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CN108341813B - 取代的1-(异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-苯基)脲衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents

取代的1-(异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-苯基)脲衍生物及其制备方法和用途 Download PDF

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CN108341813B CN201710060144.XA CN201710060144A CN108341813B CN 108341813 B CN108341813 B CN 108341813B CN 201710060144 A CN201710060144 A CN 201710060144A CN 108341813 B CN108341813 B CN 108341813B
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Abstract

本发明属于有机合成药物技术领域，特别涉及取代的1‑(异恶唑‑3‑基)‑3‑(3‑氟‑4‑苯基)脲衍生物及其制备方法和用途。本发明提供了一种取代的1‑(异恶唑‑3‑基)‑3‑(3‑氟‑4‑苯基)脲衍生物，其结构式如式Ⅰ所示。本发明还提供了上述取代的1‑(异恶唑‑3‑基)‑3‑(3‑氟‑4‑苯基)脲衍生物的制备方法，及其在制备FMS‑样酪氨酸激酶3抑制剂的用途。为本领域中的激酶抑制剂的制备、抗自身免疫性疾病药物的制备、新生血管生成抑制剂和抗肿瘤药物的制备提供了新的有效选择，具有很好的应用前景。
Figure DDA0001218703660000011

Description

取代的1-(异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-苯基)脲衍生物及其制 备方法和用途
技术领域
本发明属于有机合成药物技术领域，特别涉及取代的1-(异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-苯基)脲 衍生物及其制备方法和用途。
背景技术
急性髓性白血病(AML)是骨髓性白细胞异常增殖的一种血液肿瘤。近年来，随着分子生物 学、疾病基因组学等的发展，人们发现了一些与AML发生发展密切相关的靶基因，为AML 的有效治疗提供了新的选择。在这些靶基因中，FMS-样酪氨酸激酶3(FLT3)被证明是其中最 重要的一种。FLT3在造血干细胞、树突细胞、B细胞和自然杀伤细胞前体细胞的增殖和分化 的调节中起着重要作用。研究表明，约三分之一的AML患者发生了FLT3基因突变，其中FLT3基因内部串联重复突变(FLT3-ITD)，约占原发性AML患者的23％，FLT3酪氨酸激酶域单个氨基酸突变(FLT3-TKD)，约占AML患者的7％。另外，大量研究也表明FLT3突变与 AML患者的预后直接相关。因此，FLT3被认为是AML治疗的有效靶点。研发FLT3抑制剂 已成为当前的研究热点。
目前已有多个FLT3抑制剂报道，其中部分抑制剂已进入临床试验，包括：MLN518、KW-2449、TKI-258、索拉非尼、TCS-359、普纳替尼(AP24534)、DCC-2036、SKLB-1028、 AC220等。这些抑制剂中，AC220对FLT3具有高度选择性，在复发型和化疗耐药型病人群 体中，该化合物的完全缓解率可达44％至54％1,2。但是后期分子机制研究显示，AC220连续 治疗后，FLT3激酶在原有突变的基础上产生二次突变，导致药物结合困难和耐药的发生。主 要突变位点集中在位于“activation loop”的第835位天冬氨酸(D835)和位于“gatekeeper”的第691位苯丙氨酸(F691)3。这些点突变的出现，使得用于AML治疗的药物研发又遇到了新 的挑战。因此，研发可克服FLT3耐药突变的新型高活性FLT3抑制剂已成为当前的一项迫切 任务和研究热点之一。
发明内容
本发明提供了一种取代的1-(异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-苯基)脲衍生物，其结构式如式Ⅰ所 示：
Figure BDA0001218703640000021
其中，X为碳或氮；Y为氮、氧或硫；
R1、R2独立地为-H、-NO2、卤素、
Figure BDA0001218703640000022
苯基、5～12元饱和或不饱和的杂环基；或者R1和R2组合成环，所述的环为取代的苯基、取代的5～12元饱和或不饱和的杂环基；所述5～12 饱和或不饱和的杂环基含有1～2个杂原子；所述的杂原子为氮、氧或硫；
所述取代的苯基、取代的5～12元饱和或不饱和杂环基的取代基为-H、卤素、C1～C6烷基、 C1～C6烷氧基、
Figure BDA0001218703640000023
n＝1～4；
R6为C1～C6烷基、卤素、C1～C6烷氧基、
Figure BDA0001218703640000024
-N(CH3)2、
Figure BDA0001218703640000025
或苯基。
作为本发明优选的方案，X为碳或氮；Y为氧；
R1、R2独立地为-H、-NO2、卤素、
Figure BDA0001218703640000026
苯基、5～12元饱和或不饱和的杂环基；或者R1和R2组合成环，所述的环为取代的苯基、取代的5～12元饱和或不饱和的杂环基；所述5～12 饱和或不饱和的杂环基含有1～2个杂原子；所述的杂原子为氮、氧或硫；
所述取代的苯基、取代的5～12元饱和或不饱和杂环基的取代基为-H、卤素、C1～C6烷基、 C1～C6烷氧基、
Figure BDA0001218703640000027
n＝1～4；
R6为C1～C6烷基、卤素、C1～C6烷氧基、
Figure BDA0001218703640000028
-N(CH3)2、
Figure BDA0001218703640000029
或苯基。
优选的，X为碳或氮；Y为氧；
R1、R2独立地为-H、-NO2、卤素、
Figure BDA00012187036400000210
或5～10元饱和或不饱和的杂环基；或者R1和R2组合成环，所述的环为取代的苯基、取代的5～10元饱和或不饱和的杂环基；所述的5～10元饱和或不饱和的杂环基含有1～2个杂原子；所述的杂原子为氮、氧或硫；
所述取代的苯环、取代的5～10元饱和或不饱和的杂环基上的取代基为-H、卤素、C1～C4烷氧基、
Figure BDA00012187036400000211
n＝1～4；
R6为C1～C6烷基、卤素、C1～C6烷氧基、
Figure BDA00012187036400000212
-N(CH3)2、
Figure BDA00012187036400000213
或苯基。
进一步优选的，X为碳或氮；Y为氧；
R1、R2独立地为-H、-NO2、卤素、
Figure BDA0001218703640000031
或5～6元饱和的杂环基；或者R1和R2组合成环，所述的环为取代的苯基、取代的5～10元不饱和的杂环基；所述的5～10元饱和或不饱和杂环 基含有1～2个杂原子；所述的杂原子为氮或氧；
所述取代的苯基、取代的5～6元不饱和的杂环基上的取代基为-H、卤素、C1～C4烷氧基、
Figure BDA0001218703640000032
n＝1～4；
R6为C1～C6烷基、卤素、C1～C6烷氧基、
Figure BDA0001218703640000033
-N(CH3)2、
Figure BDA0001218703640000034
或苯基。
更进一步优选的，X为碳或氮；Y为氧；
R1、R2独立地为-H、-NO2、卤素、
Figure BDA0001218703640000035
或5～6元饱和的杂环基；或者R1和R2组合成环，所述的环为取代的苯基、取代的5～6元不饱和的杂环基；所述的5～6元饱和杂环基或5～10元不饱和杂环基含有1～2个杂原子；所述的杂原子为氮或氧；
所述取代的苯基、取代的5～10元不饱和的杂环基上的取代基为卤素、C1～C4烷氧基、
Figure BDA0001218703640000036
n＝1～4；
R6为C1～C6烷基、卤素、C1～C6烷氧基、
Figure BDA0001218703640000037
-N(CH3)2、
Figure BDA0001218703640000038
或苯基。
再进一步优选的，X为碳或氮；Y为氧；
R1、R2独立地为-H、-NO2、卤素、
Figure BDA0001218703640000039
或5～6元饱和的杂环基；或者R1和R2组合成环，所述的环为取代的苯基、取代的5～6元不饱和的杂环基；所述的5～6元饱和杂环基或5～10元不饱和杂环基含有1～2个杂原子；所述的杂原子为氮或氧；
所述苯基、取代的5～10元不饱和的杂环基上的取代基为-H、卤素、C1～C4烷氧基、
Figure BDA00012187036400000310
Figure BDA00012187036400000311
n＝1～4；
R6为卤素、C1～C6烷氧基、
Figure BDA00012187036400000312
-N(CH3)2、
Figure BDA00012187036400000313
或苯基。
最优的，X为碳或氮；Y为氧；
R1、R2独立地为-H、-NO2、卤素、
Figure BDA00012187036400000314
或5～6元饱和的杂环基；或者R1和R2组合成环，所述的环为取代的苯基、取代的5～6元不饱和的杂环基；所述的5～6元饱和杂环基或5～10元不饱和杂环基含有1个氮原子；
所述苯基、取代的5～10元不饱和的杂环基上的取代基为-H、-Cl、C1～C4烷氧基、
Figure BDA0001218703640000041
Figure BDA0001218703640000042
n＝1～4；
R6为C1～C6烷氧基、
Figure BDA0001218703640000043
-N(CH3)2、
Figure BDA0001218703640000044
或苯基。
上述取代的1-(异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-苯基)脲衍生物，当X为氮，Y为氧，R1和R2环合 为取代的苯环时，其结构式如式Ⅱ所示：
Figure BDA0001218703640000045
其中，R3、R4独立地为-H、卤素、C1～C4烷氧基、
Figure BDA0001218703640000046
n＝1～4；
R6为C1～C6烷基、卤素、C1～C6烷氧基、
Figure BDA0001218703640000047
-N(CH3)2、
Figure BDA0001218703640000048
或苯基。
作为本发明优选的方案，R3、R4独立地为-H、卤素、C1～C4烷氧基、
Figure BDA0001218703640000049
n＝1～4；R6为卤素、C1～C6烷氧基、
Figure BDA00012187036400000410
-N(CH3)2、
Figure BDA00012187036400000411
或苯基。
优选的，R3、R4独立地为-H、卤素、C1～C4烷氧基、
Figure BDA00012187036400000412
n＝1～4；R6为 C1～C6烷氧基、
Figure BDA00012187036400000413
-N(CH3)2、
Figure BDA00012187036400000414
或苯基。
最优的，R3、R4独立地为-H、C1～C4烷氧基、
Figure BDA00012187036400000415
n＝1～4；R6为C1～C6烷氧基、
Figure BDA00012187036400000416
-N(CH3)2、
Figure BDA00012187036400000417
或苯基。
上述取代的1-(异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-苯基)脲衍生物，当X为氮，Y为氧，R1和R2环合 为含有1个氮原子的取代不饱和6元杂环时，其结构式如式Ⅲ所示：
Figure BDA00012187036400000418
其中，R5为-H、卤素、C1～C4烷氧基、
Figure BDA00012187036400000419
n＝1～4；
R6为C1～C6烷基、卤素、C1～C6烷氧基、
Figure BDA00012187036400000420
-N(CH3)2、
Figure BDA00012187036400000421
或苯基。
作为本发明优选的方案，R5为-H、卤素、C1～C4烷氧基或
Figure BDA00012187036400000422
n＝1～4；R6为C1～C6烷基、卤素、C1～C6烷氧基、
Figure BDA0001218703640000051
-N(CH3)2、
Figure BDA0001218703640000052
或苯基。
优选的，R5为-H、卤素、C1～C4烷氧基或
Figure BDA0001218703640000053
