CN108330111B

CN108330111B - 细胞色素p450突变蛋白及其应用

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Publication number: CN108330111B
Application number: CN201710057245.1A
Authority: CN
Inventors: 周志华; 王平平; 严兴; 孙凤娇; 程宜兴; 杨成帅
Original assignee: Shenghe Everything Suzhou Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shenghe Everything Shanghai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-01-20
Filing date: 2017-01-20
Publication date: 2023-01-31
Anticipated expiration: 2037-01-20
Also published as: WO2018133844A1; JP2020513843A; KR102310518B1; CN108330111A; KR20190129840A; JP7090266B2

Abstract

本发明提供了一种细胞色素P450突变蛋白及其应用，具体地，本发明对细胞色素P450 CYP716A47中的关键位点进行改造后，可以显著提高PPD产量以及PPD/DM比例。

Description

细胞色素P450突变蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和植物生物学、天然产物药物领域，具体地，本发明涉及一种细胞色素P450突变蛋白及其应用。

背景技术

人参皂苷是五加科人参属植物(如人参、三七、西洋参等)中的主要活性物质，近年来在葫芦科植物绞股蓝中也发现一些人参皂苷。目前，国内外科学家已经从人参、绞股蓝等植物中分离出了至少100多种人参皂苷，这些皂苷在人参中的含量差别非常大。其中一些疗效显着的三萜皂苷在天然总皂苷中含量极低(亦被称为稀有皂苷)，由于提取的成本很高，所以价格就非常昂贵。目前多种皂苷已经用于临床，如以人参皂苷Rg3单体为主要成分的药物参一胶囊可改善肿瘤患者的气虚症状，提高机体免疫功能。以人参皂苷Rh2单体为主要成分的今幸胶囊是一种保健药品用于提高机体免疫力，增强抗病能力。

由于稀有人参皂苷往往具有独特生物活性或更显著疗效，传统制备稀有人参皂苷都是从人参或三七中提取的大量皂苷经过化学水解法、酶法水解和微生物法水解来制备。由于野生的人参资源已基本耗竭，人参总皂苷资源目前主要来源于人参或三七的人工栽培，而其人工栽培的生长周期长(一般需要5-7年以上)，并且受到地域的限制，还经常受到病虫害而需要施用大量的农药，所以，人参或三七的人工栽培有严重的连作障碍(人参或三七种植地需要休耕5-15年以上才能克服连作障碍)，所以人参皂苷的产量、品质及安全性都面临挑战。另一方面，以人参总皂苷为原料来制备单一成分的皂苷，因为总皂苷中还有大量的成份无法转化为目标人参皂苷单体(例如原人参三醇型皂苷)无法得到利用，不仅造成资源的浪费，还会增加抽提纯化成本。

合成生物学的发展为植物来源的天然产物的异源合成提供了新的机遇。以酵母为底盘，通过代谢途径的组装和优化，已经实现了用廉价的单糖来发酵合成青蒿酸或者双氢青蒿酸，继而再通过一步化学转化的方法生产青蒿素，这表明合成生物学在天然产物的药物合成方面具有的巨大潜力。利用酵母底盘细胞通过合成生物学方法异源合成稀有人参皂苷单体，原料为廉价的单糖，制备过程为安全性可调控的发酵过程，避免了任何外来污染(例如，原料植物人工种植时使用的农药)，因此，通过合成生物学技术制备稀有人参皂苷单体，不仅具有成本优势，而且，可以保证成品的品质与安全性。利用合成生物学技术制备足够量的各种高纯度稀有人参皂苷单体，用于活性测定及临床实验，促进稀有人参皂苷的创新药物研发。

利用合成生物学方法来人工合成具有药用活性的人参皂苷，首要需要解析与重构原人参二醇PPD的合成代谢途径。由于人参皂苷属于三萜化合物，植物中MVA和MEP代谢途径提供了萜类化合物的共同前体IPP和DMAPP，为三萜化合物前体角鲨烯和2,3-环氧角鲨烯的合成奠定了基础由于目前的细胞色素P450 蛋白催化达玛烯二醇合成原人参二醇催化活性很低，在利用微生物细胞工厂生产PPD时是一个限速步骤，不仅限制了PPD产量的提高也导致了中间产物DM的积累。

因此，本领域需要对细胞色素P450进行更多的研究和改造，以获得更高效的细胞色素P450蛋白元件从而促进人参皂苷细胞工厂合成效率。

发明内容

本发明提供了一种细胞色素P450突变蛋白，通过采用所述的突变蛋白可以产生很高的PPD产量以及PPD/DM比例。

本发明的第一方面提供了一种细胞色素P450的突变蛋白，所述的突变蛋白为非天然蛋白，且所述突变蛋白具有催化生成原人参二醇的催化活性，并且所述突变蛋白在野生型的细胞色素P450的对应于SEQ ID NO.:1的选自下组的一个或多个与酶催化活性相关的核心氨基酸发生突变：

