CN108309975A - 小分子化合物wb460在制备治疗胰腺癌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种如式(I)所示的小分子化合物WB460在制备治疗胰腺癌疾病药物中的应用。在体外，该化合物能抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭及克隆形成，诱导胰腺癌细胞发生凋亡和细胞周期阻滞；在体内，WB460抑制胰腺癌的生长和转移。本发明具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于医药及其制备和应用技术领域，具体涉及小分子化合物WB460在制备治疗胰腺瘤药物中的应用。
背景技术
胰腺癌是一种高恶性程度的消化道肿瘤，早期患者无明显症状且没有敏感及特异的标签蛋白，预防或早期诊断相对困难，患者预后差，5年生存率不到7％，被称为“癌中之王”。近年来，胰腺癌发病率和死亡率明显上升，在发达国家胰腺癌的致死率排第四位，预测在未来十年将会成为第二大致死癌症。
目前，根据不同发展阶段，胰腺癌的治疗方式包含手术、放疗及化疗，手术是临床上唯一可治愈的方法。然而，由于胰腺癌患者常常确诊较晚，丧失根治机会，只有10-15％的患者符合手术条件，并且80％接受手术及辅助治疗的患者会复发并死亡。晚期患者利用吉西他滨、吉西他滨和埃罗替尼联用、吉西他滨和白蛋白紫杉醇联用或放化疗来治疗胰腺癌，但是最终大部分患者胰腺癌转移到肝、肺、腹膜而死亡。
STAT3(signal transducers and activators of transcription 3)，即信号转导和转录激活因子3，是细胞因子及生长因子所介导的JAK-STAT3信号通路中的转录激活因子之一，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程。其中STAT3在很多恶性肿瘤中均异常高表达，并促进很多血液瘤和实体瘤的发生发展，包括白血病、淋巴瘤、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、头颈癌等。
目前，STAT3直接抑制剂包含多肽类、小分子化合物类及寡核苷酸类。由于STAT3多肽抑制剂代谢不稳定且通透性差，限制了它们在体内的应用；寡核苷酸类抑制剂由于核酸酶的快速降解，其生物利用率差、药代动力学较差及半衰期短，因此临床使用受限；小分子化合物类抑制剂中STA-21、Cryptotanshinone、Stattic、BBI608和JMC-9由于都含有醌类或类醌类结构，在临床上表现出较大的毒性且抗癌活性较低。尽管有一些有前景的研究，但尚未有STAT3直接抑制剂被批准用于临床使用。因此开发一类具有良好抗肿瘤活性的新型STAT3抑制剂十分必要。
本申请涉及制备具有我国自主知识产权的一类新型用于治疗胰腺癌的小分子候选药物，并阐明其作用机制，为后续新药研发奠定基础，具有重要的理论意义和广阔的应用前景。
发明内容
本发明提出了一种如式(I)所示的WB460的小分子化合物或药学上可接受的盐在制备治疗胰腺癌的药物中的应用，所述式(I)WB460用于抑制胰腺癌的增殖、生长、转移、侵袭、浸润以及克隆形成等。
其中，式(I)所示WB460是一种小分子化合物，其分子式为C18H14BrN5O3S，分子量为460.31。
本发明应用中，所述式(I)WB460小分子化合物能够选择性地抑制高表达STAT3活性蛋白即p-STAT3(Y705)的胰腺癌细胞的增殖。
本发明应用中，所述式(I)WB460小分子化合物阻滞胰腺癌细胞株的细胞周期；其中，所述式(I)WB460阻滞胰腺癌细胞到M期；其中，所述胰腺癌细胞包括PANC-1、BxPC-3。
本发明应用中，所述式(I)WB460小分子化合物诱导胰腺癌细胞株的细胞凋亡；其中，所述胰腺癌细胞包括PANC-1、BxPC-3。
本发明应用中，所述式(I)WB460小分子化合物抑制胰腺癌细胞株的迁移、侵袭以及浸润；其中，所述胰腺癌细胞包括PANC-1、BxPC-3。
本发明应用中，所述式(I)WB460小分子化合物抑制胰腺癌细胞株的克隆形成；其中，所述胰腺癌细胞包括PANC-1、BxPC-3。
本发明应用中，所述式(I)WB460小分子化合物抑制胰腺癌细胞株的生长；其中，所述胰腺癌细胞包括PANC-1。
