CN108220238A - 一种减少cd8+t细胞凋亡并增强其功能的培养方法 - Google Patents
一种减少cd8+t细胞凋亡并增强其功能的培养方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108220238A CN108220238A CN201810018042.6A CN201810018042A CN108220238A CN 108220238 A CN108220238 A CN 108220238A CN 201810018042 A CN201810018042 A CN 201810018042A CN 108220238 A CN108220238 A CN 108220238A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cells
- culture
- reagent
- cell
- add
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 title 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 94
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 93
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 22
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims abstract description 19
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 claims abstract description 19
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 12
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 39
- 102100037907 High mobility group protein B1 Human genes 0.000 claims description 33
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 25
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 24
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 24
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 21
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 20
- 238000012136 culture method Methods 0.000 claims description 19
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 19
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 16
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims description 16
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 15
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 14
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 13
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 13
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 12
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 claims description 11
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 claims description 11
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 claims description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 10
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 230000033540 T cell apoptotic process Effects 0.000 claims description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 claims description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 5
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 claims description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 2
- 101100339431 Arabidopsis thaliana HMGB2 gene Proteins 0.000 claims 6
- 108700010013 HMGB1 Proteins 0.000 claims 6
- 101150021904 HMGB1 gene Proteins 0.000 claims 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims 1
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 claims 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 abstract description 8
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 abstract description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 abstract description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 2
- 238000003672 processing method Methods 0.000 abstract description 2
- 102100023990 60S ribosomal protein L17 Human genes 0.000 abstract 2
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 35
- 101710168537 High mobility group protein B1 Proteins 0.000 description 27
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 19
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 18
- 101001023379 Homo sapiens Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Proteins 0.000 description 13
- 102100035133 Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Human genes 0.000 description 13
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 12
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 11
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 9
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- 102000008096 B7-H1 Antigen Human genes 0.000 description 3
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 description 3
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N Piperazine Chemical compound C1CNCCN1 GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012288 TUNEL assay Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 210000005008 immunosuppressive cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000024023 negative regulation of T cell apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 229960005141 piperazine Drugs 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/51—B7 molecules, e.g. CD80, CD86, CD28 (ligand), CD152 (ligand)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于肿瘤预防和治疗技术领域，具体涉及一种优化的T细胞的培养方法。该方法通过HMGB1的应用，降低CD8+T细胞表面的PD‑1的表达，同时降低T细胞的凋亡，进而增强T细胞杀伤肿瘤的功能效果。本申请通过优化T细胞的培养体系，结合采用肿瘤微环境中应激性细胞释放的高迁移率族蛋白B1（HMGB1）的处理，有效降低了CD8+T细胞表面PD‑1的表达，进而使得T细胞的杀伤能力有了明显的改善，同时有效降低了细胞凋亡水平，最终使得生物免疫治疗技术能够更好的用于肿瘤治疗，对于延长病人生存质量和生存期具有较为重要的应用价值，同时由于相关处理方式较为成熟，因而具有较好的推广应用意义。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤预防和治疗技术领域，具体涉及一种优化的T细胞的培养方法。