第91位脯氨酸(P)；

第87位亮氨酸(L)；

第235位赖氨酸(K)；

第349位赖氨酸(K)；

第366位缬氨酸(V)；

第231位天冬酰胺(N)；

第285位丝氨酸(S)；

第113位谷氨酰胺(Q)；

第18位亮氨酸(L)；和/或

缺失第1-4位中的1、2、3、或4个氨基酸。

在另一优选例中，所述突变蛋白缺失SEQ ID NO.:1的选自下组的一个或多个氨基酸：

第1位甲硫氨酸(M)；

第2位丙氨酸(A)；

第3位丙氨酸(A)；

第4位丙氨酸(A)。

在另一优选例中，所述的突变蛋白缺失SEQ ID NO.:1中1-4位，且第18位亮氨酸(L)发生突变。

在另一优选例中，所述的突变蛋白缺失SEQ ID NO.:1中1-4位，且第18位亮氨酸(L)突变为异亮氨酸(I)。

在另一优选例中，所述第87位亮氨酸(L)突变为异亮氨酸(I)；和/或

第235位赖氨酸(K)突变为精氨酸(R)；和/或

第349位赖氨酸(K)突变为精氨酸(R)；和/或

第366位缬氨酸(V)突变为异亮氨酸(I)；和/或

第231位天冬酰胺(N)突变为酪氨酸(Y)；和/或

第285位丝氨酸(S)突变为半胱氨酸(C)；和/或

第91位脯氨酸(P)突变为组氨酸(H)；和/或

第113位谷氨酰胺(Q)突变为精氨酸(R)；和/或

第18为亮氨酸(L)突变为异亮氨酸(I)。

在另一优选例中，所述的突变选自下组：L87I；K235R；K349R和V366I；N231Y 和S285C；P91H；Q113R。

在另一优选例中，所述细胞色素P450的突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2-8所示。

在另一优选例中，所述的突变蛋白除所述突变(如87、235、349、366、231、 285、91、113位、18位、和/或1-4位氨基酸)外，其余的氨基酸序列与SEQ ID NO.:1 所示的序列相同或基本相同。

在另一优选例中，所述的基本相同是至多有50个(较佳地为1-20个，更佳地为 1-10个、更佳地1-5个)氨基酸不相同，其中，所述的不相同包括氨基酸的取代、缺失或添加，且所述的突变蛋白仍具有催化生成原人参二醇的催化活性活性。

在另一优选例中，与SEQ ID NO.:1所示序列的同源性至少为80％，较佳地至少为85％或90％，更佳地至少为95％，最佳地至少为98％，且同源性≤485/486或 99.79％。

在另一优选例中，所述细胞色素P450的突变蛋白催化达玛烯二醇(DM)反应生成原人参二醇(PPD)。

在另一优选例中，所述细胞色素P450的突变蛋白催化达玛烯二醇(DM)的 C12位发生羟基化，生成原人参二醇(PPD)。

在另一优选例中，所述的细胞色素P450的突变蛋白催化如下反应：

在另一优选例中，所述反应具有选自下组的一个或多个特点：

(i)反应体系的pH为5.0-9.0，较佳地，7.0-8.0，更佳地，7.4-7.5；

(ii)反应温度为20-40℃，较佳地，25-35℃，更佳地，26-33℃，最佳地，30；

(iii)反应时间为0.5h-36h，较佳地，2h-12h，更佳地，2h-3h。

在另一优选例中，所述细胞色素P450的突变蛋白催化达玛烯二醇(DM)的生成原人参二醇(PPD)的催化活性为野生型P450(SEQ ID NO.:1)的125-250％。

在另一优选例中，所述细胞色素P450的突变蛋白具有选自下组的一个或多个特征：

(a)与野生型的细胞色素P450蛋白相比，催化获得的原人参二醇产量/达玛烯二醇(PPD/DM)的比例≥20％，较佳地23-250％，更佳地25-250％或30-200％。

(b)与野生型的细胞色素P450蛋白相比，催化获得的原人参二醇(PPD)的产量(mg/L)≥300，较佳地303-600，更佳地305-500。

本发明第二方面提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码本发明第一方面所述的突变蛋白。

在另一优选例中，所述多核苷酸选自下组：

(a)编码如SEQ ID NO.:2-8任一所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:15-21任一所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:15-21任一所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)，且编码SEQ ID NO.:1或2-8任一所示多肽的多核苷酸；

(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的多核苷酸在细胞色素P450的突变蛋白的ORF的侧翼还额外含有选自下组的辅助元件：信号肽、分泌肽、标签序列(如6His)、或其组合。

在另一优选例中，所述的多核苷酸选自下组：DNA序列、RNA序列、或其组合。

本发明第三方面提供了一种载体，所述的载体含有本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述载体包括表达载体、穿梭载体、整合载体。

本发明第三方面提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体，或其基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为真核细胞，如酵母细胞或植物细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为原核细胞，如大肠杆菌。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为人参细胞。

本发明第五方面提供了一种产生本发明第一方面所述细胞色素P450的突变蛋白的方法，包括步骤：

在适合表达的条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而表达出细胞色素P450的突变蛋白；和

分离所述细胞色素P450的突变蛋白。

本发明第六方面提供了一种酶制剂，所述酶制剂包含本发明第一方面所述的细胞色素P450的突变蛋白。

在另一优选例中，所述的酶制剂包括注射剂、和/或冻干制剂。

本发明第七方面提供了一种制备原人参二醇的方法，包括步骤：

(i)将本发明第一方面所述的细胞色素P450的突变蛋白与反应底物接触，进行催化反应，从而获得所述原人参二醇；和

(i i)任选地，分离并纯化所述原人参二醇。

在另一优选例中，所述反应底物为达玛烯二醇。

在另一优选例中，在步骤(i)中，所述催化反应的时间为0.5h-36h，较佳地， 2h-12h，更佳地，2h-3h。

在另一优选例中，在步骤(i)中，所述催化反应的温度为20-40℃，较佳地， 25-35℃，更佳地，26-33℃，最佳地，30℃；

本发明第八方面提供了一种本发明第一方面所述的突变蛋白的用途，所述的突变蛋白用于催化达玛烯二醇(DM)生成原人参二醇(PPD)，或被用于制备催化达玛烯二醇(DM)生成原人参二醇(PPD)的催化制剂。