本发明应用中，所述式(I)WB460小分子化合物能够在小鼠皮下荷瘤模型中抑制胰腺癌生长。
本发明应用中，所述式(I)WB460小分子化合物能够在小鼠尾静脉注射肺转移模型中，抑制胰腺癌转移。
本发明应用中，所述式(I)WB460小分子化合物的水合物或药学上可接受的盐或药学上可接受的载体等具有与式(I)WB460小分子化合物相同的效果。
本发明还提出了式(I)WB460小分子化合物在体外和体内抑制高表达STAT3活性蛋白的胰腺癌细胞的增殖的应用及方法；其中，相对于低表达STAT3蛋白的胰腺癌细胞，所述式(I)WB460小分子化合物对高表达STAT3蛋白的胰腺癌细胞的抑制作用更为明显。
本发明还提出了式(I)所示的WB460小分子化合物在抑制胰腺癌细胞生长中的应用及方法。
本发明还提出了一种药物组合物，包括所述的式(I)WB460小分子化合物或药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。
本发明还提出了式(I)WB460小分子化合物或药学上可接受的盐或药学上可接受的载体、以及含有式(I)WB460的药物组合物在制备治疗恶性肿瘤的药物中的应用。其中，所述恶性肿瘤为高表达STAT3活性蛋白的恶性肿瘤，包括血液瘤和实体瘤，其中，所述血液瘤有白血病、淋巴瘤等，所述实体瘤有胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、头颈癌等。
本发明筛选得到小分子化合物WB460，在细胞水平上，WB460与STAT3蛋白结合，且明显下调STAT3(Y705)磷酸化，选择性地抑制高表达p-STAT3(Y705)细胞的增殖，同时抑制胰腺癌细胞的迁移、侵袭及克隆形成；动物实验也表明WB460也可以抑制胰腺癌的生长及转移，并且在发挥功效的药物浓度下表现出较低的毒性。目前FDA批准的治疗胰腺癌的药物为吉西他滨、吉西他滨和埃罗替尼联用、吉西他滨和白蛋白紫杉醇联用。虽然上述药物能够相对提高患者的生存期，但平均生存期不足一年，患者最终仍死于胰腺癌的转移及复发。本发明在靶向STAT3蛋白治疗胰腺癌方面取得的新突破成功填补了国内该领域的空白，具有很大的开发前景。本发明为靶向STAT3蛋白抗胰腺癌的新药研发提供了重要参考，具有良好的应用前景。
附图说明
图1所示为式(I)WB460对STAT3磷酸化表达量不同的胰腺癌细胞的增殖抑制图。
图(1A)表示七种胰腺癌细胞中STAT3、p-STAT3(Y705)、p-STAT3(S727)的蛋白水平图；
图(1B)表示式(I)WB460随着药物浓度的增加对不同胰腺癌细胞活性的影响；
图(1C)表示式(I)WB460及BP-1-102对不同胰腺癌细胞的半数抑制浓度(IC50)。
图2所示为式(I)WB460对胰腺癌细胞STAT3蛋白及磷酸化的STAT3蛋白的影响。
图(2A)表示式(I)WB460对胰腺癌细胞PANC-1、BxPC-3中STAT3、p-STAT3(Y705)、p-STAT3(S727)蛋白的影响；
图(2B)表示式(I)WB460对其他4种胰腺癌细胞p-STAT3(Y705)蛋白的影响。
图3所示为式(I)WB460在不同浓度下与STAT3全长蛋白的结合图。
图4所示为式(I)WB460诱导胰腺癌细胞周期阻滞。
图(4A)表示式(I)WB460随着药物浓度的增加，胰腺癌细胞周期图；
图(4B)表示式(I)WB460随着药物浓度的增加，胰腺癌细胞周期统计图；
图(4C)表示式(I)WB460对胰腺癌细胞M期标志蛋白的影响。
图5所示为式(I)WB460诱导胰腺癌细胞凋亡。
图(5A)表示式(I)WB460随着药物浓度的增加，胰腺癌细胞的凋亡图；
图(5B)表示式(I)WB460随着药物浓度的增加，胰腺癌细胞的凋亡统计图。
图6所示为式(I)WB460抑制胰腺癌细胞迁移、侵袭及克隆形成。
图(6A)表示式(I)WB460随着药物浓度的增加，胰腺癌细胞的迁移及侵袭图；
图(6B)表示式(I)WB460随着药物浓度的增加，胰腺癌细胞的迁移及侵袭统计图；
图(6C)表示式(I)WB460随着药物浓度的增加，胰腺癌细胞的克隆形成图；
图(6D)表示式(I)WB460随着药物浓度的增加，胰腺癌细胞的克隆形成统计图。
图7所示为式(I)WB460抑制体内胰腺癌肿瘤生长。
