CN108344832A

CN108344832A - 一种主成分与其杂质完全分离的检测方法

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Publication number: CN108344832A
Application number: CN201711471312.0A
Authority: CN
Inventors: 赵旺明; 翟富民; 朱海峰; 包华兰; 石文革
Original assignee: Jiangsu Yue Xing Medical Technology Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Yue Xing Medical Technology Co Ltd
Priority date: 2017-12-28
Filing date: 2017-12-28
Publication date: 2018-07-31
Anticipated expiration: 2037-12-28
Also published as: CN108344832B

Abstract

本发明公开了一种主成分与其杂质完全分离的检测方法，其特征在于：采用反相高效液相色谱法,以苯基液相色谱柱，采用二极管阵列检测器,采用梯度洗脱程序，以一定比例的缓冲盐溶液一钠盐一有机相为流动相。本发明的优点是：本发明方法专属性强,准确度高,操作简便。

Description

一种主成分与其杂质完全分离的检测方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种主成分与其杂质完全分离的检测方法。

背景技术

2-[(2R)-2-羟基-3-[[4-(3-氧代-4-吗啉基)苯基]氨基]丙基]-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮(主成分)在生产时采用4-(4-氨基苯基)吗啉-3-酮与(S)-(+)-N-(2,3-乙氧基丙基)邻苯二甲酰亚胺反应生成。这两种起始物料中有杂质残留并且在合成主成份的过程中会生成副产物，需在检测过程中控制这些杂质的残留。现有的2-[(2R)-2-羟基-3-[[4-(3-氧代-4-吗啉基)苯基]氨基]丙基]-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮与其杂质完全分离的检测方法，专属性不强,准确度底,操作复杂。因此，应该提供一种新的技术方案解决上述问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种主成分与其杂质完全分离的检测方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种主成分与其杂质完全分离的检测方法,采用反相高效液相色谱法,以苯基液相色谱柱，采用二极管阵列检测器,采用梯度洗脱程序，以一定比例的缓冲盐溶液一钠盐一有机相为流动相。

进一步的技术方案：

色谱柱选自安捷伦ZORBAX-SB，250mm*4.6mm*5μm。

所述有机相为甲醇、乙腈、丙醇、异丙醇中的一种。

优选的，所述有机相为甲醇。

所述缓冲盐溶液为磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、高氯酸盐中的一种。

优选的，所述缓冲盐溶液为磷酸盐，缓冲盐溶液pH为6.8。

所述钠盐为氢氧化钠、乙酸钠、硫酸钠中的一种。

优选的，所述钠盐为氢氧化钠。

一种2-[(2R)-2-羟基-3-[[4-(3-氧代-4-吗啉基)苯基]氨基]丙基]-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮与其杂质完全分离的检测方法,包括以下几个步骤，

1)、取2-[(2R)-2-羟基-3-[[4-(3-氧代-4-吗啉基)苯基]氨基]丙基]-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮样品适量，分别用甲醇溶解样品，配制成每lmL含2-[(2R)-2-羟基-3-[[4-(3-氧代-4-吗啉基)苯基]氨基]丙基]-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮0.1～1.5mg的样品溶液；

2)、设置流动相流速为0.5～1.5mL/min，检测波长为200～240nm，色谱柱柱温箱温度为20～40℃，进样量为5～30μL；

3)、流动相A为pH6.8磷酸盐缓冲液，甲醇为95：5，流动相B为甲醇，梯度洗脱程序为：

进一步的，步骤2)所述的检测波长为220nm流速为1.0ml/min，色谱柱柱温箱为30℃，进样量为10μL

本发明的优点是：本发明方法专属性强,准确度高,操作简便。

附图说明

图1：专属性-空白溶液色谱图

图2：专属性-4-硝酮定位用溶液色谱图

图3：专属性-亚胺定位用溶液色谱图

图4：专属性-主成份定位用溶液色谱图

图5：专属性-二取代定位用溶液色谱图

图6：系统适用性溶液色谱图

图7：定量限试验色谱图

图8：检测限试验色谱图

图9：进样精密度试验色谱图

图10：重复性试验色谱图

图11：中间精密度试验色谱图

图12：耐用性-未改变色谱图

图13：耐用性-pH-6.6色谱图

图14：耐用性-pH-7.0色谱图

图15：耐用性-波长-218nm色谱图

图16：耐用性-波长-222nm色谱图

图17：耐用性-流速-0.8ml/min色谱图

图18：耐用性-流速-1.2ml/min色谱图

图19：耐用性-柱温-28℃色谱图

图20：耐用性-柱温-32℃色谱图

具体实施方式

2-[(2R)-2-羟基-3-[[4-(3-氧代-4-吗啉基)苯基]氨基]丙基]-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮(以下简称主成分)在生产时采用4-(4-氨基苯基)吗啉-3-酮与(S)-(+)-N-(2,3-乙氧基丙基)邻苯二甲酰亚胺反应生成。这两种起始物料中有杂质残留并且在合成主成份的过程中会生成副产物，需在检测过程中控制这些杂质的残留。