本发明第九方面提供了一种本发明第一方面所述的突变蛋白或本发明所述的宿主细胞的用途，其特征在于，用于制备原人参二醇(PPD)。

本发明第十方面提供了一种产生转基因植物的方法，其特征在于，包括步骤：将本发明第四方面所述的宿主细胞再生为植物，其中，所述的宿主细胞为植物细胞。

本发明第十一方面提供了一种突变的启动子序列，所述的启动子序列与野生型P450启动子(SEQ ID NO.:9)相比，P450蛋白的转录活性提高至少30％(如40-100 ％)。

在另一优选例中，所述的启动子的序列为SEQ ID NO.:10-13中任一所示的序列。

在另一优选例中，所述突变启动子为启动子1D1，可以显著提高P450蛋白的表达量；

所述突变启动子含有与转录强度相关的以下核心核苷酸：

第28位核苷酸T缺失；

第417位核苷酸为G；

第445位核苷酸为G；

第654位核苷酸为A；

第655位核苷酸为A；

其中，所述核苷酸位置编号基于SEQ ID NO.:9所示的序列。

在另一优选例中，所述突变的启动子1D1与转录强度相关的以下核心核苷酸：

第417位核苷酸为G；

第445位核苷酸为G；

其中，所述核苷酸位置编号基于SEQ ID NO.:9所示的序列。

在另一优选例中，所述的突变启动子1D1除了417和445位核苷酸外，其余核苷酸与SEQ ID NO.:9所示的序列相同或基本相同。

在另一优选例中，所述的突变启动子1D1具有SEQ ID NO.:10所示的序列。

在另一优选例中，所述突变的启动子为启动子9C1-2，具有与转录强度相关的以下核心核苷酸。

第28位核苷酸T缺失。

其中，所述核苷酸位置编号基于SEQ ID NO.:9所示的序列。

在另一优选例中，所述的突变启动子9C1-2除了28位核苷酸外，其余核苷酸与 SEQID NO.:9所示的序列相同或基本相同。

在另一优选例中，所述的突变启动子9C1-2具有SEQ ID NO.:11所示的序列。

在另一优选例中，所述突变的启动子为启动子11B5，具有与转录强度相关的以下核心核苷酸。

第654位核苷酸为A。

其中，所述核苷酸位置编号基于SEQ ID NO.:9所示的序列。

在另一优选例中，所述的突变启动子11B5除了654位核苷酸外，其余核苷酸与 SEQID NO.:9所示的序列相同或基本相同。

在另一优选例中，所述的突变启动子11B5具有SEQ ID NO.:12所示的序列。

在另一优选例中，所述突变的启动子为启动子15F1，具有与转录强度相关的以下核心核苷酸：

第655位核苷酸为A。

其中，所述核苷酸位置编号基于SEQ ID NO.:9所示的序列。

在另一优选例中，所述的突变启动子15F1除了655位核苷酸外，其余核苷酸与 SEQID NO.:9所示的序列相同或基本相同。

在另一优选例中，所述的突变启动子15F1具有SEQ ID NO.:13所示的序列。

本发明第十二方面提供了一种表达盒，所述的表达盒含有本发明上述的启动子，以及与所述启动子操作性相连的本发明所述的编码本发明P450突变蛋白的核苷酸序列。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了生产达玛烯二醇的重组酿酒酵母菌株WP8的构建示意图。

图2显示了野生型及1G4、2D8、3B9、8G7、9C1、16F8和24A10突变体菌株PPD/DM柱状图。

图3显示了生产原人参二醇的重组酿酒酵母菌株HPLC检测图。

图4显示了生产原人参二醇的重组酿酒酵母菌株产量示意图。

具体实施方式

通过广泛而深入的研究，本发明人通过大量筛选，意外的筛到了可显著提高细胞色素P450突变蛋白催化活性的关键氨基酸位点。本发明发现，对细胞色素P450 CYP716A47中的关键位点进行改造后，可以显著提高PPD产量以及 PPD/DM比例。此外，本发明人还发现，野生型的细胞色素P450 CYP716A47的第1位-第4位氨基酸缺失，并同时突变其中一个关键位点(如第18位氨基酸)，可显著提高其催化活性，具体表现在PPD/DM的比例可提高至125.6％。

此外，本发明人还构建了合成达玛烯二醇DM的酿酒酵母底盘细胞WP8，并通过选用Stratagene公司GeneMorph II Random Mutagenesis Kit随机突变试剂盒，获得了细胞色素P450(CYP716A47)的突变体库，并通过转化酿酒酵母底盘细胞WP8，构建了一个单拷贝插入酵母基因组并合成原人参二醇PPD的 CYP716A47酵母突变体文库。在此基础上，完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“AxxB”表示第xx位的氨基酸A变为氨基酸B，例如“L87I”表示第87位的氨基酸L突变为I，以此类推。

本发明突变蛋白及其编码核酸

如本文所用，术语“突变蛋白”、“本发明突变蛋白”、“本发明细胞色素P450突变蛋白”可互换使用，均指非天然存在的细胞色素P450突变蛋白，且所述突变蛋白为基于SEQ IDNO.:1所示蛋白进行人工改造的蛋白，其中，所述的突变蛋白含有与酶催化活性相关的核心氨基酸，且所述核心氨基酸中至少有一个是经过人工改造的；并且本发明突变蛋白具有催化达玛烯二醇DM的C12 发生羟基化形成原人参二醇PPD的酶活性。