图(7A)表示各组小鼠给药三周后处死小鼠，剥离的皮下胰腺癌肿瘤图；
图(7B)表示各组小鼠给药三周期间小鼠的肿瘤体积统计图
图(7C)表示各组小鼠给药三周后处死小鼠，剥离的皮下胰腺癌肿瘤重量统计图；
图(7D)表示各组小鼠给药三周期间小鼠的体重统计图；
图(7E)表示各组小鼠给药三周后处死小鼠，剥离的心、肝、脾、肺、肾HE图；
图(7F)表示各组小鼠给药三周后处死小鼠，剥离的皮下胰腺癌肿瘤染Ki67免疫组化图。
图8所示为式(I)WB460抑制体内胰腺癌肿瘤转移。
图(8A)表示各组小鼠给药六周期间的活体成像系统显示的肿瘤转移图；
图(8B)表示各组小鼠给药六周期间的小鼠体重统计图。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1：WB460的制备。
称取N-BOC-4-哌啶酮、丙二腈、硫和L-脯氨酸溶解于DMF中，在60℃下搅拌反应10h；冷却后将反应液缓慢滴加到搅拌的水中，将析出的固体过滤、干燥，经过柱层析纯化后得到中间体2-氨基-3氰基哌啶并噻吩衍生物。将中间体2-氨基-3氰基哌啶并噻吩衍生物、1-甲基吡唑-4-羧酸、2-氯-1-甲基吡啶碘化物和DMAP溶解于10mL二氯甲烷中，在搅拌中缓慢滴加三乙胺并加热回流4h，柱层析后得到中间体2-(1-甲基-4-吡唑)-甲酰胺基-3-氰基-6-叔丁氧羰基-4,5,6,7-四氢[2,3-c]哌啶并噻吩。将中间体2-(1-甲基-4-吡唑)-甲酰胺基-3-氰基-6-叔丁氧羰基-4,5,6,7-四氢[2,3-c]哌啶并噻吩溶解于10mL二氯甲烷中，在冰浴下缓慢滴加4N HCl气体的1,4-二氧六环溶液1mL，常温下搅拌过夜，蒸干溶剂得到2-(1-甲基-4-吡唑)-甲酰胺基-3-氰基-6-氢-4,5,6,7-四氢[2,3-c]哌啶并噻287mg,产率100％；将5-溴呋喃-2-羧酸、EDC.HCl和HOBt溶于5mL的DMF中，反应30min后加入2-(1-甲基-4-吡唑)-甲酰胺基-3-氰基-6-(2-羟乙酰基)-4,5,6,7-四氢[2,3-c]哌啶并噻吩，继续反应3h，萃取，柱层析得到WB-460，产率51％，反应过程如下式所示。1H NMR(500MHz,DMSO)δ11.53(s,1H),8.47(s,1H),8.07(s,1H),7.13(d,J＝2.9Hz,1H),6.80(d,J＝3.2Hz,1H),4.76(s,2H),3.92-3.91(m,5H),2.76-2.75(m,2H)。
实施例2：式(I)WB460对高表达STAT3(Y-705)磷酸化蛋白的胰腺癌细胞增殖有强烈抑制以及胰腺癌细胞中STAT3的蛋白水平。
技术方法
(1)细胞的培养
本发明中所用胰腺癌细胞PANC-1、BxPC-3、MIAPaCa-2、SW1990、AsPC-1、Capan-2、CFPAC-1细胞均购自中科院上海细胞库，细胞放置在37℃恒温培养箱中。
胰腺癌PANC-1细胞培养在含10％的胎牛血清和1％丙酮酸钠的DMEM中，MIAPaCa-2细胞培养在含10％的胎牛血清、1％丙酮酸钠及2.5％的马血清中，AsPC-1、BxPC-3及Capan-2细胞培养在含10％的胎牛血清和1％丙酮酸钠的1640中，CFPAC-1细胞培养在10％的胎牛血清的IMEM中，SW1990细胞培养在10％的胎牛血清的L-15中。
(2)免疫印迹(Western Blot)
细胞经不同浓度WB-460处理12-24h后，用PBS清洗细胞，加入RIPA裂解液和磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂裂解细胞，再将细胞裂解液离心、定量、煮沸变性，用聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE电泳分离蛋白质样品，然后转移到硝酸纤维素薄膜上，经BSA封闭液封闭1h后，分别用STAT3、p-STAT3(Y705)、p-STAT3(S727)、β-actin的一抗在4℃孵育过夜，再用带有荧光标记的二抗孵育1h，最后用Odyssey扫膜仪检测蛋白的表达水平。
(3)MTS法测定细胞增殖实验
