CN108220286A

CN108220286A - 粪便宿主dna甲基化检测方法

Info

Publication number: CN108220286A
Application number: CN201810266872.0A
Authority: CN
Inventors: 罗海贝; 王臣; 赵然; 冯俊; 陈小凤
Original assignee: SHANGHAI RUIYI BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI RUIYI BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2018-03-28
Filing date: 2018-03-28
Publication date: 2018-06-29

Abstract

本发明提出了提取粪便中宿主DNA的试剂组合物及利用其提取粪便中宿主DNA的方法、DNA甲基化的方法和对经过甲基化的粪便宿主DNA进行甲基化特异性PCR检测的试剂盒及方法。所述试剂组合物包括：提供硫酸根离子的裂解液A；以及提供钙离子的絮凝剂。利用本发明的试剂组合物能够充分提取出粪便中的宿主DNA，且提取效率较好、宿主DNA纯度较高，操作简便，适于规模化应用。

Description

粪便宿主DNA甲基化检测方法

技术领域

本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及粪便宿主DNA甲基化检测方法。更具体地，本发明涉及提取粪便中宿主DNA的试剂组合物及利用其提取粪便中宿主DNA的方法、DNA甲基化的方法和对经过甲基化的粪便宿主DNA进行甲基化特异性PCR检测的试剂盒及方法。

背景技术

DNA甲基化(DNA methylation)是最早发现的修饰途径之一，是表观遗传修饰的重要组成部分。DNA甲基化一般发生在CpG位点，而DNA基因启动子区域CpG岛与基因表达密切相关。由此，甲基化水平的检测对于研究宿主的特定基因表达情况具有重要意义。于人类而言，DNA甲基化与癌症关系巨大，一些基因的甲基化检测已被广泛用于癌症的早期诊断中，如乳腺癌(p16ink4a、RARβ)、肺癌(p16、DAPK、APC)、卵巢癌(TUSC3)等。

粪便作为一种新的非损伤性来源的样本，在动物分子遗传学、种群生态学和一些肠道疾病诊断等领域广泛应用。粪便中含有许多具有遗传信息的样品，如肠道菌群DNA、食物残渣样品DNA、消化道脱落细胞DNA等。

然而，目前对粪便宿主DNA的检测仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

脱落细胞是宿主遗传变异信息分析的优良载体，但由于其含量较低且粪便样本中干扰物质种类和含量较多，如多聚糖、胆盐、胆酸、色素和粘液等，虽有很多商业化的试剂盒，但大多数只能进行宏量肠道菌群DNA提取，对宿主细胞DNA效率极低，难以满足后续分析，并且由于粪便宿主DNA样本中干扰物质通常难以完全去除，为微量宿主DNA基因甲基化的检测进一步增加了难度。

有鉴于此，发明人通过对提取粪便宿主DNA的试剂进行优化，尤其是絮凝剂的添加，从而有效去除粪便宿主DNA中杂质、PCR抑制物等，提高粪便宿主DNA的提取效率。在甲基化过程中，通过添加λDNA作为转化辅助因子，显著降低甲基化过程中DNA损失，并显著提高对于转化后微量目标基因片段的回收率。通过对甲基化的宿主DNA中目标片段进行扩增，以实现检测目的。在扩增过程中，选择较佳的扩增试剂及扩增程序，从而提高扩增效率，进一步提高检测准确性和灵敏度。

为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种提取粪便中宿主DNA的试剂组合物。根据本发明的实施例，所述试剂组合物包括：提供硫酸根离子的裂解液A；以及提供钙离子的絮凝剂。

由于粪便样本中宿主细胞DNA含量较少，且干扰物质种类及含量较多，如多聚糖、胆盐、胆酸、色素和粘液等，会导致DNA提取效果较差，且杂质较多。进而，发明人创造性地构建絮凝体系，以去除粪便样本中的干扰物质。具体地，在裂解液A中提供硫酸根离子，其可以与后续加入的含有钙离子的絮凝剂发生硫酸钙沉淀反应形成絮状沉淀，同时可以沉淀多种颗粒物等干扰物，从而提高粪便宿主DNA的提取效率及纯度。并且，利用该试剂组合物提取的操作简便，适于规模化应用。

根据本发明的实施例，上述提取粪便中宿主DNA的试剂组合物还可以进一步具有下列附加技术特征：

根据本发明的实施例，所述裂解液A中含有硫酸铵，所述絮凝剂为氯化钙溶液。由此，通过构建絮凝体系，沉淀多种颗粒物等干扰物质，进一步提高粪便宿主DNA的提取效率，且不影响后续DNA甲基化及PCR扩增反应的发生。