术语“核心氨基酸”指的是基于SEQ ID NO.:1，且与SEQ ID NO.:1同源性达至少80％，如84％、85％、90％、92％、95％、98％的序列中，相应位点是本文所述的特定氨基酸，如基于SEQ ID NO.:1所示的序列，核心氨基酸为：

第91位脯氨酸(P)；

第87位亮氨酸(L)；

第235位赖氨酸(K)；

第349位赖氨酸(K)；

第366位缬氨酸(V)；

第231位天冬酰胺(N)；

第285位丝氨酸(S)；

第113位谷氨酰胺(Q)；

第18位亮氨酸(L)；和/或

缺失第1-4位中的1、2、3、或4个氨基酸，且对上述核心氨基酸进行突变所得到的突变蛋白或缺失所述第1-4位氨基酸所得到的突变蛋白具有催化达玛烯二醇 DM的C12发生羟基化形成原人参二醇PPD的酶活性。

优选地，在本发明中，对本发明的所述核心氨基酸进行如下突变：

第87位亮氨酸(L)突变为异亮氨酸(I)；和/或

第235位赖氨酸(K)突变为精氨酸(R)；和/或

第349位赖氨酸(K)突变为精氨酸(R)；和/或

第366位缬氨酸(V)突变为异亮氨酸(I)；和/或

第231位天冬酰胺(N)突变为酪氨酸(Y)；和/或

第285位丝氨酸(S)突变为半胱氨酸(C)；和/或

第91位脯氨酸(P)突变为组氨酸(H)；和/或

第113位谷氨酰胺(Q)突变为精氨酸(R)；和/或

第18为亮氨酸(L)突变为异亮氨酸(I)。

应理解，本发明突变蛋白中的氨基酸编号基于SEQ ID NO.:1作出，当某一具体突变蛋白与SEQ ID NO.:1所示序列的同源性达到80％或以上时，突变蛋白的氨基酸编号可能会有相对于SEQ ID NO.:1)的氨基酸编号的错位，如向氨基酸的N末端或C末端错位1-5位，而采用本领域常规的序列比对技术，本领域技术人员通常可以理解这样的错位是在合理范围内的，且不应当由于氨基酸编号的错位而使同源性达80％(如90％、95％、98％)的、具有相同或相似产生原人参二醇PPD催化活性的突变蛋白不在本发明突变蛋白的范围内。

本发明突变蛋白是合成蛋白或重组蛋白，即可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的突变蛋白可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的突变蛋白还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括所述突变蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持所述突变蛋白相同的生物学功能或活性的蛋白。

本发明的突变蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的突变蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的突变蛋白，或(iii)成熟突变蛋白与另一个化合物(比如延长突变蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的突变蛋白，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此突变蛋白序列而形成的突变蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此突变蛋白的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。本发明中，保守性替换的氨基酸最好根据表I进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明的活性突变蛋白具有催化达玛烯二醇DM的C12发生羟基化形成原人参二醇PPD的酶活性。

优选地，所述的突变蛋白如SEQ ID NO.:2-8所示。应理解，本发明突变蛋白与SEQID NO.:2-8所示的序列相比，通常具有较高的同源性(相同性)，优选地，所述的突变蛋白与SEQ ID NO.:2-8所示序列的同源性至少为80％，较佳地至少为 85％-90％，更佳地至少为95％，最佳地至少为98％，最佳地，≥485/486(99.79％)。

此外，还可以对本发明突变蛋白进行修饰。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的突变蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在突变蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的突变蛋白。这种修饰可以通过将突变蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的突变蛋白。

术语“编码突变蛋白的多核苷酸”可以是包括编码本发明突变蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或突变蛋白的片段、类似物和衍生物。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的突变蛋白的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件) 下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1) 在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2) 杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3) 仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。

本发明的突变蛋白和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地，被纯化至均质。

本发明多核苷酸全长序列通常可以通过PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子 (或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的多核苷酸。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

野生型细胞色素P450

如本文所用，“野生型细胞色素P450”是指天然存在的、未经过人工改造的细胞色素P450，其核苷酸可以通过基因工程技术来获得，如基因组测序、聚合酶链式反应(PCR)等，其氨基酸序列可由核苷酸序列推导而得到。所述野生型细胞色素P450的氨基酸序列如SEQID NO.:1所示。

上述涉及的野生蛋白、本发明突变蛋白的序列信息如表2(见实施例)所示。

表达载体

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或本发明突变蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的突变蛋白。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码本发明突变蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，编码突变蛋白的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明突变蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、 DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、 HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母、植物细胞(如人参细胞)。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300 个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的 DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的主要优点包括：

(i)经大量筛选和改造，本发明首次发现了细胞色素P450(CYP716A47)的催化活性位点及其启动子的关键位点，改造了相关位点后，能够显著提高细胞色素P450催化活性和表达量，并显著提高PPD产量以及PPD/DM比例。

(ii)本发明首次发现野生型的细胞色素P450 CYP716A47的第1位-第4位氨基酸缺失，并同时突变其中一个关键位点(如第18位氨基酸)，可显著提高其催化活性，具体表现在PPD/DM的比例可提高至125.6％。

(iii)本发明还发现对野生型的细胞色素P450 CYP716A47的其他位点如第 235/349/366/231/285/91/113等位点的一个或几个氨基酸进行突变也可显著提高其催化活性，具体表现在PPD/DM的比例可提高26.1-80.2％。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