n＝1～4；R6为卤素、C1～C6烷氧基、
Figure BDA0001218703640000054
或苯基。
最优的，R5为-H、卤素、C1～C4烷氧基或
Figure BDA0001218703640000055
n＝1～4；R6为卤素、C1～C6烷氧基或
Figure BDA0001218703640000056
上述取代的1-(异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-苯基)脲衍生物，其结构式为：
Figure BDA0001218703640000057
本发明还提供了上述取代的1-(异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-苯基)脲衍生物的制备方法。
路线一，式Ⅲ所示化合物的合成路线：
Figure BDA0001218703640000061
上述式Ⅲ所示化合物的合成步骤为：
a)将原料1、盐酸羟胺和氢氧化钠于常温下反应半小时，然后加入氢氧化钠调节pH至 8～9，再升温至40～60℃反应8～12h；TCL检测反应完全后，反应液用甲基叔丁基醚萃取，弃 去有机层，水层再用DCM(二氯甲烷)进行萃取，收集DCM层，用饱和食盐水洗涤、干燥、过滤之后，除去溶剂即得N'-羟基-4,4-二甲基-3-羰基戊脒；将N'-羟基-4,4-二甲基-3-羰基戊脒 溶于水中，然后用浓盐酸调节溶液的pH至4～5，然后升高温度到40～60℃，反应2～4小时； 反应完全后，将反应液冷却至室温，在0～5℃缓慢将溶液pH值调节至11～13，过滤出沉淀， 低温烘干，得到中间体2；所述原料1、盐酸羟胺和氢氧化钠的摩尔比为10:11:11；
b)在0～5℃，向三光气和乙酸乙酯中缓慢滴加中间体2的乙酸乙酯溶液，然后再在0～5℃ 缓慢滴加三乙胺，然后升温至60～80℃反应2～4小时；反应完毕后，将有机相除去，然后加 入4-氨基-2-氟苯酚的乙酸乙酯溶液，然后反应液于60～80℃下加热反应4～6h；反应完毕后， 将反应液中有机相除去后，加入碳酸钾的饱和水溶液萃，取并取有机层经柱层析提纯，得到 中间体3；所述三光气、中间体2、三乙胺、4-氨基-2-氟苯酚的摩尔比为17.8:35.7:71.4:35；
c)将中间体4和BOC酸酐(二碳酸二叔丁酯)溶在二氧六环中，升温至80～110℃，反应6～10h；然后浓缩反应液，调节pH值为3～4，随后萃取，收集有机层，经洗涤、干燥、过 滤，滤液除去有机相，得到中间体5；所述中间体4和BOC酸酐的摩尔比为15.6:18.7；
d)将中间体5、TMEDA(四甲基乙二胺)、正丁基锂在四氢呋喃溶液中，无氧条件下于-78℃下保持2h，随后在冰水浴条件下保持10min，然后再次降温至-78℃以下开始缓慢通入CO2气体，3～4h后缓慢升温至20～30℃，并充分搅拌后加入水淬灭；然后浓缩反应液，将pH值调节为2～3，然后萃取，合并有机层，经柱层析提纯，得到中间体6；所述正丁基锂为催化量；
e)将中间体6溶于DCM中，于常温下缓慢加入三氟乙酸(TFA)，常温反应2～4h后，加入水与稀氢氧化钠溶液调节pH为11～12，然后萃取，弃去有机层，水层中再加入醋酸调节pH为弱酸性，然后萃取，合并有机层，经洗涤、干燥、过滤后，滤液除去有机相，得到中间 体7；所述TFA为催化量；
f)将中间体7和醋酸甲脒在乙二醇甲醚中，于110～140℃，反应8～12h；反应完全后， 浓缩反应液，加入饱和碳酸钠溶液，然后用乙酸乙酯进行萃取，合并有机层，用饱和食盐水 洗涤，有机层经干燥、过滤后，滤液除去有机相，得到中间体8；所述中间体7和醋酸甲脒 的摩尔比为1:3；
g)在甲醇溶液中加入金属钠碎片，常温搅拌，然后将中间体8加入其中，升高温度至 40～60℃，反应6～10h；反应完全后，将反应液调节pH至中性，经柱层析提纯，得到中间体 9；所述中间体8、金属钠的摩尔比为1:6；
h)将中间体9、三氯氧磷和氯仿在60～80℃，反应0.5～2h后，向其中缓慢加入三乙胺， 反应6～10h后，浓缩反应液，向其中加入DCM，然后将混合液缓慢的滴加到饱和碳酸氢钠的 冰水液中；滴加完毕后，萃取，取DCM层合并，然后洗涤、干燥、过滤，滤液除去有机相，得到中间体10；所述三氯氧磷、三乙胺为催化量；
i)将中间体10和中间体3溶于丁酮，然后加入碳酸钾，于60～90℃反应4～6h后，浓缩 反应液，经柱层析提纯，得到式Ⅲ化合物；所述中间体10和化合物3的摩尔比为5:6。
路线二，式Ⅱ所示化合物的合成路线：
Figure BDA0001218703640000071
上述式Ⅱ所示化合物的合成步骤为：
j)将原料2和中间体3溶于丁酮，然后加入碳酸钾，于60～90℃反应4～6h后，浓缩反应 液，经柱层析提纯，得到化合物式Ⅱ；所述原料2和中间体3的摩尔比为5:6；
或，k)将原料4和喹唑啉衍生物溶于N，N-二甲基甲酰胺，然后加入碳酸铯，于120～140℃ 反应4～6h后，浓缩反应液，经柱层析提纯，得到中间体12；所述原料4和喹唑啉衍生物的 摩尔比为5：6；
l)将中间体12和原料5溶于四氢呋喃，然后滴加三乙胺，升温至110～130℃反应2～4h 后，浓缩反应液，经柱层析提纯，得到化合物式Ⅱ；所述中间体12和原料5的摩尔比为1： 1.2。
路线三，式Ⅰ所示化合物的合成路线：
Figure BDA0001218703640000072
上述式Ⅰ所示化合物的合成步骤为：
m)将原料3和中间体3溶于丁酮，然后加入碳酸钾，于60～90℃反应4～6h后，浓缩反 应液，经柱层析提纯，得到化合物式Ⅰ；所述原料3和中间体3的摩尔比为5：6；
或，n)将原料4和嘧啶衍生物溶于N，N-二甲基甲酰胺，然后加入碳酸铯，于120～140℃ 反应4～6h后，浓缩反应液，经柱层析提纯，得到中间体11；所述原料4和嘧啶衍生物的摩 尔比为5：6；
o)将中间体11和原料5溶于四氢呋喃，然后滴加三乙胺，升温至110～130℃反应2～4h 后，浓缩反应液，经柱层析提纯，得到式Ⅰ化合物；所述中间体11和原料5的摩尔比为5：6。
本发明还提供了上述取代的1-(异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-苯基)脲衍生物药学上可接受的盐 和水合物。
本发明还提供了上述取代的1-(异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-苯基)脲衍生物药学上可接受的盐 和水合物。
本发明还提供了式Ⅰ、式Ⅱ和式Ⅲ所示化合物的前药。依据本发明，前药是上述式Ⅰ、 式Ⅱ和式Ⅲ所示化合物的衍生物，它们自身可能具有较弱的活性或甚至没有活性，但是在给 药后，在生理条件下(例如通过代谢、溶剂分解或另外的方式)被转化成相应的生物活性形 式。
本发明还提供一种组合物，是由本发明提供的上述取代的1-(异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-苯基) 脲衍生物添加药学上可以接受的辅助性成分制备而成的。
本发明还提供了上述取代的1-(异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-苯基)脲衍生物、它的盐或水合物 在制备FMS-样酪氨酸激酶3抑制剂中的用途。优选的，上述取代的1-(异恶唑-3-基)-3-(3-氟 -4-苯基)脲衍生物、它的盐或水合物在针对FLT3酪氨酸激酶内部串联重复突变(FLT3-ITD)或 在FLT3酪氨酸激酶原有内部串联重复突变(FLT3-ITD)基础上产生的单个氨基酸突变的耐药 的FLT3-ITD/F691L或FLT3-ITD/D835Y抑制剂中的用途。
本发明还提供了上述取代的1-(异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-苯基)脲衍生物、它的盐或水合物 在制备治疗急性髓性白血病药物中的用途。
本发明还提供了上述取代的1-(异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-苯基)脲衍生物、它的盐或水合物 在制备抗自身免疫性疾病药物中的用途。
本发明还提供了上述取代的1-(异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-苯基)脲衍生物、它的盐或水合物 在制备新生血管生成抑制剂中的用途。
本发明还提供了上述取代的1-(异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-苯基)脲衍生物、它的盐或水合物 在制备抗肿瘤药物中的用途。
本发明所述化合物有效地克服临床药物AC220产生的各种耐药，特别针对二次突变耐药 FLT3-ITD/F691L和FLT3-ITD/D835Y具有较好的治疗作用。本发明提供了一类新型的吡唑并 嘧啶的衍生物，其主要是4位有取代，并提供了本发明吡唑并嘧啶衍生物的简便、高效、成 本低廉的制备方法。本发明1-(5-(叔丁基)异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-苯基)脲衍生物对多种激酶具 有良好的抑制活性，对多种实体瘤、白血病以及自身免疫性疾病均具有抑制作用，为本领域 中的激酶抑制剂的制备、抗自身免疫性疾病药物的制备、新生血管生成抑制剂和抗肿瘤药物 的制备提供了新的有效选择，具有很好的应用前景。
附图说明
图1 化合物SKLB707体外细胞凋亡检测实验结果；图1A、1B、1C、1D分别表示不同浓度化合物SKLB707对MV4-11、Ba/F3 FLT3-ITD、Ba/F3 FLT3-ITD/ F691L以及Ba/F3 FLT3-ITD/ D835V的凋亡检测实验结果。
图2 化合物SKLB707对FLT3信号通路体外检测实验结果。图2A为不同浓度下化合物SKLB707和AC220对FLT3信号通路各关键蛋白的抑制率曲线图；图2B为化合物SKLB707和AC220对FLT3信号通路各关键蛋白的抑制作用。
图3 化合物SKLB707体 内药效检测实验结果。不同剂量的SKLB707都可以完全消除小鼠皮下瘤（图3A），并且老鼠的体重没有下降（图3B），老鼠的状态同样也没有明显变化。
具体实施方式
实施例1 3-氨基-5-叔丁基异恶唑(中间体2)的制备
Figure BDA0001218703640000091
称取原料1(4,4-二甲基-3-氧代戊腈)(1.25g，10mM)于装有100mL水的250mL圆底烧 瓶中，然后加入盐酸羟胺(759mg，11mM)和氢氧化钠(440mg，11mM)，将反应液在常温下搅拌半小时，后加入适量氢氧化钠调节pH至8～9，然后升温至50℃反应10h。TCL检测反应完全后，共用100mL甲基叔丁基醚分三次加入溶液中进行萃取，弃去有机层，水层再次分三次共加入150mL的DCM(二氯甲烷)进行萃取，收集DCM层，用饱和食盐水洗涤三次，随 后加入无水硫酸钠干燥，过滤之后取滤液旋干，既得白色固体N'-羟基-4,4-二甲基-3-羰基戊脒(721mg，45.6％)，HPLC纯度96％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.30(s,2H),5.52(s,1H),4.04(s,2H),1.30(s,9H)ppm.ESI-MS m/z:159.1[M+H]+。
称取N'-羟基-4,4-二甲基-3-羰基戊脒(1.58g,10mM)于250mL的圆底烧瓶中，后加入75mL 的水，然后用浓盐酸调节溶液的pH至4～5，然后升高温度到50℃，反应三小时。TCL检测 反应完全后，将反应液冷却至室温，在冰水浴中缓慢加入适量氢氧化钠溶液调节pH＝12，随 后会有白色沉淀析出，用减压泵抽滤后，分别用水和乙醚洗涤白色沉淀，低温烘干，得到灰 色固体，即为中间体2(800mg，收率57.1％)，HPLC纯度95％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.66(s,1H),7.35(s,2H),1.24(s,9H)ppm。ESI-MS m/z:141.1[M+H]+。
实施例2 1-(5-(叔丁基)异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-羟苯基)脲(中间体3)的制备
Figure BDA0001218703640000092
称取三光气(5.282g，17.8mM)于500mL圆底烧瓶中，然后加入乙酸乙酯200mL，然后在 冰水浴环境中向烧瓶中缓慢滴加100mL中间体2(5g，35.7mM)的乙酸乙酯溶液，滴加完毕后 再在冰水浴环境中缓慢滴加三乙胺(7.2g，71.4mM)，然后升温至70℃反应三小时。反应完毕 后，直接用旋转蒸发仪将有机相除去，然后加入4-氨基-2-氟苯酚(4.4g，35mM)的乙酸乙酯溶 液200mL，然后反应液于70℃下加热反应5h，TCL检测反应完毕后，将反应液中有机相用 旋转蒸发仪除去后加入200mL碳酸钾的饱和水溶液，萃取并取上层的有机层加入100～200mm 的粗硅胶拌样。采用柱层析法，用300～400mm的硅胶拌样，体积比DCM︰MeOH(甲醇)＝50︰1作为洗脱剂，最终获得白色固体中间体3(7.34g，收率70.1％)，HPLC纯度96％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.72(d,J＝12.5Hz,1H),7.27(s,1H),6.51(s,1H),6.53(s,1H), 6.01(s,2H),5.70(s,1H),1.31(s,9H)ppm。ESI-MS m/z:294.2[M+H]+。