背景技术
肺癌是中国乃至全球恶性程度非常高的肿瘤，在各类肿瘤中的发病率及死亡率一直位居第一，是威胁人类健康的头号杀手。攻克肺癌已成为刻不容缓的重要任务。因此，提高肿瘤免疫治疗的效果，延长肿瘤患者生存期具有十分重要的意义。
现有技术中，通过体外培养杀伤肿瘤细胞，进而通过过继性细胞免疫方式来增强患者免疫力、增强对肿瘤细胞的抑制杀伤力，是目前认为的最好的提升肿瘤患者生存质量的方法之一。在肿瘤免疫治疗方法中，由于T细胞功能更强、细胞生存时间更长，因此对肿瘤杀伤也就更有意义。也因此，体外T细胞培养方式、培养方法的效率、效果也是肿瘤免疫治疗技术中的关键和核心。
发明内容
现有技术中，CD8+T细胞功能容易受肿瘤微环境中免疫抑制性细胞释放的免疫抑制性细胞因子等的抑制性作用影响，进而影响相关肿瘤杀伤效果，针对这一缺陷，本申请目的在于提供一种上调CD8+T细胞功能的培养方法。
本申请的技术方案详述如下。
一种减少CD8+T细胞凋亡并增强其功能的培养方法，该方法的主要技术原理是：通过HMGB1的应用，降低CD8+T细胞表面的PD-1的表达，同时降低T细胞的凋亡，进而增强T细胞杀伤肿瘤的功能效果；
所述HMGB1，为一种应激细胞分泌到细胞外的分泌蛋白，优选采用重组蛋白HMGB1，从而便于获得和调节用量；
所述CD8+T细胞，其初始来源为外周血来源的CD8+T细胞（健康人体外周血或肺癌患者外周血均可），或者为肺癌患者的肺癌组织来源的T细胞；
以外周血来源的CD8+T细胞的培养为例，该培养方法具体包括如下步骤：
（一）采集外周血后，分离提取获得单个核细胞和自体血清，具体操作参考如下：
采集5mL外周血，1500 rpm/min 离心10 min后，分离沉淀细胞和上清液（即自体血清），将上清液灭活后 -20℃保存备用；
将沉淀细胞用30mL生理盐水重悬后置于15mL淋巴细胞分离液上，进行密度梯度离心，收集单个核细胞并用生理盐水洗三次；所述密度梯度离心，具体参数为：2500 rpm/min离心25min；
（二）磁珠分选CD8+ T细胞，具体如下：
（1）细胞计数
根据目的细胞（即CD8+ T细胞）在总细胞液中所占比例，以及最终需要的细胞量，计算出大致需要分选的细胞总数（即确定所需分选的细胞总量），根据此计算结果，选择对应量的步骤（一）中所收集的单个核细胞，使用Washing Buffer清洗，然后1500rpm离心10min，弃上清；
（2）磁珠孵育
对步骤（1）中所得沉淀细胞，按80 μL/107cell量加入Washing Buffer重悬细胞，再按20μL /107cell量加入CD8磁珠，混匀后避光孵育20min（中间可进行适当摇动，以确保孵育效果）；
（3）冲洗细胞
在步骤（2）中孵育后体系中，加入3mL的Washing Buffer冲洗细胞，1500rpm离心10min，弃上清；
（4）使用磁场分选收集阴性细胞
选用MS柱子，使用配套的适配器将其固定在磁场中，柱子下面有收集管，将步骤（3）中冲洗后细胞用500μL的 Washing Buffer重悬后，缓慢加入到MS柱子内，待柱内无液体后，再使用500μL 的Washing Buffer冲洗柱子3遍（不要加外力作用），最后收集阴性细胞；
（5）使用活塞压下柱子上阳性细胞
更换步骤（4）中MS柱子下方的收集管，在MS柱子内加入500μL的Washing Buffer后，使用活塞压下柱子上阳性细胞，所得即为CD8+T 细胞；
（三）体外细胞培养，具体为：
第0天：将步骤（二）所获的磁珠分选CD8+T细胞平铺于24孔板中，每孔铺2106，每孔加入淋巴细胞培养基1mL；
所述淋巴细胞培养基具体例如采用Takara公司的GT-T551无血清培养基；
然后加入A试剂，加入量（即终浓度）为10μL/mL，勿剧烈晃动培养板，再按淋巴细胞培养基体积比10%比例（例如，若淋巴细胞培养基最初为9ml，应加入自体血清1ml）加入自体血清（步骤（1）中离心灭活后上清液）；置于37℃、5% CO2培养箱中进行培养；
所述A试剂为溶解有IL-2和CD3/CD28 Dynabeads（Dynabeads™ Human T-ActivatorCD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation）的GT-T551无血清培养基，IL-2的浓度为10U/μL，CD3/CD28 Dynabeads的浓度为2×105 beads/μL；
bead与细胞数量比例为1:1；
第3天：加入B试剂，加入量（即终浓度）为10μL/mL，勿剧烈晃动培养板，按体积比半量方式换液加入淋巴细胞培养基及其初体积10%比例（例如，若淋巴细胞培养基最初为450μL，应加入自体血清50μL，混匀后一起加入培养板的孔内）自体血清；
所述B试剂为溶解有IL-2的GT-T551无血清培养基，IL-2的浓度为10U/μL；
保持B试剂终浓度为10μL/mL进行扩增培养，扩增培养操作具体可参考如下：
第5天：吹打细胞并扩增至两个24孔板的孔中，按1mL/孔量加入淋巴细胞培养基，再次加入B试剂，加入量（即终浓度）均为10μL/mL，勿剧烈晃动培养板；
第7天：吹打细胞并扩增至6孔板中，按3～5mL/孔量加入GT-T551无血清培养基，加入B试剂至终浓度为10μL/mL，同时加入GT-T551无血清培养基10%体积的自体血清；
第9天：在步骤“第七天”的培养板中，半量换液后，补充加入B试剂，使B试剂终浓度为10μL/mL，勿剧烈晃动培养板；
上述扩增培养操作后（吹打细胞并进一步扩增，视细胞量而定具体扩增体积），具体例如在第12天：加入C试剂，加入量（即终浓度）为10μL/mL，并加入淋巴细胞培养基及其初体积10%比例自体血清；
