)剧烈筛分1分钟。收集保留在两个筛之间的聚集体并在室温(20℃-27℃)下储存在紧密封闭的小瓶中，用塑料石蜡膜密封直到使用。在该阶段结束时，每种最终颗粒/聚集体组合物中存在的所有组分均匀分布在其中。

血液制备。

实施例1-2中使用的血液由Lahav合同研究组织(C.R.O.)从杀死(exterminated)的猪收集并且在冷藏容器(4℃)中递送。在收集血液时，在每升血液中加入5000IU肝素[肝素钠-Fresenius 5000IU/1ml注射液；制造商：BODENE(PTY)LTD经营为Intramed；目录编号：9207910LAB]。

为了防止凝结，在到达时加入另外的肝素(每1升血液5000IU)。通过将瓶倒置几次将肝素化的血液轻轻混合。在下一步骤中，为了除去残留凝块，将肝素化的血液通过20μm聚丙烯注射器过滤器(由Entegris提供的SVL25D20HQSA25)过滤并收集到聚丙烯容器中(以防止由玻璃引起的血液凝结)。将过滤后的肝素化血液储存在4℃下直到使用。

Bloom测试。

Bloom是用于测量凝胶或明胶的内聚强度的测试。内聚强度表示测试材料/组合物的分子之间的结合。一般来说，Bloom测试涉及确定为了产生4mm的凹陷通过圆柱形活塞(直径为12.7mm)必须施加到6.67％明胶凝胶(通过将7.5克明胶溶解在105克水中而制备)的自由表面的力(以克为单位)。对于该测试，凝胶通常在具有以下尺寸的玻璃器皿中形成：容量为150ml、内径为59mm并且高度为85mm。将下行活塞的速度设置为30mm/分钟(参见US1540979中所述的Bloom测试)。

在下文的实施例中，进行改进的Bloom测试以测试当不同的测试粉末组合物与血液混合时形成的凝块的内聚强度。将该参数评估为每种测试组合物的潜在止血功效的指标。一般来说，较高的阻力(Bloom测试中的较高值)与较高的内聚强度相关，并且表明该组合物具有较高的止血功效；低阻力与低内聚强度相关，并且表明该组合物具有低止血功效。在与未补充的ORC纤维比较的基础上，评估由每种测试粉末组合物引起的内聚强度。将结果表示为相对于未补充的ORC纤维的阻力的倍数增加。

改进的Bloom测试如下进行：

1)将300mg每种测试粉末组合物称重到7ml管(内径：15mm，高度：50mm)中。

2)将2.5ml血液(如以上在“血液制备”中所述制备)加入到每种粉末组合物中。

3)将管以3200rpm剧烈涡旋振荡，直到没有干燥粉末在视觉上明显为止，并且将血液-粉末组合物混合物温育3分钟以促使形成凝块。

4)为了测量内聚强度，将小瓶置于'Lloyd LF plus’仪器中，并且以恒定的预设下降速度：5mm/分钟将金属棒[1.27cm(0.5英寸)]插入小瓶中。以毫帕(MPa)为单位测量凝块对延伸入凝块7mm处的金属棒移动的阻力。该测试在室温下进行。

缝合临床前模型。

使用脉冲式离体心肺分流术(CPB)模型来模拟生理条件。该模型描述于：

Sergeant,P.,Kocharian,R.,Patel,B.,Pfefferkorn,M.和Matonick,J.(2016)。Needle-to-suture ratio,as well as suture material,impacts needle-holebleeding in vascular anastomoses(针与缝合比以及缝合材料影响血管吻合中的针孔出血)。互动式心血管与胸外科杂志(Interactive CardioVascular and ThoracicSurgery),22(6),813-816.doi:10.1093/icvts/ivw042。

简而言之，脉冲式离体心肺分流术模型使用一系列泵和室来形成、控制和维持整个系统的血压。该模型包括用于过滤进入猪颈动脉和从猪颈动脉返回的血液的储存器、计算机集成的数据采集系统、充氧器和换热器。存在流动阻抗和体积分配调整以允许精细调整血液体积流量和压力控制。

收集来自置于猪颈动脉中的缝合线的失血并称重以建立渗漏率。计算渗漏率并记录为在一段时间内收集的血液体积。

为了模拟生理条件，使用以下参数：

120/80mmHg的压力

72/min的脉博率

33℃-35℃的血液温度

向1L供体猪血液中加入10,000IU肝素并用10mg/ml鱼精蛋白硫酸盐滴定以将活化凝结时间(ACT)调节至大约369秒。使用VetScan i-STAT便携式手持单元(Abbott Point ofCare公司)和I-STAT ACT Celite Cartridge(Abbott Poing of Care公司，部件号：600-9006-10)测量ACT。

