CN108359600A - 一种高灵敏度、快速、绝对定量的dna片段检测系统及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高灵敏度、快速、绝对定量的DNA片段检测系统，包括DNA扩增模块，用于承载DNA扩增体系，包括至少两万个独立反应单元，每个反应单元可盛装的液体体积为小于1nL；温度控制模块，用于控制所述DNA扩增模块的反应温度；检测模块，用于激光扫描实时检测所述DNA扩增模块中的扩增结果；本发明还公开了一种高灵敏度、快速、绝对定量的DNA片段检测方法。本发明公开的检测系统和检测方法在检测DNA片段时，具有耗时短、灵敏度高和可以进行绝对定量检测的优势。
Description
技术领域
本发明属于DNA检测领域，具体涉及一种高灵敏度、快速、绝对定量的DNA片段检测系统及检测方法。
背景技术
DNA检测技术，是对DNA分子结构、含量和序列的检测和分析，是生物医药领域研究和应用的基础。DNA检测的一大挑战是获取非常稀少样本的DNA信息，如远古生物化石中的DNA，人类毛发、血液中的稀有DNA片段等，必须依赖DNA的扩增技术。聚合酶链式反应(PCR)技术是一种用于放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术。1983年，美国PE Cetus公司的Kary Mullis建立了PCR技术，随后被广泛应用于分子生物学、基因工程以及其他与DNA鉴定相关的领域。随着科学技术的不断发展，学者们对特定DNA片段，尤其是含量低的稀有DNA片段的研究，给PCR技术提出了新要求和挑战。需要开发高灵敏度、快速、绝对定量的DNA检测技术。
中国专利CN105505761A公开了一种数字等温核酸检测装置：包括微流控芯片、温控系统及压力驱动系统；微流控芯片通过基板层、设置在基板层上的通道层以及设置在通道层上方的盖片依次层合形成用于微滴生成的微流控通道和用于核酸扩增的反应区间；温控系统包括自下向上对基板层施加压力的下压板和自上向下对基板层施加压力的上压板，上压板和下压板均设置有温度传感器以及对反应区间加热的加热元件；压力驱动系统用于向微流控芯片内通道层施加压力，使待测液自流入端流入反应区内。该装置中使用微流控芯片承载DNA扩增体系，通过微流控芯片中微通道中的十字交叉或斜向交叉结构，样品在压力作用下流经微通道时，流体经上述结构的剪切作用形成微滴，然后进入反应腔内，由于微滴是以一定的速度进入反应腔内，并且微滴是连续不断的进入反应腔内，因此进入反应腔的微滴极可能相遇形成较大的液滴，使得样品的体积增大，同时检测需要在扩增结束后进行检测，而检测时使用了分辨率较低的荧光显微镜检测，综上原因使得靶DNA片段检测耗时长，检测灵敏度低，无法对样品中的DNA进行绝对定量，且微流控芯片制造工艺复杂，通量不高。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题是现有技术中等温核酸检测装置检测耗时长、灵敏度低以及无法绝对定量，进而提供一种高灵敏度、快速、绝对定量的DNA片段检测系统及检测方法。
为此本发明提供一种高灵敏度、快速、绝对定量的DNA片段检测系统，包括DNA扩增模块，用于承载DNA扩增体系，包括至少两万个独立反应单元，每个反应单元可盛装的液体体积为小于1nL；
温度控制模块，用于控制所述DNA扩增模块的反应温度；
检测模块，用于激光扫描实时检测所述DNA扩增模块中的扩增结果。
优选的，所述DNA扩增模块包括微孔阵列芯片。
优选的，所述微孔阵列芯片上设置有列阵的微孔，所述微孔为蜂窝状排列。
优选的，所述DNA扩增模块还包括芯片底座和上盖，所述芯片底座中部设置有凹槽，所述微孔阵列芯片放置于所述凹槽内，所述上盖放置在所述微孔阵列芯片上。
优选的，所述芯片底座为铝材料，所述上盖为透明玻璃片。
优选的，所述温度控制模块为温度控制样品池，包括：
底座，所述底座开设有通孔；
透明视窗，安装在所述通孔内；
加热陶瓷，设置在所述透明视窗两侧的所述底座上；
