CN108220475A

CN108220475A - 基于rpa技术的樱桃灰霉病菌检测方法及检测专用引物

Info

Publication number: CN108220475A
Application number: CN201810249149.1A
Authority: CN
Inventors: 王春伟; 王燕; 余廷濠; 荆琦; 王芝涵; 高海馨; 张曦倩; 王建明; 张作刚; 王美琴
Original assignee: Shanxi Agricultural University
Current assignee: Shanxi Agricultural University
Priority date: 2018-03-26
Filing date: 2018-03-26
Publication date: 2018-06-29

Abstract

本发明公开了一种基于RPA技术的樱桃灰霉病菌检测方法及检测专用引物，所述RPA检测专用引物是SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的引物对，用于检测或辅助检测樱桃灰霉病菌，或者制备检测或辅助检测樱桃灰霉病菌用产品。以所述专用引物对从待测植株或病原菌中提取的DNA进行RPA扩增，扩增产物含有296bp的片段，则待测植株或病原菌中含有樱桃灰霉病菌。本发明检测方法操作简便、检测速度快、特异性强、灵敏度高，适合基层对病原菌的快速检测要求，可用于樱桃灰霉病菌的发病前期检测与病害预测预报。

Description

基于RPA技术的樱桃灰霉病菌检测方法及检测专用引物

技术领域

本发明属于植物病原真菌的分子检测技术领域，涉及到一种利用重组酶介导等温扩增技术检测樱桃果实中灰霉病菌的方法，以及检测专用引物和试剂盒。

背景技术

樱桃(Cerasus pseudocerasus (Lindl.) G. Don)，属蔷薇科Rosaceae李亚科Prunoideae樱属Cerasus，多年生木本果树，起源于我国，栽培历史已达3000余年。樱桃果形娇小、色泽鲜艳、营养丰富、味道鲜美，广受人们青睐，其栽培面积和总产量稳定增长。我国樱桃种植区主要分布在山东、辽宁、河南、山西、陕西、河北、安徽等地区。

随着种植面积的扩大以及种植环境的变化，近年来，樱桃上新出现的病害种类呈上升趋势。尤其是樱桃果实成熟后呼吸代谢旺盛，采摘后几天内就会出现枯梗、果实软化腐烂和风味变淡等，失去其商品和食用价值。并且，樱桃果皮薄且果肉多汁，采摘贮运过程中极易受到多种真菌感染引起病害发生，大大缩短了樱桃的贮藏时间及货架期，进而严重影响樱桃的外观及商品价值，制约樱桃产业的健康可持续发展。

灰霉病是樱桃生产中的主要病害之一，其由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起，在樱桃生长的中后期以及贮藏期发病率高，危害严重。该病菌可危害樱桃的茎叶、花、果实等多个部位，在温湿度适宜时可萌发形成大量的分生孢子，发病处新生的灰霉分生孢子可在一个生长季重复进行多次再侵染，从而导致病情极易扩展传播，加重危害。并且在果实运输或贮藏过程中，由于机械摩擦造成伤口或温湿度及密闭条件控制不当，极易促使病原菌再次繁殖与扩散，造成更大危害。因此，建立一套快速灵敏的检测方法，用于樱桃灰霉病菌的快速检测与早期诊断，对于及时防控病原菌的流行与传播具有重要意义。

植物病原真菌的传统检测办法是先从发病植物组织或周围土壤中分离、纯化获得病原菌，再根据其形态学特征及生物学特性进行分类鉴定。病原菌的分离培养至少需要3～5天时间，耗时费力，且在分离培养过程中极易污染各种杂菌，鉴定准确度较低。更为重要的是，该办法容易遗漏处于潜育期或出现隐症现象的病原菌，从而耽误病害的及时防治。

近年来，分子生物学技术快速发展，为植物病原真菌的快速检测提供了新的思路。应用较多的包括聚合酶链式反应(PCR)、巢式PCR和荧光定量PCR等技术。这些方法均需要经过病原菌分离培养、DNA提取纯化及PCR扩增的过程，操作复杂繁琐、费时费力，需要DNA提取及纯化试剂盒或各种试剂，以及昂贵的PCR仪或特殊仪器设备，并且需要具有一定分子生物学基础及操作技术的专业人员才能完成，无法满足基层检测的需求。