根据本发明的实施例，所述裂解液A包括：硫酸铵、硫氰酸胍、Tris-HCl、EDTA、CTAB和PVP-10。发明人经过大量实验得到上述较优裂解液A组成，其能够提供宿主细胞裂解和基因组DNA释放的环境，沉淀样本中的多聚糖类抑制物，并尽量避免细菌破壁释放基因组DNA污染宿主DNA，同时提供形成絮状沉淀的SO₄ ^2-离子。

根据本发明的优选实施例，所述裂解液A包括：25～500mM的硫酸铵；25～500mM的硫氰酸胍；10～100mM的Tris-HCl，pH为5-8；20～200mM的EDTA，pH为8.0；0.5～2.5质量％的CTAB；以及0.5～2.5质量％的PVP-10。根据本发明的更优选实施例，所述裂解液A包括：50～100mM的硫酸铵；50～100mM的硫氰酸胍；20～50mM的Tris-HCl，pH为6.5-7.5；40～50mM的EDTA，pH为8.0；1.5～2.0质量％的CTAB；以及1.5～2.0质量％的PVP-10。由此，能够进一步裂解宿主细胞、释放基因组DNA，充分沉淀样本中的多聚糖类抑制物，并尽量避免细菌破壁释放基因组DNA污染宿主DNA，从而提高宿主DNA提取效率及纯度。

根据本发明的实施例，所述絮凝剂为0.5～2M的氯化钙溶液。根据本发明的优选实施例，所述絮凝剂为0.5～1M的氯化钙溶液。发明人经过的大量实验得到上述较优浓度，由此，其中的钙离子能够充分与裂解液A中的硫酸根离子反应形成絮状沉淀，充分沉淀干扰物质，从而进一步提高宿主DNA提取效率及纯度。

根据本发明的实施例，所述试剂组合物进一步包括：裂解液B、蛋白消化液、结合液、DNA吸附载体、去杂质液A、去杂质液B和DNA溶解液。发明人经过大量得到上述较优试剂组合物组分，其中裂解液B和蛋白消化液提供充分消化蛋白质和宿主细胞膜结构并使宿主DNA充分释放的条件。结合液提供高离液环境使DNA分子沉淀并与DNA吸附载体结合。去杂质液A和去杂质液B用于去除非特异性结合在吸附载体上的蛋白、盐类和其它未消化的干扰物质。DNA溶解液提供低盐和高pH环境用于DNA吸附载体上DNA的分离和溶解。

根据本发明的实施例，所述裂解液B包括：硫氰酸胍、Tris-HCl和Triton X-100。根据本发明的优选实施例，所述裂解液B包括：2～6M的硫氰酸胍；10～100mM的Tris-HCl，pH为5～8以及0.1～5质量％的Triton X-100。根据本发明的更优选实施例，所述裂解液B包括：3.5～4.5M的硫氰酸胍；20～50mM的Tris-HCl，pH为5.5～6.5以及0.5～1质量％的TritonX-100。发明人经过大量实验得到上述较优裂解液B组分，由此，以进一步充分消化蛋白质和宿主细胞膜结构并使宿主DNA充分释放，从而进一步提高宿主DNA提取效率及纯度。

根据本发明的实施例，所述蛋白消化液为蛋白酶K溶液。根据本发明的优选实施例，所述蛋白消化液为10～50mg/ml的蛋白酶K溶液。根据本发明的更优选实施例，所述蛋白消化液为15～25mg/ml的蛋白酶K溶液。发明人经过大量实验得到上述较优蛋白消化液组分，由此，以进一步充分消化蛋白质和宿主细胞膜结构并使宿主DNA充分释放，从而进一步提高宿主DNA提取效率及纯度。

根据本发明的实施例，所述结合液为无水乙醇。由此，以进一步提高DNA分子沉淀并与DNA吸附载体结合效率。

根据本发明的实施例，所述DNA吸附载体为硅羟基磁珠。由此，以充分结合DNA分子沉淀，便于除去干扰物质。

根据本发明的实施例，所述去杂质液A包括：硫氰酸胍、乙酸铵、Triton X-100、Tris-HCl和乙醇。根据本发明的优选实施例，所述去杂质液A包括：1～2M的硫氰酸胍；20～200mM的乙酸铵；0.1～0.5质量％的Triton X-100；10～100mM的Tris-HCl，pH6～8以及40～70质量％的乙醇。根据本发明的更优选实施例，所述去杂质液A包括：2M的硫氰酸胍；25～50mM的乙酸铵；0.2～0.25质量％的Triton X-100；15～25mM的Tris-HCl，pH为6.8以及45～60质量％乙醇。发明人经过大量实验得到上述较优去杂质液A，以便进一步去除非特异性结合在吸附载体上的蛋白、盐类和其它未消化的干扰物质，从而进一步提高宿主DNA提取效率及纯度。