本方法有限考虑了4种杂质，需控制的杂质名称及结构式见表1：

表1杂质结构及来源

需验证的主成份纯度验证方法：

待验证的纯度检测条件：

色谱柱：安捷伦ZORBAX-SB 250mm*4.6mm*5um

进样量：10ul，流速：1.0ml/min，柱温：30℃，波长：220nm流动相组成：

流动相A：Ph6.8磷酸盐缓冲液(1L水中含1.36g的磷酸二氢钾+0.188g的氢氧化钠)：甲醇＝95:5，流动相B：甲醇

t/min	A％	B％
			0.0	95	5
20.0	90	10
			37.0	65	35
42.0	65	35
			43.0	95	5
55.0	95	5

色谱方法的方法学验证

专属性试验：

主成分定位用溶液/样品浓度(500ug/ml)：

精密称取25mg本品至50ml容量瓶中，加入10ml甲醇及适量纯化水溶解后用纯化水定容至刻度，混匀。

4-氨酮母液：

精密称取25mg至50ml容量瓶中，加入10ml甲醇及适量纯化水溶解后用纯化水定容至刻度，混匀。

4-硝酮母液：

亚胺母液：

二取代母液：

精密称取100mg至100ml容量瓶中，加入20ml甲醇及适量纯化水溶解后用纯化水定容至刻度，混匀。

空白溶液(20％甲醇水溶液)：

在50ml容量瓶中加入10ml甲醇后用纯化水稀释定容至刻度，混匀。专属性试验溶液：

精密移取各杂质母液、主成分母液各适量，至同一容量瓶中，配制成各杂质及主成分均为50ug/ml的混合溶液，混匀。用来考察专属性、分离度。

各杂质及主成分定位溶液：

精密移取各杂质及主成分母液适量，分别配制成50ug/ml的定位用溶液。

将空白溶液、专属性试验溶液、主成分定位用溶液、4-氨酮定位用溶液、4-硝酮定位用溶液、亚胺定位用溶液、二取代定位用溶液分别注入液相色谱仪，记录色谱图。

表2专属性试验验证结果

结论：1.各峰间分离度符合预设要求；2.理论塔板数符合预设要求；3.各峰峰纯度小于纯度阈值。

进样精密度试验：

精密称取本品49.05mg至100ml容量瓶中，加入20ml甲醇和适量纯化水溶解后用纯化水稀释定容至刻度。同法配制空白溶液。

将空白溶液和样品进样重复性试验溶液分别注入液相色谱仪，记录色谱图。

表3各杂质与主成份进样精密度试验结果

结论：4-氨酮、4-硝酮、亚胺、主成分、二取代的RSD为2.06％、2.38％、0.52％、0.12％、3.10％；最大单杂的RSD为0.36％，但相对保留时间为0.34的未知杂质呈逐渐增大趋势，RSD为57.93％，主成分的RSD符合要求。溶液需现配现进。