所述温度控制样品池还包括热电偶，安装在所述底座上，与所述加热陶瓷连接，用于监测所述温度控制样品池内的温度。
优选的，所述温度控制样品池还包括盖体，所述盖体的一侧插接在所述底座上，与所述底座形成一个密闭的内腔，所述透明视窗，加热陶瓷和热电偶均设置在所述内腔中。
优选的，所述透明视窗材质为玻璃或聚甲基丙烯酸甲酯中的一种。
优选的，所述检测模块为激光共聚焦成像系统。
优选的，所述DNA扩增体系为LAMP扩增体系或普通PCR扩增体系中的一种。
优选的，还包括DNA提取模块，所述DNA提取模块为血液DNA提取试剂盒、组织DNA提取试剂盒、细胞DNA提取试剂盒、病毒DNA提取试剂盒、植物DNA提取试剂盒、FFPEDNA提取试剂盒、细菌DNA提取试剂盒、口腔黏膜DNA提取试剂盒、无细胞DNA提取试剂盒中的至少一种。
优选的，还包括结果分析模块，用于将检测模块得到的结果进行分析输出。
本发明提供一种数字PCR芯片，包括所述检测系统中的温度控制样品池。
本发明提供一种高灵敏度、快速、绝对定量的DNA片段检测方法，包括使用所述检测系统的步骤。
优选的，所述检测方法包括如下步骤：
S10.提取DNA；
S20.将S10步骤得到的DNA配制成所述DNA扩增体系；
S30.将DNA扩增体系装载到DNA扩增模块中；
S40将DNA扩增模块放置在所述温度控制模块中，通过所述检测模块进行检测。
优选的，所述检测方法还包括S50步骤，将S40得到的检测结果通过结果分析模块进行数据分析输出。
优选的，所述S30步骤还包括如下步骤：
S31.将微孔阵列芯片固定在底座的凹槽内；
S32.将所述DNA扩增体系的移至刮片上，推进所述DNA扩增体系并将其装载到所述微孔阵列芯片上；
S33.用密封油覆盖所述微孔阵列芯片，盖上上盖，放置到所述温度控制样品池中。
优选的，所述密封油为硅油或液体石蜡中的一种。
优选的，所述DNA扩增体系为普通PCR体系，包括靶DNA、引物、酶、荧光标记物和反应基础液；
所述S40步骤还包括如下步骤：
S41.将所述DNA扩增模块放入所述温度控制样品池中，设定扩增温度程序；
S42.将所述温度控制样品池放入所述检测模块中，每一个循环后进行一次检测，直至判断出PCR反应是否进行。
优选的，所述DNA扩增体系为LAMP体系，包括引物、酶、荧光标记物和反应基础液；所述引物包括BIP、B3、FIP、F3、LF、LB、Pr中至少四条。
所述S40步骤还包括如下步骤：
S41.将所述DNA扩增模块放入所述温度控制样品池中，设定扩增温度；
S42.将所述温度控制样品池放入所述检测模块中，每隔1-5min进行一次检测，直至判断出PCR反应是否进行。
优选的，在S41步骤中，所述DNA扩增模块放置在所述温度控制样品池中所述加热陶瓷和所述透明视窗的上表面。
本发明提供的一种高灵敏度、快速、绝对定量的DNA片段检测系统、温度控制样品池或高灵敏度、快速、绝对定量的DNA片段检测方法在DNA检测中的用途。
本发明技术方案具有如下优点：
1.本发明提供的一种高灵敏度、快速、绝对定量的DNA片段检测系统，包括DNA扩增模块，用于承载DNA扩增体系，包括至少两万个独立反应单元，每个反应单元可盛装的液体体积为小于1nL；温度控制模块，用于控制所述DNA扩增模块的反应温度；检测模块，用于实时检测所述DNA扩增模块中的扩增结果；通过控制将DNA扩增模块中包括至少两万个独立反应单元，每个反应单元可盛装的液体体积为小于1nL，控制样品的体积减少，同时保证可检测大量的样品，通量大，同时检测模块的激光扫描实时检测，检测分辨率高，通过DNA扩增模块和检测模块，从原始样本开始到得到检测结果，减少了所需靶DNA扩增倍数，节省了过量循环带来的时间消耗，整个流程耗时最短；
通过DNA扩增模块和激光扫描成像分辨率的提高来实现高灵敏度检测，DNA扩增模块每个独立反应单元内液体体积小于1nL，通过高效单元隔离、精确的控制进样和激光共聚焦成像保证了高成像分辨率(分辨率可达5微米)，显著提高了检测的灵敏度，本发明的靶DNA检测浓度可低至1ng/μL，比现有PCR检测技术高10～100倍；