MTS实验是一种运用比色法间接测定活细胞数量的方法。MTS是一种新合成的四唑类化合物，通过被活细胞内线粒体内的琥珀酸脱氢酶还原成橙黄色的甲瓒，在490nm处测量还原产物的吸光值与活细胞的数量呈正比，从而反映细胞活力情况。此实验可以用于评价化合物对胰腺癌细胞增殖的影响，从而判断化合物对胰腺癌细胞增殖的抑制作用并计算IC50。
各细胞以(1-10)×103个/孔的密度，每孔100μL均匀接种到96孔板，放在恒温培养箱中待细胞贴壁后，对照组加入相应的培养基，实验组给予不同浓度的化合物，药物处理24-96h后取出在显微镜下观察细胞状态，在避光条件下，加入MTS，混合均匀后避光放置在恒温培养箱，用酶标仪490nm处测定读取光吸收值，实验重复三次，IC50用GraphPad5 Prism软件计算得到。
实验结果如图1所示，图(A)为七种胰腺癌细胞中STAT3、p-STAT3(Y705)、p-STAT3(S727)的蛋白水平，可以看到SW1990和AsPC-1细胞中STAT3的磷酸化蛋白含量较低，其它五种胰腺癌细胞的STAT3的磷酸化蛋白水平较高；图(B)为不同浓度的式(I)WB460对胰腺癌细胞增殖的抑制曲线，可以看到(I)WB460可以明显抑制p-STAT3(Y705)含量高的细胞增殖，对于p-STAT3(Y705)含量低的胰腺癌细胞AsPC-1、SW1990抑制不明显；图(C)为式(I)WB460及BP-1-102对胰腺癌细胞增殖的IC50，显示WB460比BP-1-102的IC50低且它对于STAT3活性蛋白含量不同的胰腺癌细胞有选择性抑制作用。
实施例3：式(I)WB460下调STAT3(Y705)的磷酸化。
技术方法
(1)免疫印迹(Western Blot)
方法如上所述
实验结果如图2所示，从图(A)可以看出式(I)WB460浓度梯度依赖地显著下调PANC-1、BxPC-3细胞内STAT3(Y705)的磷酸化，而对于STAT3蛋白和STAT3(S-727)的磷酸化水平没有影响；图(B)显示式(I)WB460浓度梯度依赖地下调其他胰腺癌细胞的STAT3(Y705)的磷酸化水平。
实施例4：式(I)WB460可以与STAT3全长蛋白结合。
技术方法
(1)表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance technology，SPR)
该技术是基于SPR检测生物传感芯片(Biosensor chip)上配体与分析物作用的前沿技术，与传统手段比较，SPR具有无需对样品进行标记、能实时监测、灵敏度高等突出优点。
我们将纯化的STAT3全长蛋白进行SPR检测。操作简述如下：将感应芯片插入Bicore T200检测系统，用PBST溶液平衡系统。待测蛋白溶解在醋酸钠溶液中，然后通过氨基将上述蛋白固定在感应芯片的独立垂直通路上，摸索相关参数，待基数稳定后，溶解于PBST溶液的不同浓度的待测化合物水平流入芯片，实验结果数据用软件通过进行动态分析。通过该实验可以检测待测化合物在何种浓度下可以与STAT3蛋白相互结合，结合与分离的时间等参数。
实验结果如图3所示，式(I)WB460可以与STAT3全长蛋白结合，且其解离常数KD值为2.96μM。
实施例5：式(I)WB460能将胰腺癌细胞周期阻滞在M期。
技术方法
(1)流式染PI检测细胞周期实验
细胞周期是指细胞从上一次分裂结束开始到下一次分裂结束的活动过程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。G0/G1期：细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA的含量仍为二倍体；S期：DNA开始合成，这时细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间；当DNA复制结束成为四倍体时，细胞进入G2期；M期：细胞开始进行有丝分裂。碘化丙啶(PI)为插入性核酸荧光染料，能选择性地嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋中，其结合的量与DNA的含量呈正比，据此可以通过检测结合DNA的荧光染料PI的荧光强度来反映处于不同周期的细胞数量。利用流式细胞仪检测荧光强度，从而反应细胞周期情况。