除非有特别说明，否则本发明实施例中的试剂和材料均为市售产品。

实施例1生产达玛烯二醇的重组酿酒酵母菌株构建

为对细胞色素P450 CYP716A47的文库进行筛选，本发明首先构建了一株可生产原人参二醇前体化合物达玛烯二醇的酿酒酵母底盘细胞。

向野生型酿酒酵母中导入达玛烯二醇合成酶基因PgDDS，利用酿酒酵母自身的甲羟戊酸途径合成的2,3-环氧角鲨烯可以合成达玛烯二醇。通过对人工构建的达玛烯二醇合成途径进行优化包括对合成限速步骤优化、前体供应优化等获得了高产达玛烯二醇的酿酒酵母菌株WP8，作为酿酒酵母底盘细胞，如图1 所示。

实施例2定向进化获得高效的细胞色素P450突变体蛋白

(1)以细胞色素P450基因序列(命名为optPPDS,SEQ ID NO.:14，编码SEQ ID NO.:1的氨基酸序列)为模板，利用引物 EP-1(5”-ATGGCTGCGGCCATGGTCTTAT-3”(SEQ ID NO.:22))和 EP-2(5”-GTTATGTGGATGCAGATGGATT-3”(SEQ ID NO.:23)进行易错PCR。所述易错PCR选用Stratagene公司GeneMorph II Random Mutagenesis Kit随机突变试剂盒。PCR程序为：95℃2min；95℃10s，55℃15s，72℃2min，共28 个循环；72℃10min降至10℃，模板使用量为50ng。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后回收获得细胞色素P450易错PCR产物。

(2)以酿酒酵母基因组为模板，利用分子克隆常规方法中的醋酸锂转化方法将步骤(1)中的易错PCR产物导入实施例1中制备的酿酒酵母底盘细胞，获得转化产物(即转化子)。

(3)将转化产物均匀涂布于YPD+200mg/L G418抗生素筛选平板，30℃静置培养2-3天。将所有克隆用牙签挑取转接到96孔板中，30℃震荡培养1天，转接到一个新的96孔板中进行发酵4天。向发酵液中加入等体积的正丁醇溶剂萃取 1h，吸取上层有机相进行HPLC检测各个转化子达玛烯二醇和原人参二醇产量及其比例。

(4)经过对24块96孔板的筛选，获得原人参二醇产量/达玛烯二醇的比例 (PPD/DM)提高20％以上的克隆共7个，编号分别为1G4、2D8、3B9、8G7、9C1、 16F8和24A10。分别以各克隆的基因组为模板，利用引物EP-1和EP-2进行PCR 获得各克隆的细胞色素P450片段，进行测序检测，从而获得各突变体的核苷酸序列和蛋白序列。

上述获得的各野生型和突变体蛋白序列信息及PPD/DM如图2和表2所示：

表2

	SEQ ID NO.	备注	PPD/DM提高
				optPPDS	1	野生型	0
1G4	2	L87I	53.2％
				2D8	3	K235R	57.7％
3B9	4	K349R,V366I	80.2％
				8G7	5	N231Y,S285C	26.1％
9C1	6	P91H	84.20％
				16F8	7	Q113R	30.6％
24A10	8	第1-4位氨基酸缺失，L18I	125.6％

(5)在对细胞色素P450突变体文库筛选的过程中还进一步筛选获得了一系列的突变启动子序列，这些突变的启动子序列有利于提高细胞色素P450的表达量从而提高原人参二醇合成效率和产量。获得原人参二醇产量/达玛烯二醇的比例(PPD/DM)提高20％以上的突变启动子有4个，编号分别为1D1、9C1-2、11B5 和15F1。分别以1D1、9C1-2、11B5和15F1克隆的基因组为模板，利用引物进行PCR获得各克隆的启动子片段，进行测序检测获得突变启动子核苷酸序列。

上述获得的各野生型和突变启动子核苷酸序列信息及PPD/DM如表3所示：

表3不同启动子+野生型P450

	SEQ ID NO.	备注	PPD/DM提高
				GAL1	9	野生型启动子	0
1D1	10	SEQ ID NO.:9中发生突变：C417G,A445G	44.1％
				9C1-2	11	SEQ ID NO.:9中发生突变：第28位T缺失	80.1％
11B5	12	SEQ ID NO.:9中发生突变：G654A	62.2％
				15F1	13	SEQ ID NO.:9中发生突变：G655A	44.1％

所述结果表明，这些突变的启动子可以进一步提高野生型P450蛋白的表达量，进而提高原人参二醇产量/达玛烯二醇的比例。此外，这些突变的启动子还可以进一步与本发明的P450突变蛋白的编码序列联用，从而进一步提高原人参二醇产量/达玛烯二醇的比例。

实施例3利用所述细胞色素P450突变体蛋白进行原人参二醇高效异源合成

(1)以酿酒酵母基因组为模板，用实施例1的方法，用SEQ ID NO.:14转化酿酒酵母菌株WP8，获得生产原人参二醇的重组酿酒酵母菌株WP8-WT。

(2)类似的分别以突变体基因1G4、2D8、3B9、8G7、9C1、16F8和24A10(核苷酸序列为SEQ ID NO.:15-21，相应的氨基酸序列为SEQ ID NO.:2-8)代替野生型optPPDS基因为模板。进行上述PCR获得各个PCR片段，分别转化酿酒酵母菌株WP8，获得含各突变体蛋白的生产原人参二醇的重组酿酒酵母菌株 WP8-1G4、WP8-2D8、WP8-3B9、WP8-8G7、WP8-9C1、WP8-16F8和WP8-24A10。

(3)配置固体培养基：配置培养基：1％Yeast Extract(酵母膏)，2％ Peptone(蛋白胨)，2％Dextrose(glucose)(葡萄糖)，2％琼脂粉。