通过DNA扩增模块的独立反应单元数多(至少20000)，且每个独立反应单元内液体体积小于1nL，保证每个独立反应单元内只存在一个或零个靶DNA片段，通过对每个单元的计数(0或1)，实现绝对定量。
2.本发明提供的一种高灵敏度、快速、绝对定量的DNA片段检测系统，所述DNA扩增体系为LAMP体系或普通PCR体系中的一种，能够适配多种PCR体系对DNA进行扩增。
3.本发明提供的数字PCR芯片，在检测DNA片段时，具有耗时短、灵敏度高和可以进行绝对定量检测的优势。
4.本发明提供的一种高灵敏度、快速、绝对定量的DNA片段检测方法，具有耗时短、灵敏度高和可以进行绝对定量检测的优势。
附图说明
图1为本发明实施例1中DNA扩增模块的结构示意图；
图2为本发明实施例1中DNA扩增模块的装配示意图；
图3为本发明实施例1中温度控制样品池的结构示意图；
图4为本发明实施例1中温度控制样品池的结构示意图；
图5为本发明实施例1中温度控制样品池的结构示意图
图6为本发明实施例1中激光共聚焦成像系统与温度控制样品池装配关系示意图；
图7为本发明实施例4中装载芯片后的扫描图；
图8为本发明实施例4检测结核分歧杆菌的激光共聚焦系统拍照结果；白色亮点为目标DNA分子。
附图标记说明：
1-芯片底座；2-上盖；3-微孔阵列芯片；4-盖体；5-底座；6-加热陶瓷；7-热电偶；8-透明视窗；9-温度控制样品池；10-激光共聚焦成像系统；101-激光器；102-检测器。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供一种高灵敏度、快速、绝对定量的DNA片段检测系统，包括DNA扩增模块，用于承载DNA扩增体系，包括至少两万个独立反应单元，每个反应单元可盛装的液体体积为小于1nL；温度控制模块，用于控制所述DNA扩增模块的反应温度；检测模块，用于激光扫描实时检测所述DNA扩增模块中的扩增结果。
所述DNA扩增模块，如图1和图2所示，DNA扩增模块包括芯片底座1、上盖2和微孔阵列芯片3；芯片底座1的中部设置有凹槽，用于放入微孔阵列芯片3，上盖2盖在微孔阵列芯片3上，盖合后的上盖2的上表面与芯片底座1上表面处于同一平面上，上盖2为透明玻璃片。芯片底座1采用铝材料，通过机加工制造而成，微孔阵列芯片3通过光刻蚀微纳加工技术和表面修饰技术制造而成，将其分割为大量独立反应单元，用于承载DNA扩增体系；独立反应单元为列阵的微孔，微孔呈蜂窝状排列，在本实施例中其包括两万个微孔，每个微孔可盛装的液体体积为小于1nL。DNA扩增体系优选为LAMP体系，LAMP体系由靶DNA片段、引物、荧光标记物、双蒸水、Bst DNA聚合酶和反应基础液组成。引物包含BIP、B3、FIP、F3、LF、LB中的至少一种，荧光标记物为SYBR Green I、HNB、钙黄绿素、FRET探针中的一种。反应基础液由dNTP、缓冲溶液、Mg盐等中的一种或几种组成。DNA扩增模块的装配方法为将芯片固定在芯片底座1上，将配置好的LAMP体系混合液用微量移液器移至刮片上，通过机械推进器将混合液装在到微孔阵列芯片3上的微孔中，用密封油覆盖微孔阵列芯片3，最后盖上上盖2，排除气泡，完成装配。密封油优选为硅油或液体石蜡。在本实施例中微孔阵列芯片3选择包括两万个微孔，每个微孔可盛装的液体体积为0.9nL的微孔阵列芯片。
所述温度控制模块为温度控制样品池9，如图3-图5所示，温度控制样品池9包括底座5、透明视窗8，底座5中部开设有贯通的通孔，透明视窗8嵌装在通孔内，透明视窗8的材质为玻璃或聚甲基丙烯酸甲酯中的一种，可以使光线从底座5的下方，通过透明视窗8底部到达透明视窗8的上部。在透明视窗8的左右两侧安装有加热陶瓷6，所述加热陶瓷为片状，加热陶瓷6的上表面与透明视窗8的上表面平齐。所述底座5上设有样品槽，加热陶瓷6和透明视窗8设置在所述样品槽的底面，加热陶瓷6的上表面与透明视窗8的上表面与所述样品槽的底面平齐，所述样品槽用于放置DNA扩增模块。还包括热电偶7，安装在底座5开设的槽沟内，位于透明视窗8的一侧，所述热电偶7与加热陶瓷6连接。盖体4的右侧可拆卸的插接在底座的右侧插孔内。将DNA扩增模块的芯片底座1放置在样品槽中，上盖2朝向透明视窗8一侧，盖上盖体4即可用于检测。