将胰腺癌PANC-1、BxPC-3细胞，约(1-10)×106个/孔接种于6cm皿，放置于培养箱中至细胞贴壁，加入不同浓度的化合物。12-96h后消化收集细胞，用PBS清洗一次细胞后，加入1mL的75％乙醇重悬细胞，4℃过夜。第二天将细胞离心，弃去75％的乙醇，用PBS清洗细胞两次后加入200-800μL PBS，并在避光条件下加入1-10μL的RNA酶和1-10μL的PI，混匀后室温避光孵育30min，转移到5mL的流式管中用流式细胞仪检测细胞周期，并用ModFit软件统计各个时期的细胞比例。
(2)免疫印迹(Western Blot)
方法如上所述
实验结果如图(4A)和(4B)所示，式(I)WB460在0.5μM的浓度下处理胰腺癌PANC-1、BxPC-3细胞后，G2/M期的细胞比例分别由11.45％、21.98％上升到93.22％、92.08％。由图(4C)所示，磷酸化的组蛋白H3(Ser10)和磷酸化的Ser/Thr-MPM2均为M期标志物，我们可以看到随着WB460浓度的增高，p-H3((Ser10)和p-Ser/Thr-MPM2的蛋白水平明显上升。因此，式(I)WB460能将胰腺癌细胞周期阻滞在M期。
实施例6：式(I)WB460能将引起胰腺癌细胞凋亡。
技术方法
(1)流式检测细胞凋亡实验
在正常细胞中，磷酯酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，在细胞发生凋亡早期，PS由细胞膜脂质双层的内侧翻向膜外侧。Annexin-V作为一种磷脂结合蛋白，与PS有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的PS与凋亡早期的细胞膜结合。因此，Annexin-V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。碘化丙啶(PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和死细胞由于细胞膜通透性增加，PI可以透过细胞膜而使细胞核染红。将Annexin-V与PI共同作用时，可以用来鉴别活细胞，处于凋亡早期和中晚期的细胞。细胞双染法利用流式细胞仪检测可以将细胞分为四个类别，通过四个象限表现出来，分别是死亡细胞、正常细胞、晚期凋亡和早期凋亡细胞。
将胰腺癌PANC-1、BxPC-3细胞，(1-10)×105个/孔接种于六孔板中，细胞贴壁后加入不同浓度的化合物。待化合物处理12-96h后，收集细胞。由于药物作用下的死细胞漂浮在培养基中，收集细胞时需将培养基一起收集离心。用预冷的PBS洗2遍后用凋亡试剂盒检测。实验分为不染组、单染Annexin V组、单染PI组、PI和Annexin V双染组(100μL的1×bindingbuffer重悬细胞)，加药浓度组按从低到高进行染色。不染组不加PI以及Annexin V，单染PI组加入PI 1-10μL，单染Annexin V组加入Annexin V 1-10μL，Annexin-V-PI双染组均加入PI和Annexin V各1-10μL，混匀。室温下避光孵育15min后，加入200-500μL的1×bindingbuffer，混匀后避光条件下将细胞悬液转移到5mL的流式管中，用流式细胞仪上机检测。凋亡的细胞的统计包括早期凋亡细胞和中晚期凋亡细胞，用FlowJo软件处理数据并进行分析。
实验结果如图(5A)和(5B)所示，式(I)WB460在0.5μM的浓度下处理胰腺癌PANC-1、BxPC-3细胞后，胰腺癌细胞的凋亡率分别达到了12％、29.76％，表明式(I)WB460能诱导细胞凋亡。
实施例7：式(I)WB460能抑制胰腺癌细胞侵袭、迁移和克隆形成。
技术方法
(1)Transwell小室迁移实验
肿瘤转移是肿瘤发展的重要环节。将胰腺癌PANC-1、BxPC-3细胞消化并计数，细胞重悬在无血清并含有不同浓度化合物的基础培养基中，细胞以(1-10)×104个/孔(300μL)接种至Transwell小室的上室中，对照组加入等量的DMSO。下室中则加入700μL含有对应浓度化合物的含20％胎牛血清的培养基。小室置于细胞培养箱中培养12-48h后取出小室用4％的多聚甲醛固定小室细胞，30min后，用2‰的结晶紫染液将细胞染色15min，清洗小室，将未结合的结晶紫洗掉，用棉签轻轻擦拭Transwell小室的上侧，将未迁移至下侧的细胞擦掉。自然干燥后在显微镜下拍照，统计多个视野下的细胞数目。