重组酶介导等温扩增(Recombinase Polymerase Amlification，RPA)技术被公认是可以替代PCR的核酸检测技术。其原理是利用重组酶与引物结合形成蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。另外，RPA技术有多重工具酶匹配进行有效扩增，扩增效率远高于传统的PCR技术，所用时间更短，最短可在5min内实现。由于RPA技术具有扩增用时短、不需昂贵仪器、特异性好等特点，使其应用越来越广泛。

RPA技术的最大特点是只需要1对引物即可在37℃左右的恒温条件下实现模板核酸的扩增，不需要通过高低温度循环实现核酸解链和退火，因此不需要昂贵的仪器设备。而且37℃的常规反应温度很容易满足，适合基层对病原菌的快速检测。

目前，RPA技术已经广泛应用于人体、动物或植物上的病毒检测，但在植物病原真菌的检测方面，尤其是对于樱桃果实灰霉病菌的RPA检测，未见相关应用报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于RPA技术的樱桃灰霉病菌检测方法，以建立樱桃果实灰霉病菌的快速检测新方法。

提供适用于所述检测方法的检测专用引物，以及含有该专用引物的试剂盒，是本发明的另一发明目的。

为实现上述发明目的，本发明首先针对樱桃灰霉病菌的核糖体转录间隔区(ITS)，采用Primer Premier 5.0软件设计了一系列的RPA引物，并通过实验对所设计的引物进行优化筛选，获得了一对用于RPA检测樱桃灰霉病菌的专用引物，其中一条引物包含SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列，另一条引物包含SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

具体地，所述引物对具有下列所示的核苷酸序列：

上游引物RPA ITS-F：5'-GAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGA-3'；

下游引物RPA ITS-R：5'-GCGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCAT-3'。

本发明所设计的RPA检测专用引物长度在30～35bp，比一般的PCR检测引物长。引物过短会降低重组率，影响RPA反应的扩增速度和检测灵敏度。

进而，本发明提供了上述引物对在检测或辅助检测樱桃灰霉病菌，或者制备检测或辅助检测樱桃灰霉病菌用产品中的应用。

具体地，所述检测或辅助检测樱桃灰霉病菌包括：检测或辅助检测待测植株是否感染樱桃灰霉病菌，以及检测或辅助检测待测病原菌是否为樱桃灰霉病菌。

所述制备检测或辅助检测樱桃灰霉病菌用产品包括：制备检测或辅助检测待测植株是否感染樱桃灰霉病菌的产品，以及制备检测或辅助检测待测病原菌为樱桃灰霉病菌的产品。

进一步地，本发明还提供了一种用于检测或辅助检测樱桃灰霉病菌的RPA试剂，在所述RPA试剂中包括有上述引物对。

优选地，上述RPA试剂中，所述引物对在RPA试剂中的终浓度为0.42μM。

更进一步地，本发明还提供了一种用于检测或辅助检测樱桃灰霉病菌的试剂盒，在所述试剂盒中包括有上述引物对及上述RPA试剂。

本发明所述试剂盒中还包括了RPA反应试剂，所述RPA反应试剂优选采用RAA核酸扩增试剂（基础型，杭州众测生物科技有限公司），包括有复合酶检测干粉，A Buffer和BBuffer。

进而，本发明提供了一种基于RPA技术的樱桃灰霉病菌检测方法，所述方法是从待测植株或待测病原菌中免培养快速提取得到病原菌DNA作为模板，用所述引物对或所述RPA试剂或所述试剂盒进行RPA扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测RPA扩增产物的大小，若所述RPA扩增产物含有大小为296bp的片段，则所述待测植株或待测病原菌中含有樱桃灰霉病菌，若所述RPA扩增产物不含有大小为296bp的片段，则所述待测植株或待测病原菌中不含有樱桃灰霉病菌。

其中，可以采用任何适合的常规DNA提取方法，从待测植株或待测病原菌中免培养快速提取得到病原菌DNA。例如，包括但不限于采用NaOH快速裂解法，从樱桃灰霉病发病果实中提取得到病原菌的DNA。或者，包括但不限于采用Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒，提取供试病原菌菌株的基因组DNA。

