CN108450005A - 一种治疗和预后方法 - Google Patents

Abstract

本公开内容教导了一种确定将胚胎成功植入雌性受试者导致妊娠的可能性的测定，以及促进妊娠的治疗方法。本文提供了一种改善的辅助生殖技术方法，其基于妊娠结果的预后评估，以及治疗靶标的鉴定。本文教导了包括预后评估和治疗所需试剂的组合物。本公开教导了一种确定孕妇可能经受流产的风险的测定。在测定中使用的生物标志物包括CSF3、CSF3R、IL‑17A或者P1GF。

Description

一种治疗和预后方法

提交数据

本申请与2015年9月30日提交的名称为“一种治疗和预后方法”的澳大利亚临时专利申请号2015903979相关，并要求其优先权，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本公开教导了一种确定将胚胎成功植入雌性受试者导致妊娠的可能性的测定，以及促进妊娠的治疗方法。本文提供了一种改善的辅助生殖技术方法和治疗靶标的鉴定。本文教导了包括预后评估和治疗所需试剂的组合物。

背景技术

本说明书中作者提及的出版物的书目细节在说明书的最后按字母顺序收集。

本说明书中对任何现有技术的提及，不是并且不应被视为承认、或者任何形式的暗示在任何国家这种现有技术构成普通常识的一部分。

辅助生殖技术(ART)对人类雌性实现成功结果的妊娠的能力产生了重大影响。

然而，ART过程对于接受者是一种情绪和压力的体验。降低不成功的植入结果的能力将有助于降低这种压力并降低手术的总体成本。

作为在人临床应用中ART的普遍的指标，如Macaldowie等人(2013)的报告Assisted reproductive technology in Australia and New Zealand 2011(澳大利亚，新南威尔士大学，悉尼：国家产期流行病学和统计小组)指出，在2011年进行这一手术的澳大利亚女性增加8.3％。95.1％的案例中的，女性使用她们自己的(自体)卵母细胞或胚胎。大约三分之一的女性使用冷冻/解冻的胚胎。尽管辅助生殖技术的使用有所增加，但成功临床妊娠的比率不高。事实上，在2011年，只有23.1％导致临床妊娠以及17.5％的活产(Macaldowie等人(2013)，上文)。

已经研究了一系列参数对于ART的成功与否的影响，如接受者的年龄、自体和卵母细胞/胚胎接受者周期以及新鲜的胚胎的使用与冷冻/解冻的胚胎的比较。然而，仍然需要基于知识的评估方法来辅助临床医生确定雌性接受者的子宫是否是对胚胎接受做好最佳准备，以及鉴定促进成功ART的治疗靶标。

发明内容

本说明书教导了一种用于辅助生殖技术的改善的方法。在一个实施方案中，在排卵诱导触发后2天(OI+2天)，如人绒毛膜促性腺激素触发(hCG+2天)、促性腺激素释放激素类似物触发(GnRHa+2天)或其它药物触发加上2天或早期分泌期等价期，采集生物液体样本评估子宫内膜的接受性。同时，“+2天”提供有用的时间段，本发明涵盖至少1天至5天的时间段。早期等价期包括一个自然的或刺激的周期。例如，一个自然周期是黄体化激素(LH)+2天(LH+2天)。同样，时间段可以从1天到5天。本发明涵盖在植入方法中使用冷冻胚胎。生物样本包括子宫样本或血液、血浆、血清、腹水、淋巴液、组织渗出物或尿样本。CSF3或其受体的水平或糖基化形式确定了在该周期中成功植入受精胚胎的可能性程度，以及进一步的，妊娠是否可能是临床或临床前妊娠。此外，提出拮抗CSF3活性包括CSF3介导的信号传导和/或激动CSF3受体以改善成功妊娠的可能性。改善的方案使临床医生能够决定是否继续进行胚胎移植，或是冷冻并存储胚胎用于随后使用或治疗雌性患者以提高妊娠成功。尽管如此，该方法也可用于在辅助生殖技术方法中测试子宫内膜接受性。本文涵盖一种组合物，其包括进行方法和促进治疗所需的试剂。

因此，本说明书教导了在植入时间窗口之前(即在OI+5天，例如hCG+5天或GnRHa+5天或中期分泌期等价期)进行的子宫内膜接受性测试。能够完成根据本发明开发的测定并且以及时的方式解释结果，以最小化在胚胎移植/植入时子宫腔中的干扰。这降低了对潜在接受者的压力，是有效的并具有高水平的预测结果。尽管如此，本测定也适用于筛选植入冷冻胚胎的接受者。该测定是基于知识的，将生物标志物的水平或2种或多种生物标志物的水平比率相对于对照水平或比率进行比较。因此，本文提供了一种基于知识的评估方法，其使临床医生能够确定胚胎移植将导致成功的临床妊娠的相对可能性。本文进一步提供了一种治疗雌性患者以改善成功妊娠的可能性的方法。

本文的测定能够确定在经刺激的或自然周期期间雌性受试者中预测的接受性，以确定在胚胎移植时是否存在可行的接受性子宫内膜。这有助于临床医生确定是进行胚胎移植或冷冻胚胎，并且等待自然周期或者可选地其它治疗周期，其中子宫状态更有利于成功的胚胎移植和植入。该方法也可用于评估激素刺激之前的子宫内膜接受性。

在一个实施方案中，样本是在卵子收集时(在激素刺激周期，通过hCG(hCG+2天)、GnRHa(GnRHa+2天)或其它药物(OI+2天)排卵诱导后两天(或早期分泌期等价期))获得的子宫灌洗样本形式的子宫样本。可选地，样本是血液、血浆或血清、腹水、淋巴液、组织渗出物或尿。检测的生物标志物是CSF3。当CSF3低时，该测定确定有利的子宫内膜接受性。可以对妊娠者和未妊娠者的水平进行比较。因此，CSF3是雌性应用的生物标志物。在不将本发明限制于任何一种理论或作用模式的情况下，提出了CSF3及其受体影响胚胎在子宫环境内的附着，并影响子宫内膜发育。

重要的是，以前临床使用CSF3作为佐剂提高植入率的实践似乎是误导和禁忌。本文提出中和过量的CSF3以改善妊娠成功。

因此，本文提供了一种用于针对胚胎植入的可能结果区分雌性受试者的测定，所述结果选自妊娠和未妊娠，所述测定包括从来自受试者的液体样本确定CSF3或CSF3受体的浓度，其中，相对于对照，CSF3的水平升高或CSF3受体的水平降低，提供了成功妊娠的差的可能性的指示。正常的CSF3和CSF3受体水平指示成功妊娠的可能性。

本文进一步提供了一种区分经受辅助生殖技术方法的雌性受试者的测定，其针对妊娠或未妊娠的可能性进行区分，并且如果妊娠，妊娠是临床妊娠或临床前妊娠进行区分，该测定包括确定来自受试者的液体样本中的CSF3和/或CSF3受体的水平，其中当相对于对照，CSF3的水平是正常的，或者CSF3受体是高的，成功的妊娠被认为是可能的；当相对于对照，CSF3的水平是高的或CSF受体是低的时，成功妊娠被认为是较低可能的。多变量分析可以包括来自多于一种来源(例如子宫灌洗和血清)的其它生物标志物(例如VEGF、IL-6、IL-8、IL-17A、CRP、PIGF、sFlt-1和/或sGP130)，或者体重指数(BMI)和年龄的生物标志物。如本文所教导的，相对于对照，VEGF、IL-6、IL-8、IL-17A、CRP、PIGF、sFlt-1和/或sGP130中的任何一种或多种的升高支持不可能成功的妊娠结果。提出这些标志物中的任何一种或多种与CSF3或CSF3受体一起进行测定。此外，或可选的，可以使用CSF3、IL-17A和/或PIGF进行单独的独立测定。其它标志物如黄体酮也可与BMI和年龄一起测量。此外，低于正常水平的CSF3与流产的较高发生率相关。

本文教导的是一种进行测定以确定CSF3或其受体水平的试剂盒。本文还涉及一种计算机程序以帮助数据的分析。在一个实施方案中，本文提供的测定可以用于与病理学服务相关的现有的基于知识的架构或平台中。例如，测定的结果通过通信网络(例如因特网)被传输到处理系统，在处理系统中存储算法并且用于产生预测的后验概率值，该预测的后验概率值转化为子宫内膜导致成功妊娠的接受性或非接受性的可能性的指数，然后以预后或预测报告的形式转发给临床医生。

因此，本文教导的是一种组合物或试剂盒或基于计算机的系统，其包括检测CSF3或其受体的浓度所必需的试剂以及促进确定和向临床医生传输报告的计算机硬件和/或软件。提及生物标志物的“水平”还涵盖确定CSF3与其受体的比率。该试剂盒还可以包括检测VEGF、IL-6、IL-8、IL-17A、CRP、PIGF、sFlt-1和/或sGP130中的一种或多种的水平的试剂。在一个实施方案中，试剂盒能够检测CSF3、IL-17A和/或PIGF中的至少一种。

本发明进一步提供促进子宫内膜接受性和辅助临床妊娠更有利的结果的药物的开发。此类药物包括CSF3拮抗剂和CSF3受体激动剂，可用作治疗剂或佐剂以改善妊娠成功。

表1提供了缩写词列表。

表1

缩写词

附图说明

图1是显示在来自可孕和特发性不孕女性的自然周期的早期分泌期期间收集的子宫灌洗中存在的生物标志物浓度的图示。

图2是显示自然周期可孕和不孕女性在早期分泌期期间、以及在hCG+2时经受IVF刺激的女性子宫内膜中CSF3和CSF3受体的免疫组织化学的图示。显示了可孕(A)和不孕(B)中的CSF3染色和可孕(C)和不孕(D)子宫内膜中CSF3受体染色的代表性图像。还显示了来自不孕女性在成为妊娠(E)或未妊娠(F)的IVF刺激周期中在hCG+2收集的组织的额外图像。显示了阴性对照IgG染色。