实施例3叔丁基(6-氟吡啶-3-基)氨基甲酸酯(中间体5)的制备
Figure BDA0001218703640000101
在250mL的圆底烧瓶中加入中间体4(6-氟吡啶-3-胺)(2g，15.6mM)和BOC酸酐(二碳酸二叔丁酯，4g，18.7mM)，然后加入150mL二氧六环作溶剂，随后升温至100℃，反应 约8h，直至TLC检测反应。然后减压浓缩反应液，加入水和稀盐酸溶液调节pH为3～4，随 后加入150mL乙酸乙酯萃取，分三次加入到水层，收集乙酸乙酯层。然后用饱和食盐水将乙 酸乙酯层洗涤三次，再用无水硫酸钠干燥乙酸乙酯层，随后过滤后，滤液直接用旋转蒸发仪 将有机相除去，得白色固体中间体5(2.56g,收率71％)，HPLC纯度95％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.77(s,1H),8.47(s,1H),7.92(d,J＝8.1Hz,1H),7.42(d,J＝ 8.7Hz,1H),1.48(s,9H)ppm。ESI-MS m/z:213.2[M+H]+。
实施例4 5-叔丁氧基羰基氨基-2-氟异烟酸(中间体6)的制备
Figure BDA0001218703640000102
在250mL三口烧瓶中加入中间体5(1g，4.375mM)，然后加入100mL重蒸无水的四氢呋 喃溶液，随后用量程为-80℃到50℃的温度计以及橡胶塞、三通活塞将瓶口塞住密封。然后通 过三通活塞将瓶内抽真空，同时用氮气充分置换。然后注入0.2mL的TMEDA(四甲基乙二 胺)，并置于-80℃的冷阱中降温，直至瓶中温度低于-78℃，然后缓慢注入8mL正丁基锂，在 -78℃下保持2h。随后将三口瓶取出在冰水浴条件下保持10min，然后再次放入-80℃的冷阱 中，当温度低于-78℃时开始缓慢通入CO2气体，3h后将三口瓶取出置于常温搅拌装置中， 此时有大量气体放出。当反应瓶内温度上升至10℃左右时将三口瓶置于30℃油浴锅加热，并 充分搅拌后加入50mL水淬灭，然后减压浓缩反应液，向其中加入稀盐酸溶液，调节pH为 2～3，然后分三次共加入150mL乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，用饱和食盐水洗涤三次后 加入100～200mm的粗硅胶拌样，用DCM︰MeOH＝10︰1作为洗脱液最终得到淡黄色固体中间体6(300mg，产率为26％)，HPLC纯度97％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.04(s,1H),9.13(s,1H),7.77(s,1H),1.48(s,9H)ppm。ESI-MS m/z:257.2[M+H]+。
实施例5 5-氨基-2-氟异烟酸(中间体7)的制备
Figure BDA0001218703640000103
在100mL圆底烧瓶中加入中间体6(500mg,1.83mM)，然后加入30mL的DCM溶解， 于常温下缓慢加入10mL的三氟乙酸(TFA)，常温搅拌反应三小时后加入水与稀氢氧化钠溶液中和剩余的三氟乙酸并调节pH为11～12，然后萃取，弃去有几层，取水层。水层中再加入醋酸调节pH为弱酸性，然后分三次加入共150mL乙酸乙酯进行萃取，合并有机层，用饱和食 盐水洗涤三次，合并乙酸乙酯层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤后滤液直接用旋转蒸发仪将有机相除去，最终得淡黄色固体中间体7(200mg，产率63％)，HPLC纯度96％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.11(s,1H),8.03(s,1H),7.48(s,1H),6.27(s,2H)ppm。ESI-MS m/z:157.1[M+H]+。
实施例6 6-氟吡啶并[3.4-D]嘧啶-4-酚的(中间体8)的制备
Figure BDA0001218703640000111
称取中间体7(200mg，1.2mM)和醋酸甲脒(374mg，3.6mM)放入100mL的圆底烧瓶中，加入50mL的乙二醇甲醚，升高温度至120℃，反应10h。TCL检测反应完全后，减压浓缩， 加入50mL的饱和碳酸钠溶液，然后分三次共100mL的乙酸乙酯进行萃取，合并有机层，用 饱和食盐水洗涤三次，取有机层加入无水硫酸钠干燥，过滤后滤液直接用旋转蒸发仪将有机 相除去，即得灰色固体中间体8(150mg，产率为69％)，HPLC纯度96％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.97(s,1H),7.86(s,1H),7.43(s,1H),3.96(s,1H)ppm。ESI-MS m/z:166.1[M+H]+。
实施例7 6-甲氧基吡啶并[3.4-d]嘧啶-4-酚(中间体9)的制备
Figure BDA0001218703640000112
向100mL的圆底烧瓶中加入20mL的甲醇溶液，随后称取160mg金属钠，将其切成碎片 加入其中，常温搅拌反应20min，然后称取中间体8(200mg，1.13mM)加入其中，升高温度至 50℃，反应8h。反应完全后，加入稀盐酸溶液调节pH至中性，然后加入100～200mm的粗硅胶拌样，用DCM︰MeOH＝50︰1作为洗脱剂，使用柱层析法得到灰色固体中间体9(150mg， 产率为70.1％)，HPLC纯度95％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.46(s,1H),7.22(s,1H),7.19(s,1H),3.87(s,1H),3.80(s,3H) ppm。ESI-MS m/z:178.1[M+H]+。
实施例8 4-氯-6-甲氧基吡啶并[3,4-d]嘧啶(中间体10)的制备
Figure BDA0001218703640000113
称取中间体9(300mg，1.7mM)于100mL的圆底烧瓶中，然后加入10mL的氯仿和0.5mL的三氯氧磷，升温至70℃，反应1h后，向其中缓慢加入0.8mL三乙胺，反应8h后减压浓缩， 向浓缩液中加入20mL的DCM将产品溶解，然后将混合液缓慢的滴加到100mL饱和碳酸氢 钠的冰水液中。滴加完毕后，萃取，取下层的DCM层合并，然后用饱和食盐水洗涤三次， 随后用无水硫酸钠干燥，过滤后滤液直接用旋转蒸发仪将有机相除去，得灰色固体中间体 10(170mg，产率为51.3％)，HPLC纯度96％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.76(s,1H),7.63(s,1H),5.91(s,1H),3.77(s,3H)ppm。ESI-MS m/z:196.1[M+H]+。
实施例9 1-(5-(叔丁基)异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-((6-甲氧基吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基)氧)苯基)脲 (化合物11)的制备
Figure BDA0001218703640000121
称取中间体10(195mg,1mM)和化合物3(351mg，1.2mM)于100mL圆底烧瓶中，加入40mL的丁酮溶解混合物，然后加入碳酸钾(165mg，1.2mM)的作为缚酸剂，升高温度至80℃反应5h后，减压浓缩加入100-200mm的粗硅胶拌样，用DCM︰MeOH＝150︰1作为洗脱剂， 使用柱层析方法最终得白色的化合物11(80mg,产率为17.7％)，HPLC纯度95％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.67(s,1H),9.22(s,1H),9.13(s,1H),8.71(s,1H),7.72(d,J ＝12.5Hz,1H),7.52(s,1H),7.45(s,1H),7.27(s,1H),6.52(s,1H),4.05(s,3H),1.30(s,9H) ppm。13C NMR(100MHz,CDCl3)δ181.66,165.28,162.35,158.18,152.37,152.19,150.74, 141.78,137.35,135.04,123.69,123.08,115.82,109.19,108.96,98.06,91.76,67.72,64.67,56.14, 54.76,32.97,28.61.ESI-MS m/z:453.2[M+H]+。
实施例10 1-(5-(叔丁基)异恶唑-3-基)-3-(4-((6-氯吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基)氧)-3-氟苯基)脲(化 合物11a)的制备
Figure BDA0001218703640000122
合成方法与实施例9相同(4,6-二氯吡啶[3,4-d]嘧啶作为反应原料)，反应处理得到灰白 色粉末化合物11a，反应产率为20.11％，HPLC纯度96％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.67(s,1H),9.36(s,1H),9.14(s,1H),8.95(s,1H),8.41(s, 1H),7.73(d,J＝12.7Hz,1H),7.45(t,J＝8.6Hz,1H),7.27(d,J＝8.6Hz,1H),6.52(s,1H),1.30 (s,9H)ppm.13C NMR(100MHz,DMSO)δ180.79,166.04,164.80,158.71,155.62,151.87, 147.34,139.66,138.81,133.89,127.24,125.38,124.81,118.72,115.30,112.48,107.44,93.01, 28.83ppm。ESI-MS m/z:457.1[M+H]+。
实施例11 1-(5-(叔丁基)异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-((6-(2-甲氧基乙氧基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基) 氧)苯基)脲(化合物11b)的制备
Figure BDA0001218703640000123
合成方法与实施例9相同，将实施例9中的4-氯-6-甲氧基吡啶并[3,4-d]嘧啶替换为4-氯 -6-乙基吡啶并[3,4-d]嘧啶，反应处理得到灰白色粉末化合物11b，反应产率为18.6％，HPLC 纯度为96％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.66(s,1H),9.20(s,1H),9.13(s,1H),8.71(s,1H),7.72(d,J ＝12.8Hz,1H),7.51(s,1H),7.44(t,J＝8.8Hz,1H),7.26(d,J＝8.7Hz,1H),6.52(s,1H),4.59– 4.52(m,2H),3.78–3.69(m,2H),1.99(s,3H),1.30(s,9H)ppm。13C NMR(100MHz,CDCl3)δ 181.64,165.32,161.66,158.26,155.25,152.42,150.41,141.80,137.43,135.05,123.67,123.15, 115.79,109.18,108.94,99.16,91.81,63.23,32.97,28.61,14.73ppm.ESI-MS m/z:497.2[M+H]+。
实施例12 1-(5-(叔丁基)异恶唑-3-基)-3-(4-((6-乙氧基吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基)氧)-3-氟苯基) 脲(化合物11c)的制备
Figure BDA0001218703640000131
合成方法与实施例9相同，将实施例9中的4-氯-6-甲氧基吡啶并[3,4-d]嘧啶替换为(2- 甲氧基乙氧基)吡啶并[3,4-d]嘧啶作为反应物，反应处理得到白色粉末化合物11c，反应产率 为16.6％，HPLC纯度97％。
1H NMR(400MHz,DMSO)；δ9.66(s,1H),9.20(s,1H),9.13(s,1H),8.71(s,1H),7.72(d,J ＝12.8Hz,1H),7.51(s,1H),7.44(t,J＝8.8Hz,1H),7.26(d,J＝8.7Hz,1H),6.52(s,1H),4.59– 4.52(m,2H),3.78–3.69(m,2H),1.99(s,3H),1.30(s,9H)ppm。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ 181.63,165.32,161.65,158.24,155.28,152.41,150.42,141.80,137.43,135.05,123.67,123.15, 115.79,109.18,108.94,99.16,91.82,71.02,66.27,59.19,28.61ppm。ESI-MS m/z:497.2[M+H]+.