根据本发明的实施例，所述去杂质液B包括：乙酸铵、Tris-HCl和乙醇。根据本发明的优选实施例，所述去杂质液B包括：5～50mM的乙酸铵溶液；5～50mM的Tris-HCl，pH6～8以及60～90质量％的乙醇。根据本发明的更优选实施例，所述去杂质液B包括：10mM的乙酸铵、10mM的Tris-HCl，pH为6.8以及70～80质量％乙醇。发明人经过大量实验得到上述较优去杂质液B，以便进一步去除非特异性结合在吸附载体上的蛋白、盐类和其它未消化的干扰物质，从而进一步提高宿主DNA提取效率及纯度。

根据本发明的实施例，所述DNA溶解液为Tris-HCl。根据本发明的优选实施例，所述DNA溶解液为5～25mM的Tris-HCl，pH8～9。根据本发明的更优选实施例，所述DNA溶解液为10mM的Tris-HCl，pH为8.5。由此，以便进一步溶解DNA，且有效防止其降解。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种利用前面所述提取粪便中宿主DNA的试剂组合物提取粪便中宿主DNA的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：a、取粪便样本，加入所述裂解液A，混合并离心；b、收集步骤a所得上清，加入所述絮凝剂，混匀并离心；c、收集步骤b所得上清，加入所述蛋白消化液和裂解液B，孵育；d、向步骤c所得混合液中加入与步骤c所述上清等体积的所述结合液，再加入与步骤c所述蛋白消化液等体积的所述DNA吸附载体，混匀，室温放置；e、将步骤d的结合体系放置在磁力架上磁吸，吸除清液；f、向步骤e的DNA吸附载体上加入所述去杂质液A，混合，在磁力架上磁吸，吸除清液；g、向步骤f的DNA吸附载体上加入所述去杂质液B，混合，在磁力架上磁吸，吸除清液；h、向步骤g的DNA吸附载体上加入所述DNA溶解液，混合，室温放置，在磁力架上磁吸，收集清液，以便获得DNA。

由于粪便样本中宿主细胞DNA含量较少，且干扰物质种类及含量较多，如多聚糖、胆盐、胆酸、色素和粘液等，会导致DNA提取效果较差，且杂质较多。进而，发明人创造性地获得上述提取粪便宿主DNA的方法，各试剂之间相互作用，从而提高宿主DNA的提取效率及纯度，尤其是构建絮凝体系，通过絮凝剂提供的钙离子与裂解液A提供的硫酸根离子反应形成絮状沉淀，可以同时沉淀多种颗粒物等干扰物质，从而进一步提高宿主DNA的提取效率及纯度。并且，本发明的方法操作简便，适于规模化应用。

根据本发明的实施例，所述方法包括：a、取0.1～5g粪便样本，加入600μl～10ml所述裂解液A，涡旋振荡1～5分钟，在10000g离心5分钟；b、收集步骤a所得上清，加入1/10体积所述絮凝剂，颠倒数次，在10000g离心5分钟；c、收集步骤b所得上清，按照每1ml上清加入20μl蛋白消化液，再加入与所述上清等体积的所述裂解液B，置于50～60℃孵育10分钟；d、向步骤c所得混合液中加入与步骤c所述上清等体积的所述结合液，加入与步骤c所述蛋白消化液等体积的所述DNA吸附载体，涡旋振荡1分钟，室温放置5～10分钟；e、将步骤d的结合体系放置在磁力架上磁吸30秒，吸除清液；f、向步骤e的DNA吸附载体上加入500μl～1ml所述去杂质液A，涡旋振荡1分钟，在磁力架上磁吸30秒，吸除清液；g、向步骤f的DNA吸附载体上加入500μl～1ml所述去杂质液B，涡旋振荡1分钟，在磁力架上磁吸30秒，吸除清液；h、向步骤g的载体磁珠上加入100～200μl DNA溶解液，涡旋振荡1分钟，并在室温放置5分钟，在磁力架上磁吸30秒，收集清液，以便获得DNA。发明人经过大量实验得到上述较优的提取条件，由此，以进一步提高宿主DNA的提取效率及纯度。

需要说明的是，前面针对提取粪便中宿主DNA的试剂组合物所描述的特征和优点，同样适用于该方法，在此不再赘述。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种DNA甲基化的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：利用前面所述试剂组合物提取粪便中的DNA，并将所得到的DNA与λDNA进行混合，得到混合DNA；以及利用已知方法或者试剂盒对所述混合DNA进行甲基化处理。