本发明上述方法中，一种优选的RPA扩增反应过程包括：在装有RAA核酸扩增试剂检测干粉的反应单元管中加入A Buffer 41.5μL，10μM的上游引物2μL，10μM的下游引物2μL，模板DNA 2.0μL，B Buffer 2.5μL，盖上管盖，上下翻转混匀5～6次，将RPA扩增体系充分混匀，5,000×g离心10s，置于37℃金属浴上反应30min。

本发明上述方法中，RPA反应结束后，向RPA扩增产物中加入50μL苯酚/氯仿(1∶1)溶液，充分混匀后11,000×g离心3min，取上清液5μL于1.0%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果。

所述琼脂糖凝胶电泳检测的检测电压80V，电流110A，检测时间40min。

本发明提供了一组适用于樱桃灰霉病菌RPA检测的引物对，将该组引物对应用于樱桃灰霉病菌的RPA检测中，具有操作简便、检测速度快、特异性强、灵敏度高等优点。

本发明检测方法无需对病原菌进行分离纯化及培养，反应在37℃左右的恒温条件下即可实现模板核酸的扩增，也不需要通过高低温度循环实现核酸解链和退火，因此不需要昂贵的仪器设备，37℃的反应温度甚至不需要借助于仪器设备，正常人体温度就能满足，非常适合基层对病原菌的快速检测要求。

本发明可以用于带菌植株组织中樱桃灰霉病菌的快速检测，只需约2h即可完成检测过程，是一种检测樱桃灰霉病菌的有效手段。

本发明检测方法用于樱桃灰霉病菌的发病前期检测与病害的预测预报，对于确定防治适期、有效防治病害具有十分重要的意义。

附图说明

图1是RPA引物扩增凝胶电泳图。其中，泳道M为Marker2000、1为引物ITS-F/ITS-R、2为正反应对照、3为阴性对照。

图2是不同RPA反应温度下的凝胶电泳图。其中，泳道M为Marker2000、1为34℃、2为37℃、3为40℃、4为43℃。

图3是不同RPA反应时间下的凝胶电泳图。其中，泳道M为Marker2000、1为10min、2为20min、3为30min、4为40min、5为50min、6为60min。

图4是RPA与PCR反应灵敏度检测凝胶电泳图。其中，A为RPA反应、B为PCR反应；泳道M为Marker2000、1为700pg/μL、2为100pg/μL、3为10pg/μL、4为1pg/μL、5为100fg/μL。

图5是RPA检测特异性凝胶电泳图。其中，M为Marker2000、1为灰霉病菌、2为禾谷镰刀菌、3为层出镰刀菌、4为链格孢菌、5为枝状枝孢菌、6为正反应对照、7为阴性对照。

图6是实际样品的RPA检测凝胶电泳图。其中，泳道M为Marker2000、1为健康果实、2为发病果实、3为正反应对照、4为阴性对照。

具体实施方式

下述实施例仅为本发明的优选技术方案，并不用于对本发明进行任何限制。对于本领域技术人员而言，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

若未特别指明，以下实施例均按照常规实验条件进行操作，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1。

RPA引物长度一般为30至35个核苷酸。引物过短会严重影响重组酶的活性，长引物并不一定能提高扩增性能，反而会增加形成二级结构的可能性，增大来自引物的噪音。此外，引物设计时应尽量避免容易形成二级结构、引物-引物互作、发夹结构的序列，减少引物二聚体的形成。扩增产物大小不超过500bp。

根据樱桃灰霉病菌ITS序列，使用Primer Premier 5.0设计了SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示核苷酸序列的由上下游引物组成的RPA引物对。

RPA ITS-F：5'-GAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGA-3'。

RPA ITS-R：5'-GCGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCAT-3'。

实施例2。

采用NaOH快速裂解法，从樱桃灰霉病发病果实中快速提取供试病原菌的基因组DNA。具体提取过程如下。

1) 向每毫克樱桃果实中加入10μL 0.5mol/L NaOH溶液。

2) 在研钵中将植物组织充分磨碎成糊后，转入1.5mL离心管中。

3) 11,000×g离心6min。

4) 取上清液5μL，加入495μL 0.1mol/L Tris-HCl(pH=8.0)，混合均匀，得到含有灰霉病菌基因组DNA的溶液。

实施例3。

采用Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒提取供试病原菌菌株的基因组DNA。具体提取过程如下。