所述检测模块优选为激光共聚焦成像系统。进一步的，所述检测系统还包括结果分析模块，结果分析模块为计算机和数据处理软件，对检测模块输出的结果进行分析，并输出分析结果。如图6所示，将温度控制样品池9放置在激光共聚焦成像系统10上，激光器101发射出激光，通过温度控制样品池9的透明视窗8照射到微孔阵列芯片3上，激发DNA扩增反应体系的荧光，检测器102通过检测荧光进行样品检测。
进一步的，所述检测系统还包括DNA提取模块，DNA提取模块为血液DNA提取试剂盒、组织DNA提取试剂盒、细胞DNA提取试剂盒、病毒DNA提取试剂盒、植物DNA提取试剂盒、FFPEDNA提取试剂盒、细菌DNA提取试剂盒、口腔黏膜DNA提取试剂盒、无细胞DNA提取试剂盒中的一种或几种组成，用于将获取的样品(细胞、细菌、病毒、组织、血液等)通过DNA提取试剂盒提取DNA，得到靶DNA。
此实施方式中的检测系统的检测方法为：
S10.使用DNA提取模块提取DNA：将获取的样品(细胞、细菌、病毒、组织、血液等)通过DNA提取试剂盒的处理，得到靶DNA，耗时30～60分钟；
S20.混合LAMP体系中的所需的靶DNA、引物、酶、荧光标记物和反应基础液，得到LAMP混合液，耗时1分钟；
S30.将LAMP混合液装载到DNA扩增模块中，耗时4-5分钟；
S31.将微孔阵列芯片固定在芯片底座1的凹槽内；
S32.将LAMP混合液用微量移液器移至刮片上，通过机械推进器将LAMP混合液装载到微孔阵列芯片3的微孔中；
S33.用密封油覆盖所述微孔阵列芯片3，盖上上盖2，完成封装；
S40将DNA扩增模块放置在温度控制样品池9中，芯片底座1固定在样品槽中，上盖2朝向透明视窗8一侧，盖上盖体4，设置扩增温度，随后将样品放置在激光共聚焦成像系统中，每隔一段时间(1～5min)进行一次检测，直至判断出PCR反应是否进行，耗时15～60分钟。
S50.将S40得到的检测结果，通过结果分析模块处理，得出成像图片，荧光强度曲线和靶DNA含量等数据。耗时5～10分钟。
实施例2
本实施例提供了一种数字PCR芯片，包括温度控制样品池9，如图3-图5所示，温度控制样品池9包括底座5、透明视窗8，底座5中部开设有贯通的通孔，透明视窗8嵌装在通孔内，透明视窗8的材质为玻璃或聚甲基丙烯酸甲酯中的一种，可以使光线从底座8的下方，通过透明视窗8到达透明视窗8的上部。在透明视窗8的左右两侧安装有加热陶瓷6，加热陶瓷片6的上表面与透明视窗8的上表面平齐，所述底座5上设有样品槽，加热陶瓷6和透明视窗8设置在所述样品槽的底面，加热陶瓷6的上表面与透明视窗8的上表面与所述样品槽的底面平齐，所述样品槽用于放置DNA扩增模块。还包括热电偶7，安装在底座5开设的槽沟内，位于透明视窗8的一侧，所述热电偶7与加热陶瓷6连接。盖体4的右侧可拆卸的插接在底座的右侧插孔内。
进一步的，还包括芯片，所述芯片包括芯片底座1、上盖2和微孔阵列芯片3；芯片底座1的中部设置有凹槽，用于放入微孔阵列芯片3，上盖2盖在微孔阵列芯片3上，盖合后的上盖2的上表面与芯片底座1上表面处于同一平面上，上盖2为透明玻璃片。芯片底座1采用铝材料，通过机加工制造而成，微孔阵列芯片3通过光刻蚀微纳加工技术和表面修饰技术制造而成，将其分割为大量独立反应单元，用于承载DNA扩增体系；独立反应单元为列阵的微孔，微孔呈蜂窝状排列。在检测时，将承载有DNA扩增体系的芯片的芯片底座1放置在样品槽中，上盖2朝向透明视窗8一侧，盖上盖体4即可用于检测。在本实施例中微孔阵列芯片3选择包括2.5万个微孔，每个微孔可盛装的液体体积为0.7nL的微孔阵列芯片。
实施例3
本实施例提供一种高灵敏度、快速、绝对定量的DNA片段检测系统，包括DNA扩增模块，用于承载DNA扩增体系，包括至少两万个独立反应单元，每个反应单元可盛装的液体体积为小于1nL；温度控制模块，用于控制所述DNA扩增模块的反应温度；检测模块，用于激光扫描实时检测所述DNA扩增模块中的扩增结果。