定量限试验：

根据系统适用性溶液的各峰的信噪比，计算出由此信噪比直接稀释至10:1时所需的稀释稀释体积，稀释得到定量限试验溶液。

各色谱峰信号强度与基线噪音之比约为10:1。

表4各杂质与主成份定量限试验结果

检测限试验：

将定量限试验溶液稀释3倍，得到检测限试验溶液。

各色谱峰信号强度与基线噪音之比约为3:1。

表5各杂质与主成份检测限试验结果

主成份线性试验：

线性溶液6(150％)：精密称取37.5mg本品至50ml容量瓶中，加入10ml甲醇及适量纯化水溶解后用纯化水定容至刻度，混匀。

线性溶液5(100％)：精密称取25mg本品至50ml容量瓶中，加入10ml甲醇及适量纯化水溶解后用纯化水定容至刻度，混匀。

线性溶液4(70％)：精密移取线性溶液5(100％)7ml至10ml容量瓶中，用20％甲醇水溶液定容至刻度。

线性溶液3(50％)：精密移取线性溶液5(100％)5ml至10ml容量瓶中，用20％甲醇水溶液定容至刻度。

线性溶液2(20％)：精密移取线性溶液5(100％)2ml至10ml容量瓶中，用20％甲醇水溶液定容至刻度。

线性溶液1(2％)：精密移取线性溶液2(20％)1ml至10ml容量瓶中，用20％甲醇水溶液定容至刻度。

将6份线性溶液分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以主成分的实际浓度为横坐标，以主成分的峰面积为纵坐标，进行线性回归分析，主成分线性相关系数(R²)应大于0.999。

表6主成份线性试验结果

结论：主成分在0.01mg/ml～0.69mg/ml之间呈现良好线性关系，线性方程为y＝56407x+296.58，相关系数R²为0.9997。

重复性试验：

分别配制6份样品溶液，现配现进。同法配制空白溶液。

主成分RSD≤2.0％。

表7各杂质与主成份重复性试验结果

结论：主成分的RSD符合要求。

中间精密度试验：

在不同时间使用不同厂家仪器由不同人员使用同型号不同批号的色谱柱，分别配制6份样品溶液，现配现进。同法配制空白溶液。

主成分的重复性与中间精密度的12组数据相比较，纯度检测结果的RSD≤2.0％。

表8主成份与杂质中间精密度试验结果

结论：主成分的重复性与中间精密度的12组数据的RSD为0.036％。符合要求。

耐用性试验：

改变流速(0.9ml/min、1.1ml/min)、波长(218nm、222nm)、柱温(28℃、32℃)、流动相的pH(6.6、7.0)后检测本品主成分纯度，与未改变条件的检测结果对比。

配制样品溶液，现配现进。同法配制空白溶液。

改变条件后的检测结果与为改变的检测结果相比较，主成分纯度的RSD≤2.0％。

表9耐用性试验结果

结论：本方法对流速、柱温、检测波长、流动相的pH值耐用性良好，且各杂质之间无干扰，分离度大于1.5。

经验证的主成份纯度检测方法

检测方法：

色谱柱：安捷伦ZORBAX-SB 250mm*4.6mm*5um

流动相A：Ph6.8磷酸盐缓冲液：甲醇＝95:5，流动相B：甲醇

t/min	A％	B％
			0.0	95	5
20.0	90	10
			37.0	65	35
42.0	65	35
			43.0	95	5
55.0	95	5

主成份纯度检测结果

Claims

1.一种主成分与其杂质完全分离的检测方法,其特征在于：采用反相高效液相色谱法,以苯基液相色谱柱，采用二极管阵列检测器,采用梯度洗脱程序，以一定比例的缓冲盐溶液一钠盐一有机相为流动相。

2.根据权利要求1所述的一种主成分与其杂质完全分离的检测方法,其特征在于：色谱柱选自安捷伦ZORBAX-SB，250mm*4.6mm*5μm。

3.根据权利要求1所述的一种主成分与其杂质完全分离的检测方法,其特征在于：所述有机相为甲醇、乙腈、丙醇、异丙醇中的一种。

4.根据权利要求1所述的一种主成分与其杂质完全分离的检测方法,其特征在于：所述有机相为甲醇。

5.根据权利要求1所述的一种主成分与其杂质完全分离的检测方法,其特征在于：所述缓冲盐溶液为磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、高氯酸盐中的一种。

6.根据权利要求5所述的一种主成分与其杂质完全分离的检测方法,其特征在于：所述缓冲盐溶液为磷酸盐，缓冲盐溶液pH为6.8。

7.根据权利要求1所述的一种主成分与其杂质完全分离的检测方法,其特征在于：所述钠盐为氢氧化钠、乙酸钠、硫酸钠中的一种。

8.根据权利要求7所述的一种主成分与其杂质完全分离的检测方法,其特征在于：所述钠盐为氢氧化钠。

9.根据权利要求1所述的一种主成分与其杂质完全分离的检测方法,其特征在于：包括以下几个步骤，

t/min A％ B％ 0.0 95 5 20.0 90 10 37.0 65 35 42.0 65 35 43.0 95 5 55.0 95 5

10.根据权利要求的9所述的一种主成分与其杂质完全分离的检测方法，其特征在于：步骤2)所述的检测波长为220nm流速为1.0ml/min，色谱柱柱温箱为30℃，进样量为10μL。