发明人利用“亚硫酸氢盐能够将所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变”的原理，对由粪便中提取的宿主DNA进行甲基化处理。进一步地，发明人创造性地在宿主DNA中加入λDNA，由此可以增加核酸总量，在甲基化转化过程中减少吸附、洗涤、洗脱过程中产生的原样本核酸的损失。另外，由于粪便样本的特殊性，某些干扰物质可能对甲基化转化过程有影响，比如吸附到核酸上，影响亚硫酸氢盐的转化效率。进而，加入λDNA可以降低单位核酸上潜在吸附的干扰物质，使原样本核酸的转化更完全，相当于有更多的样本核酸可用于有效检测。利用本发明的DNA甲基化的方法能够有效地降低甲基化转化过程中宿主DNA的损失率，提高低拷贝宿主DNA甲基化的检测灵敏度。

根据本发明的实施例，利用前面所述利用试剂组合物提取粪便中宿主DNA的方法提取粪便中的方法提取粪便中的DNA。由此，以提高宿主DNA的提取效率及纯度。

根据本发明的实施例，所述DNA和λDNA总用量为500ng～2μg。发明人经过大量实验得到上述较优用量，在此条件下能够进一步降低甲基化转化过程中宿主DNA的损失率，提高低拷贝宿主DNA甲基化的检测灵敏度。

根据本发明的实施例，采用下列之一的试剂盒进行所述甲基化处理：ZYMOResearch公司生产的EZ DNA Methylation Kit，货号D5001；DNA Methylation-Gold^TM Kit，货号D5008；Qiagen公司生产的QIAGEN Bisulfite，货号59104。由此，以进一步降低甲基化转化过程中宿主DNA的损失率，提高低拷贝宿主DNA甲基化的检测灵敏度。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种对经过甲基化的粪便宿主DNA进行甲基化特异性PCR(qMSP)检测的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：引物、探针、HotStart Taq酶、dNTPs以及PCR扩增缓冲液，其中，所述PCR扩增缓冲液包括：Tris-HCl、KCl溶液、MgCl₂溶液、α-酪蛋白、甜菜碱、铵和/或胺类化合物以及非离子表面活性剂，所述粪便宿主DNA是采用前面所述试剂组合物提取的，或者是利用前面所述利用试剂组合物提取粪便中宿主DNA的方法获得的，所述甲基化是采用前面所述DNA甲基化的方法进行的。

发明人经过大量实验获得上述试剂盒，其可以有效地对经过甲基化的微量粪便宿主DNA进行PCR扩增，且对于多数不同引物/探针的扩增特异性均表现良好，且扩增稳定性和灵敏度高。具体地，甜菜碱用于提高对于复杂二级结构DNA的扩增；硫酸铵和四甲基氯化铵用于降低引物和模板的错配，增强PCR特异性；非离子表面活性剂用于保护聚合酶的活性和稳定性；α-酪蛋白用于抵制粪便DNA中残留抑制物的干扰，提高扩增的稳定性和灵敏度。

根据本发明的实施例，所述PCR扩增缓冲液包括：8～15mM的Tris-HCl，pH值为8～9；35～100mM的KCl溶液；1～5mM的MgCl₂溶液；0.1～1mg/ml的α-酪蛋白；0.5～2M的甜菜碱；10～100mM的铵和/或胺类化合物以及0.1～10质量％的非离子表面活性剂。根据本发明的优选实施例，所述PCR扩增缓冲液包括：10mM Tris-HCl，pH为8.3；50mM KCl溶液；2.5mMMgCl₂溶液；0.3～0.6mg/mlα-酪蛋白；0.8～1M的甜菜碱；15～20mM铵和/或胺类化合物以及0.1～1质量％非离子表面活性剂。由此，以进一步提高扩增特异性、稳定性或灵敏度。

根据本发明的实施例，所述铵类化合物为硫酸铵，所述胺类化合物为四甲基氯化铵，所述非离子表面活性剂为Triton X-100、Tween-20和/或NP-40。由此，以进一步提高扩增特异性、稳定性或灵敏度。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种对经过甲基化的粪便宿主DNA进行甲基化特异性PCR检测的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将前面所述对经过甲基化的粪便宿主DNA进行甲基化特异性PCR检测的试剂盒中各试剂与经过甲基化的粪便宿主DNA进行混合，以便得到混合液；以及对所述混合液进行PCR扩增反应。利用本发明的方法能够有效地对经过甲基化的微量粪便宿主DNA进行PCR扩增，且对于多数不同引物/探针的扩增特异性均表现良好，且扩增稳定性和灵敏度高。