配置液体培养基：配置培养基：1％Yeast Extract(酵母膏)，2％Peptone(蛋白胨)，2％Dextrose(glucose)(葡萄糖)。

挑取在固体培养基平板上划线的重组酿酒酵母菌WP8-1G4、WP8-2D8、 WP8-3B9、WP8-8G7、WP8-9C1、WP8-16F8和WP8-24A10，分别于含有5mL液体培养基的试管震荡培养过夜(30℃，250rpm，16h)；离心收集菌体，转移至10mL液体培养基的50mL三角瓶中，调OD600至0.05，30℃，250rpm震荡培养4天得到发酵产物。本方法对每一株重组酵母同时设置一个平行实验。

达玛烯二醇及原人参二醇提取及检测：从10mL发酵液中吸取100μL发酵液，用Fastprep震荡裂解酵母，加入等体积的正丁醇抽提，而后在真空条件下使正丁醇蒸干。用100μL甲醇溶解后通过HPLC检测目的产物PPD和DM的产量(图 3、图4和表4)。

上述获得的各重组酿酒酵母菌株原人参二醇和达玛烯二醇产量如表4所示：

表4

结果表明，与野生型的细胞色素P450相比，本发明的细胞色素P450突变蛋白可显著提高PPD的产量(最高可达490mg/L)和PPD/DM的比例(最高可达63％)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

浙江宏冠生物药业有限公司

<120> 细胞色素P450突变蛋白及其应用

<130> P2016-2211

<160> 23

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 486

<212> PRT

<213> 人参(Panax ginseng)

<400> 1

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<213> 人参(Panax ginseng)

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taatacgctt aactgctcat tgctatattg aagtacggat tagaagccgc cgagcgggcg 240

acagccctcc gacggaagac tctcctccgt gcgtcctggt cttcaccggt cgcgttcctg 300

aaacgcagat gtgcctcgcg ccgcactgct ccgaacaata aagattctac aatactagct 360

tttatggtta tgaagaggaa aaattggcag taacctggcc ccacaaacct tcaaatcaac 420

gaatcaaatt aacaaccata ggataataat gcgattagtt ttttagcctt atttctgggg 480

taattaatca gcgaagcgat gatttttgat ctattaacag atatataaat gcaaaagctg 540

cataaccact ttaactaata ctttcaacat tttcggtttg tattacttct tattcaaatg 600

tcataaaagt atcaacaaaa aattgttaat atacctctat actttaacgt caaggagaaa 660

aaactata 668

<210> 10

<211> 668

<212> DNA

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aaactata 668

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ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt tttttggatg gacgcaaaga agtttaataa 60

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aactata 667

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<211> 668

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ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

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aaactata 668

<210> 13

<211> 668

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcaatac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

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<213> 人参(Panax ginseng)

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atggctgcgg ccatggtctt attcttttcc cttagtttat tgttgttgcc acttcttcta 60

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<213> 人参(Panax ginseng)

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actctaaatg gtacaattac cttcgttttg aattacttgg cagaattccc tgatgtttac 960

aaccaagtgt taaaagagca agtagaaata gccaactcta agcatccaaa ggaactgctt 1020

aactgggaag atttgagaaa aatgaagtac tcttggaatg tggcgcaaga ggtactgaga 1080

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<211> 1458

<212> DNA

<213> 人参(Panax ginseng)

<400> 16

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ctctttgctt atttctcata cactaagaga atcccacaaa aagagaatga ttcaaaagct 120

cctttacctc caggccaaac aggttggcca ttgattggag agacactcaa ttacttgagt 180

tgtgtcaagt caggtgtttc agaaaacttc gtgaagtaca gaaaggaaaa gtactcccca 240

aaggttttta gaacatctct tttaggggaa cctatggcaa ttctttgcgg accagaaggt 300

aataagtttc tctactcaac tgagaaaaag ttggttcaag tttggtttcc atcttcagta 360

gaaaagatgt tcccacgtag ccatggtgag tcaaacgccg acaacttttc taaggttaga 420

ggtaagatga tgttcctact aaaagttgac gggatgaaaa agtatgttgg tctaatggat 480

agagtgatga aacagttctt ggaaacagat tggaacagac agcaacaaat caatgttcat 540

aacactgtca aaaagtacac tgttactatg tcctgcagag tattcatgtc tatcgatgat 600

gaggaacaag tcacaagatt gggttcttct attcaaaaca tagaggctgg ccttttagca 660

gttccaatca acattcctgg aactgcaatg aacagagcca tcaggacagt taaactctta 720

actagagaag ttgaggcagt cattaagcag agaaaggttg acttattgga aaacaagcaa 780

gcctctcagc cacaggatct tttaagccac ctactattaa cagctaatca agatggtcaa 840

ttcttatcag aaagtgatat cgcatcccat ttgattggtt tgatgcaagg aggctacaca 900

actctaaatg gtacaattac cttcgttttg aattacttgg cagaattccc tgatgtttac 960

aaccaagtgt taaaagagca agtagaaata gccaactcta agcatccaaa ggaactgctt 1020

aactgggaag atttgagaaa aatgaagtac tcttggaatg tggcgcaaga ggtactgaga 1080

atcattccac ctggtgtcgg gacatttaga gaagctatta ccgatttcac ctacgctggt 1140

tatttgattc ctaaagggtg gaagatgcat ttgattccac acgacactca caaaaaccca 1200

acctacttcc cttctcctga gaagttcgac ccaacaagat tcgaaggaaa tggcccagca 1260

ccatacacat ttacaccatt tggcggcgga ccacgtatgt gtcctggtat cgaatacgct 1320

agactagtca ttttgatctt tatgcacaac gtggtaacaa acttccgttg ggaaaaactg 1380

atccctaatg aaaagatact gaccgatcca atacctagat tcgcacacgg tttaccaatc 1440

catctgcatc cacataac 1458

<210> 17

<211> 1458

<212> DNA

<213> 人参(Panax ginseng)

