CN108409635A - 一种咔唑类荧光胸腺嘧啶类药物标记试剂、合成与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及咔唑类荧光胸腺嘧啶类药物标记试剂、合成与应用，以咔唑为荧光母体环，苄基氯为反应活性基团，其化学名称为：4‑(9H‑咔唑‑9‑基)苄氯。本发明所述的新型的稳定咔唑类荧光胸腺嘧啶类药物标记试剂可以在温和条件下准确、灵敏、快速地标记胸腺嘧啶类药物，从而实现复杂体系中微量、痕量胸腺嘧啶类药物的分离与检测，可用于环境分析、食品安全等研究领域中，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于有机小分子胸腺嘧啶类药物荧光标记技术领域，具体涉及一种新型的稳定咔唑类荧光胸腺嘧啶类药物标记试剂及其合成方法与应用。
背景技术
胸腺嘧啶类药物是一系列不同取代基的硫脲类衍生物。该类药物可降低甲状腺激素的产生，抑制正常代谢，降低胃肠动力，增加皮下和肌肉组织以及胃肠道的保水能力，增加动物的体重，被广泛应用于动物养殖中。因此食物品质变得恶劣，含有该类药物残留的食物也因此对人体健康造成潜在的危害。快速准确地测定胸腺嘧啶类药物残留对于环境化学、食品安全具有重要的意义。该类药物不具备荧光发光性质，基于质谱检测平台的检测方法干扰比较多，但是该类药物极性比较大，反相色谱保留行为能力差，基质干扰比较强，因此要提高该类药物的检测灵敏度，改善其在反相色谱分析中的保留行为，通过化学衍生技术，引入荧光团与疏水性结构，是实现该类药物荧光检测，改善其反相色谱保留行为的有效途径。然而，尚未见化学荧光衍生-高效液相色谱荧光分析在该类药物检测中的报道。因此，开发一种化学荧光衍生-高效液相色谱荧光分析策略应用于该类药物检测具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是应用胸腺嘧啶类药物在pH＝8.0的碱性条件下，分子中的“C＝S”键异构化为“C－SH”的性质，通过对胸腺嘧啶药物异构化结构中“－SH”(巯基)与标记试剂的反应，实现对该类药物的高效标记，进而实现对胸腺嘧啶类药物的高效液相-荧光分析。本发明同时提供其合成方法与应用。
本发明所述的新型的稳定咔唑类荧光胸腺嘧啶类药物标记试剂，是以咔唑为荧光母体环，以苄基氯为反应活性基团，其化学名称为：4-(9H-咔唑-9-基)苄氯，其化学结构式为：
所述的新型的稳定咔唑类荧光胸腺嘧啶类药物标记试剂的合成方法，包括以下步骤：
(1)第一步取代反应：将咔唑、4-溴苄醇溶解到二甲亚砜中，加入碘化亚铜、二叔戊酰甲烷和碳酸钾，油浴130℃反应过夜，反应结束后，待反应液冷却至室温，抽滤，然后将抽滤液与(10-30)wt％NaCl水溶液混合析出固体，回收固体并干燥，用乙腈重结晶，得到中间体(4-(9H-咔唑-9-基)苯基)甲醇；
(2)第二步氯代反应：将中间体(4-(9H-咔唑-9-基)苯基)甲醇溶解于二氯甲烷中，滴加少量三乙胺作催化剂，将二氯亚砜逐滴加到上述溶液中，室温下反应4小时，反应结束后，减压蒸干除去溶剂，将固体用乙腈重新溶解，然后将溶液与(10-30)wt％NaCl水溶液混合析出固体，回收固体并干燥，用乙腈重结晶，得到目标产物4-(9H-咔唑-9-基)苄氯。
其中：
步骤(1)中咔唑与4-溴苄醇摩尔比为1:1.2，碘化亚铜、二叔戊酰甲烷和碳酸钾的加入量分别为咔唑质量的25％、22％和50％。
步骤(1)中反应温度为130℃，反应时间为24h。
采用乙腈将步骤(1)中所得中间体(4-(9H-咔唑-9-基)苯基)甲醇重结晶3次，得到白色针状结晶产品。
步骤(2)中(4-(9H-咔唑-9-基)苯基)甲醇与二氯亚砜的摩尔比为1:1.3，三乙胺的加入量为(4-(9H-咔唑-9-基)苯基)甲醇质量的3.5％。
步骤(2)中，在室温条件下，反应时间为4h。
采用乙腈将步骤(2)中所得目标产物4-(9H-咔唑-9-基)苄氯重结晶2次，得到白色针状结晶产品。