根据本发明的实施例，所述引物浓度为100～400nM；所述TaqMan探针浓度为200～500nM；所述Taq酶浓度为0.1～1U/μl的；所述dNTPs浓度为0.2mM；所述经过甲基化的粪便宿主DNA浓度为1～20μl；所述PCR扩增缓冲液的稀释倍数为1倍；所述Tris-HCl浓度为10mM，pH为8.3；所述KCl溶液浓度为50mM；所述MgCl₂溶液浓度为2.5mM；所述α-酪蛋白浓度为0.3～0.6mg/ml；所述甜菜碱浓度为0.8～1M；所述铵和/或胺类化合物浓度为15～20mM；所述非离子表面活性剂浓度为0.1～1质量％。发明人经过大量实验得到上述较优浓度配比，由此，以进一步提高扩增特异性、稳定性或灵敏度。

根据本发明的实施例，所述PCR扩增反应采用降落PCR模式，扩增程序为：98℃8min；95℃3min；95℃10s/62℃30s，2个循环；95℃10s/61～56℃30s，6循环，每循环降1℃；95℃10s/55℃30s，2个循环；95℃10s/54℃30s，5个循环；95℃10s/53℃30s，10个循环；95℃10s/52℃30s，20个循环。发明人设定特定的降落PCR扩增程序，以减少不同目标序列对于退火温度的选择性，并能减少引物二聚体和非特异性产物的形成，进一步提高检测灵敏度。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了通过本发明的方法检测目标基因甲基化水平的qMSP结果，其中TFPI2为目标基因，beta-Actin为参考基因。

图2显示了通过市售试剂盒按照流程的组合检测qMSP结果，其中TFPI2为目标基因，beta-Actin为参考基因。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

1、粪便宿主DNA提取与质检

取粪便样本共5例，每个样准确称取200mg干重，各两份。一份按照本发明所述方法提取，另一份按照QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit(货号51604)标准操作流程进行提取。

按照优选组分，本发明方法提取流程：向1g样本中加入600μl裂解液A(100mM硫酸铵，100mM硫氰酸胍，50mM Tris-HCl(pH6.8)，50mM EDTA，1.5％CTAB，2％PVP-10)，涡旋振荡3min，10000g离心5min；小心收集上清500μl，加入50μl絮凝剂(0.75M氯化钙)，颠倒5次，10000g离心5min；小心收集上清500μl，加入10μl蛋白消化液(20mg/ml蛋白酶K)，再加入500μl裂解液B(4M硫氰酸胍，25mM Tris-HCl(pH6.0)，1％Triton X-100)，在56℃孵育10分钟；加入500μl结合液(无水乙醇)，10μl载体磁珠(硅羟基磁珠)，涡旋振荡1min，室温放置8min；在磁力架上磁吸30s，充分吸除上清；向磁珠中加入500μl去杂质液A(2M硫氰酸胍，50mM乙酸铵，0.2％Triton X-100，20mM Tris-HCl(pH6.8)，50％乙醇)，涡旋振荡1min，在磁力架上磁吸30秒，充分吸除清液；向磁珠中加入500μl去杂质液B(10mM乙酸铵，10mM Tris-HCl(pH6.8)，70％乙醇)，涡旋振荡1min，在磁力架上磁吸30秒，充分吸除清液；向磁珠中加入200μl DNA溶解液(10mM Tris-HCl(pH8.5))，涡旋振荡1min，并在室温放置5min，在磁力架上磁吸30s，转移清夜至新的离心管，用于后续操作。

按照QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒标准操作流程：向样本中加入1mlInhibitEX Buffer，涡旋1min至样本充分均质，16000g离心1min；取25μl蛋白酶K至新的离心管，并吸取600μl前一步上清至蛋白酶K管，加入600μl Buffer AL并涡旋15s，置于70℃孵育10min；加入600μl乙醇，并涡旋混匀，分三次QIAamp spin column，每次在16000g离心1min；小心向柱上加入500μl Buffer AW1，在16000g离心1min，除去收集管内液体；向柱上加入500μl Buffer AW2，在16000g离心3min，除去收集管内液体；继续在16000g离心3min，将QIAamp spin column移至新的1.5ml离心管，加入200μl Buffer ATE，室温放置1min，并在16000g离心1min，用于后续操作。

利用Applied Biosystems公司生产的NanoDrop 2000测定两种提取方法所获得DNA样本的质量，见下表：

由试验结果可以看出，利用本发明所述提取方法对于不同粪便样本宿主DNA提取的稳定性较好，纯度非常高；而按照商品化试剂盒的提取方法明显带有大量的微生物基因组污染，并且所获取样本的纯度较低。