图3是显示从可孕(F)和原发性特发性不孕(PIF)女性收集的早期分泌期子宫内膜的细胞区室腺上皮(GE)腔管上皮(LE)和基质(S)中IHC评分的图示。

图4是显示从在经受ART的女性收集的子宫内膜的腺上皮(GE)中IHC评分的图示，所述女性分类为具有妊娠结果或未妊娠结果，受精卵供体在旁边。

图5是显示通过用高浓度和低浓度的糖基化和非糖基化CSF3处理对ECC1细胞附着的作用的图示。急性暴露和慢性暴露(暴露前24小时)的作用。

图6是显示在高(a)和低(b)浓度下用非糖基化(A)和糖基化CSF3(B)处理对ECC1细胞增殖的作用的图示。急性暴露和慢性暴露(暴露前24小时)的作用。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001。

图7是显示非糖基化(a)和糖基化(b)CSF3对滋养层细胞迁移的作用的图示。

图8是显示非糖基化(a)和糖基化(b)CSF3对滋养层细胞侵袭的作用的图示。

图9是实施例7中区分的血清队列的示意图。针对活产而确定最终患者结果。

图10是从经受历相同周期胚胎移植的106名女性收集的血清测定的预测指数的图示。在收集卵母细胞时，在hCG+2收集血清。结果归于妊娠(胎儿心跳)或未妊娠(包括生物化学/临床前妊娠)。

图11是从经受相同周期胚胎移植的106名女性收集的血清测定的预测指数的图示。在收集卵母细胞时，在hCG+2收集血清。结果归于妊娠(胎儿心跳)或未妊娠(包括生物化学/临床前妊娠)。进行采用Tukey事件后统计分析的ANOVA以比较组间的PI值，****p<0.0001。

图12是从经受相同周期胚胎移植的106名女性中收集的血清测定的预测指数，以及4因素建模结果模型的图示。在收集卵母细胞时，在hCG+_2收集血清。以4因素逻辑回归模型，将结果归于活产、流产、未妊娠和临床前/生物化学妊娠。进行采用Tukey事件后统计分析的ANOVA以比较组间的PI值，****p<000.1、***p<0.001、*p<0.01。

图13是从经受相同周期胚胎移植的174名女性收集的血清测定的预测指数的图示。在收集卵母细胞时，在4hCG+2时收集血清。结果归于妊娠(胎儿心跳)或未妊娠(包括生物化学/临床前妊娠)，并产生2因素模型。T检验****p<0.0001。

图14是从经受相同周期胚胎移植的173名女性收集的血清测定的预测指数的图示。在收集卵母细胞时，在hCG+2收集血清。结果被归于活产、未妊娠、流产或生物化学/临床前妊娠)，并且比较产生自2因素模型的P1值。进行采用Tukey事件后统计分析的ANOVA以比较组间的PI值，****p<0.0001。

图15是从经受相同周期胚胎移植的173名女性中收集的血清测定的预测指数，以及4因素结果模型建模的图示。在收集卵母细胞时，在hCG+2收集血清。结果被归于活产、未妊娠、流产或生物化学/临床前妊娠)，以及产生自4因素logitboost模型的Pl值。进行采用Tukey事件后统计分析的ANOVA以比较组间的PI值，****p<0.0001、***p<0.001、*p<0.01。

图16I至图16III是表示IL-17A水平和妊娠结果的图示。

图17是显示低于CSF3的正常水平指示较高流产发生率的图示。

具体实施方式

贯穿本说明书，除非上下文另有要求，词语“包括”或者如“包括”或“含有”之类的变化，将被理解为暗示包括所述元素或整数或方法步骤、或者元素或整数或方法步骤的组，但不排除任何元素或整数或方法步骤、或者元素或整数或方法步骤的组。

如本说明书使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数的方面，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“生物标志物”包括单一的生物标志物，以及两个或多个的生物标志物；提及“胚胎”包括单一的胚胎，以及两个或多个胚胎；提及“本公开”包括本公开教导的单一的和多个的方面；等。术语“发明”涵盖本文教导和提供的方面。在本发明的范围内提供所有这些方面。提及“样本”包括子宫样本、或血液、血浆或血清、腹水、淋巴液、组织渗出物或尿液样本。

除非上下文另有明确规定，本说明书中指定的各种范围内的数值的使用被表述为近似值，因为表述范围内的最小值和最大值的前面均带有词语“约”。此外，收集的方式、液体的体积和浓度的水平(例如在灌洗液体对比吸出物(aspirate)中)将导致不同的范围。尽管如此，本领域技术人员将补偿这里给出的特定范围的“低”和“高”值，而不偏离本发明的范围。而且，这些范围的公开意图作为包括最小值和最大值之间的每个值的连续范围。此外，本方法延伸至两种或多种标志物的比率，其提供与导致临床妊娠的成功胚胎移植的可能性水平相关的数值。使用估计：稀释因子＝血清浓度除以灌洗尿素浓度确定灌洗的稀释因子。提及“OI+2”是指通过人绒毛膜促性腺激素(hCG)或其它药物或激素，比如但不限于促性腺激素释放激素类似物(GnRHa)，排卵诱导后两天。“对照”通常指在健康个体中妊娠之前或之后生物标志物的水平。方便地，对照是一种统计验证的水平。

提及关于妊娠的“成功”不必需意味着妊娠将足月(go to term)。无论妊娠最终结果，提及成功的妊娠意思是进展至临床妊娠。目的是区分妊娠、临床前妊娠和未妊娠。所述方法还可以基于低于CSF3正常水平的水平来区分活产与流产的可能性。

提供了一种快速、有效和敏感的子宫内膜接受性的测定，用于鉴定在进行辅助生殖技术之后可能具有成功妊娠结果的人类雌性受试者。通过过量的CSF3的正常化或拮抗作用和/或增强CSF3受体(CSFR)水平，这提供了改善的辅助生殖技术方法的开发。

本公开教导了这样一种测定，其基于CSF3或CSF3介导的信号传导和/或CSF3R的水平，区分潜在人类雌性接受者对于自体、冷冻/解冻或异种胚胎植入成功妊娠的可能与否。如上所述，成功的妊娠意思是进展至临床妊娠。实质上，CSF3和/或CSF3R水平是从液体样本中确定的，在取样和植入的周期中区分患者妊娠或未妊娠以及临床前妊娠或临床妊娠的可能性。这些生物标志物也可用于确定接受者使用捐献的卵子或捐献的受精胚胎实现妊娠的成功与否。生物标志物可以被单独考虑或与患者身体特征如BMI和年龄相组合进行考虑。提及“液体样本”包括子宫灌洗、血液、血浆和血清、腹水、淋巴液、组织渗出物和尿。可以在来自一种来源或来自两种或多种来源(例如子宫灌洗和血清)的液体样本中确定CSF3和CSF3R。

生物标志物包括CSF3和CSF3R以及CSF3介导的信号传导的指标。相对于对照确定CSF3的水平、CSF3R的水平和/或CSF3介导的信号传导的指标的水平，包括这些生物标志物的水平的比率。对照包括研究中的受试者队列中的水平，或者可以是通过大量研究获得的统计确定的知识数据库。提及“第一知识库(base)”，其包括这种形式的数据，即生物标志物的水平或生物标志物的水平的比率与某些妊娠结果之间的相关性。第二知识库代表来自经受预后测定的接受者的数据。将第二知识库中的数据与第一知识库进行比较，以确定成功妊娠的可能与否。此外，生物标志物可能需要进行多变量分析，包括身体参数如BMI和年龄，以及来自两种不同的来源。

实质上，在自然周期之后或在激素刺激治疗之后存在人类雌性受试者进行卵子收集。可选地，该方法不依赖于卵子收集。此时测量的CSF和/或CSF3R的水平或比率对于确定是否进行后续胚胎受精或是等待另一个周期是有用的。在一个实施方案中，在该周期时期期间CSF或IL-8的水平升高或CSF3R的低水平是成功妊娠可能性差的指标。可选地，相对于对照，CSF3的正常(低)水平或CSF3R的正常(高)水平各自是成功妊娠可能性更高的的指标。在辅助生殖技术方法中，测定结果也适用于激素刺激之前的子宫内膜接受性，并且本文涉及这样的测定。

在一个实施方案中，在卵子收集时，雌性受试者通常是被镇静的，并且这是获得子宫样本以测试生物标志物的水平的方便时间。如果意图使用冷冻胚胎，在任何事件中，雌性受试者可以被镇静。在一个实施方案中，使用软导管灌注1-10ml盐水，然后将其作为子宫灌洗回收。尽管吸出样本也是适合的，但用于本方法的目的，子宫灌洗被认为是最佳的。提及“1-10ml”的盐水包括1、2、3、4、5、6、7、8、9和10ml。1-3ml范围的盐水被认为是最佳的。可以测试样本的蛋白水平或编码CSF3或CSF3R的相应mRNA的水平。吸出物可以在5-1000μl范围内。在另一个实施方案中，由血液、血浆或血清、腹水、淋巴液、组织渗出物或尿确定CSF3或CSF3R的水平。在另一个实施方案中，CSF3和/或CSF3R单独确定或与BMI和年龄组合确定。

方便地，在雌性受试者镇静和收集子宫样本时，确定CSF3和/或CSF3R的水平和/或比率，以根据胚胎植入的预期结果区分受试者。结果包括妊娠或未妊娠。对于实现妊娠的那些受试者，生物标志物还可以预测临床或临床前妊娠。在一个实施方案中，相对于对照，CSF3的正常水平指示妊娠的可能结果。CSF3水平升高指示降低的妊娠可能性。另一方面，CSF3R水平降低更可能与差的妊娠结果相关。如上所述，该测定可用于在辅助生殖技术方法中刺激之前测定子宫内膜接受性。

对于实现妊娠的那些受试者，相对于对照，CSF3R的正常水平升高指示相较于临床前妊娠而言临床妊娠的可能性，临床前妊娠与CSF3R的水平降低相关。

因此，本公开教导了一种用于在辅助生殖技术方法中针对胚胎植入的预期结果来区分人类雌性受试者的方法，所述方法包括确定液体样本中CSF3和/或CSF3R的水平，其中，相对于对照，CSF3的水平升高指示成功妊娠的可能性低，以及相对于对照，CSF3R的水平降低指示成功妊娠的可能性低，以及相对于对照，CSF3水平正常指示高的成功妊娠结果，和相对于对照，CSF3R的水平正常指示高的成功妊娠结果。

