CN1084349C

CN1084349C - 一种制备聚－β－羟基丁酸酯的方法

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Publication number: CN1084349C
Application number: CN98102281A
Authority: CN
Inventors: 尹进; 沈忠耀; 李红旗
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 1998-06-19
Filing date: 1998-06-19
Publication date: 2002-05-08
Anticipated expiration: 2018-06-19
Also published as: CN1201043A

Abstract

本发明涉及一种制备聚-β-羟基丁酸酯的方法，该方法是首先构建既含PHB合成基因又含λ噬菌体裂解基因S(-)RRz的基因工程菌，该菌在含葡萄糖的培养基中培养时，菌体中PHB的含量可达占菌体干重的60%以上。将积累了PHB的细胞用含螯合剂EDTA的缓冲液诱导，在20min内使细胞裂解，裂解率接近100%。裂解后的细胞沉淀用表面活性剂SDS洗涤，可获得纯度高于99%的PHB。

Description

一种制备聚-β-羟基丁酸酯的方法

本发明涉及一种制备聚-β-羟基丁酸酯的方法，属生物化工技术领域。

聚-β-羟基丁酸酯(PHB)是微生物合成的一种高分子聚合物，由于具有生物可降解性、生物相容性、压电性、光学活性以及在生物合成过程中可利用再生原料的特性等，在医学、药学、农业、电子等领域具有独特而广阔的应用前景。但目前PHB的大规模生产和广泛应用仍未实现，其中一个最主要的原因就是生产PHB的成本较石油化工塑料高得多：目前以石油为原料合成的塑料价格约为1$/kg，而PHB的价格却高达16$/kg。

目前利用微生物发酵来制备PHB的方法主要可分为两步：第一步是发酵培养，以获得大量积累了PHB的细胞；第二步是从积累了PHB的细胞中分离提取PHB。由于PHB是一种以颗粒状态存在于细胞中的胞内产物，分子量高达100万以上，不溶于水，仅溶于氯仿等少数几类有机溶剂，且溶解度低，所以分离提取非常困难，成本高，其分离成本在PHB的生产成本中占主要，约40％以上。目前已发展的破细胞壁分离PHB的方法主要有溶剂萃取法、化学试剂法、机械法和酶法：

(1)溶剂萃取法是利用有机溶剂将细胞中的PHB溶解而分离的方法，所用的有机溶剂有氯仿(专利EP 0,015123 A1)、二氧杂环己烷(专利JP63,198,661)、四氢呋喃及其衍生物(专利JP07 79,788)，乙氰和丙氰(专利JP 07 79,985)，乙酸酐和乙酸(专利DE 4,215,860)，1，2-丙二醇(专利AT 380,068)等。溶剂萃取法的主要缺点是溶剂用量大，所以成本高。

(2)化学试剂法是利用化学物质如氢氧化钠等强碱，次氯酸钠、双氧水(专利WO94/24,302)等氧化剂，油酸钠(专利JP 07 79,787)、十二烷基磺酸钠(SDS)等表面活性剂，或乙二胺四乙酸二钠(EDTA)等螯合剂的作用，将细胞中的非PHB杂质转变成可溶性的成分而除去的方法。该方法的缺点是化学试剂如次氯酸钠的使用会对PHB分子产生严重降解作用(最大可达50％)，并且污染环境。

(3)酶法是利用各种裂解酶(如蛋白裂解酶)的作用，将细胞中的非PHB杂质降解成可溶性的成分而除去的方法(专利US 4,910,1445)。该方法需要加入外源酶，分离步骤多。

(4)机械法只是一种破细胞壁、释放PHB颗粒的方法，不能纯化PHB。它是利用高压匀浆机的作用来破坏细胞壁(Harrison et al，Bioseparation，1991，2：155-166)。该方法需要昂贵的设备。