所述DNA扩增模块，如图1和图2所示，DNA扩增模块包括芯片底座1、上盖2和微孔阵列芯片3；芯片底座1的中部设置有凹槽，用于放入微孔阵列芯片3，上盖2盖在微孔阵列芯片3上，盖合后的上盖2的上表面与芯片底座1上表面处于同一平面上，上盖2为透明玻璃片。芯片底座1采用铝材料，通过机加工制造而成，微孔阵列芯片3通过光刻蚀微纳加工技术和表面修饰技术制造而成，将其分割为大量独立反应单元，用于承载DNA扩增体系；独立反应单元为列阵的微孔，微孔呈蜂窝状排列，在本实施例中其包括两万个微孔，每个微孔可盛装的液体体积为小于1nL。DNA扩增体系优选为普通PCR体系，普通PCR体系由靶DNA片段、引物、荧光标记物、双蒸水、DNA聚合酶和反应基础液组成。引物包含前引物和后引物，荧光标记物为SYBR Green I、HNB、钙黄绿素、FRET探针中的一种。反应基础液由dNTP、缓冲溶液、Mg盐等中的一种或几种组成。DNA扩增模块的装配方法为将芯片固定在芯片底座1上，将配置好的普通PCR体系混合液用微量移液器移至刮片上，通过机械推进器将混合液装在到微孔阵列芯片3上的微孔中，用密封油覆盖微孔阵列芯片3，最后盖上上盖2，排除气泡，完成装配。密封油优选为硅油或液体石蜡。在本实施例中微孔阵列芯片3选择包括3万个微孔，每个微孔可盛装的液体体积为0.5nL的微孔阵列芯片。
所述温度控制模块为温度控制样品池9，如图3-图5所示，温度控制样品池9包括底座5、透明视窗8，底座5中部开设有贯通的通孔，透明视窗8嵌装在通孔内，透明视窗8的材质为玻璃或聚甲基丙烯酸甲酯中的一种，可以使光线从底座5的下方，通过透明视窗8底部到达透明视窗8的上部。在透明视窗8的左右两侧安装有加热陶瓷6，所述加热陶瓷为片状，加热陶瓷6的上表面与透明视窗8的上表面平齐。所述底座5上设有样品槽，加热陶瓷6和透明视窗8设置在所述样品槽的底面，加热陶瓷6的上表面与透明视窗8的上表面与所述样品槽的底面平齐，所述样品槽用于放置DNA扩增模块。还包括热电偶7，安装在底座5开设的槽沟内，位于透明视窗8的一侧，所述热电偶7与加热陶瓷6连接。盖体4的右侧可拆卸的插接在底座的右侧插孔内。将DNA扩增模块的芯片底座1放置在样品槽中，上盖2朝向透明视窗8一侧，盖上盖体4即可用于检测。
所述检测模块优选为激光共聚焦成像系统。进一步的，所述检测系统还包括结果分析模块，结果分析模块为计算机和数据处理软件，对检测模块输出的结果进行分析，并输出分析结果。如图6所示，将温度控制样品池9放置在激光共聚焦成像系统10上，激光器101发射出激光，通过温度控制样品池9的透明视窗8照射到微孔阵列芯片3上，激发DNA扩增反应体系的荧光，检测器102通过检测荧光进行样品检测。
进一步的，所述检测系统还包括DNA提取模块，DNA提取模块为血液DNA提取试剂盒、组织DNA提取试剂盒、细胞DNA提取试剂盒、病毒DNA提取试剂盒、植物DNA提取试剂盒、FFPEDNA提取试剂盒、细菌DNA提取试剂盒、口腔黏膜DNA提取试剂盒、无细胞DNA提取试剂盒中的一种或几种组成，用于将获取的样品(细胞、细菌、病毒、组织、血液等)通过DNA提取试剂盒提取DNA，得到靶DNA。
此实施方式中的检测系统的检测方法为：
S10.使用DNA提取模块提取DNA：将获取的样品(细胞、细菌、病毒、组织、血液等)通过DNA提取试剂盒的处理，得到靶DNA，耗时30～60分钟；
S20.混合普通PCR体系中的所需的靶DNA、引物、酶、荧光标记物和反应基础液，得到PCR混合液，耗时1分钟；
S30.将PCR混合液装载到DNA扩增模块中，耗时4-5分钟；
S31.将微孔阵列芯片固定在芯片底座1的凹槽内；
S32.将PCR混合液用微量移液器移至刮片上，通过机械推进器将PCR混合液装载到微孔阵列芯片3的微孔中；
S33.用密封油覆盖所述微孔阵列芯片3，盖上上盖2，完成封装；
S40将DNA扩增模块放置在温度控制样品池9中，芯片底座1固定在样品槽中，上盖2朝向透明视窗8一侧，盖上盖体4，按照下述扩增程序控制温度；