因此，升高的CSF3水平提示成功妊娠的可能性低。还可以确定额外的标志物或因子，包括VEGF、IL-6、IL-8、IL-17A、CRP、PIGF、sFlt-1和/或sGP130的水平。黄体酮、BMI的水平和患者年龄也是有用的测量参数。这些生物标志物的水平升高是成功妊娠可能性差的指标。

本公开教导了一种用于在辅助生殖技术方法中针对胚胎植入的预期结果区分人类雌性受试者的方法，所述方法包括确定液体样本中IL-17A的水平，其中，相对于对照，IL-17A的水平升高指示成功妊娠的低的可能性，以及正常的IL-17A水平指示成功妊娠结果的高的可能性。

本文还教导了一种用于在辅助生殖技术方法中针对胚胎植入的预期结果区分人类雌性受试者的方法，所述方法包括确定液体样本中PIGF的水平，其中，相对于对照，PIGF的水平升高指示成功妊娠的低的可能性，以及正常的PIGF水平指示成功妊娠结果的高的可能性。

本文进一步教导了一种用于在辅助生殖技术方法中针对胚胎植入的预期结果区分人类雌性受试者的方法，所述方法包括确定液体样本中CSF3和/或CSF3R与IL-17A和/或PIGF的水平，其中，相对于对照，CSF3的水平升高，指示成功妊娠的低的可能性，和相对于对照，CSF3R的水平降低指示成功妊娠的低的可能性，和相对于对照，IL-17A和/或PIGF的水平升高指示成功妊娠的低的可能性，以及全部与对照相比，正常的CSF3水平指示成功妊娠结果的高的可能性，和CSF3R的正常水平指示成功妊娠结果的高的可能性，和IL-17A和/或PIGF的正常水平指示成功妊娠的高的可能性。

本文涉及一种用于针对胚胎植入的可能结果区分雌性受试者的测定，所述结果选自妊娠和未妊娠，所述测定包括确定来自受试者的子宫样本的CSF3和/或CSF3R的浓度，其中CSF3或CSF3R的水平或CSF3和CSF3R的水平的比率提供了成功妊娠可能性的指示。

本文提供了一种针对妊娠或未妊娠的可能性对经受辅助生殖技术方法的雌性受试者进行区分的多重测定，所述测定包括确定来自受试者的液体中的CSF3和/或CSF3R的水平，其中，当CSF3的水平是正常的，则成功妊娠被认为是可能的；当CSF3的水平是高的，则成功妊娠被认为是较低可能；如果CSF3R的水平是正常的，则成功妊娠被认为是更为可能的；如果CSF3R的水平是低的，则成功妊娠被认为是较低可能的。这些水平是相对于对照。

在一个实施方案中，液体样本是子宫灌洗样本。在另一个实施方案中，液体样本是血液、血浆、血清、腹水、淋巴液、组织渗出物或尿。

在一个实施方案中，雌性接受者进行激素辅助周期或自然周期(例如采用黄体化激素)。在一个实施方案中，在启动任何激素辅助周期之前评估子宫内膜接受性。

尽管在卵子收集时采集子宫样本最方便，但本方法并不排除获得多种样本。然而，优选地，在卵子收集时对雌性受试者进行一次采样，或者对于具有冷冻/解冻胚胎的雌性受试者，在激素辅助周期的OI+2天(例如hCG+2或GnRH+2或其它药物的OI触发)或者早期分泌期等价期进行采样。排卵可以通过hCG或其它药物比如但不限于GnRHa进行诱导。血液或其它液体样本可以在任何时间采集，并且侵入性小得多。方便地，在对患者卵子收集的同时采集非灌洗样本。

可以与相同受试者经受周期或非周期时期的CSF3和/或CSF3R的水平或水平的比率进行比较，或者与经受类似手术的雌性队列进行比较，或者与一定统计数目的试验中所收集的第一知识库进行比较。如上所述，测试对象中确定的生物标志物的水平代表未知预测结果的第二知识库。第二知识库与第一知识库相比较。

尽管不旨在将本方法的解释限制为生物标志物“升高”或“降低”(或正常)水平的特定值，降低的CSF对比升高的CSF的示例是：对于降低而言，为0-2000皮克/ml的样本，以及对于升高而言，为3000至10000皮克/ml的样本。这些数字代表来自3ml的子宫灌洗，并且将依据样本收集的精确方法而改变。

这些基于Bioplex 200仪器(Biorad Laboratories，伯克利，CA，USA)平台。基于使用的病理学平台，范围可能有所不同。

本发明不限于将这些范围贯穿所有雌性受试者，但是这里给出的范围仅针对将由临床医生所监测的可能水平提供一种指导。此外，可以考虑患者的身体特征，如BMI和年龄。

特别地，本文提供的区分测定可以用于与病理学/临床服务相关的现有的基于知识的架构或平台。在一个实施方案中，测定结果通过通信网络(例如因特网)被传输到存储有算法的处理系统，并用于产生预测的后验概率值，该值转化为特定结果的概率，然后以预后或预测报告的形式转发给最终用户(例如临床医生)。

因此，该测定可以是试剂盒或基于计算机的系统的形式，其包括检测生物标志物浓度所必需的试剂，以及促进确定和向临床医生传输报告的计算机硬件和/或软件。

本文提供了一种用于针对胚胎植入的可能结果区分雌性受试者的预后测定，所述结果选自妊娠和未妊娠，所述测定包括确定来自受试者的液体样本中CSF3和/或CSF3R的浓度；其中CSF3或CSF3R的水平或CSF3和CSF3R的水平的比率提供了成功妊娠可能性的指示。测量CSF3和CSF3R可能会提高预后测定结果的灵敏度和特异性的水平。在不脱离本发明的范围的情况下，还可以包括额外的生物标志物。

本文进一步提供一种用于针对胚胎植入的可能结果区分雌性受试者的预后测定，所述结果选自妊娠和未妊娠，所述测定包括确定来自受试者的液体样本中CSF3和/或CSF3R的浓度。此外，“结果”包括流产或妊娠未足月的可能性。

在一个实施方案中，液体样本是子宫灌洗。在一个实施方案中，液体样本是血液、血浆、血清、腹水、淋巴液、组织渗出物或尿。在一个实施方案中，在两种或多种不同的液体样本中确定生物标志物。

在一个实施方案中，本文教导了一种用于针对胚胎植入的可能结果区分雌性受试者的测定，所述测定包括确定来自受试者的液体样本中CSF3和/或CSF3R的浓度；使水平进行第一知识库数据所产生的算法，所述数据包括来自针对结果已知状态的受试者中相同生物标志物的水平，其中所述算法提供受试者进行或不进行妊娠的概率指数。提及“算法”是指进行多变量分析功能的算法。后者可能包括如BMI和年龄的因素。该算法可以进一步区分临床和临床前妊娠。

在一个实施方案中，雌性受试者经受激素刺激。在一个可选的实施方案中，雌性受试者经历自然排卵周期。

第一知识库的数据也可来自具有已知妊娠结果的多个受试者或受试者的队列。

CSF3和/或CSF3R的浓度或水平的确定能够建立基于相对于对照的生物标志物浓度的诊断规则。可选地，诊断规则基于统计和机器学习算法的应用。这种算法使用生物标志物与训练数据(具有已知结果状态)中观察到的植入结果之间的关系来推断关系，然后使用该关系来预测甚至是状态未知的植入状态。采用一种算法，该算法提供了受试者将妊娠的概率指数，以及一旦妊娠，是临床妊娠或临床前妊娠的妊娠可能状态。该算法进行多变量分析功能。

因此，在一个实施例中，本发明提供一种基于统计和机器学习算法的应用的诊断规则。这种算法使用CSF3和/或CSF3R与训练数据(具有已知植入状态)中观察到的植入结果状态之间的关系来推断关系，然后用该关系来预测具有未知状态的受试者的状态。数据分析领域的技术人员认识到，可以使用训练数据中推断关系的许多不同形式，而不实质改变本发明。

本发明涉及训练数据的知识库用于产生算法的用途，其中所述训练数据包括来自具有已知植入结果的受试者的CSF3和/或CSF3R水平，在输入第二知识库的数据时，该算法提供了预测可能结果的概率指数，所述第二知识库的数据包括来自具有未知植入结果可能性的受试者的相同生物标志物水平。

“受试者”通常是人类雌性。在一个实施方案中，人类雌性在育龄期范围内选择。然而，本发明延伸至兽医应用。因此，受试者可以是非人类的雌性哺乳动物，例如牛、马、绵羊动物或非人灵长动物。尽管如此，本发明特别适用于检测人类雌性中的胚胎植入事件的结果。

术语“训练数据”包括相对于对照的生物标志物的水平的知识。这是第一知识库。“对照”包括已知植入成功或失败状态的受试者或受试者队列中的生物标志物水平，或者可以是基于试验的统计学确定的水平。术语“水平”还包括生物标志物的水平的比率。

“训练数据”还包括CSF3的浓度或CSF3R的水平。数据可以包括关于这些生物标志物增加或降低的信息。还可以使用额外的生物标志物，比如但不限于VEGF、IL-6、IL-8、IL-17A、CRP、PIGF、sFlt-1和sGP130。也可以测定黄体酮。类似于关于CSF3和CSF3R的前述实施方案，CSF3的升高(或CSF3R的降低)连同VEGF、IL-6、IL-8、IL-17A、CRP、PIGF、sFlt-1和/或sGP130中一种或多种的升高指示成功妊娠的差的可能性。在一个实施方案中，可以在独立测定中测定CSF3、CSF3R、IL-17A和/或PIGF中的任何一种。

本发明进一步涉及用于区分经受辅助生殖的雌性受试者的试剂组，所述组包括特异性结合CSF3和/或CSF3R的试剂，其用于确定CSF3和/或CSF3R的水平，然后使水平进行第一知识库的数据所产生的算法，所述数据包括来自针对胚胎植入已知状态的受试者的相同生物标志物的水平，其中所述算法提供受试者具有或不具有成功妊娠的概率指数。“成功”妊娠是导致临床妊娠的一种妊娠。在“成功”妊娠的定义中不涉及导致流产的随后事件。