实施例13 1-(5-(叔丁基)异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-((6-(2-吗啉乙氧基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基)氧) 苯基)脲(化合物11d)的制备
Figure BDA0001218703640000132
合成方法与实施例9相同，将实施例9中的4-氯-6-甲氧基吡啶并[3,4-d]嘧啶替换为4-(2 -((4-氯吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基)氧基)乙基)吗啉为反应物，反应处理得到灰白色固体化 合物11d，反应产率为14.8％，HPLC纯度为96％。
1H NMR(400MHz,DMSO)；δ9.66(s,1H),9.20(s,1H),9.13(s,1H),8.71(s,1H),7.72(d,J ＝12.8Hz,1H),7.51(s,1H),7.44(t,J＝8.8Hz,1H),7.26(d,J＝8.6Hz,1H),6.52(s,1H),4.54(s, 2H),3.74(d,J＝7.0Hz,4H),3.64–3.52(m,4H),2.77(s,2H),1.30(s,9H)ppm。13CNMR(100 MHz,CDCl3)δ181.67,165.30,161.67,158.18,155.27,152.42,152.10,150.56,141.80,123.64, 123.12,115.79,109.16,108.93,98.84,91.75,66.93,64.65,57.60,54.06,28.61ppm。ESI-MS m/z: 552.1。
实施例14 1-(5-(叔丁基)异恶唑-3-基)-3-(4-((7-氯喹唑啉-4-基)氧基)-3-氟苯基) 脲(化合物13a)的制备
Figure BDA0001218703640000141
称取中间体3(100mg,0.34mM)和氢氧化钠(11.05mg，0.28mM)溶于四氢呋喃和水(体积 比＝5︰1)的混合溶液中，常温搅拌30分钟。然后加入原料2a(4，7-二氯喹唑啉，157.98mg， 0.23mM)，升温至60～66℃，反应6h。将反应混合液真空浓缩后加入水，用乙酸乙酯萃取三 次后，真空浓缩，用100～200mm粗硅胶拌样，用石油醚︰乙酸乙酯＝3︰1作为洗脱剂，得到 最终化合物13a(64.1mg，产率为63.12％)。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.66(s,1H),9.12(s,1H),8.78(s,1H),8.51(dd,J＝9.0,6.1 Hz,1H),7.84(d,J＝10.1Hz,1H),7.73(m,2H),7.44(t,J＝8.9Hz,1H),7.26(d,J＝8.6Hz,1H), 6.52(s,1H),1.30(s,9H)。13C NMR(100MHz,DMSO)δ180.79,166.04,164.80,158.71,155.62, 151.87,147.34,139.66,138.81,133.89,127.24,125.38,124.81,118.72,115.30,112.48,107.44, 93.01,28.83。ESI-MS m/z:456.1[M+H]+。
实施例15 1-(5-(叔丁基)异恶唑-3-基)-3-(4-((6,7-二甲氧基吡啶-4-基)氧基)-3-氟 苯基)脲(化合物SKLB707)的制备
Figure BDA0001218703640000142
合成方法与实施例14相同，将实施例14中的4，7-二氯喹唑啉替换为4-氯-6,7-二甲氧基 喹唑啉为反应物，反应处理得到灰白色固体化合物SKLB707，产率为78.34％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.71(s,1H),9.23(s,1H),8.58(s,1H),7.70(dd,J1＝12.8Hz, J2＝2.0Hz,1H),7.58(s,1H),7.42(s,1H),7.25(d,J＝8.7Hz,1H),6.89(s,1H),6.53(s,1H),4.01 (s,3H),4.00(s,3H),1.31(s,9H)。13C NMR(100MHz,DMSO)δ180.79,164.55,158.72,156.42, 155.33,152.90,152.62,151.87,150.75,149.43,138.48,134.44,124.92,115.27,109.59,107.27, 101.02,93.00,56.68,56.53,28.83。ESI-MS m/z:482.3[M+H]+。
实施例16 1-(4-((6,7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-3-(5-(叔 丁基)异恶唑-3-基)脲(化合物13c)的制备
Figure BDA0001218703640000143
合成方法与实施例14相同，将实施例14中的4，7-二氯喹唑啉替换为4-氯-6,7-双(2- 甲氧基乙氧基)喹唑啉为反应物，反应处理得到灰白色固体化合物13c，产率为48.66％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.64(s,1H),9.09(s,1H),8.56(s,1H),7.68(dd,J1＝12.8,J2 ＝2.4Hz,1H),7.61(s,1H),7.44(s,1H),7.39(d,J＝6.0Hz,1H),7.26–7.21(m,1H),6.52(s,1H), 4.38–4.31(m,4H),3.78–3.74(m,4H),3.36(d,J＝6.4Hz,6H),1.30(s,9H)。13C NMR(100 MHz,DMSO)δ180.79,172.48,164.55,158.72,155.71,153.06,152.64,151.86,149.99,149.33, 124.92,115.25,109.61,108.15,107.20,102.58,102.28,93.00,70.57,68.90,58.81,28.83。ESI-MS m/z:507.2[M+H]+。
实施例17 1-(5-(叔丁基)异恶唑-3-基)-3-(4-((6,7-甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟 苯基)脲(化合物13d)的制备
Figure BDA0001218703640000151
称取原料2d(4-氯-6,7-二甲氧基喹啉，500mg,1.0mM)和原料4(4-硝基-2-氟苯酚，704mg，2.0mM)于100mL圆底烧瓶中，加入10mL的2,6-二甲基吡啶溶解混合物，然后加入 有机碱1，8-二氮杂二环十一碳-7-烯，升高温度至147℃反应8h后，减压浓缩加入300-400mm的粗硅胶拌样，用DCM︰MeOH＝50︰1作为洗脱剂，使用柱层析方法最终得黄色的化合物(2-氟-4-硝基苯氧基)-6,7-二甲氧基喹唑啉(产率为46.5％)，HPLC纯度95％。
称取(2-氟-4-硝基苯氧基)-6,7-二甲氧基喹唑啉(100mg,1.0mM)和铁粉(81mg，5.0mM) 于25mL圆底烧瓶中，加入5mL乙醇和5mL水溶解混合物，然后加入氯化铵(8mg，0.5mM)， 升高温度至60℃反应3h后，反应液抽滤后减压浓缩，加入原料5(58mg，1.2mM)于25mL圆 底烧瓶中，加入10mL的甲苯溶解混合物，然后加入滴加2-3滴三乙胺，升高温度至120℃反 应5h后，加入300～400mm的粗硅胶拌样，用DCM︰MeOH＝50︰1作为洗脱剂，使用柱层析方法最终得淡黄色的化合物13d(产率为34.3％)，HPLC纯度95％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.88(s,1H),8.90(s,1H),8.50(d,J＝5.2Hz,1H),8.20(s,1H), 7.49(s,1H),7.43–7.33(m,2H),7.11(d,J＝9.6Hz,1H),6.55(d,J＝5.3Hz,1H),6.49(s,1H), 3.94(d,J＝7.4Hz,6H),1.33–1.19(m,9H)。
实施例18 1-(5-(叔丁基)异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-(喹啉-4-基氧基)苯基)脲(化合物 13e)的制备
Figure BDA0001218703640000152
称取原料2e(4-氯喹啉，100mg,1.0mM)和中间体3(200mg，1.0mM)于100mL圆底烧瓶中，加入10mL的2,6-二甲基吡啶溶解混合物，然后加入有机碱1，8-二氮杂二环十一碳-7-烯，升高温度至147℃反应8h后，减压浓缩加入300-400mm的粗硅胶拌样，用DCM︰ MeOH＝50︰1作为洗脱剂，使用柱层析方法最终得黄色的化合物13e(产率为62.5％)，HPLC 纯度95％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.68(d,J＝5.1Hz,1H),8.33(d,J＝8.3Hz,1H),8.03(d,J＝ 8.4Hz,1H),7.82(t,J＝7.6Hz,1H),7.66(t,J＝7.6Hz,1H),7.10(t,J＝9.0Hz,1H),6.57(dd,J＝ 12.5,3.4Hz,2H),6.49(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H),6.26(d,J＝32.2Hz,1H),5.51(s,2H),1.34–0.98 (m,9H)。
实施例19 1-(4-((7-(苄氧基)-6-甲基喹唑啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-3-(5-(叔丁基) 异恶唑-3-基)(化合物13f)的制备
Figure BDA0001218703640000161
称取原料2f(7-苄氧基-4-氯-6-甲氧基喹唑啉，100mg,1.0mM)和中间体3(98mg，1.0mM) 于100mL圆底烧瓶中，加入10mL的乙腈溶解混合物，然后加入碳酸钾(132mg，2.0mM)，升 高温度至80℃反应8h后，减压浓缩加入300-400mm的粗硅胶拌样，用DCM︰MeOH＝50︰1 作为洗脱剂，使用柱层析方法最终得黄色的化合物13f(产率为62.5％)，HPLC纯度95％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.56(d,J＝1.8Hz,1H),7.94(dd,J＝11.8,2.4Hz,1H),7.81– 7.76(m,1H),7.62(s,1H),7.54(s,2H),7.52(s,2H),7.46(d,J＝2.9Hz,1H),7.44(s,2H),7.42(s, 1H),7.40(s,1H),7.38(s,1H),5.37(s,2H),4.00(s,3H),1.28(s,9H)。
实施例20 4-(4-(3-(5-(叔丁基)异恶唑-3-基)脲基)-2-氟苯氧基)-7-二甲氧基喹唑啉 -6-基乙酸酯(化合物13g)的制备
Figure BDA0001218703640000162
称取原料2g(3,4-二氢-7-甲氧基-4-氧代喹唑啉-6-醇乙酸酯，1g,1.0mM)于100mL圆底 烧瓶中，加入10mL的三氯氧磷溶解混合物，然后加入2mL三乙胺升高温度至70℃反应4h 后，减压浓缩得到黄色固体6-乙酰氧基-4-氯-7-甲氧基喹唑啉。称取6-乙酰氧基-4-氯-7-甲氧 基喹唑啉(100mg,1.0mM)和中间体3(116mg，1.0mM)于100mL圆底烧瓶中，加入10mL的 乙腈溶解混合物，然后加入碳酸钾(157mg，2.0mM)，升高温度至80℃反应8h后，减压浓缩加入300-400mm的粗硅胶拌样，用DCM︰MeOH＝50︰1作为洗脱剂，使用柱层析方法最终 得黄色的化合物13g(产率为62.5％)，HPLC纯度95％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.37(s,1H),9.62(s,1H),9.08(s,1H),8.49(s,1H),7.67(dd, J＝12.9,2.5Hz,1H),7.50(s,1H),7.38(d,J＝3.7Hz,1H),7.22(dd,J＝8.8,1.4Hz,1H),6.52(s, 1H),4.00(s,3H),2.03(m,3H),1.30(d,J＝4.0Hz,9H)。
实施例21 1-(5-(叔丁基)异恶唑-3-基)-3-(4-((7,8-二氢-[1,4]二恶烷[2,3-g]喹唑啉-4- 基)氧基)-3-氟苯基)脲(化合物13i)的制备
Figure BDA0001218703640000163
称取原料2i(4-氯-6,7-二亚甲基二羟喹唑啉，100mg,1.0mM)和中间体3(228mg，1.0mM) 于100mL圆底烧瓶中，加入10mL的乙腈溶解混合物，然后加入碳酸钾(310mg，2.0mM)，升 高温度至80℃反应8h后，减压浓缩加入300-400mm的粗硅胶拌样，用DCM︰MeOH＝50︰1 作为洗脱剂，使用柱层析方法最终得黄色的化合物13i(产率为62.5％)，HPLC纯度95％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.63(s,1H),9.11(s,1H),8.53(s,1H),7.67(q,J＝2.6Hz,2H), 7.41(s,1H),7.37(d,J＝8.8Hz,1H),7.23(dd,J＝8.8,1.4Hz,1H),6.52(s,1H),4.50–4.40(m, 4H),1.30(s,9H).