2、宿主DNA甲基化转化

为更好地说明本发明的有益效果，分别采用本发明的甲基化转化方案和ZYMOResearch试剂盒及其提供的方法对步骤1中采用本发明方法所得到的宿主DNA进行甲基化处理，具体如下：

本发明甲基化转化方案：取宿主DNA样本10μl，加入10μl lambda DNA(ThermoFisher，货号SD0011，稀释至50ng/μl)。

常规甲基化转化方案：取宿主DNA样本10μl，加入10μl灭菌蒸馏水。按照DNAMethylation-Gold^TM Kit(货号D5008)的标准流程进行操作。分别向DNA样本中加入130μlCT Conversion Reagent(现配现用)，涡旋混匀后按照(98℃，10min；64℃，2.5h)的条件进行转化反应；准备Zymo-Spin^TM I-96 Binding Plate，加入600μl M-Binding Buffer，然后分别将转化后的样本加入Binding Plate内，颠倒数次混匀，然后在3000g离心5min，吸除下层溶液；向Plate内加入400μl M-Wash Buffer，3000g离心5min，吸除下层溶液；向Plate内加入200μl M-Desulphonation Buffer，室温放置15min，然后3000g离心5min，吸除下层溶液；向Plate内加入400μl M-Wash Buffer，3000g离心5min，吸除下层溶液；继续向Plate内加入400μl M-Wash Buffer，3000g离心5min，吸除下层溶液；将Plate转移到新的收集管，加15μl M-Elution Buffer，室温放置5min后，在3000g离心3min。获得转化后DNA样本用于后续检测。

3、qMSP定量扩增检测

便于更好地作比较，针对本发明的提取和转化方案进一步采用本发明所述qMSP定量体系和条件进行检测，而针对商业试剂盒甲基化转化方案则采用常规qMSP定量体系和条件进行检测，本发明以检测粪便中宿主DNA的TFPI2基因甲基化情况，并以Beta-Actin基因作为参考基因，两种方法采用相同的目标基因和参考基因进行检测。

粪便宿主DNA甲基化目标和参考基因的转化后检测引物和探针采用MethylPrimer Express Software v1.0进行设计，获得的序列信息如下：

a、按照本发明所述qMSP方案，50ul扩增体系按照下述条件进行：

10μM TFPI2引物：1μl+1μl

10μM TFPI2探针：2μl

10μM Beta-Actin引物：1μl+1μl

10μM Beta-Actin探针：2μl

5U/μl HotStarTaq Plus DNA Polymerase：2.5μl

10mM dNTPs：1μl

按照本发明所获取的转化后DNA模板：5μl

5X PCR扩增缓冲液：10μl

灭菌去离子水：23.5μl

其中，5X PCR扩增缓冲液的成分为：50mM Tris-HCl(pH8.3)、250mM KCl、12.5mMMgCl₂、2.5mg/mlα-酪蛋白、5M甜菜碱、100mM四甲基氯化铵、2.5％Tween-20。

降落PCR扩增程序为：98℃，8min；95℃，3min；95℃，10s/62℃，30s(2循环)；95℃，10s/61-56℃，30s(6循环，每循环降1℃)；95℃，10s/55℃，30s(2循环)；95℃，10s/54℃，30s(5循环)；95℃，10s/53℃，30s(10循环)；95℃，10s/52℃，30s(20循环)。

扩增后检测荧光信号动态变化情况，结果参见附图2。

b、按照常规qMSP方案，按照HotStarTaq Plus DNA Polymerase(Qiagen，货号203601)试剂盒方案进行50ul体系扩增。

10μM TFPI2引物：1μl+1μl

10μM TFPI2探针：2μl

10μM Beta-Actin引物：1μl+1μl

10μM Beta-Actin探针：2μl

5U/μl HotStarTaq Plus DNA Polymerase：2.5μl

10mM dNTP mix：1μl

25mM MgCl₂：4μl

按照常规方案所获取的转化后DNA模板：5μl

10X PCR Buffer：5μl

灭菌去离子水：24.5μl

然后按照常规PCR进行扩增，程序为：95℃，5min；95℃，94℃，30s/55℃，30/72℃，60s(40循环)；72℃，10min。

扩增后检测荧光信号动态变化情况，结果参见附图1和2。

由图1和图2的荧光信号结果可以看出：对5例TFPI2基因甲基化阳性(设计区域)样本的检测和参考beta-Actin基因的检测，通过本发明所构建的提取-甲基化转化-特定PCR扩增组合方法，能够有效检测到TFPI2基因甲基化的阳性，其参考基因beta-Actin的荧光信号也非常均匀。通过商品化试剂盒的拼接方案进行检测对于目标序列和参考序列的扩增均明显落后许多，充分表明本发明组合方法的有效性。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种提取粪便中宿主DNA的试剂组合物，其特征在于，包括：