总的说来，目前已发展的破细胞壁分离PHB的溶剂萃取法、化学试剂法、机械法和酶法均不是一种理想的方法，直接影响了PHB的大规模生产和广泛应用。

作为胞内产物的PHB，其分离的首要问题是细胞壁的破碎。科学家们很早就发现噬菌体可以裂解细胞，研究表明，λ噬菌体裂解细胞时起主要作用的是其裂解基因所产生的酶。λ噬菌体的裂解基因包括三种：S、R、Rz，其中R和Rz基因产物的功能是降解细胞壁，S基因产物的作用是改变细胞膜的通透性，以使R和Rz基因产生的酶穿过细胞膜，到达细胞壁，从而作用于细胞壁。将裂解基因SRRz克隆入大肠杆菌中，如果三基因同时表达，细胞将很快死亡(Garrett et al.Mol.Gen.Genet.1981，182：326-331)，并且在细胞的不同生长时期诱导裂解基因表达，其裂解效率是不同的：在细胞的对数生长期时，细胞的裂解效率最高，以后随着步入稳定生长期，细胞的裂解效率也随着降低(Kloos et al，J.Bacteriol.，1994，176(23)：7352-7361)。但如果S基因是带有琥珀突变的缺陷型基因S(-)，S(-)基因在细胞中将不表达，此时细胞正常生长，并且可以在细胞内积累基因R和Rz的产物。将积累了R和Rz产物的细胞用2％氯仿，或者冻融处理，则可以使细胞裂解(Crabtree et al，J.Bacteriol.，1984.158(1)：354-356)。氯仿和冻融处理的作用相当于S基因产物的功能，即破坏细胞膜，让R和Rz的酶可以到达细胞壁的肽聚糖层，从而裂解细胞。但到目前为止，无论是克隆SRRz还是克隆S(-)RRz用于破碎细胞均未见实际应用例子的报道。

本发明的目的是将上游的基因工程技术与下游的发酵技术和后处理技术结合在一起，提出一种新型的制备聚-β-羟基丁酸酯的方法，即：构建既含PHB合成基因又含λ噬菌体裂解基因的基因工程菌，使该菌既具有大量积累PHB的能力，又具有可诱导裂解的特性，从而可简化PHB的分离方法以制备PHB。由于在重组大肠杆菌中，PHB的积累是伴随细胞的生长进行的，在稳定生长期时达到最大。如果用克隆λ噬菌体的裂解基因SRRz来裂解细胞、分离目的产品PHB时，就存在着产品积累量最大与细胞裂解效率最高的矛盾。所以，本发明选择使用带有琥珀突变的缺陷型裂解基因S(-)RRz，而不是本来的裂解基因SRRz，将裂解基因S(-)RRz和PHB的合成基因克隆入同一宿主菌中。发酵培养该宿主菌，当菌体中PHB积累达到最大时，用外加的条件模拟S基因产物的功能，以改变细胞膜的通透性，使R和Rz的酶可以穿过细胞膜到达细胞壁的肽聚糖层，从而裂解细胞，释放PHB颗粒。用裂解基因S(-)RRz代替本来的裂解基因SRRz解决了细胞中PHB积累量最大与细胞裂解效率最高的矛盾。

本发明研究的制备聚-β-羟基丁酸酯的方法，由以下各步骤组成：

(1)从λ(sam7 cI857)噬菌体的DNA上分离出含裂解基因S(-)RRz的DNA片段，将此片段插入质粒载体中，大量扩增质粒；

(2)从含裂解基因S(-)RRz的质粒载体上分离出含裂解基因S(-)RRz的DNA片段，从含PHB合成基因的质粒载体上分离出含PHB合成基因的DNA片段，连接上述两种DNA片段，构建既含裂解基因S(-)RRz又含PHB合成基因的质料；

(3)将既含裂解基因S(-)RRz又含PHB合成基因的质粒转入大肠杆菌中，构建既具有大量积累PHB的能力又具有可诱导裂解特性的基因工程大肠杆菌；

(4)在含葡萄糖的培养基中培养此基因工程大肠杆菌，使细胞既积累PHB又积累裂解基因R和Rz的产物。培养条件为：pH＝5.0-7.5，摇瓶转速150-220r/min，温度32-40℃。当细胞生长进入稳定期，细胞中PHB积累量达到最大时，4000-8000r/min离心10-20min，收获细胞：