(2)Transwell小室侵袭实验
先将基质胶放在冰上融化，然后用PBS将基质胶配置成含10％基质胶的PBS溶液，每个Transwell小室中加入100μL该溶液，放置在培养箱中0.5-1h后，将其用吸泵吸干净，后续实验操作和迁移实验操作相同。
(3)克隆形成实验
克隆形成实验是检测癌细胞体外增殖能力的有效方法。将胰腺癌PANC-1、BxPC-3细胞消化并计数，以每孔(1-10)×103个细胞均匀接种于六孔板中，待细胞贴壁后加入含有不同浓度化合物的完全培养基中。培养7-14天后，用吸泵吸掉原来的培养基，用PBS清洗1次后再用4％的多聚甲醛固定细胞30min，2‰结晶紫染液将细胞染色15min，用自来水洗掉多余的结晶紫染液，室温自然干燥后在显微镜下拍照，计算细胞克隆形成数量。
实验结果如图6所示，图(6A)为化合物抑制胰腺癌PANC-1、BxPC-3细胞迁移、侵袭图，式(I)WB460即能以剂量依赖性地抑制PANC-1、BxPC-3胰腺癌细胞的侵袭和迁移，(6B)为相应的统计图。图(6C)为化合物抑制胰腺癌PANC-1、BxPC-3细胞的克隆形成图，在0.5μM下式(I)WB460即能显著抑制PANC-1、BxPC-3胰腺癌细胞的克隆形成，说明化合物在体外具有良好的抗胰腺癌细胞增殖的效果；图(6D)为统计图。
实施例8：式(I)WB460能抑制胰腺癌肿瘤生长
技术方法
(1)裸鼠皮下荷瘤实验
皮下荷瘤实验即为在裸鼠皮下注射肿瘤细胞，肿瘤细胞吸收小鼠体内的营养物质，迅速增殖形成肿瘤，然后将小鼠分组进行实验，实验组对小鼠进行给药处理，可以观察药物对肿瘤的作用效果。
将(1-10)×106个胰腺癌细胞PANC-1皮下注射到免疫缺陷小鼠(BALB/c-nude，裸鼠，5-6周)右侧背部皮下，待皮下肿瘤长到100mm3左右时，将小鼠均匀分为四组，即空白对照组隔天腹腔注射50μL的DMSO，低剂量组隔天腹腔注射10mg/kg溶于DMSO的WB460，高剂量组隔天腹腔注射20mg/kg溶于DMSO的WB460，阳性对照组隔天腹腔注射20mg/kg的BP-1-102，每两天测量肿瘤的体积和小鼠体重，连续给药三周后处死小鼠并剥离皮下肿瘤，称重并拍照。
(2)裸鼠体内毒性检测实验
将各组小鼠的心、肝、脾、肺、肾剥离出来，经PBS洗漱后，利用4％的多聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋、切片、苏木精伊红染色、脱水封片后，在倒置显微镜下观察并拍照，检测化合物WB460对内脏组织的影响。
(3)免疫组化实验
将各组小鼠的胰腺癌皮下肿瘤剥离出来，用4％的多聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋、切片后，再经脱蜡、抗原修复、去除过氧化氢酶、封闭抗原位点、孵Ki67一抗、二抗、显色、苏木精染色、脱水封片后，在显微镜下观察并拍照，检测各组小鼠胰腺癌肿瘤中Ki67的表达含量。
实验结果如图7所示，图(7A)显示式(I)WB460隔天给药20mg/kg的胰腺癌肿瘤最小，说明式(I)WB460能够剂量依赖性地显著抑制胰腺癌肿瘤的生长；(7B)为统计的给药期间的肿瘤体积；(7C)为剥离胰腺癌肿瘤的重量，式(I)WB460能够剂量依赖性地抑制胰腺癌肿瘤的重量；图(7D)为给药期间小鼠体重的变化，BP-1-102组小鼠体重增长减慢；(7E)为各组小鼠剥离的心、肝、脾、肺、肾的H&E图，可以明显看到BP-1-102组小鼠的肝发生了肝组织灶状坏死，伴有炎细胞的浸润(箭头所指的部分)，说明BP-1-102在20mg/kg隔天给药的剂量下对小鼠有毒性；(7F)为各组小鼠剥离的胰腺癌肿瘤的免疫组化图，Ki67为细胞增殖的标志物，表达量随着胰腺癌恶性程度的增加而上升，从图中箭头所指的部分可以看出WB460组小鼠的褐色较浅且少，而DMSO组及BP-1-102组褐色较多且深，说明式(I)WB460可以抑制胰腺癌的恶性增长。
实施例9：式(I)WB460能抑制胰腺癌肿瘤转移
技术方法
(1)裸鼠尾静脉转移实验
小鼠尾静脉转移模型可以用来检测化合物能否在体内抑制肿瘤细胞的远端转移。由于小鼠毛细血管尺寸的限制，肿瘤细胞很少能够通过肺循环的方式从动脉系统到达静脉系统，因此肿瘤细胞会阻滞在肺部，很容易在肺部生长和转移。