测定的雌性受试者中CSF3和/或CSF3R的水平或浓度提供了本文称为“第二知识库的数据”的输入测试数据。第二知识库的数据或者相对于对照进行考虑，或者被输入由“第一知识库的数据”产生的算法，该算法包括具有已知植入结果的受试者中生物标志物水平的信息。第二知识库的数据来自于针对胚胎植入事件状态未知的受试者或受试者的队列。算法的输出是概率或可能性因子，本文称为受试者最终实现临床妊娠的成功妊娠的概率指数。水平可以在一种类型的液体样本(例如子宫灌洗或血清)或来自两种或多种来源(例如子宫灌洗和血清)中确定。

与CSF3或CSF3R“特异性结合”的试剂通常包括免疫相互作用分子，如抗体或杂交物、衍生物，包括其重组或修饰形式或其抗原结合片段。试剂也可以是受体或其它配体。这些试剂有助于确定生物标志物的水平。

因此，本发明进一步提供了一组针对CSF3和/或CSF3R的固定化配体。该组可以包括一种生物标志物的配体或两种生物标志物的配体。这样的配体包括针对CSF3和/或CSF3R的抗体。

本发明的另一个方面涉及一种组合物或试剂盒，其用于针对辅助生殖的结果区分雌性受试者，该试剂盒包括含有一种或多种针对CSF3和/或CSF3R的配体的物质组合物；该试剂盒还包括促进确定结合配体的CSF3和/或CSF3R浓度的试剂。在使用中，该试剂盒促进确定生物标志物。然后将CSF3或CSF3R的水平或CSF3和CSF3R的水平比率与对照进行比较，或进行第一知识库的数据产生的算法，所述数据包括来自针对植入结果状态已知的受试者或受试者队列的相同生物标志物的水平，其中算法提供受试者具有或不具有特定结果的概率指数。在一个实施方案中，结果是妊娠或未妊娠。在其它实施方案中，结果是临床妊娠或临床前妊娠。

配体如对每种生物标志物特异的抗体，能够定量或定性检测或确定CSF3和/或CSF3R的水平。提及“水平”包括浓度，如单位体积的重量、单位体积的活性或单位体积的单位或其它方便的代表形式，以及水平的比率。“水平”可以是CSF3介导的信号传导的程度，因此可以测量CSF3介导的信号传导或CSF3R活性的下游指标。

“样本”包括子宫样本，如子宫灌洗或吸出物。子宫灌洗提供了最为一致的数据。尽管如此，可以修改该测定以使用血液、血浆或血清、腹水、淋巴液，组织渗出物或尿。可选地，样本是生物化学检测的组织样本。

鉴定经受辅助生殖技术方法的受试者中CSF3和/或CSF3R的水平，在区分植入的结果中是有用的。基于本文的公开，本领域普通技术人员还可以鉴定额外的生物标志物，其可以提供改善的选择性和灵敏度。这样的鉴定仍被认为在本发明的范围内。

如上所述，“配体”或“结合试剂”等术语是指能够特异性地或实质上特异性地(即具有有限的交叉反应性)结合生物标志物上表位的任何化合物、组合物或分子。“结合试剂”通常具有单一的特异性。尽管如此，本文还涉及针对两种或多种生物标志物具有多种特异性的结合试剂。结合试剂(或配体)典型地是抗体，如单克隆抗体或其衍生物或类似物，但也包括但不限于：Fv片段；单链Fv(scFv)片段；Fab'片段；F(ab')2片段；人源化抗体和抗体片段；骆驼化抗体和抗体片段；和上述的多价形式。视情况而定，还可以使用多价结合试剂，包括但不限于：单特异性或双特异性抗体；如二硫键稳定的Fv片段、scFv串联体(tandems)((scFv)₂片段)、双抗体、三抗体或四抗体，其典型地是共价连接的或以其它方式稳定(即亮氨酸拉链或螺旋稳定的)的scFv片段。如本领域所述，“结合试剂”还包括适配体(aptamer)。

制备抗原特异性结合试剂的方法在本领域中是公知的，包括抗体及其衍生物和类似物以及适配体。多克隆抗体可以通过免疫动物产生。单克隆抗体可根据标准(杂交瘤)方法制备。包括人源化抗体的抗体衍生物和类似物可以通过从编码单克隆抗体的DNA中分离DNA片段并根据标准方法将适合的V区亚克隆到适合的表达载体中来重组制备。文献中描述了噬菌体展示和适配体技术，并且允许具有非常低交叉反应性亲和力的抗原特异性结合试剂的体外克隆扩增。噬菌体展示试剂和系统是商业可获得的，并且包括重组噬菌体抗体系统(Recombinant PhageAntibody System，RPAS)，其可从新泽西州皮斯卡塔韦的AmershamPharmaciaBiotech,Inc.商业获得，以及pSKAN噬菌粒展示系统可从佛罗里达马可岛的MoBiTec，LLC商业获得。适配体技术在例如但不限于美国专利号5,270,163；5,475,096；5,840,867和6,544,776中描述。

ECLIA、ELISA、Luminex LabMAP和Bioplex免疫测定是检测生物标志物水平的适合的测定的示例。在一个示例中，第一结合试剂/抗体附着于表面，以及包括可检测基团的第二结合试剂/抗体结合第一抗体。可检测基团的示例包括，例如但不限于：荧光染料、酶，用于结合第二结合试剂的表位(例如，当第二结合试剂/抗体是小鼠抗体时，其通过荧光标记的抗小鼠抗体检测)，例如抗原或结合对的成员，如生物素。该表面可以是平面表面，如在典型的网格型阵列的情况中(例如但不限于96孔板和平面微阵列)，或者是非平面表面，如包被的珠阵列技术，其中珠的每种“种类”采用例如荧光染料(如在美国专利号6,599,331、6,592,822和6,268,222中描述的Luminex技术)或量子点技术(例如，在美国专利号6,306,610中描述的)标记。这样的测定也可以被认为是实验室信息管理系统(LIMS)。

在珠型免疫测定中，可以使用Luminex LabMAP系统。LabMAP系统结合了内部染有两种光谱不同的荧光染料的聚苯乙烯微球。使用这些荧光染料的精确比率，创建了一种由具有具体光谱地址的100种不同微球组(set)所组成的阵列。每种微球组可以在其表面上具有不同的反应物。由于微球组可以通过其光谱地址加以区分，因此它们可以组合，从而可以在单个反应容器中同时测量多达100种不同的分析物。与报告分子偶联的第三荧光染料定量在微球表面发生的生物分子相互作用。在Luminex分析仪中，当微球通过两个单独的激光器时，它们在快速流动的流体流中被单独地询问(interrogate)。高速数字信号处理基于光谱地址对微球进行分类，并对每个样本在几秒钟内定量表面的反应。

如本文所用，“免疫测定”是指能够检测和定量期望的生物标志物即CSF3和/或CSF3R的免疫测定，典型地但不是只有夹心测定(sandwich assays)。

从用于确定子宫(或其它样本)CSF3和/或CSF3R水平的测定产生的数据，可用于确定雌性受试者中胚胎植入事件进展至临床妊娠的可能性。将包括CSF3和/或CSF3R水平的数据输入，与对照进行比较，或将其输入提供成功妊娠可能性值的算法中。如上所述，“成功妊娠”是指妊娠。也可以区分进一步的结果，如临床或临床前妊娠。也可以通过受试者的预后测定进行辅助生殖治疗方案的监测。

如上所述，本文教导了用于针对胚胎植入的预期结果区分雌性受试者的方法，其通过确定CSF3和/或CSF3R的水平，以及将这些水平作为第二知识库数据用于第一知识库数据或具有已知植入结果的患者中相同生物标志物的水平产生的算法中。“速度”是指患者样本中生物标志物浓度随时间的变化。

术语“对照样本”包括可用于建立来自具有已知胚胎植入结果的受试者数据的第一知识库的任何样本。

本发明的方法可用于确定辅助生殖技术周期的可能结果(即妊娠或未妊娠)。本发明还可用于监测妊娠的进展并监测特定治疗是否是有效的或不是预植入的。特别地，该方法可用于确认子宫内膜中存在或不存在对植入最为接受的环境以发生和进展至临床妊娠。

如上所述，抗体可以用于依赖于生物标志物的抗原决定簇和抗体之间的结合相互作用的多种免疫测定中的任何一种。这种测定的示例是放射免疫测定、酶免疫测定(例如ECLIA、ELISA)、免疫荧光、免疫沉淀、乳胶凝集、血细胞凝集和组织化学测试。抗体可用于检测和定量样本中生物标志物的水平，以确定导致成功妊娠可能性水平的子宫内膜接受性。

特别地，本发明的抗体还可用于免疫组织化学分析，例如在细胞和亚细胞水平，检测生物标志物，将其定位于特定的细胞和组织以及具体的亚细胞位置，并定量表达水平。

本领域已知的使用光和电子显微镜定位抗原的细胞化学技术可用于检测生物标志物。通常地，本发明的抗体可以采用可检测物质进行标记，并且基于可检测物质的存在，在组织和细胞中对生物标志物蛋白定位。可检测物质的示例包括但不限于以下：放射性同位素(例如³H、¹⁴C、³⁵S、¹²⁵I、¹³¹I)、荧光标记(例如FITC、罗丹明、镧系元素荧光)、发光标记如鲁米诺；酶标记(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶)、生物素基团(其可以通过标记的亲和素检测，例如含有可通过光学或量热法检测的荧光标志物或酶活性的链霉亲和素)、由第二报告子识别的预定的多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域；表位标签)。在一些实施方案中，标记通过各种长度的间隔臂连接以降低潜在的空间位阻。抗体也可以与电子致密物质偶联，如铁蛋白或胶体金，电子显微镜可以很容易地观察到这些电子致密物质。

可以将抗体或样本固定在能够固定细胞、抗体等的载体或固体支持物上。例如，载体或支持物可以是硝化纤维素或玻璃、聚丙烯酰胺、辉长岩(gabbros)和磁铁矿。支持物材料可以具有任何可能的构造，包括球形(例如珠)、圆柱形(例如试管或孔的内表面，或者杆的外表面)或平面的(例如片、测试条)。也可以采用间接方法，在其中通过引入第二抗体放大初级抗原-抗体反应，第二抗体针对与生物标志物蛋白反应的抗体具有特异性。例如，如果针对CSF3或CSF3R具有特异性的抗体是兔IgG抗体，则第二抗体可以是如本文所述采用可检测物质标记的山羊抗兔γ-球蛋白。