(5)用外加的条件模拟S基因产物的功能处理细胞，诱导细胞裂解。模拟S基因产物功能的方法可以是物理法如对细胞冻融，或者是化学法如用含螯合剂的缓冲液重悬细胞等，目的是改变细胞膜的通透性，使R和Rz的酶可以穿过细胞膜到达细胞壁的肽聚糖层，从而裂解细胞。

(6)细胞裂解液4000-8000r/min离心10-20min，收集沉淀。沉淀用表面活性剂溶液洗涤，4000-8000r/min离心10-20min，收集沉淀，烘干，即可得PHB产品，纯度可达99％以上。

利用本发明的方法构建的既含PHB合成基因又含λ噬菌体裂解基因S(-)RRz的基因工程菌，既具有大量积累PHB的能力，又具有可诱导裂解的特性。在含葡萄糖的培养基中摇瓶培养时细胞中PHB的含量可达占菌体干重的60％以上，并且培养液中不用添加诱导裂解基因表达的昂贵诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)。培养后所得的细胞可很容易地用含螯合剂的缓冲液诱导，使细胞裂解，细胞的裂解率接近100％。细胞诱导裂解后，离心分离沉淀，可初步纯化细胞中的PHB。进一步用SDS溶液洗涤沉淀，可将PHB的纯度提高到99％以上。

与传统的微生物发酵制备PHB的方法相比，本发明将PHB的发酵和分离结合在一起，具有许多的优点，可避免传统的微生物发酵制备PHB的方法中带来的PHB分离困难的问题，如：可避免机械法所需的昂贵设备所带来的费用问题；可避免化学试剂法所带来的试剂回收、环境污染以及对PHB分子的降解问题。与酶法相比，本方法具有操作简单、细胞裂解控制方便、不需加入外源酶等优点。

另外，本发明所创建的利用克隆λ噬菌体裂解基因S(-)RRz和目的产品基因构建基因工程菌来发酵生产、进而诱导细胞裂解以破细胞壁分离胞内产物的方法，在其它基因工程产品的制备中同样具有广阔的推广和应用前景。

附图说明：

图1λ噬菌体裂解基因S(-)RRz的基因谱图。

图2质粒pUC18的基因谱图。

图3质粒pUC18-S(-)RRz的基因谱图。

图4质粒pTZ18u-PHB的基因谱图。

图5质粒pTU9的基因谱图。

图6不同IPTG浓度的LBG培养基培养后大肠杆菌JM109(pTU9)细胞用缓冲液A诱导时浊度变化的比较。

图7大肠杆菌JM109(pTU9)细胞用缓冲液A诱导前后的电镜观察。

(a)诱导前(放大倍数：13000×)

(b)诱导后(放大倍数：2000×)

图8质料pTU14的基因谱图。

图9不同IPTG浓度的LBG增养基中增养后大肠杆菌JM109(pTU14)细胞用缓冲液A诱导时浊度变化的比较。

图10大肠杆菌JM109(pTU14)细胞用缓冲液A诱导前后的电镜观察。

(a)诱导前(放大倍数：13000×)

(b)诱导后(放大倍数：2000×)

图11大肠杆图JM109(pTZ18u-PHB)、大肠杆菌JM109(pTU9)、大肠杆菌JM109(pTU14)细胞用缓冲液A诱导时浊度变化的比较。

图12大肠杆菌JM109(pTZ18u-PHB)用缓冲液A诱导前后的电镜观察。

(a)诱导前(放大倍数：13000×)

(b)诱导后(放大倍数：13000×)