实施例22 1-(5-(叔丁基)异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-((7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基) 喹唑啉-4-基)氧基)脲(化合物13j)的制备
Figure BDA0001218703640000171
称取原料2j(3,4-二氢-7-甲氧基-4-氧代喹唑啉-6-醇乙酸酯，1g(1.0mM)于100mL圆底 烧瓶中，加入10mL的三氯氧磷溶解混合物，然后加入2mL三乙胺升高温度至70℃反应4h 后，减压浓缩得到黄色固体4-氯-7-甲氧基喹唑啉-6-醇。称取4-氯-7-甲氧基喹唑啉-6-醇(150mg, 1.0mM)和N-(3-氯丙基)吗啉(140mg，1.2mM)于100mL圆底烧瓶中，加入10mL的DMF溶解 混合物，然后加入碳酸钾(284mg，2.0mM)，升高温度至130℃反应8h后，减压浓缩加入 300-400mm的粗硅胶拌样，用DCM︰MeOH＝50︰1作为洗脱剂，使用柱层析方法得黄色的 化合物4--氯-7-(2-甲氧基乙氧基)-6-(3-吗啉-4-基-丙氧基)-喹唑啉。称取4--氯-7-(2-甲氧基乙氧 基)-6-(3-吗啉-4-基-丙氧基)-喹唑啉(100mg,1.0mM)和中间体3(92mg，1.0mM)于100mL圆底 烧瓶中，加入10mL的DMF溶解混合物，然后加入碳酸钾(104mg，2.0mM)，升高温度至130℃ 反应8h后，减压浓缩加入300-400mm的粗硅胶拌样，用DCM︰MeOH＝50︰1作为洗脱剂， 使用柱层析方法最终得黄色的化合物13j(产率为62.5％)，HPLC纯度95％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.63(s,1H),9.08(s,1H),8.56(s,1H),7.66(d,J＝2.4Hz,1H), 7.57(s,1H),7.40(d,J＝3.7Hz,2H),7.24(dd,J＝8.9,1.4Hz,1H),6.52(s,1H),4.24(t,J＝6.6 Hz,2H),4.00(s,3H),3.59–3.55(m,4H),2.46(d,J＝6.9Hz,2H),2.39(s,4H),2.00–1.94(m, 2H),1.30(s,9H)。
实施例23 1-(5-(叔丁基)异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4–((6-甲氧基-7-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-基) 氧基)脲(化合物13k)的制备
Figure BDA0001218703640000172
称取原料2k(7-苄氧基-4-氯-6-甲氧基喹唑啉，1g,1.0mM)于100mL圆底烧瓶中，加入 20mL的甲醇溶解，然后加入钯碳(706g,2.0mM)，氮气保护下升温至70℃反应4h后，反应液抽滤后减压浓缩得到黄色固体6-乙酰氧基-4-氯-7-甲氧基喹唑啉。称取6-乙酰氧基-4-氯-7- 甲氧基喹唑啉(200mg,1.0mM)于100mL圆底烧瓶中，加入10mL NaOH水溶液和二氧六环 (1:1)的混合溶液溶解该化合物，常温搅拌反应8h后，调PH至3-4左右，用乙酸乙酯萃取收集有机相减压浓缩的黄色固体4-氯-7-甲氧基喹唑啉-6-醇。称取4-氯-7-甲氧基喹唑啉-6-醇 (150mg,1.0mM)和N-(3-氯丙基)吗啉(140mg，1.2mM)于100mL圆底烧瓶中，加入10mL的DMF溶解混合物，然后加入碳酸钾(284mg，2.0mM)，升高温度至130℃反应8h后，减压浓 缩加入300-400mm的粗硅胶拌样，用DCM︰MeOH＝50︰1作为洗脱剂，使用柱层析方法得 黄色的化合物4--氯-7-(2-甲氧基乙氧基)-6-(3-吗啉-4-基-丙氧基)-喹唑啉。称取4--氯-7-(2-甲氧 基乙氧基)-6-(3-吗啉-4-基-丙氧基)-喹唑啉(100mg,1.0mM)和中间体3(92mg，1.0mM)于100mL 圆底烧瓶中，加入10mL的DMF溶解混合物，然后加入碳酸钾(104mg，2.0mM)，升高温度 至130℃反应8h后，减压浓缩加入300-400mm的粗硅胶拌样，用DCM︰MeOH＝50︰1作为 洗脱剂，使用柱层析方法最终得黄色的化合物13k(产率为62.5％)，HPLC纯度95％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.71(s,1H),9.10(s,1H),8.63(s,1H),7.66(d,J＝2.4Hz,1H), 7.54(s,1H),7.45(d,J＝3.7Hz,2H),7.24(dd,J＝8.9,1.4Hz,1H),6.42(s,1H),4.26(t,J＝6.6 Hz,2H),4.07(s,3H),3.62–3.59(m,4H),2.42(d,J＝6.9Hz,2H),2.37(s,4H),1.98(m,2H),1.33 (s,9H)。
实施例24 1-(5-(叔丁基)异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-((7-甲氧基-6-(2-吗啉代乙基)喹 唑啉-4-基)氧基)苯基)脲(化合物13l)的制备
Figure BDA0001218703640000181
合成方法与实施例23相同，将实施例23中的3,4-二氢-7-甲氧基-4-氧代喹唑啉-6-醇乙酸 酯替换为4-(2-((4-氯-7-甲氧基喹啉-6-基)氧基)乙基)吗啉为反应物，反应处理得到 灰白色固体化合物13l。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.75(s,1H),9.21(s,1H),8.70(s,1H),7.63(d,J＝2.4Hz,1H), 7.60(s,1H),7.54(d,J＝3.7Hz,2H),7.30(dd,J＝8.9,1.4Hz,1H),6.42(s,1H),δ4.19(s,2H), 3.90(s,3H),3.59(s,4H),2.75(s,2H),1.21(d,J＝23.1Hz,4H),1.33(s,9H)。
实施例25 1-(3-氟-4-((6-甲氧基-7-(2-吗啉代乙基)喹唑啉-4-基)氧基)苯基)-3-(5- 异丙基异恶唑-3-基)脲(化合物13m)的制备
Figure BDA0001218703640000182
合成方法与实施例24相同，将实施例23中的7-苄氧基-4-氯-6-甲氧基喹唑啉替换为4- (2-((4-氯-6-甲基喹唑啉-7-基)氧基)乙基)吗啉为反应物，反应处理得到灰白色固体 化合物13m。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.77(s,1H),9.25(s,1H),8.72(s,1H),7.64(d,J＝2.4Hz,1H), 7.65(s,1H),7.58(d,J＝3.7Hz,2H),7.35(dd,J＝8.9,1.4Hz,1H),6.45(s,1H),δ4.23(s,2H), 3.92(s,3H),3.57(s,4H),2.78(s,2H),1.25(d,J＝23.1Hz,4H),1.35(s,9H)。
实施例26 1-(5-(叔丁基)异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-((7-甲氧基-6-(3-(哌啶-1-基)丙 氧基)氧基)苯基)脲(化合物13n)的制备
Figure BDA0001218703640000191
合成方法与实施例23相同，将实施例23中的3,4-二氢-7-甲氧基-4-氧代喹唑啉-6-醇乙酸 酯替换为4-(3-((4-氯-7-甲氧基喹啉-6-基)氧基)丙基)吗啉为反应物，反应处理得到 灰白色固体化合物13n。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.71(s,1H),9.10(s,1H),8.63(s,1H),7.66(d,J＝2.4Hz,1H), 7.54(s,1H),7.45(d,J＝3.7Hz,2H),7.24(dd,J＝8.9,1.4Hz,1H),6.42(s,1H),4.26(t,J＝6.6 Hz,2H),3.62–3.59(m,4H),2.42(d,J＝6.9Hz,2H),2.37(s,6H),1.98(m,2H),1.33(s,9H)。
实施例27 1-(3-氟-4-((6-甲氧基-7-(3-(哌啶-1-基)丙氧基)喹唑啉-4-基)氧基)苯基) -3-(5-异丙基异恶唑-3-基)基)脲(化合物13o)的制备
Figure BDA0001218703640000192
合成方法与实施例24相同，将实施例23中的7-苄氧基-4-氯-6-甲氧基喹唑啉替换为4- (4-((4-氯-6-甲基喹唑啉-7-基)氧基)丁基)吗啉为反应物，反应处理得到灰白色固体 化合物13o。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.70(s,1H),9.10(s,1H),8.63(s,1H),7.66(d,J＝2.4Hz,1H), 7.54(s,1H),7.45(d,J＝3.7Hz,2H),7.24(dd,J＝8.9,1.4Hz,1H),6.42(s,1H),4.27(t,J＝6.6 Hz,2H),3.62–3.59(m,4H),2.44(d,J＝6.9Hz,2H),2.38(s,6H),1.98(m,2H),1.33(s,9H)。
实施例28 1-(5-(叔丁基)异恶唑-3-基)-3-(4-((6-(3-(二甲基氨基)丙氧基)-7-甲 基喹唑啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)脲(化合物13p)的制备
Figure BDA0001218703640000193
合成方法与实施例23相同，将实施例23中的3,4-二氢-7-甲氧基-4-氧代喹唑啉-6-醇乙酸 酯替换为3-((4-氯-7-甲氧基喹啉-6-基)氧基)-N，N-二甲基丙-1-胺为反应物，反应处理 得到灰白色固体化合物13p。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.78(s,1H),9.20(s,1H),8.74(s,1H),7.67(d,J＝2.4Hz,1H), 7.65(s,1H),7.59(d,J＝3.7Hz,2H),7.36(dd,J＝8.9,1.4Hz,1H),6.47(s,1H),δ4.09(s,2H), 3.94(d,J＝24.0Hz,3H),2.41(s,2H),2.16(d,J＝19.4Hz,6H),1.82(s,2H),1.24(s,9H)。
实施例29 1-(5-(叔丁基)异恶唑-3-基)-3-(4-((7-(3-(二甲基氨基)丙氧基)-6-甲 基喹唑啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)脲(化合物13r)的制备
Figure BDA0001218703640000201
合成方法与实施例24相同，将实施例23中的7-苄氧基-4-氯-6-甲氧基喹唑啉替换为4- ((4-氯-6-甲基喹唑啉-7-基)氧基)-N，N-二甲基丁-1-胺为反应物，反应处理得到灰白色固 体化合物13r。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.78(s,1H),9.20(s,1H),8.74(s,1H),7.67(d,J＝2.4Hz,1H), 7.65(s,1H),7.59(d,J＝3.7Hz,2H),7.36(dd,J＝8.9,1.4Hz,1H),6.47(s,1H),δ4.09(s,2H), 3.94(d,J＝24.0Hz,3H),2.41(s,2H),2.16(d,J＝19.4Hz,6H),1.82(s,2H),1.24(s,9H)。
实施例30 4-(4-(3-(5-(叔丁基)异恶唑-3-基)脲基)-2-氟苯氧基)-N-甲基吡啶酰胺(化 合物14a)的制备
Figure BDA0001218703640000202