在使用放射性标志物作为可检测物质的情况下，生物标志物可以通过放射自显影进行定位。放射自显影的结果可以通过用各种光学方法确定放射自显影中的颗粒密度来定量。

本文所述的本发明的方法也可以使用微阵列进行，如寡核苷酸阵列、cDNA阵列、基因组DNA阵列或抗体阵列。

在一个实施方案中，本发明的方法涉及检测编码CSF3或CSF3R的mRNA，以及基于表达水平确定生物标志物的水平。本领域技术人员可构建用于检测编码样本中生物标志物的mRNA序列的核苷酸探针。适合的探针包括基于编码来自生物标志物区域中至少5个连续氨基酸的核酸序列的核酸分子，特别是它们包括15至30个核苷酸。核苷酸探针可以用可检测物质如放射性标记进行标记，该放射性标记提供适当的信号并具有足够的半衰期，如³²P、³H、⁴⁴C等。可以使用的其它可检测物质包括被特异性标记的抗体识别的抗原、荧光化合物、酶、对标记的抗原特异性的抗体和发光化合物。考虑到探针与待检测的核苷酸的杂交和结合的速率以及可用于杂交的核苷酸的量，可以选择适合的标记。如Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第二版)，1989中通常描述的，标记的探针可以与固体支持物如硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上的核酸杂交。核酸探针可用于检测编码CSF3或CSF3R的基因转录物，其提供等级水平(tier level)的指示。在一个实施方案中，通过特异性确定生物标志物的表达水平，将探针用于雌性受试者的区分。

探针可用于杂交技术以检测编码生物标志物蛋白的基因的表达。该技术通常涉及在有利于探针与核酸中的互补序列特异性退火的条件下，将从雌性受试者或其它细胞来源的子宫样本获得的核酸(例如mRNA)与探针接触并孵育。孵育后，去除未退火的核酸，并且如果存在与探针已杂交的核酸，则可以对其进行检测。

mRNA的检测可涉及将mRNA转化成cDNA和/或使用扩增方法如聚合酶链式反应(PCR)扩增特异性的基因序列，随后使用本领域技术人员已知的技术分析扩增的分子。本领域技术人员可以常规设计适合的引物。

本文描述的杂交和扩增技术可用于测定编码生物标志物的基因表达的定性和定量方面。例如，RNA可以从已知表达编码生物标志物的基因的细胞类型或组织中分离，并且利用本文提及的杂交(例如标准Northern分析)或PCR技术进行测试。

引物和探针可以在上述方法中原位使用，即直接用于从子宫活检获得的患者组织的组织切片(固定的和/或冷冻的)。

本发明提供了一种针对胚胎植入的特定结果的可能性区分雌性受试者的方法，其包括：

(a)提供来自受试者的液体样本；

(b)从编码CSF3和/或CSF3R的样本中提取包括mRNA的核酸；

(c)使用聚合酶链式反应扩增提取的mRNA；

(d)确定编码CSF3或CSF3R的mRNA的水平；和

(e)使转录物的水平进行提供胚胎植入的可能结果的概率指数的算法。在一个实施方案中，“液体样本”包括子宫灌洗。在另一个实施方案中，液体样本是血液、血浆、血清、腹水、淋巴液、组织渗出物或尿。在一个实施方案中，确定生物标志物的水平，并组合患者的BMI和/或年龄进行多变量分析。

本文所述的方法可以通过使用预先包装的诊断试剂盒来进行，所述诊断试剂盒包括进行本发明的任何方法所必需的试剂。例如，试剂盒可以包括至少一种本文所述的特异性的核酸或抗体，其可以方便地使用，例如，在临床应用中，以筛选和诊断患者，以及筛选和鉴定那些具有成功胚胎植入的子宫内膜的个体。试剂盒还可以包括核酸引物，其用于在聚合酶链式反应中用于扩增编码生物标志物的核酸。试剂盒还可以包括可用于本发明方法的核苷酸、酶和缓冲液，以及电泳标志物如200bp梯(ladder)。试剂盒还包括用于实施本发明方法的详细说明。

上述方面进一步适用于测量CSF3或CSF3R与VEGF、IL-6、IL-8、IL-17A、CRP、PIGF、sFlt-1和/或sGP130中的一种或多种的组合。黄体酮也可以被测定。与CSF3或CSF3R组合的VEGF、IL-6、IL-8、IL-17A、CRP、PIGF、sFlt-1和/或sGP130中的任何一种或多种的升高指示成功妊娠结果的差的可能性。就独立测定而言，可以测定CSF3、CSF3R、IL-17A和/或PIGF中的任何一种。CSF3、IL-17A和/或PIGF升高指示差的妊娠可能性。

本文提供一种基于算法的筛选测定，以筛选来自经受辅助生殖技术方案的雌性受试者的样本。通常地，基于CSF3和/或CSF3R的水平(或编码CSF3和/或CSF3R的基因的表达水平)收集输入数据，并进行算法以评估水平的任何升高或降低的统计显著性，随后水平信息为输出数据。用于评估输入数据的计算机软件和硬件涵盖在本发明中。

本发明的另一方面涉及一种治疗经受辅助生殖技术方法的雌性受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用拮抗CSF3活性或使CSF3或CSF3R活性水平正常化的试剂。这种试剂包括CSF3R的激动剂。可能不必需完全抑制CSF3活性，而是将CSF3活性水平降低至无害水平。这是关于CSF3活性或CSF3R水平的“正常化”。

本发明进一步提供了CSF3拮抗剂或CSF3R激动剂在制备促进成功妊娠的药物中的用途。

因此，本文涉及CSF3拮抗剂或CSF3R激动剂作为佐剂改善雌性受试者的植入率的用途。如上所述，例如，CSF3可被抑制至零活性或被抑制至与经历成功妊娠的正常受试者中的水平等价的水平。因此，可以使用CSF3的完全抑制或CSF3水平的正常化来实现成功的妊娠结果。类似地，可以使用CSF3R激动剂来升高CSF3R，由于过量CSF3的负反馈机制而使CSF3R下调。

因此，本文涉及一种药物组合物，其包含CSF3拮抗剂或CSF3R激动剂，所述药物组合物进一步包含一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。

术语“拮抗剂(anatomist)”、“激动剂”、“药物(medicament)”、“活性剂(active)”、“药(drug)”、“药剂(medicine)”、“化合物”和“治疗剂”在本文中可互换使用，是指诱导期望的药理学和/或生理学作用的物质，包括使CSF3信号传导活性正常化，或CSF3信号传导活性的作用正常化。药理学和/或生理学作用包括抑制CSF3对CSF3R的负反馈作用。该术语还涵盖其药学上可接受的和药理活性的形式，包括盐。期望的作用是防止CSF3R水平降低的CSF3活性的抑制或正常化。

因此，本文涉及的试剂包括CSF3信号传导调节剂，其涵盖可下调CSF3或上调CSF3R的分子。

如本文所使用的术语“治疗”是指治疗性治疗。治疗导致改善了成功妊娠的可能性。

试剂可以是蛋白或非蛋白(即非蛋白化学品)分子。术语“试剂”还可以描述为具有使CSF3信号传导正常化的能力的拮抗剂、激动剂、药物、活性药、治疗剂、药剂、化合物或其它分子。示例包括针对CSF3的抗体或CSF3R的可溶或突变形式或下调编码CSF3的基因或mRNA的寡核苷酸或微小RNA。

在一个实施方案中，所述试剂是可溶的CSF3R或其突变形式。“突变”形式包括含有一个或多个氨基酸取代、添加或缺失的CSF3R的一部分。这种突变形式可以增加血清半衰期或突变的可溶的CSF3R或增加对CSF3的结合活性，从而降低可用于结合CSF3R的CSF3的量。

在一个实施方案中，所述试剂是CSF3的非功能性形式，其可以结合CSF3R而不诱导CSF3信号传导。这种CSF3的非功能形式通常含有对CSF3信号传导所需的CSF3中一部分的单个或多个氨基酸取代、添加或缺失，但不阻止其与CSF3R结合。因此，这种突变的CSF3防止活性CSF3诱导信号传导。

在一个实施方案中，所述试剂是CSF3特异性的抗体。任何抗体都是人抗体或非人抗体的去免疫化或人源化形式。

术语“抗体”包括多克隆和单克隆抗体以及衍生自单克隆抗体的所有不同形式，包括但不限于全长抗体(例如具有完整的Fc区)；抗原结合片段，包括例如Fv、Fab、Fab'和F(ab')₂片段；和使用重组方法产生的抗体衍生多肽，如单链抗体。如本文所用的术语“抗体”还指例如在转基因动物中或通过噬菌体展示产生的人抗体，以及嵌合抗体和人源化抗体。还包括可以是治疗可接受的其它形式的抗体及其抗原结合片段，例如，衍生自软骨海洋动物或骆驼科的单结构域抗体，或来自基于此类抗体的文库。关于后者的实施方案，抗体可以是国际专利公开号WO 2005/118629中定义的免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)，其来自软骨海洋动物如鲨鱼。也可以参考Nuttal等人(2003)Eur.J.Biochem 270:2543-3554。

术语“单克隆抗体”在本文中用于指从一群实质上同质的抗体获得的抗体。即，除了可能以少量存在的天然存在的突变之外，包含该群体的个体抗体是相同的。因此，如本文使用的修饰语“单克隆”表示抗体的特征在于从实质上同质的抗体群获得，并且不表示抗体是通过特定方法产生的。例如，根据本发明的单克隆抗体可以通过由Kohler和Milstein(1975)Nature 256：495-499描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法(如美国专利号4,816,567中描述的)制备。单克隆抗体也可以使用Clackson等人(1991)Nature 352：624-628或Marks等人(1991)J.Mol.Biol.222:581-597所述的技术从噬菌体抗体文库中分离出来。

嵌合抗体可以包括针对CSF3的抗体，其包括针对CSF3的小鼠、大鼠或兔抗体的重链和轻链可变区以及人重链和轻链恒定结构域。

试剂可以是CSF3活性的高水平拮抗剂，或者它可以是被设计或选择为将靶标分子活性降低至非零水平的低水平拮抗剂。目标是CSF3信号传导的“正常化”以降低CSF3对子宫内膜的不利作用。这些方面进一步适用于VEGF、IL-6、IL-8、IL-17A、CRP、PIGF、sFlt-1和/或sGP130水平的正常化。