<400> 17

atggctgcgg ccatggtctt attcttttcc cttagtttat tgttgttgcc acttcttcta 60

ctctttgctt atttctcata cactaagaga atcccacaaa aagagaatga ttcaaaagct 120

cctttacctc caggccaaac aggttggcca ttgattggag agacactcaa ttacttgagt 180

tgtgtcaagt caggtgtttc agaaaacttc gtgaagtaca gaaaggaaaa gtactcccca 240

aaggttttta gaacatctct tttaggggaa cctatggcaa ttctttgcgg accagaaggt 300

aataagtttc tctactcaac tgagaaaaag ttggttcaag tttggtttcc atcttcagta 360

gaaaagatgt tcccacgtag ccatggtgag tcaaacgccg acaacttttc taaggttaga 420

ggtaagatga tgttcctact aaaagttgac gggatgaaaa agtatgttgg tctaatggat 480

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<210> 18

<211> 1458

<212> DNA

<213> 人参(Panax ginseng)

<400> 18

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ggtaagatga tgttcctact aaaagttgac gggatgaaaa agtatgttgg tctaatggat 480

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aacactgtca aaaagtacac tgttactatg tcctgcagag tattcatgtc tatcgatgat 600

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gttccaatca acattcctgg aactgcaatg tacagagcca tcaagacagt taaactctta 720

actagagaag ttgaggcagt cattaagcag agaaaggttg acttattgga aaacaagcaa 780

gcctctcagc cacaggatct tttaagccac ctactattaa cagctaatca agatggtcaa 840

ttcttatcag aatgtgatat cgcatcccat ttgataggtt tgatgcaagg aggctacaca 900

actctaaatg gtacaattac cttcgttttg aattacttgg cagaattccc tgatgtttac 960

aaccaagtgt taaaagagca agtagaaata gccaactcca agcatccaaa ggaactgctt 1020

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ccatacacat ttacaccatt tggcggcgga ccacgtatgt gtcctggtat cgaatacgct 1320

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catctgcatc cacataac 1458

<210> 19

<211> 1458

<212> DNA

<213> 人参(Panax ginseng)

<400> 19

atggctgcgg ccatggtctt attcttttcc cttagtttat tgttgttgcc acttcttcta 60

ctctttgctt atttctcata cactaagaga atcccacaaa aagagaatga ttcaaaagct 120

cctttacctc caggccaaac aggttggcca ttgattggag agacactcaa ttacctgagt 180

tgtgtcaagt caggtgtttc agaaaacttc gtgaagtaca gaaaggaaaa gtactcccca 240

aaggttttta gaacatctct tttaggggaa catatggcaa ttctttgcgg accagaaggt 300

aataagtttc tctactcaac tgagaaaaag ttggttcaag tttggtttcc atcttcagta 360

gaaaagatgt tcccacgtag ccatggtgag tcaaacgccg acaacttttc taaggttaga 420

ggtaagatga tgttcctact aaaagttgac gggatgaaaa agtatgttgg tctaatggat 480

agagtgatga aacagttctt ggaaacagat tggaacagac agcaacaaat caatgttcat 540

aacactgtca aaaagtacac tgttactatg tcctgcagag tattcatgtc tatcgatgat 600

gaggaacaag tcacaagatt gggttcttct attcaaaaca tagaggctgg ccttttagca 660

gttccaatca acattcctgg aactgcaatg aacagagcca tcaagacagt taaactctta 720

actagagaag ttgaggcagt cattaagcag agaaaggttg acttattgga aaacaagcaa 780

gcctctcagc cacaggatct tttaagccac ctactattaa cagctaatca agatggtcaa 840

ttcttatcag aaagtgatat cgcatcccat ttgattggtt tgatgcaagg aggctacaca 900

actctaaatg gtacaattac cttcgttttg aattacttgg cagaattccc tgatgtttac 960

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aactgggaag atttgagaaa aatgaagtac tcttggaatg tggcgcaaga ggtactgaga 1080

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<210> 20

<211> 1458

<212> DNA

<213> 人参(Panax ginseng)

<400> 20

atggctgcgg ccatggtctt attcttttcc cttagtttat tgttgttgcc acttcttcta 60

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gaaaagatgt tcccacgtag ccatggtgag tcaaacgccg acaacttttc taaggttaga 420

ggtaagatga tgttcctact aaaagttgac gggatgaaaa agtatgttgg tctaatggat 480

agagtgatga aacagttctt ggaaacagat tggaacagac agcaacaaat caatgttcat 540

aacactgtca aaaagtacac tgttactatg tcctgcagag tattcatgtc tatcgatgat 600

gaggaacaag tcacaagatt gggttcttct attcaaaaca tagaggctgg ccttttagca 660

gttccaatca acattcctgg aactgcaatg aacagagcca tcaagacagt taaactctta 720

actagagaag ttgaggcagt cattaagcag agaaaggttg acttattgga aaacaagcaa 780

gcctctcagc cacaggatct tttaagccac ctactattaa cagctaatca agatggtcaa 840

ttcttatcag aaagtgatat cgcatcccat ttgattggtt tgatgcaagg aggctacaca 900

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ccatacacat ttacaccatt tggcggcgga ccacgtatgt gtcctggtat cgaatacgct 1320

agactagtca ttttgatctt tatgcacaac gtggtaacaa acttccgttg ggaaaaactg 1380

atccctaatg aaaagatact gaccgatcca atacctagat tcgcacacgg tttaccaatc 1440

catctgcatc cacataac 1458

<210> 21

<211> 1458

<212> DNA

<213> 人参(Panax ginseng)