所述C试剂为溶解有IL-2和重组蛋白HMGB1的GT-T551无血清培养基，其中IL-2的浓度为10U/μL，重组蛋白HMGB1的浓度为5～20 ng/μL（优选为10 ng/μL）；
第13~14天：收集细胞，检测细胞免疫表型、杀伤功能及细胞凋亡，从而对培养结果做出准确评价；
采用肺癌患者肺癌肿瘤组织来源的T细胞进行培养时，参考前述“第0天至第9天步骤”，对T细胞进行适当扩增培养后，直接参考“第12天”处理方式，采用含HMGB1的C试剂进行处理培养即可。
培养结束后，收获细胞并对免疫细胞抑制性标志物进行检测，可采用流式细胞技术检测细胞表面CD3、CD8、PD-1的表达水平来表明体外诱导培养的T细胞表面抑制性标志物的表达情况；对细胞杀伤功能的检测，可利用流式细胞技术检测功能性标志物IFN-r和细胞表面CD107a的表达水平，通过IFN-r和CD107a的表达水平来表明体外诱导培养的T细胞的杀伤功能情况；对细胞凋亡的检测，可利用TUNEL 法检测细胞凋亡的情况；基于这些检测结果，从而最终判定T细胞培养情况，并决定是否可以用于后续的肿瘤免疫治疗。
与现有常规的过继性免疫细胞的培养方法相比，本发明通过对T细胞体外培养体系进行优化，使得该技术在效应细胞抑制性标志物表达、杀伤能力及细胞凋亡等指标方面保持一致或有了更好改进，其有益效果主要体现在以下几个方面：
（1）细胞扩增能力保持一致：现有常规过继性免疫细胞培养方法中，大约可扩增细胞100倍左右，本发明所提供的培养方法中的细胞增殖能力与传统的培养方法保持了一致，细胞扩散倍增数仍然保持在大约100倍左右，因而使得该方法具有较好的应用前景；
（2）效应细胞抑制性标志物表达有明显改善：本申请通过采用HMGB1（高迁移率族蛋白B1）处理，有效降低CD8+ T细胞表面的PD-1表达，从而解除PD-L1与PD-1结合后对CD8+T细胞的限制，进而使得CD8+T细胞即使再回输至体内后，也不会被肿瘤细胞表面的PD-L1结合并抑制其功能；而就具体细胞表面的PD-1表达水平而言，与现有常规的过继性免疫细胞培养方法相比，本申请中PD-1的表达由原来的15.63 ±0.809%降至3.43 ±0.328%，降幅明显，这一结果使得本申请所制备CD8+T细胞具有潜在的更好的肿瘤杀伤效果；
（3）细胞杀伤能力明显改善：T细胞作为一种由淋巴细胞分离液分离出来的PBMC（外周血单个核细胞），经磁珠分选、体外重组人白介素-2（interlukin-2，IL-2）刺激物诱导后，已经成为一种高效的免疫活性细胞，而之后HMGB1在与CD8+T细胞结合内化过程中，激活了CD8+T细胞的功能，进一步上调了CD8+T细胞本身的杀伤功能，进而增强了T细胞对于肿瘤的杀伤能力；
一般而言，免疫效应性T细胞在攻击肿瘤细胞的时候，会分泌IFN-r 及CD107a，以这两种分子作为标志物，检测表明：现有常规的培养方法中，IFN-r＋细胞的比例为7.167 ±0.592%，而本申请中IFN-r＋细胞的比例则可达到19.03 ± 0.578%；现有常规的培养方法中，CD107a＋细胞的比例为9.1 ± 0.666%，而本申请中CD107a＋细胞的比例可达到23.3 ±0.378%；结合这些具体结果可以看出，本申请所制备CD8+T细胞具有更好的肿瘤杀伤潜力，从而能够在免疫治疗领域具有更好、更快的应用效果；
（4）细胞凋亡水平明显下降：检测结果表明，现有常规培养方法中，凋亡细胞的比例为3.813 ± 0.242%，而本申请中凋亡细胞的比例为1.7 ± 0.149%，显然表明，细胞活力更强，具有更长的生长周期，也就意味着更好的免疫效果。
总之，本申请通过优化T细胞的培养体系，结合采用肿瘤微环境中应激性细胞释放的高迁移率族蛋白B1（HMGB1）的处理，有效降低了CD8+T细胞表面PD-1的表达，进而使得T细胞的杀伤能力有了明显的改善，同时有效降低了细胞凋亡水平，最终使得生物免疫治疗技术能够更好的用于肿瘤治疗，对于延长病人生存质量和生存期具有较为重要的应用价值，同时由于相关处理方式较为成熟，因而具有较好的推广应用意义。
附图说明
图1为本发明所提供的T细胞的制备流程图；
图2为重组蛋白HMGB1（rhHMGB1）降低T细胞PD-1的表达的流式结果；
图3为重组蛋白HMGB1（rhHMGB1）增强T细胞功能性标志物IFN-r的流式结果；
图4为重组蛋白HMGB1（rhHMGB1）增强T细胞杀伤功能标志物CD107a的流式结果；
图5为TUNEL 法检测重组蛋白HMGB1（rhHMGB1）抑制T细胞凋亡的结果；
图6为流式细胞术检测重组蛋白HMGB1（rhHMGB1）抑制T细胞凋亡的结果；
图7为对T细胞表面抑制性标志物检测情况；
图8为对T细胞表面杀伤功能检测时对T细胞中IFN-r＋细胞比例检测情况；
图9为对T细胞表面杀伤功能检测时对T细胞中CD107a＋细胞比例检测情况；
图10为T细胞的凋亡情况检测情况。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步解释说明，在介绍具体实施例前，对本发明中部分实验试剂及实验设备等情况简要介绍如下。
样本患者来源：外周血样品来源于随机抽取的肿瘤患者（肺癌）自愿者，实验过程中，将同一患者的外周血平均分为两份，将未添加重组蛋白HMGB1处理的样品设为对照；
主要试剂：
本发明中所述A、B、C试剂，具体配方及配制方法如下：
A试剂：IL-2＋CD3/CD28 Dynabeads＋GT-T551无血清培养基；初始浓度为：IL-2的浓度为10U/μL，CD3/CD28 Dynabeads的浓度为2×105 beads/μL；具体使用时，各加10μL至1mL培养基中，终浓度分别为100 U/ mL，2×106 beads/mL；