图13缓冲液A诱导后的大肠杆菌JM109(pTU14)细胞沉淀再用SDS作用后PHB纯度的变化。

下面介绍本发明的实施例：

实施例1：

(1)λ(sam7 c1857)噬菌体DNA长度为48502bp，首先用限制性内切酶EcoRI酶切λ(sam7 c1857)DNA，分成长度分别为21226，7421，5804，5643，4878，3530bp的六部分。

酶切反应条件为：温度37℃，时间1.5h，酶及DNA的用量比为：

质粒或DNA 5μg

缓冲液(10×) 5μl

限制性内切酶 10U

其余体积用去离子水补允

总体积为50μl

用DNA的琼脂糖凝胶电泳法(J.萨姆布鲁克等著，分子克隆实验指南。科学出版社，1996，304-324)分离出长度为3530bp的DNA片段。然后用限制性内切酶Cla I酶切长度为3530bp的DNA片段(酶切反应条件同上)，分成长度为1466bp和2064bp的两段，裂解基因S(-)RRz位于长度为1466bp的DNA片段上(图1)，用DNA的琼脂糖凝胶电泳法分离该片段。

用限制性内切酶AccI和EcoR I酶切质料pUC18(酶切反应条件同上)，Acc I和EcoR I的酶切位点位于质粒pUC18的多克隆位点上(图2)。然后用DNA的琼脂糖凝胶电泳法分离酶切后的pUC18的DNA。用T4 DNA连接酶连接含裂解基因S(-)RRz的DNA片段到酶切后的pUC18的DNA上(J.萨姆布鲁克等著，分子克隆实验指南。科学出版社，1996，34-49)，得到一新的质粒，命名为pUC18-S(-)RRz大小为4119bp(图3)。

将此质粒转入大肠杆菌JM109中(J.萨姆布鲁克等著，分子克隆实验指南。科学出版社，1996，49-56)，构建基因工程大肠杆菌JM109(pUC18-S(-)RRz)。在5ml含100μg/ml氨苄的LB培养基(酵母浸出粉5g/L，NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L；pH＝7.0)中接入大肠杆菌JM109(pUC18-S(-)RRz)的一个单菌落，220r/min，37℃培养10h，然后以1％接种量接种于100ml含100μg/ml氨苄的LB培养基中，摇瓶的容积为250ml。37℃，220r/min培养6h，大量制备质粒pUC18-S(-)RRz(J.萨姆布鲁克等著，分子克隆实验指南。科学出版社，1996，24-28)。

(2)用限制性内切酶Hind III和Ssp I酶切含PHB合成基因的质粒pTZ18u-PHB(图4)，然后用DNA的琼脂糖凝胶电泳法分离出含PHB合成基因的DNA片段；用限制性内切酶Sca I和Hind III酶切质粒pUC18-S(-)RRz，然后用DNA的琼脂糖凝胶电泳法分离出含裂解基因S(-)RRz的DNA片段；用T4 DNA连接酶连接上述两种DNA片段，得到既含裂解基因S(-)RRz又含PHB合成基因的质粒，命名为pTU9，大小为10.5kb(图5)。

(3)将质粒pTU9转入大肠杆菌JM109中(J.萨姆布鲁克等著，分子克隆实验指南。科学出版社，1996，49-56)，构建既具有大量积累PHB的能力又具有可诱导裂解特性的基因工程大肠杆菌JM109(pTU9)。

(4)在5ml含100μg/ml氨苄的LB培养基中接入大肠杆菌JM109(pTU9)的一个单菌落，220r/min，37℃增养10h，然后以1％接种量接种于100ml含100μg/ml氨苄和IPTG浓度分别为(0，0.1，0.3，0.5mmol/L)的LBG培养基(LB培养基中加入20g/L葡萄糖)中，摇瓶的容积为250ml。37℃，220r/min培养12h后，6000r/min，离心10min收集细胞，细胞中PHB的含量可达占菌体干重的40％以上。

(5)将细胞重悬于含螯合剂EDTA的缓冲液A(2mmol/L EDTA.50mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)，pH＝8.0)中，使初始O.D.600nm值约为7，220r/min，37℃诱导细胞裂解。结果表明，用缓冲液A诱导20min后，细胞全部裂解。