将猪颈动脉从周围组织分离并安装在系统上。使用管夹来将组织固定到配件。限制颈动脉两侧的血流，并用6-0PROLENE缝合线(8806H)和BV-1针以简单连续的模式缝合颈动脉。测量2分钟内的失血质量作为基线。

将粉末/聚集体施用在缝合部位上并且在完成施用后使其固化4分钟。移除限制并测量2分钟内的失血质量。

肝活检冲孔体内模型。

使一头成熟的、约60kg的母猪在外科手术之前禁食24小时。用1150mg-1400mg氯胺酮、115mg-140mg赛拉嗪、7.5mg咪达唑仑麻醉该动物。用异氟烷维持麻醉，并且打开腹部以显示肝脏。在整个外科手术过程中连续监测平均动脉血压、体温和心率。当平均动脉血压降至低于60mmHg时终止实验。

在肝叶上进行4mm直径×2mm深度的活检冲孔，并且用手术剪将标本切除。允许冲孔部位出血30秒，并以0-5的等级目视评估出血强度；由此，对未出血给出评分为0，并且对剧烈出血给出评分为5。然后，用干净的纱布擦拭冲孔部位以除去多余的血液，并将100mg测试的聚集体组合物倒入冲头腔中(例如，具有5.0％CaCl₂、2.5％PS和2.5％εACA的聚集体组合物相当于：40mg/cm²CaCl₂、20mg/cm²PS、20mg/cm²εACA)。

将总量为100mg的最终组合物施加在直径为0.4cm的圆形冲头上。因此，将100mg组合物施加在π*(0.2cm)²约0.126cm²的冲头表面积上。意味着使用了793.65mg/cm²(由计算：100mg/0.126cm²得到)的最终组合物。

CaCl₂以最终组合物的5％的浓度使用，因此793.65*0.05等于约40mg/cm²。

PS以最终组合物的2.5％的浓度使用，因此793.65*0.025等于约20mg/cm²。

εACA以最终组合物的2.5％的浓度使用，因此793.65*0.025等于约20mg/cm²。

使用清洁纱布将温和的压力手动施加到组合物上1分钟。在4分钟的时间内监测出血，然后以0-5的等级再次评级出血强度。将结果表示为从所有平行测定实现的完全止血率的百分比。

实施例1：不同化合物对用细ORC纤维形成的凝块的内聚强度的影响。

本实施例的目的是检查由补充有不同化合物的ORC纤维引起的内聚强度。为了该目的，如上所述进行改进的bloom测试。

如图1所示，测试的粉末组合物由补充有不同化合物的细ORC纤维组成。如在“粉末制备”中的材料和方法部分中所述制备粉末。上表2示出在以下所有实验中使用的CaCl₂和FeCl₃中阳离子的百分比(w/w，基于整个重量组成)。图1是示出与未补充的细ORC纤维相比，对于不同的测试粉末组合物获得的阻力/内聚强度的倍数增加的条形图。

改进的bloom测试的结果表明当以5mm/min的速度移动时金属棒穿过测试组合物在与血液接触时形成的凝胶在7mm延伸长度处所需的力。该力反映凝胶的阻力水平(该力越大，凝胶的阻力越大)，并且继而指示凝胶的内聚强度水平。内聚强度表示组合物的分子结合在一起的强度。棒继续其平稳移动所需的力越大，则凝胶的阻力越大。

结果显示，用3％氯化铁(FeCl₃)补充ORC纤维对形成的凝块的阻力具有显著的积极效果。

还显示，用3％或6％氯化钙(CaCl₂)补充细ORC纤维以剂量依赖性方式改善了阻力。

当比较3％CaCl₂补充与进一步补充有3％PS；或3％PS和3％εACA；或3％PS和3％脱乙酰壳多糖的组合物的功效时，结果表明进一步补充的组合物的阻力有所改善。在组合物中包含3％赖氨酸(Lys)具有负面效应并降低获得的阻力(在图1中比较补充有3％CaCl₂和3％PS的细ORC纤维与补充有3％CaCl₂、3％PS和3％Lys的细ORC纤维)。

可得出结论，向ORC纤维中加入特定的带正电的化合物诸如氯化钙、鱼精蛋白硫酸盐(PS)和/或脱乙酰壳多糖改善了由纤维引起的内聚强度，这表明这些补充组合物可能在体内具有有益的止血效果。

不受机制的束缚，用特定的带正电的化合物(例如不同的阳离子(例如由CaCl₂提供的二价阳离子)、鱼精蛋白盐(例如鱼精蛋白硫酸盐)或带正电的多糖(例如脱乙酰壳多糖)和ω氨基羧酸(例如εACA))补充ORC纤维增加了由止血粉末组合物形成的凝胶的内聚强度。