1) 选取在PDA培养基上培养7～10d的病原菌，挑取新鲜菌丝，研磨成粉，装入1.5mL离心管中。

2) 加入500μL LE Buffer，混合均匀。

3) 65℃温育60min(间隔15min颠倒混匀1次)，然后移出。

4) 加入130μL DA Buffer，混匀，65℃水浴5min。

5) 14,000×g离心3min。

6) 取上清液，移入新的1.5mL离心管中。

7) 加入500μL E Binding Buffer，混合均匀。

8) 将混合液移至Spin Column，于6,000×g离心1min。

9) 向Spin Column加入500μL G Binding Buffer，10,000×g离心30s，弃去接液管中液体。

10) 向Spin Column加入600μL Wash Buffer，于10,000×g离心30s，弃去接液管中液体。

11) 重复操作10)，10,000×g离心1min。

12) Spin Column放入新的1.5mL离心管中，放置10～15min，加入40μL ddH₂O，放置1min后，离心1min。加入30μL ddH₂O，10,000×g离心1min，弃去Spin Column，离心管液体中即含有DNA。

实施例4。

以实施例2提取的DNA为模板，采用实施例1设计的RPA引物，在下述反应体系中进行RPA反应。

样品检测：向装有检测干粉的反应单元管中加入41.5μL A Buffer，2μL引物RPAITS-F2和RPA ITS-R2(10μM)，2.0μL模板DNA，2.5μL B Buffer，盖上管盖，上下翻转混匀5～6次，将RPA扩增体系充分混匀，5,000×g离心10s，置于37℃金属浴上反应30min。

阴性对照：操作步骤同样品检测，将2.0μL模板DNA改为加入2.0μL灭菌ddH₂O。

正反应对照：向装有检测干粉的反应单元管中加入41.5μL A Buffer，4μL CBuffer，2.5μL阳性对照，2.5μL B Buffer，盖上管盖，上下翻转混匀5～6次，5,000×g离心10s，置于37℃金属浴上反应30min。

RPA反应结束后，向扩增产物中加入50μL苯酚/氯仿(1∶1)溶液，充分混匀，11,000×g离心3min，取上清液5μL，进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上，根据条带大小判定结果。

电泳检测结果如图1所示。以实施例1设计的引物进行RPA扩增反应后，琼脂糖凝胶电泳检测结果显示该引物对能检测到大小为296bp的目标片段(泳道1)，目标条带清析且没有杂带，能有效检测出发病果实的灰霉病菌。

泳道2的正反应对照同样扩增出明显条带，而泳道3的阴性对照未扩增出条带。

实施例5。

采用实施例1设计的RPA引物，以实施例3提取的DNA为模板，按照实施例4反应体系进行RPA反应，并设定反应温度分别为34℃、37℃、40℃和43℃，检测不同温度对反应结果的影响。实验结果如图2所示，表明反应温度为37℃时条带清析，因此最适宜的反应温度为37℃。

实施例6。

采用实施例1设计的RPA引物，以实施例3提取的DNA为模板，按照实施例4反应体系进行RPA反应，设定反应温度为37℃，反应时间分别为10min、20min、30min、40min、50min和60min，检测不同时间对反应结果的影响。实验结果如图3所示，表明最适宜的反应时间为30min。

实施例7。

使用Nanodro 2000微量分光光度计测定出实施例3提取DNA的浓度为700pg/μL。

将其依次稀释为100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL和100fg/μL，根据上述实施例采用的引物、反应体系和反应条件，对不同浓度的DNA进行RPA和PCR检测。

实验结果如图4所示，结果表明RPA检测浓度为10pg/μL，而PCR检测浓度为1pg/μL时仍能看到目标条带，说明PCR检测的灵敏度高于RPA。但PCR检测过程需要2.5h，而RPA检测时间仅需30min，且不需要PCR仪等昂贵的仪器设备，操作程序简便，更有利在生产中推广应用。

实施例8。

为了验证本发明建立的RPA检测方法对于樱桃灰霉病菌的特异性，本实施例以多种不同病原菌作为供试材料，提取病原菌的DNA，进行RPA反应。

选择层出镰刀菌（Fusarium proliferatum）、枝状枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）、链格孢菌（Alternaria alternata）、禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）进行特异性检测。

以实施例3方法提取各病原菌的DNA，根据上述实施例1设计的引物，实施例5筛选出的反应温度和实施例6筛选出的反应时间，用实施例4方法进行RPA反应，采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，所述检测条件为电压80 V，电流110 A，检测时间40 min，检测RPA反应的特异性。若所述RPA扩增产物含有296bp的片段，则所述待测植株或待测病原菌中含有樱桃灰霉病菌，若所述RPA扩增产物不含有296bp的片段，则所述待测植株或待测病原菌中不含有樱桃灰霉病菌。

实验结果如图5所示，RPA扩增产物含有296bp的片段，而其他病原菌DNA扩增后在296bp位置均没有条带，该方法能特异性扩增出樱桃灰霉病菌的目标片段，具有很好的特异性。

实施例9。

本实施例从田间选择樱桃自然发病果实和健康果实进行实验。

首先采用实施例2的NaOH快速裂解法快速提取病果和健康果实中的病原菌DNA。

采用上述实施例1设计的引物对提取的病原菌DNA进行RPA反应：向装有检测干粉的反应单元管中加入41.5μL A Buffer，2μL引物RPA ITS-F2和RPA ITS-R2(10μM)，2.0μL模板DNA，2.5μL B Buffer，盖上管盖，上下翻转混匀5～6次，将 RPA扩增体系充分混匀，5,000×g离心10s，充分混匀后，将反应管按照实施例5筛选出的反应温度和实施例6筛选出的反应时间进行RPA反应，获得扩增产物。RPA反应结束后，向RPA扩增产物中加入50μL苯酚/氯仿(1∶1)溶液，充分混匀后，11,000×g离心3min，取上清液5μL，进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果。

1.0%琼脂糖凝胶电泳检测条件为电压80V，电流110A，检测时间40min。实验结果如图6所示，针对发病果实的RPA反应能扩增出大小为296bp的目标片段，正反应对照扩增出与发病果实一致的明显条带，阴性对照未扩增出条带，由此证明发病果实中含有灰霉病菌。而健康果实没有扩增出条带，再次证明了该PRA方法检测结果准确可靠，有很强的实用性。

SEQUENCE LISTING

<110> 山西农业大学

<120> 基于RPA技术的灰霉病菌检测方法及检测专用引物

<160> 2

<170> SIPO Sequence Listing 1.0

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物RPA ITS-F

<400> 1

GAAGAACGCA GCGAAATGCG ATAAGTAATG TGA 33

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物RPA ITS-R

<400> 2

GCGGGTATCC CTACCTGATC CGAGGTCAAC CAT 33

Claims

1.一种RPA检测樱桃灰霉病菌的专用引物，是具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列与SEQID NO.2所示核苷酸序列的引物对。

2.一种用于检测或辅助检测樱桃灰霉病菌的RPA试剂，在所述RPA试剂中包括有权利要求1所述的引物对。

3.根据权利要求2所述的RPA试剂，其特征是所述引物对在RPA试剂中的终浓度为0.42μM。

4.一种用于检测或辅助检测樱桃灰霉病菌的试剂盒，在所述试剂盒中包括有权利要求1所述的引物对或权利要求2所述的RPA试剂。

5.权利要求1所述引物对在检测或辅助检测樱桃灰霉病菌中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征是所述检测或辅助检测樱桃灰霉病菌包括检测或辅助检测待测植株是否感染樱桃灰霉病菌，以及检测或辅助检测待测病原菌是否为樱桃灰霉病菌。

7.权利要求1所述引物对在制备检测或辅助检测樱桃灰霉病菌用产品中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征是所述制备检测或辅助检测樱桃灰霉病菌用产品包括制备检测或辅助检测待测植株是否感染樱桃灰霉病菌的产品，以及制备检测或辅助检测待测病原菌为樱桃灰霉病菌的产品。

9.一种基于RPA技术的樱桃灰霉病菌检测方法，是从待测植株或待测病原菌中提取病原菌DNA作为模板，以权利要求1所述引物对或权利要求2所述RPA试剂或权利要求4所述试剂盒进行RPA扩增，琼脂糖凝胶电泳检测RPA扩增产物大小，若所述RPA扩增产物含有大小为296bp的片段，则所述待测植株或待测病原菌中含有樱桃灰霉病菌，若所述RPA扩增产物不含有大小为296bp的片段，则所述待测植株或待测病原菌中不含有樱桃灰霉病菌。

10.根据权利要求9所述的樱桃灰霉病菌检测方法，其特征是所述的RPA扩增是在37℃下反应30min。