B试剂：IL-2＋GT-T551无血清培养基，IL-2的终浓度为100U/ mL；
C试剂：IL-2＋重组蛋白HMGB1＋GT-T551无血清培养基，其中IL-2的终浓度为100U/mL，重组蛋白HMGB1的浓度为100ng/ mL；
上述A、B、C试剂中：IL-2采用北京双鹭公司产品；CD3/CD28 Dynabeads购自美国ThermoScientific；重组蛋白HMGB1购自美国Biologend；GT-T551购自日本Takara；
主要设备：
台式离心机（MULTIFUGE X3R），美国Thermo Scientific；
CO2培养箱（3111），美国Thermo Scientific；
显微镜（11090137008），德国 Leica；
流式细胞仪（FACScantoII），美国BD。
实施例1
以某肿瘤患者（肺癌）自愿者的外周血为例，采用本申请所提供的T细胞培养方法，发明人进行了相关CD8+T细胞的制备，相关步骤介绍如下。
（一）采集外周血后，分离提取获得单个核细胞和自体血清，具体操作如下：
采集5mL外周血，1500 rpm/min 离心10 min后，分离沉淀细胞和上清液（即自体血清），将上清液灭活后 -20℃保存备用；
将沉淀细胞用30mL生理盐水重悬后置于15mL淋巴细胞分离液上，进行密度梯度离心，收集单个核细胞并用生理盐水洗三次；所述密度梯度离心，具体参数为：2500 rpm/min离心25min；
（二）磁珠分选CD8+ T细胞，具体如下：
（1）细胞计数
本实施例中获得的总的PBMC数量为1.4x108个细胞，流式细胞术检测结果显示CD8+ T细胞占总的PBMC的14%，根据实验安排最终需要1x107个CD8+ T细胞；按1×107个PBMC应加入20μL CD8磁珠来计算，应加入280μL的CD8磁珠，才能最终获得约1×107个CD8+ T细胞；
根据此计算结果，将对应量的步骤（一）中所收集的单个核细胞，使用Washing Buffer清洗，然后1500rpm离心10min，弃上清。
（2）磁珠孵育
对步骤（1）中所得沉淀细胞，按80 μL/107cell量加入1120ul Washing Buffer重悬细胞，再按20μL /107cell量加入CD8磁珠280μL，混匀后避光孵育20min（中间可进行适当摇动，以确保孵育效果）；
（3）冲洗细胞
在步骤（2）中孵育后体系中，加入3mL的Washing Buffer冲洗细胞，1500rpm离心10min，弃上清；
（4）使用磁场分选收集阴性细胞
选用MS柱子，使用配套的适配器将其固定在磁场中，柱子下面有收集管，将步骤（3）中冲洗后细胞用500μL的 Washing Buffer重悬后，缓慢加入到MS柱子内，待柱内无液体后，再使用500μL 的Washing Buffer冲洗柱子3遍（不要加外力作用），最后收集阴性细胞；
（5）使用活塞压下柱子上阳性细胞
更换步骤（4）中MS柱子下方的收集管，在MS柱子内加入500μL的Washing Buffer后，使用活塞压下柱子上阳性细胞，所得即为CD8+T 细胞；
（三）体外细胞培养，具体为（培养周期如图1所示）：
第0天：将步骤（二）所获的磁珠分选CD8+ T细胞平铺于24孔板中，每孔铺2106，每孔加入淋巴细胞培养基1mL；
所述淋巴细胞培养基具体例如采用Takara公司的GT-T551无血清培养基；
然后加入A试剂，加入量（即终浓度）为10μL/mL，勿剧烈晃动培养板，再按淋巴细胞培养基初体积的10%比例加入自体血清（步骤（1）中离心灭活后上清液）；置于37℃、5% CO2培养箱中进行培养；
所述A试剂为溶解有IL-2和CD3/CD28 Dynabeads（Dynabeads™ Human T-ActivatorCD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation）的GT-T551无血清培养基，IL-2的浓度为10U/μL，CD3/CD28 Dynabeads的浓度为2×105 beads/μL；
bead与细胞数量比例为1:1；
第3天：加入B试剂，加入量（即终浓度）为10μL/mL，勿剧烈晃动培养板，按体积比半量方式换液，加入淋巴细胞培养基初体积10%的自体血清；
所述B试剂为溶解有IL-2的GT-T551无血清培养基，IL-2的浓度为10U/μL；
第5天：吹打细胞并扩增至两个24孔板的孔中，按1mL/孔量加入淋巴细胞培养基，再次加入B试剂，加入量（即终浓度）均为10μL/mL，勿剧烈晃动培养板；
第7天：吹打细胞并扩增至6孔板中，按3～5mL/孔量加入GT-T551无血清培养基，加入B试剂至终浓度为10μL/mL，同时加入自体血清10%；
第9天：在步骤“第七天”的培养板中，补充加入B试剂，使B试剂终浓度为10μL/mL，勿剧烈晃动培养板；
第12天：吹打细胞并进一步扩增，视细胞量而定具体扩增体积，加入C试剂，加入量（即终浓度）为10μL/mL，并加入自体血清10%；
所述C试剂为溶解有IL-2和重组蛋白HMGB1的GT-T551无血清培养基，其中IL-2的浓度为10U/μL，重组蛋白HMGB1的浓度为10ng/μL；
第14天：收集细胞，检测细胞免疫表型、杀伤功能及细胞凋亡，从而对培养结果做出准确评价。
参考上述操作，以现有常规培养方式作为对照（即，仅缺少上述“第12天”重组蛋白HMGB1的处理），收集细胞后，同样方式进行细胞免疫表型、杀伤功能及细胞凋亡等的检测。
具体检测时，对免疫细胞抑制性标志物的检测，采用流式细胞技术检测细胞表面CD3、CD8、PD-1的表达水平，来表明体外诱导培养的T细胞表面抑制性标志物的表达情况；对细胞杀伤功能的检测，主要是利用流式细胞技术检测功能性标志物IFN-r和细胞表面CD107a的表达水平，通过IFN-r和CD107a的表达水平来表明体外诱导培养的T细胞的杀伤功能情况；对细胞凋亡的检测，主要是利用TUNEL 法检测细胞凋亡的情况。