图6为细胞重悬于缓冲液A中后菌悬液浊度变化的时间曲线。从图中可看出，培养基中IPTG浓度对培养后细胞的诱导裂解几乎没有影响。用扫描电镜观察用缓冲液A诱导前后细胞的形态，结果也表明，即使在不添加IPTG的增养基中培养后的细胞，诱导裂解20min后，溶液中没有完整的细胞存在，细胞的裂解率接近100％，如图7所示。图7中的白斑是PHB颗粒，图7(a)为缓冲液A诱导前的情况：细胞保持完整的细胞形态，PHB颗粒保留在细胞中；图7(b)为缓冲液A诱导后的情况：没有完整的细胞存在，PHB颗粒从细胞中释放出来。IPTG是一种昂贵的试剂，不加IPTG，对降低成本是有利的。

实施例2

(1)同实施例1的(1)。

(2)同实施例1的(2)，只是用限制性内切酶Pvu II代替Sca I酶切质粒pUC18-S(-)RRz，所得到的既含裂解基因S(-)RRz又含PHB合成基因的质粒，命名为pTU14，大小为9.0kb(图8)。

(3)将质粒pTU14转入大肠杆菌JM109中(J.萨姆布鲁克等著，分子克隆实验指南。科学出版社，1996，49-56)，构建既具有大量积累PHB的能力又具有可诱导裂解特性的基因工程大肠杆菌JM109(pTU14)。

(4)在5ml含100μg/ml氨苄的LB培养基中接入大肠杆菌JM109(pTU14)的一个单菌落，220r/min，37℃培养10h，然后以1％接种量接种于100ml含100μg/ml氨苄和IPTG浓度分别为(0，0.1，0.3，0.5mmol/L)的LBG培养基中，摇瓶的容积为250ml。37℃，220r/min培养12h后，6000r/min，离心10min收集细胞，细胞中PHB的含量可达占菌体干重的48％。

(5)将细胞重悬于缓冲液A中，使初始O.D.600nm值约为8.3，220r/min，37℃诱导细胞裂解。结果表明，用缓冲液A诱导20min后，细胞全部裂解。

图9为细胞重悬于缓冲液A中后菌悬液浊度变化的时间曲线。从图中可看出，培养基中IPTG浓度对培养后细胞的诱导裂解几乎没有影响。用扫描电镜观察用缓冲液A诱导前后细胞的形态，结果也表明，即使在不添加IPTG的培养基中培养后的细胞，诱导裂解20min后，溶液中没有完整的细胞存在，细胞的裂解率接近100％，如图10所示。图10中的白斑是PHB颗粒，图10(a)为缓冲液A诱导前的情况：细胞保持完整的细胞形态，PHB颗粒保留在细胞中；图10(b)为缓冲液A诱导后的情况：没有完整的细胞存在，PHB颗粒从细胞中释放出来。

实施例3

在实施例2构建的既具有大量积累PHB的能力又具有可诱导裂解特性的基因工程大肠杆菌JM109(pTU14)的基础上，本实施例研究用氯仿作用的化学法来模拟S基因产物的功能，以诱导细胞裂解。

在5ml含100μg/ml氨苄的LB培养基中接入大肠杆菌JM109(pTU14)的一个单菌落，220r/min，37℃培养10h，然后以1％接种量接种于100ml含100μg/ml氨苄的LBG培养基中，摇瓶的容积为250ml。37℃，220r/min培养12h后，细胞生长进入稳定期，在细胞培养液中加2ml氯仿，37℃，220r/min继续培养，1h后用显微镜观察，没有完整的细胞存在，细胞的裂解率接近100％。

实施例4

在实施例2构建的既具有大量积累PHB的能力又具有可诱导裂解特性的基因工程大肠杆菌JM109(pTU14)的基础上，本实施例研究用冻融作用的物理法来模拟S基因产物的功能，以诱导细胞裂解。

在5ml含100μg/ml氨苄的LB培养基中接入大肠杆菌JM109(pTU14)的一个单菌落，220r/min，37℃培养10h，然后以1％接种量接种于100ml含100μg/ml氨苄的LBG培养基中，摇瓶的容积为250ml。37℃，220r/min培养12h后，细胞生长进入稳定期，将细胞培养液在-20℃的冰箱中冷冻10h后，于37℃，220r/min使之完全融化，1h后用显微镜观察，没有完整的细胞存在，细胞的裂解率接近100％。

实施例5

本实施例对实施例1和实施例2的带裂解基因与不带裂解基因的大肠杆菌JM109细胞用缓冲液A诱导后细胞的裂解特性进行比较，目的是说明细胞的裂解是因为细胞中积累了裂解基因R和Rz的产物所致。

将只含PHB合成基因的质粒pTZ18u-PHB转入大肠杆菌JM109中(J.萨姆布鲁克等著，分子克隆实验指南。科学出版社，1996，49-56)，构建产PHB的基因工程大肠杆菌JM109(pTZ18u-PHB)。

将大肠杆菌JM109(pTZ18u-PHB)和在实施例1和2中构建的大肠杆菌JM109(pTU9)和大肠杆菌JM109(pTU14)分别在LBG培养基中培养：在5ml含100μg/ml氨苄的LB培养基中接入一个单菌落，220r/min，37℃培养10h，然后以1％接种量接种于100ml含100μg/ml氨苄的LBG培养基中，摇瓶的容积为250ml。37℃，220r/min培养12h后，6000r/min，离心10min收集细胞。大肠杆菌JM109(pTZ18u-PHB)细胞中PHB的含量可达占菌体干重的50％。

6000r/min，离心10min分别收集大肠杆菌JM109(pTZ18u-PHB)、大肠杆菌JM109(pTU9)和大肠杆菌JM109(pTU14)的细胞。将细胞分别重悬于缓冲液A中，220r/min，37℃诱导细胞裂解，诱导后大肠杆菌JM109(pTZ18u-PHB)细胞悬液浊度的降低较大肠杆菌JM109(pTU9)和大肠杆菌JM109(pTU14)小得多(图11)。扫描电镜观察的结果也表明，大肠杆菌JM109(pTZ18u-PHB)细胞用缓冲液A处理20min后，细胞仍保持完整的细胞形态，如图12所示。图12中的白斑是PHB颗粒，图12(a)为缓冲液A诱导前的情况，细胞保持完整的细胞形态，PHB颗粒保留在细胞中；图12(b)为缓冲液A诱导后的情况：细胞保持完整的细胞形态，PHB颗粒保留在细胞中。这也说明，导致细胞裂解的内因是裂解基因S(-)RRz在细胞中表达，积累了基因R和Rz的产物，缓冲液A的作用只是模拟S基因产物的功能，是导致细胞裂解的外因。

实施例6

本实施例的目的是考察实施例2构建的大肠杆菌JM109(pTU14)细胞在含葡萄糖的丰富培养基中培养后，细胞中PHB含量更高的情况下，细胞的诱导裂解特性。

在5ml含100μg/ml氨苄的LB培养基中接入大肠杆菌JM109(pTU14)的一个单菌落，220r/min，37℃培养10h，然后以1％接种量接种于100ml含100μg/ml氨苄的增养基C(酵母浸出粉1.0g/L，蛋白胨5.0g/L，牛肉膏3.0g/L，NaCl5.0g/L，葡萄糖20g/L)中，220r/min，37℃培养16h后，细胞中PHB的含量可达占菌体干重的60％以上。6000r/min，离心10min收集细胞。将细胞重悬于缓冲液A中，使初始O.D.600nm值约为10，220r/min，37℃诱导细胞裂解，20min后，没有完整的细胞存在，PHB颗粒从细胞中释放出来，细胞的裂解率接近100％。

实施例7

本实施例的目的是考察由实施例2构建的不同PHB含量在大肠杆菌JM109(pTU14)细胞，用缓冲液A诱导后的诱导裂解特性以及细胞裂解后细胞中非PHB杂质的去除情况。

大肠杆菌JM109(pTU14)培养时，培养液中所能达到的细胞浓度以及细胞中PHB的含量与培养条件如接种量、摇瓶转速等有关。对不同条件下培养所得的不同PHB含量的细胞分别用缓冲液A诱导，在20min内细胞均可以完全裂解，这说明细胞中积累的PHB对细胞的裂解没有影响。

细胞用缓冲液A诱导裂解后，细胞中的一些非PHB成份在此过程中溶解在缓冲液A中，6000r/min，离心10min去除上清液后，可初步纯化细胞中的PHB，结果如表1所示。诱导前细胞中PHB的含量越高，诱导后所获得的沉淀中PHB的含量也越高。表1不同PHB含量的细胞用缓冲液A诱导后PHB含量变化的比较诱导前细胞中PHB 诱导后沉淀后细胞中非PHB物质的含量P_PHBO(％) PHB的含量P_PHB(％) 的去除率θ(％)

41.10 69.03 68.69

43.23 71.72 69.95

46.29 74.70 70.81

60.61 85.15 73.17

66.07 90.53 79.63

非PHB杂质的去除率θ定义为：

实施例8

本实施例的目的是在实施例7的基础上研究从裂解后的细胞中进一步纯化PHB的方法，以获得高纯度的PHB产品。

在5ml含100μg/ml氨苄的LB培养基中接入大肠杆菌JM109(pTU14)的一个单菌落，220r/min，37℃培养10h，然后以5％接种量接种于50ml含100μg/ml氨苄的培养基C中，220r/min，37℃培养16h后，菌体浓度为4.25g/L，细胞中PHB的含量可达占菌体干重的66％。6000r/min，离心10min收集细胞。将细胞用25ml缓冲液A悬浮，使干菌浓度为8.5g/L，220r/min，37℃处理20min，诱导细胞裂解。6000r/min，离心10min分离沉淀，沉淀中PHB含量可提高到90.5％。沉淀进一步用不同浓度的SDS溶液220r/min，37℃作用10min后，6000r/min，离心10min分离沉淀，可进一步纯化PHB，结果如图13所示，当SDS用量为4g/L时，可得到纯度为99.66％的PHB。

Claims

1、一种制备聚-β-羟基丁酸酯的方法，其特征在于由以下各步骤组成：

(1)从λ(sam7 cI857)噬菌体的DNA上分离出含裂解基因S(-)RRz的DNA片段，将此片段插入质粒载体中，扩增质粒；

(2)从含裂解基因S(-)RRz的质粒载体上分离出含裂解基因S(-)RRz的DNA片段，从含PHB合成基因的质粒载体上分离出含PHB合成基因的DNA片段，连接上述两种DNA片段，构建既含裂解基因S(-)RRz又含PHB合成基因的质粒；

(3)将既含裂解基因S(-)RRz又含PHB合成基因的质粒转入大肠杆菌中，构建既具有积累PHB的能力又具有可诱导裂解特性的基因工程大肠杆菌；

(4)在含葡萄糖的培养基中培养此基因工程大肠杆菌，使细胞既积累PHB又积累裂解基因R和Rz的产物，培养条件为：pH＝5.0-7.5，摇瓶转速150-220r/min，温度32-40℃，然后4000-8000r/min离心10-20min，收获细胞；

(5)用外加的条件模拟S基因产物的功能处理细胞，诱导细胞裂解，模拟S基因产物功能的方法为细胞冻融，或者为用含螯合剂的缓冲液重悬细胞，改变细胞膜的通透性，使R和Rz的酶穿过细胞膜到达细胞壁的肽聚糖层，从而裂解细胞；

(6)细胞裂解液4000-8000r/min离心10-20min，收集沉淀，沉淀用表面活性剂溶液洗涤，4000-8000r/min离心10-20min，收集沉淀，烘干，即得PHB产品。