本文教导的另一个实施方案是一种用于确定孕妇可能经受流产的风险的测定，所述测定包括确定来自孕妇的液体样本中CSF3的浓度，其中，相对于对照，如果CSF3的水平低于正常水平，指示流产的较高的发生率。

本文公开的方面通过以下非限制性实施例进一步示例性说明。

实施例

材料和方法

自然周期患者队列

如先前所述(Hannan等人(2010)Journal of proteome research 9(12):6256-64)，从可孕女性(n＝19)和原发性特发性不孕女性(n＝18)收集子宫灌洗和组织活检(如果可获得)，可孕女性证实经受常规妇科手术，原发性特发性不孕女性经受扩张和刮宫术。排除输卵管或卵巢异常(例如输卵管阻塞、输卵管囊肿、卵巢囊肿、闭经和多囊卵巢综合征)的女性，男性因素不孕同样被排除。简言之，通过使用婴儿饲管，将3.0mL无菌盐水缓慢注入子宫腔中进行灌洗收集；使用相同的管吸出子宫内容物。通过以1000rpm离心去除细胞碎片和粘液，并用移液器吸出灌洗，将灌洗等分，并且在分析前保存在-80C。基于Noyes标准(Noyes等(1975)American journal of obstetrics and gynecology 122(2)：262-3)将组织活检样本提交给至认可的病理学实验室进行时期测定(dating)。只有那些病理学时期测定为早期分泌期的样本被包括在本研究中。

辅助生殖治疗刺激的周期队列

经受刺激的IVF周期的女性的队列，在取卵母细胞时(hCG+2)进行灌洗。所有女性都在相同周期内经受新鲜胚胎移植，并归类为特发性不孕，潜在原因(例如PCOS、子宫内膜异位、男性因素和输卵管积水(hydrosalpinges)已被排除。根据周期结果将患者分为三组，即妊娠(n＝4)、未妊娠(n＝4)和临床前妊娠(n＝4)。还收集了第四组，其包括经受IVF刺激的作为卵子供体的可孕女性(n＝4)。为每份灌洗收集匹配的组织活检样本。

子宫灌洗的免疫分析

对来自自然周期队列的灌洗进行初始分析。所有测定使用Bioplex200仪器(Biorad Laboratories，伯克利，CA，USA)进行。所使用的测定是用于IL8和CSF3的Milliplex人细胞因子组(Merck Millipore，比勒利卡，MA，USA)、用于sFlt-1和sGP130的Milliplex可溶细胞因子受体组(Merck Millipore)、以及来自R&D系统的PlGF珠免疫测定(Minneapolis，MN，USA)。所有测定均对未进一步稀释的子宫灌洗样本上进行，并根据制造商的说明进行，在+4℃下将样本孵育过夜。

子宫组织中CSF3及其受体的免疫组织化学检测

CSF3及其受体CSF3R的免疫组织化学使用分别以1：200和1：400v/v稀释的针对CSF3的山羊多克隆抗体(N-20，Santa Cruz Biotechnology，达拉斯，TX，USA)和针对CSF3R的小鼠单克隆抗体(克隆S-1284，Abcam，坎布里奇，MA，USA)进行。使用匹配的物种非特异性IgG作为每种抗体的阴性对照。第二检测抗体分别是生物素化的马抗山羊和马抗小鼠(Vector Laboratories，伯林盖姆，CA，USA)。使用ABC载体染色(Vector Laboratories)联合DBA底物(Glostrup，Dako，USA)进行检测。

CSF3R的激素依赖性表达

在含有10％v/v胎牛血清(FCS)(Gibco，Life Technologies)的DMEM/F12(Gibco，Life Technologies，卡尔斯巴德，CA，USA)中，将通过基因型确认起源且经测试无支原体的ECC-1细胞培养至80％汇合，然后在含有0.5％w/v活性炭处理(charcoal-stripped，CS)的FCS(Gibco，Life Technologies)的DMEM/F12中血清饥饿24小时。细胞在此介质中，添加或不添加的10^-8M雌二醇17(E)(Sigma Aldrich，圣路易斯，MO，USA)再培养24小时，然后采用无激素、仅E或E加10^-7M甲羟黄体酮17-乙酸酯(MPA)(Sigma Aldrich)进行最后24小时的期间。在每个24小时的时间点收获介质，离心去除细胞碎片并快速冷冻。实验完成后，将细胞收集在RIPA缓冲液中(50mM Tris、150mM NaCl、0.1％w/v SDS、1％v/v Triton-X 100、0.1％w/v蛋白酶抑制剂混合物)，并冷冻直至分析。解冻裂解的细胞并离心以去除细胞碎片。

原代子宫上皮培养

从来自可孕女性的增殖期子宫内膜活检中分离子宫上皮细胞，并如前所述(Paiva等人(2011)Human reproduction 26(5)：1153-62)进行培养。以与上述细胞系相同的方式对分离的上皮细胞进行激素处理。处理后收集介质和细胞裂解物，在分析前冷冻保存。

总蛋白浓度

使用BCA蛋白测定试剂盒(Thermo Fisher)确定细胞裂解物的总蛋白浓度。所有样本以3个稀释度一式三份进行测试。使用AgileCon板读数仪(ACTGene Inc，皮斯卡塔韦，NJ，USA)在560nm处读取吸光度。计算每个样本的平均浓度。

Western印迹

通过SDS-PAGE在mini-protean TGX 4-20％梯度丙烯酰胺凝胶上分离细胞裂解物(10ug)，并使用Trans-blot Turbo(Biorad)在25V下持续7分钟，转移至0.2μm PVDF膜(Biorad，USA)。采用在TBS/T20中的5％w/v脱脂乳将膜封闭，并用稀释度为2μg/mL的前述(Layton等人(1997)Growth factors 14(2-3)：117-30)单克隆抗体(LMH711)(Ludwig癌症研究所，苏黎世，瑞士)进行印记探测。使用生物素化的马抗小鼠IgG(VectorLaboratories)和ABC Vectastain(Vector Laboratories)检测结合的抗体。使用Clarity(商标)Western ECL底物(Biorad)显色条带。使用ChemiDoc(商标)MP(Biorad)对印迹进行成像，并且进行密度分析比较E和E+P处理的细胞中的表达，其使用HRP-缀合的抗-肌动蛋白兔单克隆抗体(13E5)(Cell Signaling Technology，丹佛，MA，USA)显色β-肌动蛋白含量作为加载对照而进行。

统计分析

使用MedCalc(商标)和Graphpad Prism(商标)软件进行统计分析。通过Mann-whitney进行可孕对比不孕自然周期队列的分析数据的比较，并进行年龄、蛋白浓度和个体标志物之间的相关分析(spearman非参数)。对分析物的比率进行类似的分析。IVF队列分析比较了三个结果组(妊娠、未妊娠和临床前妊娠)，通过Kruskal-wallis以及事件后Dunn’s分析(p<0.05)以确定显著性。

实施例1

自然周期队列

来自19名可孕女性和18名原发性特发性不孕女性的子宫灌洗和子宫内膜活检被分期为早期分泌。可孕(36.7±4.0岁)和不孕(35.2±5.3岁)组之间的年龄无显著差异。详细的病史和病理学报告显示患者队列中混合有子宫病变和出血异常的(表2)。在图1中显示了子宫灌洗中生物标志物的水平。

通过Mann-Whitney检验和ROC的分析，比较了来自周期的早期分泌期期间可孕和不孕女性子宫灌洗中个体分析物的浓度(表3)。通过Mann-Whitney，在早期分泌样本中在可孕女性(平均值＝1300+/-435.8pg/mL)和不孕女性(平均值＝3309+/-705.4pg/mL)间只有CSF3显示出显著差异(p＝0.006)。在早期分泌期，可孕和不孕女性间没有其它标志物显示存在显著差异。

Spearman相关分析发现在可孕或不孕女性中，均没有与年龄相关的标志物。在可孕队列中，仅sGP130(r＝0.640，p＝0.003)和sFlt-1(r＝0.553，p＝0.014)与总蛋白浓度显著相关，并且类似地，在不孕队列中，sGP130(r＝0.484，p＝0.050)和sFlt-1(r＝0.742，p＝0.001)与蛋白浓度相关。在可孕组中，sGP130与CSF3(r＝0.490，p＝0.033)和sFlt-1(r＝0.507，p＝0.027)间可见显著相关性，而在不孕女性中，前者的关系保持(r＝0.475，p＝0.056)，后者增强(r＝0.718，p＝0.002)。在不孕女性中CSF3对比IL8(r＝0.798，p＝0.00007)和CSF3对比sFlt-1(r＝0.650，p＝0.006)间额外的强相关性明显。

鉴于所有样本都是以相同的方式收集的，假定所有样本通过注入的盐水稀释到相同的程度，而不考虑随后收获的量。据估计，在hCG+2的子宫腔内天然存在约60μl的液体(Casslen(1986)The Journal of reproductive medicine 31(6)：506-10)，因此用3ml盐水灌注导致灌洗稀释50倍。

实施例2

来自经受ART的女性的灌洗的分析

比较刺激周期中来自在hCG+2的女性的子宫灌洗中CSF3的浓度。根据周期结果将患者分为三组：妊娠、未妊娠和临床前妊娠，具有第四组，其包括经受IVF刺激作为卵子供体的可孕女性。CSF3的浓度在组间显著不同(Kruskal-Wallisp＝0.0002)，与实现妊娠的女性(平均值±SEM，1245±269)、临床前妊娠(平均值±SEM，1992±40)和可孕经刺激的卵子供体(平均值±SEM，719±274)相比，在未妊娠的女性中升高(平均值±SEM，3447±89)(图3)。个体配对分析(Dunn's检验)显示“未妊娠”与“妊娠”(p＝0.041)和“供体”(p＝0.025)组之间的显著差异。