部分检测结果如图2~6所示。具体解释分析如下：
对T细胞表面抑制性标志物检测情况（如图2所示）：检测结果表明，本申请的实验组T细胞的表面PD-1表达明显低于对照组PD-1表达（15.63 ± 0.809% vs 3.43 ±0.328%，p<0.01）；
对T细胞的杀伤功能检测（如图3、图4所示）：本申请的实验组T细胞中IFN-r＋细胞的比例明显高于对照组IFN-r＋细胞的比例（7.167 ± 0.592% vs 19.03 ± 0.578%，p<0.05；本申请的实验组T细胞中CD107a＋细胞的比例明显高于对照组CD107a＋细胞的比例（9.1 ±0.666% vs 23.3 ± 0.378%，p<0.01）；
对T细胞的凋亡情况检测（如图5、图6所示）：本申请的实验组T细胞中凋亡细胞的比例明显低于对照组凋亡细胞的比例（3.813 ± 0.242％ vs 1.7 ± 0.149％，p<0.05）。
从上述结果可以看出，本身所提供的培养方法，可有效延长T细胞的生存周期，同时有效提高其细胞杀伤效果，因此具有较好的应用价值。
实施例2
本实施例所提供的体外培养高性能T细胞的培养方法，具体过程同实施例1，仅就C试剂重组蛋白HMGB1的加入量做了适当的调整，具体实验情况如下所述。
（1） 提取单个核细胞，具体过程同实施例1中所述。
（2） 体外细胞培养，具体为：
将上述（1）中提取到的CD8+T细胞分为三个处理组：
其中一份按实施例1中 “第12天”重组蛋白HMGB1的处理的方式进行处理，只是剂量调整为“重组蛋白HMGB1的浓度为5ng/μl”，其余同实施例1中所述 (命名为5ng/μl组)；
其中一份按实施例1中 “第12天”重组蛋白HMGB1的处理的方式进行处理，只是剂量调整为“重组蛋白HMGB1的浓度为20ng/μl”，其余同实施例1中所述 (命名为20ng/μl组)；
最后一份进行现有常规CD8+T细胞培养，培养过程同实施例1中对照组处理（即，缺少“第12天”重组蛋白HMGB1的处理） (命名为对照组)。
最后，收集细胞，检测细胞的免疫表型、杀伤功能及凋亡水平，从而对培养结果做出准确的评价；部分检测结果如图7~10所示。
对图7~10分析后，主要结论如下：
对T细胞表面抑制性标志物检测情况（如图7所示）表明：本申请的5ng/μl组与20ng/μl组中T细胞的表面PD-1表达明显低于对照组PD-1表达（对照组vs 5ng/μl组：15.87 ±0.6489% vs 3.933 ± 0.4055%，p<0.01；对照组vs 20ng/μl组：15.87 ±0.6489% vs3.667 ± 0.2718%，p<0.01；5ng/μl组vs 20ng/μl组: 3.933 ± 0.4055% vs 3.667 ±0.2718%，p>0.05）；
对T细胞的杀伤功能检测（如图8、图9所示）结果表明：本申请的5ng/μl组与20ng/μl组中的T细胞中IFN-r＋细胞的比例明显高于对照组IFN-r＋细胞的比例（对照组vs 5ng/μl组：8.533 ± 0.4702% vs 16.20 ± 0.3828%，p<0.01；对照组vs 20ng/μl组：8.533 ±0.4702% vs 16.67 ± 0.202%，p<0.01；5ng/μl组vs 20ng/μl组: 16.20 ± 0.3828%vs16.67 ±0.202%，p>0.05）； 本申请的5ng/μl组与20ng/μl组中T细胞中CD107a＋细胞的比例明显高于对照组CD107a＋细胞的比例（对照组vs 5ng/μl组：9.533 ± 0.5364% vs 26.20± 0.9866%，p<0.01；对照组vs 20ng/μl组：9.533 ± 0.5364% vs 27.60 ± 0.8718%，p<0.01；5ng/μl组vs 20ng/μl组: 26.20 ± 0.9866% vs 27.60 ± 0.8718%，p>0.05）；
对T细胞的凋亡情况检测（如图10所示）结果表明：本申请的5ng/μl组与20ng/μl组中T细胞中凋亡细胞的比例明显低于对照组凋亡细胞的比例（对照组vs 5ng/μl组：3.630 ±0.239% vs 1.501 ±0.1528%，p<0.01；对照组vs 20ng/μl组：3.630 ± 0.239% vs 1.367±0.1202%，p<0.01；5ng/μl组vs 20ng/μl组: 1.501 ± 0.1528% vs1.367 ± 0.1202%，p>0.05）。
从上述结果可以看出，本申请所提供的培养方法，可有效延长T细胞的生存时间，同时有效提高其细胞杀伤效果，因此具有较好的应用价值。
Claims (5)
1.一种减少CD8+T细胞凋亡并增强其功能的培养方法，其特征在于，该方法通过HMGB1的应用，降低CD8+T细胞表面的PD-1的表达，同时降低T细胞的凋亡，进而增强T细胞杀伤肿瘤的功能效果；
所述HMGB1，为一种应激细胞分泌到细胞外的分泌蛋白；
所述CD8+T细胞，其初始来源为外周血来源的CD8+T细胞，或者为肺癌患者的肺癌组织来源的T细胞；
（一）针对外周血来源的CD8+T细胞，该培养方法具体包括如下步骤：
（1）采集外周血后，分离提取获得单个核细胞和自体血清，
（2）磁珠分选CD8+ T细胞，具体利用CD8磁珠分选获得CD8+T 细胞；
（3）体外细胞培养，具体为：
第0天：将步骤（二）所获CD8+ T细胞平铺于孔板中，加入淋巴细胞培养基；
然后加入A试剂，加入量为10μL/mL，再按淋巴细胞培养基体积比10%比例加入自体血清进行培养；