称取原料3a(4,6-二氯-5-甲氧基嘧啶，168mg,1.2mM)和原料4(4-氨基-2-氟苯酚，100mg， 1.0mM)于100mL圆底烧瓶中，加入10mL的四氢呋喃和10mL水溶解混合物，然后加入氢氧 化钠(63mg，2.0mM)，升高温度至60℃反应5h后，减压浓缩加入300-400mm的粗硅胶拌样， 用DCM︰MeOH＝150︰1作为洗脱剂，使用柱层析方法最终得白色的化合物中间体11a(4-((6- 氯-5-甲氧基嘧啶-4-基)氧代)-3-氟苯胺，80mg，产率为40.3％)，HPLC纯度95％。
称取中间体11a(80mg,1.0mM)和原料5(60mg，1.2mM)于25mL圆底烧瓶中，加入10mL的四氢呋喃溶解混合物，然后加入滴加2-3滴三乙胺，升高温度至65℃反应5h后，减压浓缩加入300-400mm的粗硅胶拌样，用DCM︰MeOH＝150︰1作为洗脱剂，使用柱层析方法最终 得淡黄色的化合物14a(80mg,产率为40.3％)，HPLC纯度95％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.80(s,1H),9.50(s,1H),8.79(d,J＝4.5Hz,1H),8.53(d,J＝ 5.6Hz,1H),7.74(dd,J＝13.1,2.1Hz,1H),7.38(dd,J＝10.3,5.7Hz,2H),7.27(d,J＝9.0Hz, 1H),7.19(dd,J＝5.5,2.6Hz,1H),6.52(s,1H),2.79(d,J＝4.8Hz,3H),1.30(s,9H)。
实施例31 1-(5-(叔丁基)异恶唑-3-基)-3-(4-((6-氯-5-甲氧基嘧啶-4-基)氧基)-3- 氟苯基)脲(化合物14b)的制备
Figure BDA0001218703640000203
称取原料3b(4-氯-N-甲基甲基吡啶酰胺，500mg,1.0mM)和原料4(4-氨基-2-氟苯酚， 745mg，2.0mM)于100mL圆底烧瓶中，加入10mL的N，N-二甲基甲酰胺溶解混合物，然后加入碳酸铯(3820mg，4.0mM)，升高温度至130℃反应5h后，减压浓缩加入300-400mm的 粗硅胶拌样，用DCM︰MeOH＝50︰1作为洗脱剂，使用柱层析方法最终得白色的化合物中间 体11b(4-(4-氨基-2-氟苯氧基)-N-甲基甲基吡啶酰胺，产率为32.3％)，HPLC纯度95％。
称取化合物中间体11b(50mg,1.0mM)和原料5(20mg，1.2mM)于25mL圆底烧瓶中，加入10mL的四氢呋喃溶解混合物，然后滴加2-3滴三乙胺，升高温度至65℃反应5h后，减压 浓缩加入300-400mm的粗硅胶拌样，用DCM︰MeOH＝50︰1作为洗脱剂，使用柱层析方法 最终得淡黄色的化合物14b(产率为45.3％)，HPLC纯度95％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.66(s,1H),9.16(s,1H),8.35(s,1H),7.68(dd,J＝12.9,2.3 Hz,1H),7.39(t,J＝8.8Hz,1H),7.22(d,J＝8.8Hz,1H),6.51(s,1H),4.01(s,3H),1.30(s,9H)。
实施例32 1-(4-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)-3-氟苯基)-3-(5-(叔丁基)异 恶唑-3-基)(化合物14c)的制备
Figure BDA0001218703640000211
称取原料3c(4-氯-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶，500mg,1.0mM)和原料4(4-硝基-2-氟苯酚， 516mg，1.2mM)于100mL圆底烧瓶中，加入10mL的2,6-二甲基吡啶溶解混合物，然后加入 4-二甲氨基吡啶(401mg，1.0mM)，升高温度至147℃反应8h后，减压浓缩加入300-400mm的粗硅胶拌样，用DCM︰MeOH＝50︰1作为洗脱剂，使用柱层析方法最终得黄色的化合物中 间体11c(4-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)-3-氟苯胺，产率为62.5％)，HPLC纯度95％。
称取中间体11c(140mg,1.0mM)和铁粉(145mg，5.0mM)于25mL圆底烧瓶中，加入5mL乙醇和5mL水溶解混合物，然后加入氯化铵(20mg，0.5mM)，升高温度至60℃反应3h，反 应液抽滤，减压浓缩后加入原料4(4-氨基-2-氟苯酚，102mg，1.2mM)于25mL圆底烧瓶中， 加入10mL的甲苯溶解混合物，然后加入滴加2-3滴三乙胺，升高温度至120℃反应5h后， 加入300-400mm的粗硅胶拌样，用DCM︰MeOH＝50︰1作为洗脱剂，使用柱层析方法最终 得淡黄色的化合物14c(产率为30.3％)，HPLC纯度95％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.04(s,1H),9.90(s,1H),9.77(s,1H),8.85(s,1H),8.16(s, 1H),7.23(t,J＝8.7Hz,1H),7.05(t,J＝8.8Hz,1H),6.85～6.78(m,1H),6.70(s,1H),6.59(s,1H), 5.22(d,J＝27.7Hz,1H),1.34～1.01(m,9H)。
实施例33 1-(5-(叔丁基)异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-(吡啶-4-基氧基)苯基)脲(化合物 14d)的制备
Figure BDA0001218703640000212
称取原料3d(4-氯吡啶，100mg,1.0mM)和中间体3(259mg，1.0mM)于100mL圆底烧瓶中，加入10mL的乙腈溶解混合物，然后加入碳酸钾(352mg，2.0mM)，升高温度至80℃反应 8h后，减压浓缩加入300-400mm的粗硅胶拌样，用DCM︰MeOH＝50︰1作为洗脱剂，使用 柱层析方法最终得黄色的化合物14d(产率为62.5％)，HPLC纯度95％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.95(s,3H),6.77(d,J＝16.4Hz,2H),6.22(s,1H),5.51(s, 1H),5.38(d,J＝14.1Hz,3H),1.22(s,9H)。
实施例34 1-(5-(叔丁基)异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-((6-吗啉代吡啶-4-基)氧基)苯基) 脲(化合物14e)的制备
Figure BDA0001218703640000221
称取原料3e(4,6-二氯嘧啶，300mg,1.0mM)和吗啉(176mg，1.0mM)于100mL圆底烧瓶中，加入10mL的二氯甲烷溶解混合物，然后加入碳酸钾(560mg，2.0mM)，常温搅拌反应 4h后，减压浓缩得到黄色固体4-(6-氯嘧啶-4-基)吗啉。称取该固体4-(6-氯嘧啶-4-基)吗 啉(150mg,1.0mM)和中间体3(176mg,1.2mM)于100mL圆底烧瓶中，加入10mL的乙腈溶 解混合物，然后加入碳酸钾加入(138mg，2.0mM)，升高温度至80℃反应8h后，减压浓缩后 加入300-400mm的粗硅胶拌样，用DCM︰MeOH＝50︰1作为洗脱剂，使用柱层析方法最终 得黄色的化合物14e(产率为62.5％)，HPLC纯度95％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.35(s,1H),7.95(s,5H),6.96(s,1H),5.75(s,1H),3.64(d,J ＝4.5Hz,8H),1.24(t,J＝13.3Hz,9H)。
实施例35 1-(5-(叔丁基)异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-((5-硝基吡啶-4-基)氧基)苯基) 脲(化合物14f)的制备
Figure BDA0001218703640000222
称取原料3f(4-氯-5-硝基嘧啶，100mg，1.0mM)和中间体3(184mg，1.0mM)于100mL圆底烧瓶中，加入10mL的乙腈溶解混合物，然后加入碳酸钾(250mg，2.0mM)，升高温度至 80℃反应8h后，减压浓缩加入300-400mm的粗硅胶拌样，用DCM︰MeOH＝50︰1作为洗脱 剂，使用柱层析方法最终得黄色的化合物14f(产率为62.5％)，HPLC纯度95％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.09(s,1H),8.71(s,1H),8.54(t,J＝5.6Hz,1H),8.10(d,J＝ 5.4Hz,1H),7.65(dd,J＝12.6,2.5Hz,1H),7.51(dd,J＝8.8,1.3Hz,1H),7.08(t,J＝9.2Hz,1H), 6.05(s,1H),1.22(s,9H)。
实施例36本发明化合物体外酶活性实验
本实验的目的是测定部分发明化合物11-11d和SKLB707在体外对突变的FLT3激酶(FLT3-ITD、FLT3(D835Y)、FLT3-ITD/F691L和FLT3-ITD/D835V)的亲和力(Kd值)。 1)实验材料
T7噬菌体株、大肠杆菌、HEK-293细胞、链霉亲和素包被的磁性小珠、SeaBlock(Pierce 公司，用于终止反应)、1％BSA(牛血清白蛋白)、0.05％Tween(吐温)20、1mM DTT(二硫苏糖醇)、0.17x PBS(磷酸盐缓冲液)、6mM DTT、聚苯乙烯96孔板、1x PBS、0.5 μM非生物素化亲和配体、100％DMSO(二甲基亚砜)，以上原料由DiscoverRX公司(美国) 提供。AC220和Ponatinib(普纳替尼)购买于Selleck Chemicals(中国，上海)。
Figure BDA0001218703640000231
2)实验方法
待大肠杆菌生长到对数生长期时，于低温下用携带有待测激酶DNA片段的T7噬菌体进 行感染，随后在32℃下震荡孵育，直至大肠杆菌裂解(约孵育90-150min)。裂解物经过离 心(6000g/min)和过滤(0.2μm)后去除细胞碎片，从而得到大量带有待测激酶DNA片段的T7噬菌体。将得到的噬菌体感染HEK-293细胞，利用宿主细胞中的蛋白表达体系生产待检测的激酶蛋白，用此方法生产出的激酶蛋白带有DNA片段，在后续实验中可以通过qPCR技术检测DNA含量从而间接测定激酶的含量。选取与待测激酶具有强亲和力，并且用生物素标记的小分子配体处理链霉亲和素包被的磁珠30min，从而产生亲和树脂用于激酶测定。随后用过量的生物素孵育处理后的磁珠，并用封闭缓冲液(SeaBlock，1％BSA，0.05％Tween20,1mM DTT)进行冲洗，以除去未结合的配体，并减少非特异性结合。接下来，将带有DNA 片段的待测激酶，带有小分子配体的磁珠和特定浓度的化合物溶液共同加到结合缓冲液(20％ SeaBlock，0.17x PBS，0.05％Tween 20,6mM DTT)中进行结合反应。所有反应均在聚苯乙 烯96孔板中进行中，反应液的最终体积是0.135ml。将反应体系在室温下震荡1h，用冲洗 缓冲液(1x PBS，0.05％Tween 20)冲洗亲和磁珠。然后将磁珠再悬浮在洗脱缓冲液(1xPBS, 0.05％Tween 20,0.5μM非生物素化亲和配体)，并在室温下摇动30分钟。在洗脱液中的激 酶浓度通过qPCR测量。各试验化合物3倍梯度稀释的11个测试点是在100％DMSO中制备， 随后在测定时稀释至1x(最终DMSO浓度为1％)。
3)化合物的亲和力测试结果
通过以上测试方法，测试了本发明中的化合物与突变的FLT3激酶(FLT3-ITD、FLT3(D835Y)、FLT3-ITD/F691L和FLT3-ITD/D835V)的结合能力(kd值)。具体部分化合物 的Kd值见表1。其中，“-”表示未测试。