实施例3

在子宫组织中CSF3及其受体的检测

在早期分泌期组织中CSF3的免疫组织化学显示了在腔管和腺上皮中通常的表达模式，并且在一定程度上显示了基质表达，类似于之前针对中期分泌组织所报道的。然而，在可孕和不孕女性之间，CSF3的染色模式没有明显的差异。结果如图2所示。

CSF3受体在周期的早期分泌期期间可孕女性的腔管和腺上皮中均显示实质的染色，而相比之下基质染色较弱。然而，在特发性不孕女性中，CSF3R的上皮表达大幅降低或甚至消失，而基质染色更强。

在hCG+2取样的小型IVF组织队列中，来自经受IVF刺激手术的可孕卵子供体和成功妊娠的女性组织中存在类似的强腺上皮染色模式，然而在未妊娠的女性中，上皮染色显著降低或消失，尽管基质染色是明显的。使用针对CSF3R的抗体，对原代子宫上皮细胞裂解物进行Western印迹分析，显示约89.2kDa的条带。存在四种已知的膜结合CSF3R的读取同种型(read-isoform)(典型同种型1具有89.6kDa的Mw、同种型2具有85.1kDa、同种型3具有95.1kDa和同种型4具有86.6kDa)。尚未报道在未妊娠子宫中存在的CSF3R形式，尽管胎盘中存在三种同种型。

实施例4

使用xCelligence实时细胞分析的CSF3对子宫内膜上皮细胞的作用

在图4中，观察到CSF3-G(糖基化的)和CSF3-NG(非糖基化的)在慢性和急性处理模型中均增加ECC1细胞的附着性，剂量反应作用很小，然而，慢性处理(暴露前24小时)CSF3-G显示反应减弱，指示细胞对GSF3-G的反应变弱。GSF3-G降低而CSF3-NG却没有，这是一个潜在的重要结果。

增殖实验(图5)显示两种CSF3形式均增加细胞的增殖，然而，对于CSF3-NG，较高的70ng/mL浓度引起比20ng/mL更高的增加，其中对慢性处理的反应超过对急性处理的反应。相比之下，对于CSF3-G，较高浓度(70ng/mL)导致细胞增殖较少增加，并且与CSF3-NG相比，慢性暴露导致对CSF3-G的反应降低。

采用Ishikawa腺细胞模型的实验发现，急性处理对附着或增殖影响很小。然而，慢性处理引起降低附着的趋势，CSF3-G和CSF3-NG在70ng/mL时显示类似的结果，然而，20ng/mL时CSF3-NG显示附着高度显著降低。

与提高增殖的20ng/mL剂量相比，Ishikawa细胞的增殖被70ng/mL CSF3-G显著降低。采用CSF3-NG再次可见反向剂量反应作用。

实施例5

使用xCelligence实时细胞分析CSF3对人类滋养层细胞的作用

在图6中，由于CSF3-G和CSF3-NG均包括在介质中，HTR8滋养层细胞系显示显著增加的侵袭，对20ng/mL的反应虽然不太明显，但显示出增加侵袭的类似趋势。迁移数据显示Htr8细胞迁移增加的趋势，但30小时后仅70ng/mL CSF-NG显示显著性。数据也显示在图7和图8中。

实施例6

CSF3的作用

囊胚和子宫内膜的同步发育对于成功建立妊娠至关重要。在每个月经周期期间，子宫内膜仅在短暂的时间段对胚胎植入具有接受性。缺乏适合的子宫内膜发育会导致不孕，并导致人工生殖技术缺乏成功。在过去的十年中，一些实验室试图鉴定子宫腔中组织或分泌物中子宫内膜接受性的标志物。除了单一的标志物研究(Heng等人(2011)Humanreproduction 26(4):840-6；Krussel等人(1999)Molecular human reproduction 5(5):452-8；Sherwin等人(2002)The Journal of clinical endocrinology and metabolism87(8):3953-60；Torry等人(1996)Fertility and sterility 66(1):72-80；Hannan等人(2011)Endocrinology 152(12):4948-56；Paiva等人(2011)上文；Salmassi等人(2005)Human reproduction 20(9):2434-40)，已经报道了一些基因组(Diaz-Gimeno等人(2011)Fertility and sterility 95(1):50-60)和蛋白组(Salamonsen等人(2013)Fertilityand sterility 99(4):1086-92；Scotchie等人(2009)Reproductive sciences 16(9):883-93；Chen等人(2009)Journal of proteome research 8(4):2032-44；Hannan等人(2010)上文)分析以鉴定接受性标志物。许多这种研究的主要目的是了解子宫内膜接受性如何发育，以及确定植入的胚胎-母体对话。因此，目前研究的一个特征是使用在正常月经周期的中期分泌期期间(LH+5至+7)收集的样本。已知在周期的这个时期调节的基因或蛋白可能确实反映了接受状态，因此提供了在排除其它不孕原因的特发性不孕女性中鉴定未能实现子宫内膜接受的潜能。然而，在辅助生殖治疗(ART)周期中，存在开发用于应用的预测性测试的潜能，如果计划胚胎移植，则通知患者和临床医生成功植入的可能性。这是特别相关的，因为越来越认识到在刺激周期期间女性子宫内膜与高度异常的组织学不一致(Evans等人(2014)Human reproduction update 20(6)：808-21；Evans等人(2012)PloS one.7(12)：e53098；Evans等人(2013)Human reproduction 28(6)：1610-9)。由于“中期分泌”期与约hCG+5时(当hCG用于排卵诱导时)的胚胎移植一致时，测试ART刺激周期的适用性是困难的，因为这可能干扰移植的胚胎，并且在胚胎移植之前留给实验室分析和报告的时间是不足的。此外，必须考虑的是，前一周期的测试是基于一个假设，即子宫内膜在每个周期中发育是相同的：这在自然周期中尚未得到证实，而进一步存在有力的证据表示在刺激周期中卵巢刺激对子宫内膜有相当大的影响(Evans等人2014上文)，因此不能假设如果修改患者的刺激方法将实现类似的接受性。

此外，许多这些报告仅利用了非常小的患者数量，并且经常排除具有子宫病理或出血不规律的女性，实际上她们占将使用接受性测试的女性中的很大比例。

在导致本发明的工作中，研究了分别在自然周期以及更具体为ART周期的接受前早期分泌或hCG+2的点，生物标志物CSF3、IL8、PlGF、sGP130和sFlt-1是否可以用于预测子宫内膜接受性的后续发育。首先检测在自然周期的早期分泌期期间在可孕和已知原发性特发性不孕女性中所选标志物的差异。那些能够在这个时期产生差异的生物标志物，随后在经受IVF治疗的不孕女性队列中在hCG+2(取卵母细胞的那天)收集的子宫灌洗中进行评估，所述女性的胚胎移植结果已知：相同周期移植后妊娠、未妊娠、临床前妊娠、以及可孕的卵子供体。

本文获得的数据显示，只有CSF3可以区分自然周期女性的早期分泌期的生育状态，并且因此将CSF3确定应用于从经受激素刺激的女性在hCG+2收集的队列，作为ART治疗周期的一部分。

子宫上皮细胞中CSF3的调节尚未完全阐明。在其它细胞类型中，已知在免疫相关细胞类型中，CSF3与其受体存在于负反馈环中(Jilma等人(2000)British journal ofhematology 111(1)：314-20)。在自然周期的早期分泌期和hCG+2时的ART女性中，在子宫内膜组织中证实CSF3受体的存在。此外，在经受IVF的女性中，还存在与CSF3高水平相关的低的或消失的受体表达，且无法实现妊娠。受体在可孕女性的上皮细胞(腔管和腺)中丰富，在基质表达很少，然而，注意到在不孕女性中，受体的低的上皮表达，以及伴随明显的强基质表达。因此，似乎负反馈环确实存在于上皮细胞中，不孕女性的CSF3升高导致受体表达降低。在不孕女性中，“开启(switch on)”基质细胞表达的机制尚不清楚，尽管可能与局部免疫细胞群相关。

CSF3对人子宫内膜上皮细胞和滋养层细胞系培养物的功能研究，提供了高CSF3在子宫腔内影响生育的证据。数据检测了糖基化(CSF3-G)和非糖基化(CSF3-NG)形式的CSF3，分别代表lenograstrim(在中国仓鼠卵巢细胞中产生)和filagastrim(在大肠杆菌中产生)的两种主要临床批准产品。这里的数据证实，CSF3的糖基化状态影响其功能作用，CSF3暴露的时期也确实如此。检测CSF3在两种浓度下的急性作用：70pg/mL，代表在不孕女性中可见的平均浓度，以及20ng/mL，代表在可孕女性中可见的平均浓度，以及在先前24小时暴露于药物后可见的影响。这里的数据提供了这样的证据，即在体内，在植入期之前子宫腔中存在升高的CSF3状态，因此，慢性实验可能与自然存在的更接近。检测两种子宫内膜上皮细胞系的附着和增殖，一种代表腔管上皮(ECC1)和另一种代表腺上皮(Ishikawa)。确定了附着作用以及增殖，附着作用是子宫内膜细胞与到达滋养层(arriving trophoblast)相互作用的能力的指示。通过在急性暴露中增加CSF3浓度来增强附着，然而，慢性暴露显著降低了这种影响。同样值得注意的是，虽然CSF3-NG以剂量响应地方式增加细胞增殖，但糖基化形式显示出与较高浓度呈反向关系，显示增殖降低。虽然两种形式不能真正代表人CSF3，但糖基化形式可能被认为是更接近的代表。再次采用腺上皮模型，急性处理显示CSF3影响很小，然而，在再次慢性暴露下，糖基化和非糖基化形式显示对增殖的反向剂量反应作用，用低剂量CSF3-G抑制增殖，以及低剂量CSF3-NG抑制附着。

在慢性暴露中的影响掩盖了由CSF3相互作用引起的受体损失，这种相互作用在糖基化和非糖基化形式之间将不同，因此引起不同的反应。在CSF3被试验性作为佐剂改善ART妊娠率的临床背景中，这些发现具有非常显著的意义。虽然针对基于子宫内膜的不孕，之前未研究子宫CSF3，但对它在卵巢中卵泡液和颗粒细胞中相关性的兴趣增加，驱使其临床使用。卵泡液中的CSF3水平比在血清中高得多(Salmassi等人，2005，上文)。然而，根据本发明，子宫灌洗中的CSF3浓度几乎比卵泡液中报道的高10倍。在雌性生殖道内这些局部高浓度的CSF3表明了局部生产和生殖意义。