<400> 21

atggctgcgg ccatggtctt attcttttcc cttagtttat tgttgttgcc aattcttcta 60

ctctttgctt atttctcata cactaagaga atcccacaaa aagagaatga ttcaaaagct 120

cctttacctc caggccaaac aggttggcca ttgattggag agacactcaa ttacttgagt 180

tgtgtcaagt caggtgtttc agaaaacttc gtgaagtaca gaaaggaaaa gtactcccca 240

aaggttttta gaacatctct tttaggggaa cctatggcaa ttctttgcgg accagaaggt 300

aataagtttc tctactcaac tgagaaaaag ttggttcaag tttggtttcc atcttcagta 360

gaaaagatgt tcccacgtag ccatggtgag tcaaacgccg acaacttttc taaggttaga 420

ggtaagatga tgttcctact aaaagttgac gggatgaaaa agtatgttgg tctaatggat 480

agagtgatga aacagttctt ggaaacagat tggaacagac agcaacaaat caatgttcat 540

aacactgtca aaaagtacac tgttactatg tcctgcagag tattcatgtc tatcgatgat 600

gaggaacaag tcacaagatt gggttcttct attcaaaaca tagaggctgg ccttttagca 660

gttccaatca acattcctgg aactgcaatg aacagagcca tcaagacagt taaactctta 720

actagagaag ttgaggcagt cattaagcag agaaaggttg acttattgga aaacaagcaa 780

gcctctcagc cacaggatct tttaagccac ctactattaa cagctaatca agatggtcaa 840

ttcttatcag aaagtgatat cgcatcccat ttgattggtt tgatgcaagg aggctacaca 900

actctaaatg gtacaattac cttcgttttg aattacttgg cagaattccc tgatgtttac 960

aaccaagtgt taaaagagca agtagaaata gccaactcta agcatccaaa ggaactgctt 1020

aactgggaag atttgagaaa aatgaagtac tcttggaatg tggcgcaaga ggtactgaga 1080

atcattccac ctggtgtcgg gacatttaga gaagctatta ccgatttcac ctacgctggt 1140

tatttgattc ctaaagggtg gaagatgcat ttgattccac acgacactca caaaaaccca 1200

acctacttcc cttctcctga gaagttcgac ccaacaagat tcgaaggaaa tggcccagca 1260

ccatacacat ttacaccatt tggcggcgga ccacgtatgt gtcctggtat cgaatacgct 1320

agactagtca ttttgatctt tatgcacaac gtggtaacaa acttccgttg ggaaaaactg 1380

atccctaatg aaaagatact gaccgatcca atacctagat tcgcacacgg tttaccaatc 1440

catctgcatc cacataac 1458

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

atggctgcgg ccatggtctt at 22

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gttatgtgga tgcagatgga tt 22

Claims

1.一种细胞色素P450的突变蛋白，其特征在于，所述的突变蛋白为非天然蛋白，且所述突变蛋白具有催化生成原人参二醇的催化活性，并且所述突变蛋白在野生型的细胞色素P450的对应于SEQ ID NO.1的选自下组的与酶催化活性相关的核心氨基酸发生突变：

第91位脯氨酸P，并且第91位脯氨酸P突变为组氨酸H；或

所述的突变蛋白缺失SEQ ID NO. 1中1-4位，且第18位亮氨酸L突变为异亮氨酸I，所述细胞色素P450的突变蛋白催化达玛烯二醇DM反应生成原人参二醇PPD。

2.如权利要求1所述的突变蛋白，其特征在于，所述的突变为P91H。

3.如权利要求1所述的突变蛋白，其特征在于，所述细胞色素P450的突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6或8所示。

4.一种多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1所述的突变蛋白。

5.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸选自下组：

(a)编码如SEQ ID NO.6或8所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.19或21所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.19或21所示序列的同源性≥95%，且编码SEQ ID NO.6、8任一所示多肽的多核苷酸。

6.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求4所述的多核苷酸。

7.一种工程化的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求6所述的载体，或其基因组中整合有权利要求4所述的多核苷酸。

8.一种产生权利要求1所述细胞色素P450的突变蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：

在适合表达的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞，从而表达出细胞色素P450的突变蛋白；和

分离所述细胞色素P450的突变蛋白。

9.一种酶制剂，其特征在于，所述酶制剂包含权利要求1所述的细胞色素P450的突变蛋白。

10.一种制备原人参二醇的方法，其特征在于，包括步骤：

(i)将权利要求1所述的细胞色素P450的突变蛋白与反应底物接触，进行催化反应，从而获得所述原人参二醇；和

(ii)任选地，分离并纯化所述原人参二醇。

11.一种权利要求1所述的突变蛋白的用途，其特征在于，所述的突变蛋白用于催化达玛烯二醇生成原人参二醇，或被用于制备催化达玛烯二醇生成原人参二醇的催化制剂。

12.一种权利要求1所述的突变蛋白或权利要求7所述的宿主细胞的用途，其特征在于，用于制备原人参二醇。

13.一种产生转基因植物的方法，其特征在于，包括步骤：将权利要求6所述的载体或权利要求4所述的核苷酸整合到宿主细胞中，再生为植物。

14.一种表达盒，其特征在于，所述的表达盒含有启动子，以及与所述启动子操作性相连的权利要求4所述的多核苷酸，所述的启动子的序列为SEQ ID NO.10-13中任一所示的序列。