所述A试剂为溶解有IL-2和CD3/CD28 Dynabeads的GT-T551无血清培养基，IL-2的浓度为10U/μL，CD3/CD28 Dynabeads的浓度为2×105 beads/μL；
第3天：加入B试剂，加入量为10μL/mL，按体积比半量方式换液加入淋巴细胞培养基及其初体积10%比例自体血清；
所述B试剂为溶解有IL-2的GT-T551无血清培养基，IL-2的浓度为10U/μL；
保持B试剂终浓度为10μL/mL进行扩增培养；
扩增后，加入C试剂，加入量为10μL/mL，并加入淋巴细胞培养基及其初体积10%比例自体血清，继续培养；
所述C试剂为溶解有IL-2和重组蛋白HMGB1的GT-T551无血清培养基，其中IL-2的浓度为10U/μL，重组蛋白HMGB1的浓度为5～20 ng/μL；
培养结束后，收集细胞，检测细胞免疫表型、杀伤功能及细胞凋亡，从而对培养结果做出准确评价；
（二）针对肺癌患者的肺癌组织来源的T细胞进行培养时，直接参考前述“体外细胞培养”相关操作，对T细胞进行适当扩增培养后，直接采用含HMGB1的C试剂进行处理培养即可。
2.如权利要求1所述减少CD8+T细胞凋亡并增强其功能的培养方法，其特征在于，步骤（一）中，具体处理方式如下：
采集5mL外周血，1500 rpm/min 离心10 min后，分离沉淀细胞和上清液，将上清液灭活后 -20℃保存备用；
将沉淀细胞用30mL生理盐水重悬后置于15mL淋巴细胞分离液上，进行密度梯度离心，收集单个核细胞并用生理盐水洗三次；所述密度梯度离心，具体参数为：2500 rpm/min离心25min。
3.如权利要求1所述减少CD8+T细胞凋亡并增强其功能的培养方法，其特征在于，步骤（二）中，CD8磁珠分选时，按20μL /107cell量加入CD8磁珠。
4.如权利要求1所述减少CD8+T细胞凋亡并增强其功能的培养方法，其特征在于，步骤（三）中，第0天培养时，所述淋巴细胞培养基为GT-T551无血清培养基。
5.如权利要求1所述减少CD8+T细胞凋亡并增强其功能的培养方法，其特征在于，步骤（三）中，C试剂中重组蛋白HMGB1的浓度为10 ng/μL。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810018042.6A CN108220238A (zh) | 2018-01-09 | 2018-01-09 | 一种减少cd8+t细胞凋亡并增强其功能的培养方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810018042.6A CN108220238A (zh) | 2018-01-09 | 2018-01-09 | 一种减少cd8+t细胞凋亡并增强其功能的培养方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108220238A true CN108220238A (zh) | 2018-06-29 |
Family
ID=62640330
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810018042.6A Pending CN108220238A (zh) | 2018-01-09 | 2018-01-09 | 一种减少cd8+t细胞凋亡并增强其功能的培养方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108220238A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113069529A (zh) * | 2021-04-16 | 2021-07-06 | 郑州大学第一附属医院 | Gsh联合pd-1/pd-l1阻断剂用于促进cd8+t细胞功能的用途 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105101803A (zh) * | 2013-02-06 | 2015-11-25 | 人类起源公司 | 具有改进特异性的修饰的t淋巴细胞 |
| WO2017019897A1 (en) * | 2015-07-29 | 2017-02-02 | Novartis Ag | Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3 |
| CN106479973A (zh) * | 2016-10-20 | 2017-03-08 | 郑州大学第附属医院 | 一种体外iak免疫细胞培养方法 |
| WO2017075451A1 (en) * | 2015-10-28 | 2017-05-04 | The Broad Institute Inc. | Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses by detecting and targeting pou2af1 |
-
2018
- 2018-01-09 CN CN201810018042.6A patent/CN108220238A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105101803A (zh) * | 2013-02-06 | 2015-11-25 | 人类起源公司 | 具有改进特异性的修饰的t淋巴细胞 |
| WO2017019897A1 (en) * | 2015-07-29 | 2017-02-02 | Novartis Ag | Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3 |