总而言之，这里的数据表明子宫中的高CSF3和低CSF3R与降低的生育相关。

本文证实CSF3不仅作为雌性生育的生物标志物的潜在用途，而且更重要地确定其在雌性生殖道中的一些作用，包括CSF3及其受体对子宫环境中潜在胚胎附着的影响，以及对子宫内膜发育的潜在影响，这对子宫内膜功能至关重要。重要的是，临床上使用CSF3作为佐剂以改善植入率可能被误导，并且确实是禁忌的。本文提出中和女性子宫内膜分泌物中存在的过量CSF3是改善妊娠成功的更有效途径。

表2

患者队列的生育状态、年龄、以及存在病理的和出血疾病

表3

显示了从分期为周期的早期分泌期的可孕和不孕队列收集的灌洗中每种生物标志物的平均值(pg/mL)、平均值的标准误差(SEM)和中值。使用非参数Mann-Whitney分析的统计分析：**p<0.01。

实施例7

血清分析的建模结果

第3天移植

第3天移植结果以“妊娠”(包括活产、流产和临床前)和“未妊娠”(包括未妊娠和临床前/生物化学妊娠)的两种结果模型建模(图9)。以下实施例模型主要使用年龄、E2/P4、IL-8/CRP、CSF3、黄体酮、IL-6/IL-17A、no.收集的卵子、子宫内膜厚度、IL6/IL8。99％的结果得到正确分类。

T检验发现妊娠和未妊娠间的预测指数存在高度显著的差异(p<0.0001)(图10)。

采用Tukey事件后检验的ANOVA发现，在活产和所有其它三类(未妊娠、流产、临床前/生物化学)间的2因素模型中产生的预测指数的差异高度显著(p<0.0001)(图11)。

第二种模型采用4种结果产生，活产、流产、临床前/生物化学妊娠和未妊娠。结果100％正确预测。所用模型主要为年龄、IL-8/VEGF、P4hCG+2-hCG0、CSF3/IL-6、IL-6/CRP、E2/P4、IL-8/IL-17A、CSF3、IL-8、CSF3/VEGF、IL-6/IL-8、子宫内膜厚度、IL-6、IL-17A/VEGF、收集的卵子、黄体酮、IL-17A/CRP、IL-8/VEGF。

采用Tukey事件后检验的ANOVA发现在活产和所有其它三类(无妊娠、流产、临床前/生物化学)之间的2因素模型中产生的预测指数存在显著差异(图11)。

第5天移植

第5天移植结果以“妊娠”(包括活产、流产和临床前)和“未妊娠”(包括未妊娠和临床前/生物化学妊娠)的两种结果模型建模，总共n＝174名女性。以下实施例模型主要使用年龄、IL-6/IL-17A、黄体酮、IL-8、CSF3、子宫内膜厚度。该模型提供82％样本的正确分类。

T检验发现妊娠和未妊娠间的预测指数存在高度显著差异(p<0.0001)(图13)。

采用Tukey事件后检验的ANOVA发现，在活产和所有其它三类(未妊娠、流产、临床前/生物化学)间的预测指数的差异高度显著(p<0.0001)。除了未妊娠和临床前/生物化学妊娠结果的差异之外，女性活产与流产相比存在显著的差异。

第二种模型采用4种结果产生，活产、流产、临床前/生物化学妊娠和未妊娠。结果100％正确预测。模型主要采用胚胎分级、CRP、年龄、IL-8、雌激素、VEGF、黄体酮、no.收集的卵子、血清总蛋白、CSF3/VEGF、CSF3/IL-6、IL-6/IL-8、卵子受精率、CSF3、CSF3/IL-8、IL-8/VEGF、CSF3/IL-8、IL-17A/CRP、IL8/CRP、IL-17A/VEGF、BMI、IL-8/IL-17A、VEGF/CRP。

该模型显示出对妊娠的极好预测；除了未妊娠和临床前结果之外，显著区别流产结果。

实施例8

IL-17A作为生物模型(biomodal)

子宫内膜液体中的IL-17A显示生物模型群体。女性人群可分为高(>1pg/mL)和低(<1pg/mL)的人群，分别在图16中分别标记为A和B。A人群的妊娠率低于B。

实施例9

生物标志物的评估

表4和表5中显示生物标志物水平和妊娠结果之间的关联。

表4

个体生物标志物的灌洗浓度总结

	可孕对比不孕(自然)	妊娠对比未妊娠(IVF)
			VEGF	不孕升高	未妊娠升高
IL-6	不孕升高	未妊娠升高
			IL-8	不孕升高	未妊娠升高
IL-17A	未检测	未妊娠升高
			CSF3	不孕升高	无差异

表5

个体生物标志物血清浓度的总结

	妊娠对比未妊娠(IVF)
		VEGF	未妊娠升高
IL-6	未妊娠升高
		IL-8	未妊娠升高
IL-17A	未妊娠升高
		CSF3	未妊娠升高
CRP	未妊娠升高

实施例10

流产的预测

图17显示CSF3的水平可用于预测流产的可能性。低于正常水平的CSF3与较高的流产发生率相关。

本领域技术人员将认识到，除了具体描述的那些之外，本文所述的公开内容易于进行变化和修改。应该理解的是，本公开涉及所有这些变化和修改。本公开还提供本说明书中单独地或共同地提及的或指示的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任何两种或多种步骤或特征或组合物或化合物的任何和所有组合。

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Claims (20)

1.一种用于针对胚胎植入的可能结果区分雌性受试者的测定，所述结果选自妊娠和未妊娠，所述测定包括从来自受试者的液体样本确定CSF3和/或CSF3受体(CSFR)的浓度，其中，相对于对照，CSF3或CSFR的水平或CSF和CSFR的水平的比率提供成功妊娠可能性的指示，其中，

相对于对照，CSF3的水平升高指示实现妊娠的差的可能性；

相对于对照，CSF3的水平正常指示实现妊娠的更高的可能性；

相对于对照，CSF3R的正常水平升高指示实现妊娠的更高的可能性，以及，

相对于对照，CSF3R的水平降低指示实现妊娠的差的可能性。

2.根据权利要求1所述的测定，其中所述生物样本选自子宫灌洗、血液、血浆或血清、腹水、淋巴液、组织渗出物或尿。

3.根据权利要求1或2所述的测定，其中还测定了VEGF、IL-6、IL-8、IL-17A、CRP、PIGF、sFlt-1和/或sGP130中的一种或多种，其中，相对于对照，这些生物标志物中的任何一种或多种的升高指示成功妊娠结果的差的可能性。

4.根据权利要求1所述的测定，其中所述雌性受试者经受激素刺激周期。

5.根据权利要求1所述的测定，其中所述雌性受试者经受自然排卵周期。

6.根据权利要求1所述的测定，其中所述液体样本是子宫灌洗样本。

7.根据权利要求1所述的测定，其中所述液体样本是血液、血浆或血清样本。

8.一种针对妊娠或未妊娠的可能性对经受辅助生殖技术方法的雌性受试者进行区分的多重测定，当妊娠时，对妊娠是临床妊娠或临床前妊娠进行区分，所述测定包括确定来自受试者的子宫液体中的CSF3和/或CSF3R的水平，其中，

当相对于对照，CSF3的水平正常时，则成功妊娠被认为是可能的；

当相对于对照，CSF3R的水平高时，则成功妊娠被认为是较低可能的；

当相对于对照，CSF3R的水平正常时，则成功妊娠被认为是更为可能的。

9.根据权利要求8所述的多重测定，其中基于预期结果，临床医生可以决定不进行胚胎移植。

10.根据权利要求8所述的多重测定，其中所述子宫样本是子宫灌洗样本。

11.一种改善的辅助生殖技术方法，其中所述方法包括使雌性患者镇静并从患者收集卵子，所述改善包括在胚胎移植期间使用CSF3拮抗剂或CSF3R激动剂作为佐剂，以促进成功妊娠的可能性。

12.CSF3和/或CSF3R的水平或水平的比率在制备测定中的用途，所述测定用以确定胚胎的成功植入至临床妊娠的可能性的水平。

13.根据权利要求12所述的用途，其中CSF3和/或CSF3R的先前水平的知识提供训练数据的第一知识库以产生算法，在输入包括来自患者的相同生物标志物水平的数据的第二知识库时，该算法提供了预测实现临床妊娠的成功与否的水平的概率指数，所述患者具有未知的妊娠成功的可能性。

14.一种治疗雌性受试者以改善植入的胚胎进展为临床妊娠的可能性的方法，所述方法包括在植入前向所述受试者施用有效量的CSF3拮抗剂或CSF3R激动剂。

15.一种用于针对胚胎植入的可能结果区分雌性受试者的测定，所述结果选自妊娠和未妊娠，所述测定包括确定来自受试者的液体样本中IL-17A的浓度，其中，IL17A的水平或IL-17A的水平相对于对照的比率提供了成功妊娠可能性的指示，其中，相对于对照，IL-17A的水平升高指示实现妊娠的差的可能性；以及相对于对照，IL-17A的水平正常指示实现妊娠的更高的可能性。

16.一种用于针对胚胎植入的可能结果区分雌性受试者的测定，所述结果选自妊娠和未妊娠，所述测定包括确定来自受试者的液体样本中的PIGF浓度，其中，PIGF水平或PIGF的水平相对于对照的比率提供了成功妊娠可能性的指示，其中，相对于对照，PIGF的水平升高指示实现妊娠的差的可能性；以及相对于对照，PIGF的水平正常指示实现妊娠的更高的可能性。

17.CSF3拮抗剂或CSF3R激动剂在制备药物中的用途，所述药物用于改善子宫内膜对胚胎的接受性从而导致成功的临床妊娠。

18.一种辅助生殖技术的改善方法，所述改善包括在妊娠前或妊娠期间使CSF3和/或CSF3R水平正常。

19.根据权利要求18所述的改善方法，其中正常发生在hCG+2。

20.一种确定孕妇可能经受流产的风险的测定，所述测定包括确定来自孕妇的液体样本中CSF3的浓度，其中，当相对于对照CSF3的水平小于正常水平时，这指示流产的发生率较高。