提供硫酸根离子的裂解液A；以及

提供钙离子的絮凝剂。

2.根据权利要求1所述的试剂组合物，其特征在于，所述裂解液A中含有硫酸铵，所述絮凝剂为氯化钙溶液；

任选地，所述裂解液A包括：硫酸铵、硫氰酸胍、Tris-HCl、EDTA、CTAB和PVP-10，所述絮凝剂为0.5～2M的氯化钙溶液；

优选地，所述裂解液A包括：

25～500mM的硫酸铵；

25～500mM的硫氰酸胍；

10～100mM的Tris-HCl，pH为5-8；

20～200mM的EDTA，pH为8.0；

0.5～2.5质量％的CTAB；以及

0.5～2.5质量％的PVP-10；

所述絮凝剂为0.5～1M的氯化钙溶液；

更优选地，所述裂解液A包括：

50～100mM的硫酸铵；

50～100mM的硫氰酸胍；

20～50mM的Tris-HCl，pH为6.5-7.5；

40～50mM的EDTA，pH为8.0；

1.5～2.0质量％的CTAB；以及

1.5～2.0质量％的PVP-10。

3.根据权利要求1所述的试剂组合物，其特征在于，进一步包括：

裂解液B、蛋白消化液、结合液、DNA吸附载体、去杂质液A、去杂质液B和DNA溶解液；

任选地，所述裂解液B包括：硫氰酸胍、Tris-HCl和Triton X-100；

所述蛋白消化液为蛋白酶K溶液；

所述结合液为无水乙醇；

所述DNA吸附载体为硅羟基磁珠；

所述去杂质液A包括：硫氰酸胍、乙酸铵、Triton X-100、Tris-HCl和乙醇；

所述去杂质液B包括：乙酸铵、Tris-HCl和乙醇；

所述DNA溶解液为Tris-HCl；

优选地，

所述裂解液B包括：2～6M的硫氰酸胍；10～100mM的Tris-HCl，pH为5～8以及0.1～5质量％的Triton X-100；

所述蛋白消化液为10～50mg/ml的蛋白酶K溶液；

所述去杂质液A包括：1～2M的硫氰酸胍；20～200mM的乙酸铵；0.1～0.5质量％的Triton X-100；10～100mM的Tris-HCl，pH6～8以及40～70质量％的乙醇；

所述去杂质液B包括：5～50mM的乙酸铵溶液；5～50mM的Tris-HCl，pH6～8以及60～90质量％的乙醇；

所述DNA溶解液为5～25mM的Tris-HCl，pH8～9；

更优选地，

所述裂解液B包括：3.5～4.5M的硫氰酸胍；20～50mM的Tris-HCl，pH为5.5～6.5以及0.5～1质量％的Triton X-100；

所述蛋白消化液为15～25mg/ml的蛋白酶K溶液；

所述去杂质液A包括：2M的硫氰酸胍；25～50mM的乙酸铵；0.2～0.25质量％的TritonX-100；15～25mM的Tris-HCl，pH为6.8以及45～60质量％乙醇；