表1化合物与突变的FLT3激酶[FLT3-ITD、FLT3(D835Y)、FLT3-ITD/F691L和 FLT3-ITD/D835V]的亲和力(Kd值)
Figure BDA0001218703640000232
Figure BDA0001218703640000241
表1结果表明，受试化合物在体外酶水平对FLT3-ITD、FLT3(D835Y)、FLT3-ITD/F691L 和FLT3-ITD/D835V(其中，FLT3-ITD/F691L和FLT3-ITD/D835V为临床上发现的AC220耐药突变体)均具有较好的结合能力，其中，针对FLT3-ITD/F691L、FLT3-ITD/D835V突变体，受试化合物SKLB707的活性明显优于阳性化合物AC220；针对FLT3-ITD/D835V突变 体，受试化合物SKLB707的活性也明显优于阳性化合物Ponatinib(普纳替尼)。
实施例37本发明化合物针对AC220耐药细胞株的体外增值抑制实验
本实验的目的是检测本发明化合物对具有AC220耐药二次突变细胞株的增值抑制活性， 采用的方法为MTT(四甲基偶氮唑盐)比色法。
1)实验材料：
主要试剂：RPMI-1640培养基购自Gibco BRL公司(Invitrogen Corporation，USA)，胎 牛血清购自Pan-Biotech公司(Germany)，IL-3(白介素-3)购自PeproTech公司，G418(遗 传霉素)购自Life Science公司。四甲基偶氮唑盐(MTT)、十二烷基磺酸钠(SDS)和DMSO (二甲亚砜)为Sigma公司(USA)产品。化合物用100％DMSO配制成10mM储存液，置 -20℃冰箱避光保存备用，临用时用完全培养液稀释至所需浓度。
细胞系及培养：本实验所用细胞系小鼠原B淋巴细胞Ba/F3和急性髓性白血病细胞MV4-11均购于美国ATCC(American type culture collection)，由本实验室保存。AC220敏感细胞株Ba/F3FLT3-ITD，AC220耐药细胞株Ba/F3FLT3-ITD/D835V和Ba/F3 FLT3-ITD/F691L由Ba/F3细胞采用Amaxa Kit V(Lonza公司)试剂盒进行电转构建。Ba/F3 细胞用含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、10ng/ml IL-3的RPMI-1640 完全培养基在5％CO2、37℃条件下培养。Ba/F3FLT3-ITD、Ba/F3FLT3-ITD/D835V和Ba/F3 FLT3-ITD/F691L使用含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和500μg/mL G418的RPMI-1640完全培养基在5％CO2、37℃条件下培养。
2)实验方法：
在96孔板中加入100μL梯度浓度的受试化合物，DMSO浓度为0.1％，每个剂量组设3个复孔。用完全细胞培养液调整细胞浓度为2×105个/mL的细胞悬液，接种于96孔板，每孔100μl细胞悬液。同时设不含药物的阴性对照组和等体积的完全培养基对照组，在37℃，5％CO2条件下培养。48小时(MV4-11为72h)后，每孔加入浓度为5mg/mL的MTT试剂20μL， 再培养2-4h后，每孔加入50μL 20％SDS(十二烷基硫酸钠)(m：v)，在37℃条件下孵育 过夜，用酶标仪(λ＝570nm)测定吸光度(A)值(A值与活细胞数成正比)，取其平均值。 相对细胞增殖抑制率＝(对照组A570-实验组A570)/(对照组A570-完全培养基A570)×100％。 实验至少重复3次。实验数据用平均值表示，数据统计资料采用t检验，P<0.05为差异有统 计学意义。以下各化合物对细胞增殖抑制作用均用IC50表示。
3)实验结果：
采用MTT比色法，对Ba/F3FLT3-ITD、Ba/F3FLT3-ITD/F691L和Ba/F3FLT3-ITD/D835V 进行了细胞增殖抑制活性测试，结果如表2和图2A所示。
表2化合物对各细胞株的增殖抑制活性(IC50：nM)
Figure BDA0001218703640000251
表2和图2A结果表明，受试化合物不仅对AC220敏感的细胞株Ba/F3FLT3-ITD具有很 强的抑制活性，对于具有AC220耐药突变的细胞株Ba/F3Ba/F3FLT3-ITD/D835V及 FLT3-ITD/F691L同样具有很好的抑制能力，可以有效克服AC220在临床上产生的耐药突变。
实施例38化合物SKLB707体外细胞凋亡检测实验
本实验的目的是检测本发明化合物SKLB707在体外引起MV4-11以及实验室自主构建细 胞株Ba/F3FLT3-ITD、Ba/F3FLT3-ITD/D835V和Ba/F3FLT3-ITD/F691L凋亡的情况。加药 处理细胞一段时间后，收集细胞进行Annexin V/PI双染，随后用流式细胞仪进行检测。
1)实验材料：
主要试剂：RPMI-1640和IMDM培养基购自Gibco BRL公司(InvitrogenCorporation， USA)，胎牛血清购自Pan-Biotech公司(Germany)，G418购自Life Science公司。PBS购 自北京中杉金桥生物技术有限公司。细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。 化合物用100％DMSO配制成10mM储存液，置-20℃冰箱避光保存备用，临用时用完全培养 液稀释至所需浓度。
细胞系及培养：细胞株Ba/F3FLT3-ITD、Ba/F3FLT3-ITD/D835V和Ba/F3 FLT3-ITD/F691L使用含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、500μg/ml G418 的RPMI-1640完全培养基在5％CO2、37℃条件下培养。MV4-11细胞使用含20％胎牛血清的 IMDM完全培养基在5％CO2、37℃条件下培养。
2)实验方法：
将待测细胞以每孔2×105个/孔的数目接种于6孔板中，同时加入不同浓度的受试化合物 SKLB707溶液，将6孔板置于细胞培养箱中培养24h。之后，将细胞悬液收集至相应流式管 中，并用PBS洗涤两次，随后加入500μL Binding Buffer(结合缓冲液)重悬细胞。细胞重悬 后向流式管中依次加入5μL Annexin V-FITC(磷脂结合蛋白-异硫氰酸荧光素)溶液和5μL PI (碘化丙啶)溶液，混匀。在室温下避光孵育5-10min，立即用流式细胞仪进行检测。
3)实验结果：
如图1所示，在细胞MV4-11和Ba/F3FLT3-ITD中，SKLB707可以诱导细胞产生明显的凋亡。在AC220耐药细胞株Ba/F3FLT3-ITD/D835V和Ba/F3FLT3-ITD/F691L中，SKLB707同样可以诱导细胞产生明显的凋亡，并且增加给药浓度，凋亡细胞的数目也随之增加。SKLB707在1、5、10、50和100nM时诱导MV4-11细胞凋亡的比例分别为38.2％、65.2％、70.3％、73.2％和81.25％；SKLB707在1、5、10、50和100nM时诱导Ba/F3FLT3-ITD细胞凋亡的比 例分别为6.4％、39.1％、44.2％、73.3％和81.25％；SKLB707在1、5、10、50和100nM时诱 导Ba/F3FLT3-ITD/F691L细胞凋亡的比例分别为5.18％、6.6％、11.67％、37.1％和45.35％；SKLB707在1、5、10、50和100nM时诱导Ba/F3FLT3-ITD/D835V细胞凋亡的比例分别为5.66％、7.72％、13.08％、39.11％和60.01％。
实施例39化合物SKLB707对FLT3信号通路体外检测实验
本实验的目的是检测发明化合物SKLB707在体外细胞水平上对FLT3信号通路抑制情 况。本实验使用MV4-11以及实验室自主构建细胞株Ba/F3FLT3-ITD、Ba/F3FLT3-ITD/D835V 和Ba/F3FLT3-ITD/F691L，加药处理细胞一定时间后提取总蛋白，用Western blot的方法检 测信号FLT3信号通路相关蛋白的表达水平。
1)实验材料：
主要试剂：RPMI-1640和IMDM培养基购自Gibco BRL公司(InvitrogenCorporation， USA)，胎牛血清购自Pan-Biotech公司(Germany)，G418购自Life Science公司，生理盐 水购自四川科伦药业股份有限公司，RIPA裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司， Cocktail(蛋白酶抑制剂)和PMSF(苯甲基磺酰氟)购自Sigma公司，BCA蛋白定量试剂盒购自 西安赫特生物科技有限公司。FLT3抗体购自Santa Cruz公司，β-actin抗体购自北京中杉金桥 公司，其余抗体均购自Cell Signaling Technology公司。HRP(辣根过氧化酶)标记的二抗购 自北京中山金桥公司，PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜)和显影底物购自millipore公司。化合物 用100％DMSO配制成10mM储存液，置-20℃冰箱避光保存备用，临用时用完全培养液稀释 至所需浓度。
细胞系及培养：细胞株Ba/F3FLT3-ITD、Ba/F3FLT3-ITD/D835V和Ba/F3 FLT3-ITD/F691L使用含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和500μg/ml G418 的RPMI-1640完全培养基在5％CO2、37℃条件下培养。MV4-11使用含20％胎牛血清的IMDM 完全培养基在5％CO2、37℃条件下培养。
2)实验方法：
将待测细胞接种到6孔板中，扩增到合适的细胞密度后，加入不同浓度的受试化合物， 在37℃，5％CO2条件下培养1个小时。将细胞离心收集起来，用预冷的生理盐水洗涤细胞两 次，并同时将细胞转移到1.5mL离心管中，吸取并弃除上清，加入适当体积的RIPA裂解液 (含1％cocktail和1％PMSF)。涡旋以使细胞完全重悬在裂解液中，并立即置于冰上裂解。 约15min后，用超声破碎仪器进行细胞破碎。随后将处理后的细胞置于低温高速离心机中离 心(13000r/min，15min)以除去细胞碎片。用BCA(二喹啉甲酸)法进行蛋白定量，同时用BSA(牛血清蛋白)标准蛋白制作标准曲线，根据标准曲线计算各组蛋白浓度，统一各组蛋白样品的浓度后，向其中加入5×蛋白上样缓冲液，随后放入100℃干式恒温器中保持10min， 使蛋白变性。处理好的蛋白样品按所需量分装后保存于-20℃备用。蛋白样品避免反复冻融。
待检测样品时，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白。电泳分离完毕，采用槽式湿转法将蛋白转移至PVDF膜上，再将PVDF膜置于含5％(m:v)脱脂奶粉的TBS/T (三羟甲基氨基甲烷-盐酸/吐温缓冲盐溶液)中封闭2h，剪开不同分子量的蛋白条带，按相 应抗体说明书推荐的稀释比例稀释一抗并在4℃冰箱孵育条带过夜。次日，取出各条带，用TBS/T缓冲液漂洗后加入1:5000稀释的HRP标记的二抗，在37℃孵育1h，随后，用TBS/T 洗脱除去过量抗体，在PVDF膜上均匀滴加HRP底物后，置于快速凝胶成像系统中显影。
3)实验结果：
图2B为化合物SKLB707和AC220对FLT3信号通路各关键蛋白的抑制作用。其中，pFLT3 表示磷酸化的FLT3，Total FLT3表示总的FLT3水平，pSTAT5表示磷酸化的STAT5，Total STAT5表示总的STAT5含量，pErk1/2表示磷酸化的Erk1/2，Total Erk1/2表示总的Erk1/2含 量，β-actin表示β-肌动蛋白的含量。
根据图2B中结果所示，在AC220敏感细胞株Ba/F3FLT3-ITD和MV4-11上，SKLB707可以剂量依赖性地抑制FLT3的自磷酸化水平，而不影响FLT3总蛋白的表达水平。同样，FLT3激酶下游蛋白STAT5和Erk1/2的磷酸化也被明显抑制。AC220对这些蛋白的磷酸化也有抑制作用，但抑制效果与同等剂量的SKLB707相比较弱。