实施例2：补充组合对由粉末组合物引起的内聚强度的影响。

先前实施例表明，与3％CaCl₂相比，用6％CaCl₂补充细ORC纤维导致较高的阻力/内聚强度。先前实施例显示，用另外的带正电的化合物进一步补充3％CaCl₂-细ORC纤维组合物增加了组合物的内聚强度。因此，在该实施例中，测试了用另外的带正电的化合物进一步补充具有高CaCl₂浓度(5％或6％)的细ORC纤维组合物对内聚强度的贡献。结果示于图2中。

类似于先前实施例中所示的结果，与仅ORC相比，补充6％CaCl₂-ORC混合物导致阻力/内聚强度增加。发现由补充6％CaCl₂形成的凝块中显示的改善的阻力在由用赖氨酸(Lys)补充6％CaCl₂混合物形成的凝块中消失了。用精氨酸(Arg)另外补充6％CaCl₂-ORC具有相同的负面效应。

用3％脱乙酰壳多糖或3％鱼精蛋白硫酸盐(PS)补充ORC纤维，再加上6％CaCl₂，显示了凝块的阻力增加。

此外，仅用3％εACA进一步补充6％CaCl₂ORC组合物降低了凝块的阻力(在图2中比较补充有6％CaCl₂的细ORC纤维与补充有6％CaCl₂和3％εACA的细ORC纤维)。

使用补充有5.0％CaCl₂、2.5％PS和2.5％ε-氨基己酸(εACA)的ORC获得了优异的结果。

这些结果表明仅特定的化合物及其特定的组合和浓度才能改善由ORC纤维引起的内聚强度特性。

实施例3：不同组合物在离体模型中的止血效果。

在该实施例中，在缝合(临床前)离体模型(如材料和方法部分中所述)中检查根据体外测试具有高内聚强度的示例性组合物的止血能力。以粉末或聚集体的形式测试组合物的功效。另外，评估了组合物中不存在钙对止血功效的影响。

粉末压实按照“粉末压实”(材料和方法部分)中的详述进行；然后使压实粉末经受按照“胶囊干燥和研磨/碾磨”中的详述进行的干燥步骤和研磨/碾磨步骤，由此形成粉末颗粒/聚集体。

以上述方式(“缝合临床前离体模型”)比较组合物施用于缝合部位之前和之后的失血体积。

为了这些目的，以压实和未压实两种形式测试了补充有5.0％CaCl₂、2.5％PS和2.5％εACA的细ORC纤维的粉末组合物；还评估了补充有5.0％PS和5.0％εACA(不含钙)的细ORC纤维的压实组合物。

如图3所示，当粉末被压实研磨并筛分成聚集体形式时，存在改善止血功效的总体趋势(观察到失血减少％的增加)。结果还显示了氯化钙对ORC粉末的功效的积极贡献。

实施例4：通过体内测试确定聚集体组合物中化合物浓度范围对止血功效的影响。

以下实施例检查了改变根据以上实施例选择的每种化合物浓度的体内止血效果。使用如上所述的肝活检冲孔体内模型从对母猪进行的不同临床前实验收集结果。每个实验的结果在不同的表-表格3、4和5中示出。在该实验中，测试了各种聚集体组合物。测试的聚集体组合物是含有或不含有化合物补充的ORC纤维，化合物的浓度在下表中指定。补充化合物的聚集体包括10.0％(最终混合物重量的w/w)长ORC纤维(参见表1A中的尺寸分布)和77.5％-85.0％细ORC纤维的ORC纤维组合。

该表列出了完全出血抑制/完全止血的成功率。在每个实验中，将细ORC聚集体(没有任何补充)用作基线对照以检查化合物补充到ORC纤维的止血功效。

表3、4和5：在肝活检冲孔体内模型中应用聚集体组合物后获得的完全止血率(每种测试组合物中的平行测定次数≥3)。

表3-5中示出的结果再次证实，每种化合物对于改善ORC纤维的止血功效均是必需的，因为含有所有三种化合物(氯化钙、PS和εACA)的组合物与其它聚集体组合物相比是显著优异的。结果显示，对于PS和εACA两者，优异的补充范围是2.5％至5.0％。其中氯化钙用作有益化合物的范围在5.0％与6.5％之间(阳离子浓度范围为1.363％-1.636％w/w)。

结果显示，补充的ORC比仅ORC效率高至少1.5倍(补充的ORC的37.5％完全止血率相对于仅ORC的25％完全止血率)。

尽管已在本公开中示出和描述了多种型式，但可以由本领域的普通技术人员在不脱离本发明范围的情况下进行适当修改来实现对本文所述的方法和系统进行另外改进。已经提及了若干此类可能的修改，并且其他修改对于本领域的技术人员而言将显而易见。例如，上文所讨论的示例、型式、几何形状、材料、尺寸、比率、步骤等等均是示例性的而非必需的。因此，本发明的范围应根据以下权利要求书来考虑，并且应理解为不限于说明书和附图中示出和描述的结构和操作的细节。

Claims

1. 一种止血组合物，包含：纤维素基纤维，其具有D90小于350µm且D50小于167µm的尺寸分布，所述纤维的浓度范围为整个组合物的83.5%-90.0% w/w；ω氨基羧酸，其浓度范围为整个组合物的2.5%-5.0% w/w；鱼精蛋白盐，其浓度范围为整个组合物的2.5%-5.0% w/w；二价阳离子，所述阳离子浓度为整个组合物的1.3%-1.8% w/w，其中所述组合物呈粉末和/或聚集体形式。

2.根据权利要求1所述的止血组合物，其中所述纤维素基纤维具有D90小于177µm且D50小于95µm的尺寸分布。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述纤维素基纤维是氧化再生纤维素(ORC)纤维。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述ω氨基羧酸是ε氨基己酸(εACA)。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述鱼精蛋白盐是鱼精蛋白硫酸盐。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中二价阳离子盐由氯化钙提供。

7. 根据权利要求6所述的组合物，其中εACA、鱼精蛋白硫酸盐和氯化钙的浓度范围分别为2.5%-5.0%、2.5%-5.0%、5.0%-6.5% w/w，并且其中剩余重量由所述纤维素基纤维贡献至100% w/w的总重量。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中由粉末组合物在与血液接触时形成的凝胶所具有的阻力等于或高于由氧化再生纤维素(ORC)组成的比较粉末组合物在与血液接触时形成的凝胶的阻力的10倍；并且/或者其中由所述聚集体组合物形成的凝胶所具有的止血能力等于或高于由ORC组成的比较聚集体组合物在与血液接触时形成的凝胶的止血能力的1.5倍。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述组合物呈聚集体形式，所述聚集体所具有的尺寸在75µm-420µm范围内。

10. 一种用于制备止血组合物的方法，包括以下步骤：将具有D90小于350µm且D50小于167µm的尺寸分布的纤维素基纤维与以下粉末化合物混合，所述纤维的浓度范围为整个组合物的83.5%-90% w/w：

i-ω氨基羧酸，其浓度范围为整个组合物的2.5%-5.0% w/w；

ii-鱼精蛋白盐，其浓度范围为整个组合物的2.5%-5.0% w/w；以及

iii-二价阳离子，所述阳离子浓度为整个组合物的1.3%-1.8% w/w。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述纤维具有D90小于177µm且D50小于95µm的尺寸分布。

12.一种能够根据权利要求10或11所述的方法获得的止血组合物。

13.根据权利要求10或11所述的方法，还包括以下步骤：压实所述止血组合物，任选地使所述经压实的组合物经受干燥和尺寸减小，从而获得止血聚集体。

14.一种能够根据权利要求13所述的方法获得的止血聚集体组合物。

15.一种用于形成凝胶的方法，包括以下步骤：

使根据权利要求1至9、12和14中任一项所述的止血粉末和/或聚集体组合物与血液接触，从而形成凝胶。

16.根据权利要求15所述的方法，其中当与所述粉末组合物进行接触时，所形成的凝胶所具有的阻力等于或高于由氧化再生纤维素(ORC)组成的比较粉末组合物在与血液接触时形成的凝胶的阻力的10倍；

并且/或者其中当与所述聚集体组合物进行接触时，所形成的凝胶所具有的止血能力等于或高于由ORC组成的比较聚集体组合物在与血液接触时形成的凝胶的止血能力的1.5倍。

17.一种能够通过根据权利要求15或16所述的方法获得的凝胶。

18.一种试剂盒，包括容器和任选的涂敷器、载体和/或使用说明，所述容器包括根据权利要求1至9、12和14中任一项所述的止血组合物。

19.一种方法，所述方法在有需要的受试者中处理出血伤口；伤口部位处的细菌感染，最小化或防止吻合部位的渗漏；密封一个部位处的渗漏和/或防止手术部位的粘连，所述方法包括将有效量的根据权利要求1至9、12和14中任一项所述的止血组合物施用到所述受试者的所述伤口和/或部位上和/或中。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述施用在不对所述组合物施加压力的情况下朝向所述伤口和/或部位进行。

21.根据权利要求1至9、12和14中任一项所述的止血组合物的用途：用于处理出血伤口；伤口部位处的细菌感染，最小化或防止吻合部位的渗漏；密封一个部位处的渗漏和/或防止粘连。

22.根据权利要求21所述的用途，用于最小化或防止冠状动脉旁路移植(CABG)手术中的渗漏。