所述去杂质液B包括：10mM的乙酸铵、10mM的Tris-HCl，pH为6.8以及70～80质量％乙醇；

所述DNA溶解液为10mM的Tris-HCl，pH为8.5。

4.一种利用权利要求1～3任一项所述试剂组合物提取粪便中宿主DNA的方法，其特征在于，包括：

a、取粪便样本，加入所述裂解液A，混合并离心；

b、收集步骤a所得上清，加入所述絮凝剂，混匀并离心；

c、收集步骤b所得上清，加入所述蛋白消化液和裂解液B，孵育；

d、向步骤c所得混合液中加入与步骤c所述上清等体积的所述结合液，再加入与步骤c所述蛋白消化液等体积的所述DNA吸附载体，混匀，室温放置；

e、将步骤d的结合体系放置在磁力架上磁吸，吸除清液；

f、向步骤e的DNA吸附载体上加入所述去杂质液A，混合，在磁力架上磁吸，吸除清液；

g、向步骤f的DNA吸附载体上加入所述去杂质液B，混合，在磁力架上磁吸，吸除清液；

h、向步骤g的DNA吸附载体上加入所述DNA溶解液，混合，室温放置，在磁力架上磁吸，收集清液，以便获得DNA；

优选地，所述方法包括：

a、取0.1～5g粪便样本，加入600μl～10ml所述裂解液A，涡旋振荡1～5分钟，在10000g离心5分钟；

b、收集步骤a所得上清，加入1/10体积所述絮凝剂，颠倒数次，在10000g离心5分钟；

c、收集步骤b所得上清，按照每1ml上清加入20μl蛋白消化液，再加入与所述上清等体积的所述裂解液B，置于50～60℃孵育10分钟；

d、向步骤c所得混合液中加入与步骤c所述上清等体积的所述结合液，加入与步骤c所述蛋白消化液等体积的所述DNA吸附载体，涡旋振荡1分钟，室温放置5～10分钟；

e、将步骤d的结合体系放置在磁力架上磁吸30秒，吸除清液；

f、向步骤e的DNA吸附载体上加入500μl～1ml所述去杂质液A，涡旋振荡1分钟，在磁力架上磁吸30秒，吸除清液；

g、向步骤f的DNA吸附载体上加入500μl～1ml所述去杂质液B，涡旋振荡1分钟，在磁力架上磁吸30秒，吸除清液；

h、向步骤g的载体磁珠上加入100～200μl DNA溶解液，涡旋振荡1分钟，并在室温放置5分钟，在磁力架上磁吸30秒，收集清液，以便获得DNA。

5.一种DNA甲基化的方法，其特征在于，包括：

利用权利要求1～3任一项所述试剂组合物提取粪便中的DNA，并将所得到的DNA与λDNA进行混合，得到混合DNA；以及

利用已知方法或者试剂盒对所述混合DNA进行甲基化处理。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，利用权利要求4所述方法提取粪便中的DNA，

任选地，

所述DNA和λDNA总用量为500ng～2μg；

采用下列之一的试剂盒进行所述甲基化处理：

ZYMO Research公司生产的EZ DNA Methylation Kit，货号D5001；

DNA Methylation-Gold^TMKit，货号D5008；

Qiagen公司生产的QIAGEN Bisulfite，货号59104。

7.一种对经过甲基化的粪便宿主DNA进行甲基化特异性PCR检测的试剂盒，其特征在于，包括：

引物、探针、Hot Start Taq酶、dNTPs以及PCR扩增缓冲液，

其中，所述PCR扩增缓冲液包括：

Tris-HCl、KCl溶液、MgCl₂溶液、α-酪蛋白、甜菜碱、铵和/或胺类化合物以及非离子表面活性剂，

所述粪便宿主DNA是采用权利要求1～3任一项所述试剂组合物提取的，或者是利用权利要求4所述方法获得的，

所述甲基化是采用权利要求5或6所述DNA甲基化的方法进行的。

8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增缓冲液包括：

8～15mM的Tris-HCl，pH值为8～9；35～100mM的KCl溶液；1～5mM的MgCl₂溶液；0.1～1mg/ml的α-酪蛋白；0.5～2M的甜菜碱；10～100mM的铵和/或胺类化合物以及0.1～10质量％的非离子表面活性剂；

所述铵类化合物为硫酸铵，所述胺类化合物为四甲基氯化铵，所述非离子表面活性剂为Triton X-100、Tween-20和/或NP-40；

优选地，所述PCR扩增缓冲液包括：

10mM Tris-HCl，pH为8.3；50mM KCl溶液；2.5mM MgCl₂溶液；0.3～0.6mg/mlα-酪蛋白；0.8～1M的甜菜碱；15～20mM铵和/或胺类化合物以及0.1～1质量％非离子表面活性剂。

9.一种对经过甲基化的粪便宿主DNA进行甲基化特异性PCR检测的方法，其特征在于，包括：

将权利要求7或8所述试剂盒中各试剂与经过甲基化的粪便宿主DNA进行混合，以便得到混合液；以及

对所述混合液进行PCR扩增反应。

10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述引物浓度为100～400nM；

所述TaqMan探针浓度为200～500nM；

所述Taq酶浓度为0.1～1U/μl的；

所述dNTPs浓度为0.2mM；

所述经过甲基化的粪便宿主DNA浓度为1～20μl；

所述PCR扩增缓冲液的稀释倍数为1倍；

所述Tris-HCl浓度为10mM，pH为8.3；

所述KCl溶液浓度为50mM；

所述MgCl₂溶液浓度为2.5mM；

所述α-酪蛋白浓度为0.3～0.6mg/ml；

所述甜菜碱浓度为0.8～1M；

所述铵和/或胺类化合物浓度为15～20mM；

所述非离子表面活性剂浓度为0.1～1质量％；

任选地，所述PCR扩增反应采用降落PCR模式，扩增程序为：

98℃8min；95℃3min；95℃10s/62℃30s，2个循环；95℃10s/61～56℃30s，6循环，每循环降1℃；95℃10s/55℃30s，2个循环；95℃10s/54℃30s，5个循环；95℃10s/53℃30s，10个循环；95℃10s/52℃30s，20个循环。