将(1-10)×106个胰腺癌细胞PANC-1-luc注射到免疫缺陷小鼠(BALB/c-nude，裸鼠，5-6周)的尾静脉中，第二天用活体成像系统检测小鼠体内荧光强度并将小鼠均匀分为四组，即空白对照组隔天腹腔注射50μL的DMSO，低剂量组隔天腹腔注射10mg/kg溶于DMSO的WB460，高剂量组隔天腹腔注射20mg/kg溶于DMSO的WB460，阳性对照组隔天腹腔注射20mg/kg的BP-1-102，每周检测小鼠体内荧光强度并记录数据，每两天测量小鼠体重，连续给药六周后处死小鼠。
实验结果如图8所示，图(8A)为给药六周期间小鼠体内胰腺癌细胞的生物发光强度图，可以看出式(I)WB460能显著抑制胰腺癌细胞的转移；图(8B)为给药期间小鼠的体重变化。
上述实施例仅为了说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让本领域技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作出的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明保护范围内。
Claims (12)
1.式(I)所示的WB460小分子化合物或药学上可接受的盐在制备治疗恶性肿瘤疾病的药物中的应用；
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述恶性肿瘤包括血液瘤和实体瘤；其中，所述血液瘤包括白血病、淋巴瘤，所述实体瘤包括胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、头颈癌。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述式(I)WB460小分子化合物用于抑制胰腺癌的增殖、生长、转移、侵袭、浸润以及克隆形成。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述式(I)WB460小分子化合物抑制STAT3活性蛋白即p-STAT3Y705高表达胰腺癌细胞的增殖。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述式(I)WB460小分子化合物抑制胰腺癌细胞株的生长。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述式(I)WB460小分子化合物抑制胰腺癌细胞的克隆形成。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述式(I)WB460小分子化合物阻滞胰腺癌细胞株的细胞周期。
8.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述式(I)WB460小分子化合物诱导胰腺癌细胞株的细胞凋亡。
9.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述式(I)WB460小分子化合物可以与STAT3全长蛋白结合，在制备抑制STAT3信号通路促进恶性肿瘤发展药物中的应用。
10.一种药物组合物，其特征在于，其包含如权利要求1中所述的式(I)WB460小分子化合物或药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。
11.如权利要求1中所述的式(I)WB460小分子化合物或药学上可接受的盐，或如权利要求10所述的药物组合物在制备治疗与高表达STAT3活性蛋白的恶性肿瘤疾病药物中的应用。
12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述恶性肿瘤包括血液瘤和实体瘤；其中，所述血液瘤包括白血病、淋巴瘤，所述实体瘤包括胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、头颈癌。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20180724 |
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