| WO2017075451A1 (en) * | 2015-10-28 | 2017-05-04 | The Broad Institute Inc. | Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses by detecting and targeting pou2af1 |
| CN106479973A (zh) * | 2016-10-20 | 2017-03-08 | 郑州大学第附属医院 | 一种体外iak免疫细胞培养方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ERIK SUNDBERG ET AL.: "High mobility group box chromosomal protein 1 acts as a proliferation signal for activated T lymphocytes", 《IMMUNOBIOLOGY》 * |
| 汤鲁明等: "高迁移率族蛋白B1的胞外作用与免疫效应", 《生理科学进展》 * |
| 王淑敏: "肺癌细胞HMGB1对IFN-γ诱导PD-L1表达水平影响的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113069529A (zh) * | 2021-04-16 | 2021-07-06 | 郑州大学第一附属医院 | Gsh联合pd-1/pd-l1阻断剂用于促进cd8+t细胞功能的用途 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ma et al. | Th17 cells regulate the production of CXCL1 in breast cancer | |
| Wijaya et al. | KLRG1+ natural killer cells exert a novel antifibrotic function in chronic hepatitis B | |
| CN110231275A (zh) | 一种基于流式细胞术检测nk细胞杀伤活性的方法 | |
| CN103642752A (zh) | 人cd3+cd8+cik细胞的制备方法 | |
| CN110484504B (zh) | 一种用于免疫治疗原发性肝细胞肝癌的细胞亚群及其制备方法 | |
| CN111351937A (zh) | 一种mmr蛋白表达缺失检测试剂盒及其检测方法 | |
| Dong et al. | DC-derived CXCL10 promotes CTL activation to suppress ovarian cancer | |
| US20180055882A1 (en) | Functional immunophenotyping of leukocytes in human tissues | |
| CN106479973B (zh) | 一种体外iak免疫细胞培养方法 | |
| Wang et al. | Hyperactivity of the IL-33-ILC2s-IL-13-M-MDSCs axis promotes cervical cancer progression | |
| CN108220238A (zh) | 一种减少cd8+t细胞凋亡并增强其功能的培养方法 | |
| CN115184246A (zh) | 一种利用cd155评价间充质干细胞生物学效力的方法 | |
| CN105547971B (zh) | 细胞毒性t细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法 | |
| CN108441481A (zh) | 一种嵌合抗原受体t细胞及其培养方法 | |
| CN110511908A (zh) | 一种nk细胞评估模型及nk细胞杀伤肿瘤细胞毒力的评价方法 | |
| CN106119193B (zh) | 一种兼有nk细胞特质的抗原特异性t细胞的制备方法 | |
| WO2024067673A1 (zh) | 肿瘤抗原特异性记忆性cd8 t细胞的鉴定、体外扩增及应用方法 | |
| EP3129469B1 (en) | Cell-surface marker of early msc aging | |
| CN116832062A (zh) | 一种小分子抑制剂药物增强nk细胞抗肿瘤作用的用途及其应用 | |
| CN116144835A (zh) | 一种提高鉴别ebv感染的淋巴细胞亚群的灵敏度的方法及其应用 | |
| CN103525764B (zh) | 培养树突状杀手细胞的配方及其方法 | |
| CN114990061B (zh) | 一种诱导扩增中央记忆性t细胞的培养方法 | |
| CN120555351B (zh) | 一种恶性胸腹水肿瘤相关淋巴细胞的规模化细胞培养方法 | |
| Kumar et al. | Monitoring natural killer cell function in human ovarian Cancer cells of Ascitic Fluid | |
| Pérez-García et al. | Young adult binge drinkers have immunophenotypical disarrangements in peripheral natural killer cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |