CN108207931A - 一种微量精子冷冻保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微量精子冷冻保存方法，旨在提供一种体积较小的、具有封闭空间、易于操作、精子活性高的微量精子(含单个精子，如睾丸穿刺精子、附睾穿刺精子、严重少精和弱精症患者的精子等)的冷冻保存载体和冷冻保存方法，精子复苏时，自液氮罐中取出冷冻管，用吸管将冷冻保存载体从冷冻管内取出，迅速加入到精子培养皿中(37℃)，倒置显微镜下(100‑200倍放大倍数)在冷冻载体内仔细寻找精子，用卵泡内单精子注射针抓取精子转入精子培养皿的精子培养基中，用于后续精子制动和成熟卵子的ICSI。
Description
技术领域
本发明涉及医学中的辅助生育领域，具体涉及微量精子(单个或几十个精子)，包括睾丸穿刺精子、附睾穿刺精子、严重少精和弱精症患者的精子等的冷冻保存技术。
背景技术
不孕不育症是严重危害人类生殖健康的重大疾病，发生率约占全世界育龄夫妇的1/6，其中50％左右是由男性因素所导致，主要表现为严重少精、弱精、畸精或无精子症，其中无精子症约占男性不育患者的15％。无精子症患者精液中完全没有精子，包括梗阻性无精子症(Obstructive azoospermia，OA)和非梗阻性无精子症(Non-obstructiveazoospermia，NOA)。NOA患者主要是由精子发生或者成熟障碍引起，目前缺乏使患者恢复生精功能的治疗手段，约占无精子症患者的60％。随着生殖医学技术的发展，卵泡内单精子注射(Intracytoplasmic sperm injection，ICSI)技术联合睾丸取精技术有望使NOA患者获得自己的遗传学后代。研究表明，通过获取NOA患者睾丸中的残存精子，并结合ICSI技术可以使卵子成功受精，从而使NOA患者获得遗传学后代。临床上ICSI治疗一般要进行附睾或睾丸的诊断性穿刺，以确保促排卵周期能够获得足够的精子用于受精。但是每个治疗周期的妊娠率仅为50％，为了获得妊娠，部分患者需要重复数次ICSI治疗，由于NOA患者睾丸本身功能较差，每次穿刺取精都有可能造成睾丸萎缩或睾丸功能进一步下降，进而完全丧失生精功能。为了尽可能地减少患者反复穿刺取精的痛苦及避免睾丸生精功能完全丧失，因此有必要对无精子症患者诊断性穿刺获得或ICSI治疗周期剩余的微量活动精子进行冷冻保存，以便在女方取卵日将复苏后存活的精子用于ICSI治疗，这将大大提高无精症患者辅助生育治疗的灵活性和可靠性。同时严重少精子症患者的精子不稳定，预防性冷冻患者的精子也非常必要，这将避免女方取卵日无精子可用而取消周期。
微量精子冷冻保存是辅助生殖领域的难题，目前还没有比较理想的冷冻保存方法。2005年黄荷凤、徐晨明发明了一种睾丸精子冻存与复苏的方法，该方法以胞浆抽空的透明带为冷冻保存载体，首先将活检的睾丸精子装入封闭的透明带内，然后进行精子冷冻保护剂的添加和洗脱，冻存与复苏过程中精子封闭保存于透明带内，避免了精子的丢失，其精子回收率高达70％，远高于常规冻存法。但是该方法使用的是哺乳动物或人卵的透明带，材料来源困难(人卵透明带很难获得)，且存在伦理争议(ICSI治疗时宿主DNA有与精子一起被注入人卵的风险)，同时还存在人畜共患病毒感染的危险，所以该方法很难在辅助生殖临床上广泛应用。2008年匡延平、彭秋平发明了一种微量精子的冷冻和解冻方法及精子的冷冻和解冻装置，该方法使用玻璃或聚苯乙烯制成的长片状或槽状的冷冻片装载精子进行冷冻保存，精子被冻存在冷冻片的液滴中，解冻时将冷冻片放在热油中复苏精子，精子回收率接近100％。但是该方法需要饱和湿度条件的专用湿盒，以保证冷冻过程中微滴不蒸发，操作过程繁琐、耗时长，大大限制了该方法在临床上的广泛使用。2011年卢慧、彭秋平等开发了一种稀少精子冷冻的保湿装置，该保湿装置提供了恒湿的条件，在精子转移过程中可以保证转移环境的湿度不变，防止将精子从培养皿中转移到冷冻载体(如冷冻片)的过程中因液滴蒸发而使液体中的渗透压增高，造成精子损伤甚至死亡，降低精子活性，但是该装置只是保湿装置不是装载精子的冷冻载体，不能进行精子冻存。2015年薛松果、彭秋实、曹少锋、匡延平开发了一种微量精子冷冻保存载体，该冷冻保存载体呈长方形、方形或圆形的水平状或凹槽状，可以承载1-3个0.1-10.0μL的冷冻液微滴，准备好冷冻液微滴后插入到盖油的精子培养皿内，用显微注射针抓取精子置入冷冻液微滴中，然后将液滴放入液氮中进行快速冷冻。解冻时将冷冻保存载体直接插入ICSI皿中，利用37℃矿物油复苏精子。该方法将冷冻保存载体插入盖油的精子培养皿内抓精子冷冻，无需考虑冷冻液微滴蒸发，不用特殊的保湿装置，操作简单，精子回收率可达100％，精子存活率约60％。但是该方法也存在一些问题，首先冻存与解冻时，液滴与矿物油直接接触，需要清洗去除，如果去除不干净可能对精子活性及ICSI治疗结果产生影响，其次液滴体积较大(0.1-10.0μL)，复苏后显微操作回收精子时需要花费较多时间才能找到并抓取冷冻保存的精子，因此限制了其在临床上的应用。
综上所述，目前微量精子冻存方法都有一定的缺陷，限制了其在临床上的应用，因此迫切需要开发一种体积更小的、具有封闭空间的精子冻存载体。本发明开发了一种球形精子冷冻保存微型载体，微量精子(包括单个精子)保存在球形载体的空腔内，有效避免了精子丢失，并且冷冻与解冻时精子不直接与矿物油接触，避免了被污染的风险，另外载体体积很小(粒径50-300μm，体积1×10-4-1×10-2μL)，无需花费很长的时间就可以找到其内部的精子，缩短了操作时间，有利于保持精子的活性。
发明内容
本发明的目的是开发一种易于操作、避免精子丢失，精子活性高的微量精子(含单个精子，如睾丸穿刺精子、附睾穿刺精子、严重少精和弱精症患者的精子等)冷冻保存载体和冷冻保存方法。
一种微量精子冷冻保存方法，其特征在于，依次包括如下步骤：
(1)精子冷冻保存载体制备
①配制一定质量浓度的高分子溶液，采用适当的微球制备技术制备水凝胶微球，去离子水清洗水凝胶微球去除溶剂和未反应的原料；
②将清洗干净的微球加入到成膜反应溶液中，搅拌条件下反应一段时间形成微球外壳，去离子水清洗水凝胶微球去除溶剂和未反应的原料，获得水凝胶微球载体；
③将清洗干净的微球加入到液化反应溶液中，搅拌条件下反应一段时间液化微球内部核心，形成中空结构，去离子水清洗水凝胶微球去除溶剂和未反应的原料，即得中空微球载体。
(2)精子冷冻保存
冷冻时，先吸取精子于精子培养皿中，然后吸取一个或几个中空微球载体于精子培养皿中，用卵泡内单精子注射针抓取一定数量的活动精子置入冷冻保存载体中，用吸管吸取冷冻保存载体放入1.8mL的冷冻管，冷冻管内为精子冻存液，液氮面上方一定高度的液氮蒸汽预冷降温一段时间后，将冷冻管投入液氮中进行快速冷冻，长期保存。
上述的微量精子冷冻保存方法步骤1是精子冷冻保存载体制备，微球制备高分子材料为海藻酸钠、果胶、透明质酸钠、硫酸软骨素、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮等的一种或两种以上，高分子溶液的质量浓度为0.5％-10％，优选质量浓度为1-5％；微球制备方法为静电液滴法、乳化内部凝胶化法、乳化外部凝胶化法、交联法等的一种或两种以上；成膜反应高分子材料为壳聚糖、聚赖氨酸、琼脂糖、纤维素、淀粉等的一种或两种以上，溶液质量浓度为0.01-10％，优选质量浓度为0.05-5％，反应时间为10-120min，优选时间为30-60min；液化反应所用试剂为碳酸钠、碳酸氢钠、柠檬酸钠、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)等的一种或两种以上，反应液质量浓度为0.05-10％，优选质量浓度为0.5-5％，反应时间为10-120min，优选时间为30-60min；微球冷冻载体外层是聚电解质膜，核心是水或柔软的水凝胶，微球载体外径为50-300μm，内径为30-250μm。
进一步的，上述的微量精子冷冻保存方法步骤2是精子冷冻保存，每个微球载体中装载1-50个精子，优选1-20个精子；每个冻存管装载1-50个微球载体，优选1-20个微球载体；预冷却时间为1-20min，优选2-10min，降温速度为1-20℃/min，优选降温速度2-10℃/min，预冷却达到的温度为-80-4℃，优选温度-30-0℃。
进一步的，上述的微量精子冷冻保存方法,精子解冻复苏时，自液氮罐中取出冷冻管，迅速加入37℃温水中，用吸管将冷冻保存载体从冷冻管内取出，迅速加入到精子培养皿中(37℃)，倒置显微镜下(100-200倍放大倍数)在冷冻载体内仔细寻找精子，用卵泡内单精子注射针抓取精子转入精子培养皿的精子培养基中，用于后续精子制动和成熟卵子的ICSI。
本发明提供的技术方案具有如下的技术优点
1、使用微球载体装载精子，有效避免了精子在冻存及复苏过程中的丢失，回收率为100％。
2、微球载体体积较小，在显微操作时很容易找到并抓取精子，有利于保持精子的活性。
3、微球载体内部是一个封闭的空间，精子保存在微球空腔内，不与外部的矿物油直接接触，避免了被污染的风险，保证了精子的复苏率不受矿物油的负面影响。
4、整个冷冻、解冻操作过程非常简单，只要可以开展显微授精就可以用该方法冷冻微量甚至单个精子，便于在辅助生殖临床上广泛推广。
5、本冷冻保存方法很好地解决了目前单精子冻存技术中复杂、繁琐、效率低下的难题，极大的提高了无精子症患者和严重少精子症患者接受辅助生育治疗的灵活性和可靠性。
附图说明
图1为海藻酸钠中空微球载体。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做详细的说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不构成对本发明的任何限制。任何人在本发明权利要求范围内所做的任何形式的修改，仍在本发明权利要求保护范围之内。
实施例1
本发明提供的一种微量精子冷冻保存方法，依次包括如下步骤：
(1)精子冷冻保存载体制备
①配制质量浓度为1.5％的海藻酸钠溶液10ml，采用静电液滴法将海藻酸钠溶液滴入质量浓度为1.1％的氯化钙溶液中形成海藻酸钙水凝胶微球，钙化30min后用去离子水清洗水凝胶微球去除微球表面的氯化钙溶液；
②将清洗干净的微球加入到质量浓度为0.05％的聚赖氨酸溶液中进行成膜反应，搅拌条件下反应30min后形成微球外壳，去离子水清洗微球去除聚赖氨酸溶液；
③将清洗干净的微球加入到质量浓度为1.4％的柠檬酸钠溶液中液化30min，完全液化内部凝胶形成中空结构，去离子水清洗微球去除柠檬酸钠溶液，即得中空微球载体。
(2)精子冷冻保存
冷冻时，先吸取10个精子于精子培养皿中，然后吸取10个中空微球载体于精子培养皿中，用卵泡内单精子注射针依次抓取1个活动精子置入1个冷冻保存载体中，用吸管吸取10个冷冻保存载体放入1.8mL的冷冻管，冷冻管内添加1ml精子冻存液(70％培养基，20％血清，10％DMSO)，液氮面上方2cm高度的液氮蒸汽预冷降温2min(降温速度20℃/min)，待温度降到-10℃后，将冷冻管投入液氮中进行快速冷冻，长期保存。
精子解冻复苏时，自液氮罐中取出冷冻管，用吸管将冷冻保存载体从冷冻管内取出，迅速加入到精子培养皿中(37℃)，倒置显微镜下(100-200倍放大倍数)在冷冻载体内仔细寻找精子，用卵泡内单精子注射针抓取精子转入精子培养皿的精子培养基中，用于后续精子制动和成熟卵子的ICSI。
微球外径130μm，内径120μm(图1)；精子回收率100％，精子存活率90％；传统冷冻保存方法，精子回收率70％，精子存活率50％；薄片冷冻法精子回收率100％，精子存活率60％。
实施例2
本发明提供的一种微量精子冷冻保存方法，依次包括如下步骤：
(1)精子冷冻保存载体制备
①配制质量浓度为1.5％的海藻酸钠溶液，采用乳化内部凝胶化法制备水凝胶微球，10ml海藻酸钠溶液中加入0.1g碳酸钙和0.1g Span80，混合均匀后加入到50ml液体石蜡中，1500rpm快速搅拌形成油包水乳液，搅拌30min后加入0.75ml冰醋酸引发凝胶反应形成水凝胶微球，反应20min后去除液体石蜡，用去离子水清洗水凝胶微球去除液体石蜡；
②将清洗干净的微球加入到质量浓度为2％的琼脂糖溶液中进行成膜反应，搅拌条件下反应30min后形成微球外壳，去离子水清洗微球去除琼脂糖溶液；
③将清洗干净的微球加入到质量浓度为1.4％的EDTA溶液中液化30min，完全液化内部凝胶形成中空结构，去离子水清洗微球去除EDTA溶液，即得中空微球载体。
(2)精子冷冻保存
冷冻时，先吸取60个精子于精子培养皿中，然后吸取6个中空微球载体于精子培养皿中，用卵泡内单精子注射针抓取6个活动精子置入1个冷冻保存载体中，用吸管吸取10个冷冻保存载体放入1.8mL的冷冻管，冷冻管内添加1ml精子冻存液(70％培养基，20％血清，10％DMSO)，液氮面上方2cm高度的液氮蒸汽预冷降温3min(降温速度20℃/min)，待温度降到-30℃后，将冷冻管投入液氮中进行快速冷冻，长期保存。
精子解冻复苏时，自液氮罐中取出冷冻管，用吸管将冷冻保存载体从冷冻管内取出，迅速加入到精子培养皿中(37℃)，倒置显微镜下(100-200倍放大倍数)在冷冻载体内仔细寻找精子，用卵泡内单精子注射针抓取精子转入精子培养皿的精子培养基中，用于后续精子制动和成熟卵子的ICSI。
微球外径140μm，内径120μm；精子回收率100％，精子存活率95％；传统冷冻保存方法，精子回收率70％，精子存活率50％；薄片冷冻法精子回收率100％，精子存活率60％。
实施例3
(1)精子冷冻保存载体制备
①配制质量浓度为1.5％的海藻酸钠和3％果胶的混合溶液10ml，采用静电液滴法将海藻酸钠溶液滴入质量浓度为1.1％的氯化钙溶液中形成海藻酸钙水凝胶微球，钙化30min后用去离子水清洗水凝胶微球去除微球表面的氯化钙溶液；
②将清洗干净的微球加入到质量浓度为0.05％的聚赖氨酸溶液中进行成膜反应，搅拌条件下反应30min后形成微球外壳，去离子水清洗微球去除聚赖氨酸溶液；
③将清洗干净的微球加入到质量浓度为1.4％的柠檬酸钠溶液液化30min，完全液化内部凝胶形成中空结构，去离子水清洗微球去除柠檬酸钠溶液，即得中空微球载体。
(2)精子冷冻保存
冷冻时，先吸取20个精子于精子培养皿中，然后吸取5个中空微球载体于精子培养皿中，用卵泡内单精子注射针抓取4个活动精子置入1个冷冻保存载体中，用吸管吸取5个冷冻保存载体放入1.8mL的冷冻管，冷冻管内添加1ml精子冻存液(70％培养基，20％血清，10％DMSO)，液氮面上方4cm高度的液氮蒸汽预冷降温5min(降温速度10℃/min)，待温度降到-20℃后，将冷冻管投入液氮中进行快速冷冻，长期保存。
精子解冻复苏时，自液氮罐中取出冷冻管，用吸管将冷冻保存载体从冷冻管内取出，迅速加入到精子培养皿中(37℃)，倒置显微镜下(100-200倍放大倍数)在冷冻载体内仔细寻找精子，用卵泡内单精子注射针抓取精子转入精子培养皿的精子培养基中，用于后续精子制动和成熟卵子的ICSI。
微球外径120μm，内径110μm；精子回收率100％，精子存活率100％；传统冷冻保存方法，精子回收率70％，精子存活率50％；薄片冷冻法精子回收率100％，精子存活率60％。
实施例4
本发明提供的一种微量精子冷冻保存方法，依次包括如下步骤：
(1)精子冷冻保存载体制备
①配制质量浓度为2％的聚乙二醇溶液，采用交联法制备中空微球，10ml聚乙二醇溶液中加入0.085g(NH4)2MoO7和0.31g Na2S·9H2O，恒温30min后加入1.0M的HCl调pH至7.0，搅拌30min后加入0.075gNH2OH·HCl进行交联反应，反应30min后结束反应，用去离子水清洗微球去除溶剂和未反应单体；
②超声震荡分散微球，并用无水乙醇清洗3次，获得中空微球。
(2)精子冷冻保存
冷冻时，先吸取48个精子于精子培养皿中，然后吸取4个中空微球载体于精子培养皿中，用卵泡内单精子注射针抓取12个活动精子置入1个冷冻保存载体中，用吸管吸取4个冷冻保存载体放入1.8mL的冷冻管，冷冻管内添加1ml精子冻存液(70％培养基，20％血清，10％DMSO)，液氮面上方4cm高度的液氮蒸汽预冷降温3min(降温速度10℃/min)，待温度降到0℃后，将冷冻管投入液氮中进行快速冷冻，长期保存。
精子解冻复苏时，自液氮罐中取出冷冻管，用吸管将冷冻保存载体从冷冻管内取出，迅速加入到精子培养皿中(37℃)，倒置显微镜下(100-200倍放大倍数)在冷冻载体内仔细寻找精子，用卵泡内单精子注射针抓取精子转入精子培养皿的精子培养基中，用于后续精子制动和成熟卵子的ICSI。
微球外径60μm，内径50μm；精子回收率100％，精子存活率95.8％；传统冷冻保存方法，精子回收率70％，精子存活率50％；薄片冷冻法精子回收率100％，精子存活率60％。
实施例5
本发明提供的一种微量精子冷冻保存方法，依次包括如下步骤：
(1)精子冷冻保存载体制备
①配制质量浓度为1.5％的海藻酸钠和0.5％的透明质酸溶液，采用乳化外部凝胶化法制备水凝胶微球，10ml海藻酸钠溶液中加入0.1g Span80，混合均匀后加入到50ml液体石蜡中，1500rpm快速搅拌形成油包水乳液，搅拌30min后滴加0.1M的CaCl2溶液引发凝胶反应形成水凝胶微球，滴加速度为4ml/min，滴加时间为30min，递加结束后再反应20min，反应结束后去除液体石蜡，用去离子水清洗水凝胶微球去除液体石蜡；
②将清洗干净的微球加入到质量浓度为0.5％的壳聚糖溶液中进行成膜反应，搅拌条件下反应30min后形成微球外壳，去离子水清洗微球去除聚赖氨酸溶液，获得核心为水凝胶的微球载体；
(2)精子冷冻保存
冷冻时，先吸取20个精子于精子培养皿中，然后吸取20个中空微球载体于精子培养皿中，用卵泡内单精子注射针抓取1个活动精子置入1个冷冻保存载体中，用吸管吸取20个冷冻保存载体放入1.8mL的冷冻管，冷冻管内添加1ml精子冻存液(70％培养基，20％血清，10％DMSO)，液氮面上方6cm高度的液氮蒸汽预冷降温10min(降温速度5℃/min)，待温度降到-20℃后，将冷冻管投入液氮中进行快速冷冻，长期保存。
精子解冻复苏时，自液氮罐中取出冷冻管，用吸管将冷冻保存载体从冷冻管内取出，迅速加入到精子培养皿中(37℃)，倒置显微镜下(100-200倍放大倍数)在冷冻载体内仔细寻找精子，用卵泡内单精子注射针抓取精子转入精子培养皿的精子培养基中，用于后续精子制动和成熟卵子的ICSI。
微球外径120μm，内径100μm；精子回收率100％，精子存活率95％；传统冷冻保存方法，精子回收率70％，精子存活率50％；薄片冷冻法精子回收率100％，精子存活率60％。
Claims (4)
1.一种微量精子冷冻保存方法，其特征在于，依次包括如下步骤：
(1)精子冷冻保存载体制备
①配制高分子溶液，采用微球制备技术制备水凝胶微球，去离子水清洗水凝胶微球去除溶剂和未反应的原料；
②将清洗干净的微球加入到成膜反应溶液中，搅拌反应于微球外表面形成微球外壳，去离子水清洗水凝胶微球去除溶剂和未反应的原料，获得水凝胶微球载体；
③将微球载体加入到液化反应溶液中，搅拌反应液化微球载体内部的水凝胶微球，形成膜包裹的中空结构，去离子水清洗水凝胶微球去除溶剂和未反应的原料，获得得中空微球载体；
(2)精子冷冻保存
冷冻时，先吸取精子置于精子培养皿中，然后吸取中空微球载体置于精子培养皿中，用卵泡内单精子注射针抓取一定数量的活动精子置入冷冻保存的载体内部，用吸管吸取冷冻保存载体放入冷冻管中，冷冻管内添加精子冻存液，冷冻管置于液氮液面上方一定高度，进行液氮蒸汽预冷降温，将冷冻管投入液氮中进行快速冷冻，并于其中保存。
2.一种权利要求1所述的微量精子冷冻保存方法，其特征在于：步骤1是精子冷冻保存载体制备，微球制备高分子材料为海藻酸钠、果胶、透明质酸钠、硫酸软骨素、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯比咯烷酮的一种或两种以上，高分子溶液的质量浓度为0.5％-10％，优选质量浓度为1-5％；
微球制备方法为静电液滴法、乳化内部凝胶化法、乳化外部凝胶化法、交联法的一种或两种以上；所述成膜反应溶液中的成膜反应高分子材料为壳聚糖、聚赖氨酸、琼脂糖、纤维素、淀粉的一种或两种以上，溶液质量浓度为0.01-10％，优选质量浓度为0.05-5％，反应时间为10-120min，优选时间为30-60min；
所述液化反应溶液中的液化反应所用试剂为碳酸钠、碳酸氢钠、柠檬酸钠、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)的一种或两种以上，反应液质量浓度为0.05-10％，优选质量浓度为0.5-5％，反应时间为10-120min，优选时间为30-60min；微球冷冻载体外层是聚电解质膜，核心是水或柔软的水凝胶，微球载体外径为50-300μm，内径为30-250μm。
3.一种权利要求1所述的微量精子冷冻保存方法，其特征在于：上述的微量精子冷冻保存方法步骤2是精子冷冻保存，每个微球载体中装载1-50个精子，优选1-20个精子；每个冻存管装载1-50个微球载体，优选1-20个微球载体；冷冻管置于液氮液面上方进行预冷却，预冷却时间为1-20min，优选2-10min，降温速度为1-20℃/min，优选降温速度2-10℃/min，预冷却达到的温度为-80-4℃，优选温度-30-0℃。
4.一种权利要求1所述的微量精子冷冻保存方法，其特征在于：精子解冻复苏时，自液氮罐中取出冷冻管，迅速加入37℃温水中，然后用吸管将冷冻保存载体从冷冻管内取出，迅速加入到精子培养皿中(37℃)，倒置显微镜下(100-200倍放大倍数)在冷冻载体内仔细寻找精子，用卵泡内单精子注射针抓取精子转入精子培养皿的精子培养基中，用于后续精子制动和成熟卵子的ICSI。
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