根据图2B中结果所示，在AC220耐药细胞株Ba/F3FLT3-ITD/D835V和Ba/F3FLT3-ITD/F691L 中，SKLB707可以剂量依赖性地抑制FLT3受体的自磷酸化水平，而不影响FLT3总蛋白的 表达水平。同样，FLT3激酶下游蛋白STAT5和Erk1/2的磷酸化也被明显抑制。而相同剂量 的AC220则对这些蛋白的磷酸化水平没有明显的抑制效果，说明FLT3激酶在发生两次突变 后，SKLB707依然能够结合于其活性区域，克服AC220耐药的现象。
实施例40化合物SKLB707体内药效检测实验
本实验的目的是检测发明化合物SKLB707在体内药效。将MV4-11皮下接种于NODSCID小鼠，构建肿瘤异种移植模型，以AC220为阳性对照，检测SKLB707抑制皮下瘤生长 情况。
1)实验材料：
主要试剂：IMDM培养基购自Gibco BRL公司(Invitrogen Corporation，USA)，胎牛血 清购自Pan-Biotech公司(Germany)。PEG400(聚乙二醇400)和DMSO购于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。p-FLT3，p-STAT5，p-ERK抗体均购于Cell Signaling Technology公司。
细胞及实验动物：MV4-11使用含20％胎牛血清的IMDM完全培养基在5％CO2、37℃条件下培养。NOD SCID小鼠(雌性5-6周龄的免疫缺陷小鼠)购于北京维通利华实验动物 技术有限公司。
2)实验方法：
扩大培养MV4-11细胞，收集处于对数生长周期的细胞，用不含血清及抗生素的IMDM 培养基重悬细胞，离心、清洗三次，最后一次计数使细胞浓度为1×10 8个/mL。接种100μL 的细胞悬液至NOD SCID小鼠右侧面的的背部皮下，构建MV4-11小鼠皮下瘤模型。待肿瘤 长至约400mm3的体积时，将小鼠随机分为5个组，每组6只，开始灌胃给药。这5个组 分别为溶剂对照组、SKLB707 1mg/kg组、SKLB707 3mg/kg组、SKLB707 10mg/kg组以及 AC2203mg/kg组。以5％DMSO、25％的PEG400(用灭菌水配成50％的PEG400)和75％的 灭菌水为溶剂，逐次加入称好的化合物中，配制相应不同浓度的药物储备液。配好后分装保 存于4℃冰箱中备用。口服灌胃给药，每天给药一次，每三天测量一次肿瘤体积和小鼠体重， 给药21天后结束实验。给药过程中观察动物的一般状况，如进食情况、精神状态、皮肤颜色 及光泽以及有无腹泻状况等等。肿瘤体积计算公式：肿瘤体积＝L×W 2/2；其中，L和W分 别为肿瘤长径和短径。
3)实验结果：
如图3所示，不同剂量的SKLB707都可以完全消除小鼠皮下瘤(图3A)，并且老鼠的体重没有下降(图3B)，老鼠的状态同样也没有明显变化。SKLB707 10mg/kg组在给药11 天可以完全消掉肿瘤；SKLB707 1mg/kg组，SKLB707 3mg/kg组和AC220 3mg/kg组在给药 12天都可以完全消掉肿瘤，表明SKLB707抑制肿瘤生长的效果同AC220相当。小鼠肿瘤异 种移植模型实验表明，SKLB707在体内具有很好的抑瘤效果。
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Claims (17)

1.取代的1-(异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-苯基)脲衍生物，其结构式如式Ⅰ所示：
Figure FDA0002574946430000011
其中，X为碳或氮；Y为氧；
R1、R2独立地为-H、-NO2、卤素或
Figure FDA0002574946430000012
或者R1和R2组合成环，所述的环为取代的苯基、取代的5～6元不饱和的杂环基；所述的5～6元不饱和的杂环基含有1个氮原子；
所述苯基、取代的5～6元不饱和的杂环基上的取代基为-H、卤素、C1～C4烷氧基、
Figure FDA0002574946430000013
或
Figure FDA0002574946430000014
n＝1～4；
R6为卤素、C1～C6烷氧基、
Figure FDA0002574946430000015
-N(CH3)2、
Figure FDA0002574946430000016
或苯基。
2.根据权利要求1所述的取代的1-(异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-苯基)脲衍生物，其特征在于：
X为碳或氮；Y为氧；
R1、R2独立地为-H、-NO2、卤素或
Figure FDA0002574946430000017
或者R1和R2组合成环，所述的环为取代的苯基、取代的5～6元不饱和的杂环基；所述的5～6元不饱和的杂环基含有1个氮原子；
所述苯基、取代的5～6元不饱和的杂环基上的取代基为-H、-Cl、C1～C4烷氧基、
Figure FDA0002574946430000018
或
Figure FDA0002574946430000019
n＝1～4；
R6为C1～C6烷氧基、
Figure FDA00025749464300000110
-N(CH3)2、
Figure FDA00025749464300000111
或苯基。
3.根据权利要求1或2所述的取代的1-(异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-苯基)脲衍生物，其特征在于：当X为氮，Y为氧，R1和R2环合为取代的苯基时，所述取代的1-(异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-苯基)脲衍生物的结构式如式Ⅱ所示：
Figure FDA00025749464300000112
其中，R3、R4独立地为-H、卤素、C1～C4烷氧基、
Figure FDA00025749464300000113
或
Figure FDA00025749464300000114
n＝1～4；
R6为卤素、C1～C6烷氧基、
Figure FDA00025749464300000115
-N(CH3)2、
Figure FDA00025749464300000116
或苯基。
4.根据权利要求3所述的取代的1-(异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-苯基)脲衍生物，其特征在于：R3、R4独立地为-H、卤素、C1～C4烷氧基、
Figure FDA0002574946430000021
或
Figure FDA0002574946430000022
n＝1～4；R6为C1～C6烷氧基、
Figure FDA0002574946430000023
-N(CH3)2、
Figure FDA0002574946430000024
或苯基。
5.根据权利要求4所述的取代的1-(异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-苯基)脲衍生物，其特征在于：R3、R4独立地为-H、C1～C4烷氧基、
Figure FDA0002574946430000025
或
Figure FDA0002574946430000026
n＝1～4；R6为C1～C6烷氧基、
Figure FDA0002574946430000027
-N(CH3)2、
Figure FDA0002574946430000028
或苯基。
6.根据权利要求1或2所述的取代的1-(异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-苯基)脲衍生物，其特征在于：当X为氮，Y为氧，R1和R2环合为含有1个氮原子的取代不饱和6元杂环基时，所述取代的1-(异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-苯基)脲衍生物的结构式如式Ⅲ所示：
Figure FDA0002574946430000029
其中，R5为-H、卤素、C1～C4烷氧基、
Figure FDA00025749464300000210
或
Figure FDA00025749464300000211
n＝1～4；
R6为卤素、C1～C6烷氧基、
Figure FDA00025749464300000212
-N(CH3)2、
Figure FDA00025749464300000213
或苯基。
7.根据权利要求6所述的取代的1-(异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-苯基)脲衍生物，其特征在于：R5为-H、卤素、C1～C4烷氧基或
Figure FDA00025749464300000214
n＝1～4；R6为卤素、C1～C6烷氧基、
Figure FDA00025749464300000215
或苯基。
8.根据权利要求7所述的取代的1-(异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-苯基)脲衍生物，其特征在于：R5为-H、卤素、C1～C4烷氧基或
Figure FDA00025749464300000216
n＝1～4；R6为卤素、C1～C6烷氧基或
Figure FDA00025749464300000217
9.取代的1-(异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-苯基)脲衍生物，其结构式为：
Figure FDA00025749464300000218
Figure FDA0002574946430000031
或
Figure FDA0002574946430000032
10.权利要求1～9任一项所述的取代的1-(异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-苯基)脲衍生物药学上可接受的盐。
11.一种组合物，是由权利要求1～9任一项所述的取代的1-(异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-苯基)脲衍生物添加药学上可以接受的辅助性成分制备而成的。
12.权利要求1～9任一项所述的取代的1-(异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-苯基)脲衍生物、权利要求10所述的盐在制备FMS-样酪氨酸激酶3抑制剂中的用途。
13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于：所述的FMS-样酪氨酸激酶3抑制剂，为针对FLT3酪氨酸激酶内部串联重复突变(FLT3-ITD)或在FLT3酪氨酸激酶原有内部串联重复突变(FLT3-ITD)基础上产生的单个氨基酸突变的耐药的FLT3-ITD-F691L或FLT3-ITD-D835Y抑制剂。
14.权利要求1～9任一项所述的取代的1-(异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-苯基)脲衍生物、权利要求10所述的盐在制备治疗急性髓性白血病药物中的用途。
15.权利要求1～9任一项所述的取代的1-(异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-苯基)脲衍生物、权利要求10所述的盐在制备抗自身免疫性疾病药物中的用途。
16.权利要求1～9任一项所述的取代的1-(异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-苯基)脲衍生物、权利要求10所述的盐在制备新生血管生成抑制剂中的用途。
17.权利要求1～9任一项所述的取代的1-(异恶唑-3-基)-3-(3-氟-4-苯基)脲衍生物、权利要求10所述的盐在制备抗肿瘤药物中的用途。
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