扩增程序为90～95℃，15min，90～95℃，30～45s；40～60℃，30-45s；70～75℃，30～45s，30～50个循环，55℃，恒温5min，降温至4℃；随后将样品放置在激光共聚焦成像系统中，每次一个循环后进行一次检测，直至判断出PCR反应是否进行，耗时70～120分钟。
S50.将S40得到的检测结果，通过结果分析模块处理，得出成像图片，荧光强度曲线和靶DNA含量等数据。耗时5～10分钟。
实施例4
本实施例使用实施例1中的检测系统以及检测方法，采用结核分歧杆菌作为样品，具体检测步骤如下：
1.引物设计
从NCBI基因数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载并得到结核分枝杆菌H37Rv IS6110的基因序列作为靶序列，运用在线软件PrimerExplorerV4(http://primerexplorer.jp/e/)设计环介导等温扩增引物组，包括一对外引物(F3、B3)和一对内引物(FIP、BIP)，其引物序列为：
2.结核分歧杆菌DNA提取
使用市售的细菌DNA提取试剂盒提取结核分歧杆菌的DNA；
(1)取细菌培养液1-5ml，10000rpm离心1分钟，尽量吸净上清；
(2)加入溶菌酶，37℃过夜破壁处理；
(3)向管中加入20μL蛋白酶K溶液，混匀；
(4)加入220μL缓冲液GB，震荡15s，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管壁内盖上的水珠；
(5)加入220μL无水乙醇于，充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管壁内盖上的水珠；
(6)将上一步所得的溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入离心管中；
(7)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入离心管中；
(8)向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入离心管中；
(9)重复操作步骤(8)；
(10)将吸附柱CB3放回离心管中，12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附柱料中残余的漂洗液；
(11)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中；
(12)将离心得到的溶液再次加入到吸附柱CB3中，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，即为待检靶DNA。用紫外分光光度法测量DNA浓度，将靶DNA溶液稀释至1ng/μL。
3.配置LAMP体系
其中LAMP反应预混液中包括荧光标记物SYBR Green I、BstDNA聚合酶和反应基础液。引物混合液中内、外引物浓度比例为1-12∶1，在本实施例中选择浓度比例为7:1。
4.装载DNA扩增模块
1)将微孔阵列芯片3固定在芯片底座1的凹槽内；
2)将步骤3中片配置好的的LAMP体系混合液用微量移液器移至刮片上，通过机械推进器将LAMP混合液装载到微孔阵列芯片3的微孔中；
3)用硅油覆盖微孔阵列芯片3，盖上上盖2，完成封装。
5.样品检测
将封装好的DNA扩增模块放置在温度控制样品池9中，芯片底座1固定在样品槽中，上盖2朝向透明视窗8一侧，盖上盖体4，设置扩增温度为60℃，随后将样品放置在激光共聚焦成像系统中，每隔1min进行一次检测，直至判断出PCR反应是否进行。
6.结果分析
结果分析模块对激光共聚焦成像系统的数据进行分析输出，得到如图8所示结果，当微孔中包含目标DNA分子时，扩增后的微孔呈现阳性荧光信号，通过计算阳性微孔与阴性微孔的数字，根据泊松分布可对模板DNA分子精确定量。
实施例5
本实施例使用实施例3中的检测系统以及检测方法，采用含有人静脉血液作为样品，具体检测步骤如下：
1.引物设计