所述的新型的稳定咔唑类荧光胸腺嘧啶类药物标记试剂的应用：检测样品中微量、痕量胸腺嘧啶类药物的含量。
具体包括以下步骤：
(1)配制pH值为8.0的磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲溶液，并用于配制5份胸腺激素嘧啶药物标准品的溶液，浓度分别为1μM、10μM、100μM、1mM、10mM；配制浓度为100mM的4-(9H-咔唑-9-基)苄氯的乙腈溶液；
(2)依次将100μL胸腺嘧啶类药物标准品的溶液和50μL 4-(9H-咔唑-9-基)苄氯的乙腈溶液加到2mL的安剖瓶中，于40℃的水浴中反应15min，反应完毕后，加入100μL稀盐酸(0.1mol/L),取10μL进行高效液相-荧光分析，以胸腺嘧啶类药物浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制胸腺嘧啶类药物浓度工作曲线；
(3)将样品用(4-(9H-咔唑-9-基)苄氯标记后，进行高效液相色谱-荧光分析，将所得到的峰面积代入胸腺嘧啶类药物浓度工作曲线中，即可求得样品中胸腺嘧啶类药物的浓度。
本发明的有益效果如下：
本发明试剂荧光最大激发波长与发射波长分别在365nm与400nm，可以对胸腺嘧啶类药物的进行荧光标记，改善该类药物在反向色谱中的保留行为，实现对该类药物的高效液相-荧光检测。该试剂以咔唑为荧光母体环，苄基氯为反应活性基团，其合成步骤简便，易于操作，两步反应即可实现高产率合成：(1)将咔唑与4-溴苄醇进行反应，得到中间体得到中间体(4-(9H-咔唑-9-基)苯基)甲醇；(2)将中间体(4-(9H-咔唑-9-基)苯基)甲醇与二氯亚砜反应，得到目标产物4-(9H-咔唑-9-基)苄氯，经乙腈重结晶2次，得到白色针状结晶体。本发明荧光标记试剂化学性质稳定，化学纯度达99.5％。
本发明所述的新型的稳定咔唑类荧光胸腺嘧啶类药物标记试剂是以咔唑为荧光母体环，以苄基氯为活性基团。苄基氯在标记胸腺嘧啶类药物时，标记条件温和、标记时间短、标记产率高。因此，本发明所述的标记试剂可以快速、准确、灵敏地标记胸腺嘧啶类药物，尤其适用于复杂体系中微量、痕量胸腺嘧啶类药物的分离检测，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是实施例1制备4-(9H-咔唑-9-基)苄氯的合成路线图。
图2是实施例1 4-(9H-咔唑-9-基)苯氯的核磁1HNMR图。
图3是实施例2标记试剂与2-硫脲嘧啶标记产物的高线液相-荧光激发在线光谱图。
图4是实施例2标记试剂与2-硫脲嘧啶标记产物的高效液相-荧光发射在线光谱图。
图5是实施例2标记试剂与胸腺嘧啶类药物的反应路线图。
图6是实施例2标记试剂衍生5种胸腺嘧啶类药物标准品的色谱分离图
A：2-硫脲嘧啶；B：6-甲基-2-硫脲嘧啶；C：6-丙基-2-硫脲嘧啶：D：6-苯基-2-硫脲嘧啶；
E：6-苄基-2-硫脲嘧啶；R：4-(9H-咔唑-9-基)苄氯。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
1、(4-(9H-咔唑-9-基)苯基)甲醇的制备
250mL三口烧瓶中加入10g咔唑，13.3g4-溴苄醇，5g碳酸钾、2.5g碘化亚铜与3mL二叔戊酰甲烷，加入150mL二甲亚砜作为溶剂，油浴130℃反应过夜；反应结束后，待反应液冷却至室温，抽滤，然后将抽滤液与15wt％NaCl水溶液混合析出固体，回收固体并干燥，用乙腈重结晶3次，得到中间体(4-(9H-咔唑-9-基)苯基)甲醇，收率为82％。
2、目标产物4-(9H-咔唑-9-基)苄氯的制备
向100ml配有电磁搅拌的单口圆底烧瓶中加入7.5g(4-(9H-咔唑-9-基)苯基)甲醇，用20mL二氯甲烷完全溶解,加少量三乙胺做催化剂,然后将30mL二氯亚砜逐滴加入到上述溶液中，滴加完毕，在室温下反应4小时，反应结束后，减压蒸干除去溶剂，将固体用乙腈重新溶解，然后将溶液与10wt％NaCl水溶液混合析出固体，回收固体并干燥，用乙腈重结晶2次，得到目标产物4-(9H-咔唑-9-基)苄氯，产率为80％。
目标产物的表征数据如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.13(d,J＝7.6Hz,2H),7.64–7.57(m,3H),7.56–7.50(m,1H),7.44–7.34(m,4H),7.30–7.24(m,2H),5.42(s,1H),4.72(s,1H).
Found:C 78.22,H 4.80,N 4.80,C12.18；Calculated:C 78.21,H 4.84,N 4.80,Cl 12.15.
实施例2
实现对胸腺嘧啶类药物的荧光标记与检测，除确保胸腺嘧啶类药物分子中的“C＝S”键完全异构化为“C－SH”外，准确的获得荧光标记试剂的最大激发与最大发射波长是提高检测灵密度的关键。利用胸腺嘧啶类药物在pH＝8.0的碱性条件下，分子中的“C＝S”键异构化为“C－SH”的性质，可以确保胸腺嘧啶类药物分子中的“C＝S”键完全异构化为“C－SH”。为获得检测的最大激发与发射波长，用浓度1μM的4-(9H-咔唑-9-基)苄氯溶液对2-硫脲嘧啶标准品溶液进行标记，然后进行高相液相-荧光分析，获得标记产物的最大激发波长为365nm，最大发射波长为400nm。同时对2-硫脲嘧啶的4-(9H-咔唑-9-基)苄氯标记产物进行高效液相-紫外检测(设置紫外吸收波长254nm)，在标记产物中没有发现未标记的2-硫脲嘧啶，进一步说明2-硫脲嘧啶中“C＝S”键完全异构化为“C－SH”以及完全的标记。
实施例3
(1)利用4-(9H-咔唑-9-基)苄氯荧光标记检测牛奶中胸腺嘧啶类药物含量，配制pH＝8.0的磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲溶液，并用于配制5份胸腺嘧啶类药物标准品的溶液，浓度分别为1μM、10μM、100μM、1mM、10mM；配制浓度为100mM的4-(9H-咔唑-9-基)苄氯的乙腈溶液；
(2)依次将100μL胸腺嘧啶类药物标准品的溶液和50μL 4-(9H-咔唑-9-基)苄氯的乙腈溶液加到2mL的安剖瓶中，于40℃的水浴中反应15min，反应完毕后，加入100μL稀盐酸(0.1mol/L),取10μL进行高效液相-荧光分析，以胸腺嘧啶类药物浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制胸腺嘧啶类药物浓度工作曲线；
(3)牛奶样品中加入乙腈萃取，然后离心取上清液，上清液用N2吹干，固体用pH＝8.0的磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲溶液重新溶解，然后用银离子固相萃取小柱富集，经银离子固相小柱富集之后的样品按照(2)中描述的方法进行标记，标记完成后，进行高效液相色谱-荧光分析，将所得到的峰面积代入工作曲线中，即可求得牛奶中胸腺嘧啶类药物的含量。
Claims (8)
1.一种咔唑类荧光胸腺嘧啶类药物标记试剂，其特征在于：以咔唑为荧光母体环，苄基氯为反应活性基团，其化学名称为：4-(9H-咔唑-9-基)苄氯，其化学结构式为：
。
2.合成如权利要求1所述的咔唑类荧光胸腺嘧啶类药物标记试剂的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)将咔唑与4-溴苄醇进行反应，得到中间体(4-(9H-咔唑-9-基)苯基)甲醇；(2)将中间体(4-(9H-咔唑-9-基)苯基)甲醇与二氯亚砜反应，得到目标产物4-(9H-咔唑-9-基)苄氯。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)是取代反应，将咔唑、4-溴苄醇溶解到二甲亚砜中，加入碘化亚铜、二叔戊酰甲烷和碳酸钾，油浴130℃反应24h，反应结束后，待反应液冷却至室温，抽滤，然后将抽滤液与(10-30)wt％NaCl水溶液混合析出固体，回收固体并干燥，用乙腈重结晶，得到中间体(4-(9H-咔唑-9-基)苯基)甲醇；优选的是，采用乙腈将步骤(1)中所得中间体(4-(9H-咔唑-9-基)苯基)甲醇重结晶3次，得到白色针状结晶产品。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(1)反应中，咔唑与4-溴苄醇摩尔比为1:1.2，碘化亚铜、二叔戊酰甲烷和碳酸钾的加入量分别为咔唑质量的25％、22％和50％。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(2)是氯代反应，将中间体(4-(9H-咔唑-9-基)苯基)甲醇溶解于二氯甲烷中，滴加少量三乙胺作催化剂，将二氯亚砜逐滴加到上述溶液中，室温下反应4小时，反应结束后，减压蒸干除去溶剂，将固体用乙腈重新溶解，然后将溶液与(10-30)wt％NaCl水溶液混合析出固体，回收固体并干燥，用乙腈重结晶，得到目标产物4-(9H-咔唑-9-基)苄氯；优选的是采用乙腈将步骤(2)中所得目标产物4-(9H-咔唑-9-基)苄氯重结晶2次，得到白色针状结晶产品。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(2)反应中，(4-(9H-咔唑-9-基)苯基)甲醇与二氯亚砜的摩尔比为1:1.3，三乙胺的加入量为(4-(9H-咔唑-9-基)苯基)甲醇质量的3.5％。
7.如权利要求1所述咔唑类荧光胸腺嘧啶类药物标记试剂在检测样品中胸腺嘧啶类药物的含量中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：包括以下步骤：
(1)配制pH值为8.0的磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲溶液，并用于配制5份胸腺激素嘧啶药物标准品的溶液，浓度分别为1μM、10μM、100μM、1mM、10mM；配制浓度为100mM的4-(9H-咔唑-9-基)苄氯的乙腈溶液；
(2)依次将100μL胸腺嘧啶类药物标准品的溶液和50μL 4-(9H-咔唑-9-基)苄氯的乙腈溶液加到2mL的安剖瓶中，于40℃的水浴中反应15min，反应完毕后，加入100μL稀盐酸(0.1mol/L),取10μL进行高效液相-荧光分析，以胸腺嘧啶类药物浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制胸腺嘧啶类药物浓度工作曲线；
(3)将样品用4-(9H-咔唑-9-基)苄氯标记后，进行高效液相色谱-荧光分析，将所得到的峰面积代入胸腺嘧啶类药物浓度工作曲线中，即可求得样品中胸腺嘧啶类药物的浓度。
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| CN116217552A (zh) * | 2023-03-22 | 2023-06-06 | 曲阜师范大学 | 用于醇类化合物标记的n-苯基咔唑类荧光化合物及其合成方法与应用 |
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| US4160835A (en) * | 1976-11-19 | 1979-07-10 | Merck & Co., Inc. | Antihypertensive compositions containing an arylsubstituted alanine and a phenyl hydrazinopropionic acid |
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