从NCBI基因数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载并得到人类表皮生长因子受体的基因序列作为靶序列，设计PCR引物组，包括前引物和后引物，其引物序列为：
2.血液DNA提取
使用市售的血液DNA提取试剂盒提取静脉血液的DNA；
3.配置普通PCR扩增体系
其中PCR反应预混液中包括荧光标记物钙黄绿素、DNA聚合酶和反应基础液。引物混合液中前、后引物浓度比例为1:1。
4.装载DNA扩增模块
1)将微孔阵列芯片3固定在芯片底座1的凹槽内；
2)将步骤3中片配置好的的PCR体系混合液用微量移液器移至刮片上，通过机械推进器将PCR混合液装载到微孔阵列芯片3的微孔中；
3)用硅油覆盖微孔阵列芯片3，盖上上盖2，完成封装。
5.样品检测
将封装好的DNA扩增模块放置在温度控制样品池9中，芯片底座1固定在样品槽中，上盖2朝向透明视窗8一侧，盖上盖体4，按照下述扩增程序设置温度；
扩增程序为95℃，15min，95℃，30s；60℃，30s；72℃，45s，30个循环，55℃，恒温5min，降温至4℃；随后将样品放置在激光共聚焦成像系统中，每次温度循环后进行一次检测，直至判断出PCR反应是否进行。
6.结果分析
结果分析模块对激光共聚焦成像系统的数据进行分析输出，当微孔中包含目标DNA分子时，扩增后的微孔呈现阳性荧光信号，通过计算阳性微孔与阴性微孔的数字，根据泊松分布可对模板DNA分子精确定量。
上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种高灵敏度、快速、绝对定量的DNA片段检测系统，其特征在于，包括：
DNA扩增模块，用于承载DNA扩增体系，包括至少两万个独立反应单元，每个反应单元可盛装的液体体积为小于1nL；
温度控制模块，用于控制所述DNA扩增模块的反应温度；
检测模块，用于激光扫描实时检测所述DNA扩增模块中的扩增结果。
2.根据权利要求1所述的检测系统，其特征在于，所述DNA扩增模块包括微孔阵列芯片；优选的，所述微孔阵列芯片上设置有列阵的微孔，所述微孔为蜂窝状排列。
3.根据权利要求2或3所述的检测系统，其特征在于，所述DNA扩增模块还包括芯片底座和上盖，所述芯片底座中部设置有凹槽，所述微孔阵列芯片放置于所述凹槽内，所述上盖放置在所述微孔阵列芯片上；优选的，所述芯片底座为铝材料，所述上盖为透明玻璃片。
4.根据权利要求1-3任一项所述的检测系统，其特征在于，所述温度控制模块为温度控制样品池，包括：
底座，所述底座开设有通孔；
透明视窗，安装在所述通孔内；
加热陶瓷，设置在所述透明视窗两侧的所述底座上；
优选的，还包括热电偶，安装在所述底座上，与所述加热陶瓷连接，用于监测所述温度控制样品池内的温度；
优选的，所述透明视窗材质为玻璃或聚甲基丙烯酸甲酯中的一种。
5.根据权利要求1-4任一项所述的检测系统，其特征在于，所述检测模块为激光共聚焦成像系统。
6.根据权利要求1-5任一项所述的检测系统，其特征在于，所述DNA扩增体系为LAMP扩增体系或普通PCR扩增体系中的一种。
7.一种数字PCR芯片，其特征在于，包括权利要求4任一项所述的检测系统中的温度控制样品池。
8.一种高灵敏度、快速、绝对定量的DNA片段检测方法，其特征在于，包括使用权利要求1-7任一项所述的检测系统的步骤。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S10.提取DNA；
S20.将S10步骤得到的DNA配制成所述DNA扩增体系；
S30.将DNA扩增体系装载到DNA扩增模块中；
S40将DNA扩增模块放置在所述温度控制模块中，通过所述检测模块进行检测。
10.权利要求1-6任一项所述的高灵敏度、快速、绝对定量的DNA片段检测系统、权利要求7所述的温度控制样品池或权利要求8-9任一项所述高灵敏度、快速、绝对定量的DNA片段检测方法在DNA检测中的用途。
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