CN108165605A - 一种同时筛选蛋白酶和纤维素酶的培养基及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时筛选蛋白酶和纤维素酶的培养基及方法。本发明培养基包括以下组分：1~3g硝酸钠、0.8~1.2g磷酸氢二钾、0.4~0.6g硫酸镁、0.4~0.6g氯化钾、1~3g羧甲基纤维素或微晶纤维素、8~12g明胶、1~3g酵母浸粉、16~18g琼脂或琼脂糖，加水定容至1000ml。本发明方法包括以下步骤：（1）将培养基制成琼脂糖凝胶平板，选择两个平板并接种相同的菌株或其发酵液培养24h；对一平板先进行碘熏后观察记录结果，碘熏颜色褪去后再进行考马斯亮蓝染色脱色观察记录结果；对另一平板直接进行考马斯亮蓝染色脱色后观察记录结果；根据观察记录结果判断出所具蛋白酶活性、纤维素酶活性的菌株。本发明环境友好，能同时检测和筛选纤维素酶和蛋白酶活性菌株，操作简单高效。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种同时筛选蛋白酶和纤维素酶的培养基及方法。
背景技术
现今筛选蛋白酶或者纤维素酶活性都是使用单一的平板，配制可以筛选不同活性酶的平板，要么筛选蛋白酶，要么筛选纤维素酶等。此外，蛋白酶筛选用的较多的是脱脂奶粉，直接可以看出透明圈，但是如果和其他方法结合起来的话，容易造成干扰。而筛选纤维素酶活性，通常用的是底物羧甲基纤维素或者微晶纤维素，然后通过刚果红或碘液浸染的方法得到结果，碘液浸染比刚果红灵敏，但是需要消耗大量的碘液且对环境有一定影响。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时筛选蛋白酶和纤维素酶的培养基及方法，旨在解决蛋白酶和纤维素酶活性需要分开筛选、且各筛选方法均存在不足的问题。
本发明是这样实现的，一种同时筛选蛋白酶和纤维素酶的培养基，该培养基包括以下组分：1~3g 硝酸钠、0.8~1.2g 磷酸氢二钾、0.4~0.6g硫酸镁、0.4~0.6g氯化钾、1~3g羧甲基纤维素或微晶纤维素、8~12g明胶、1~3g酵母浸粉、16~18g琼脂或琼脂糖，加水定容至1000ml。
优选地，该培养基包括以下组分：2g 硝酸钠、1g 磷酸氢二钾、0.5g硫酸镁、0.5g氯化钾、2g羧甲基纤维素或2g微晶纤维素、10g明胶、2g酵母浸粉、17g琼脂或琼脂糖，加水定容至1000ml。
本发明进一步提供了一种同时筛选蛋白酶和纤维素酶的方法，该方法包括以下步骤：
（1）将上述培养基制成琼脂糖凝胶平板，选择两个平板并接种相同的菌株或其发酵液培养24h；
（2）对一平板先进行碘熏5~10分钟，随后观察结果，拍照记录，碘熏颜色褪去后再进行考马斯亮蓝染色脱色观察结果，拍照记录结果；
（3）对另一平板直接进行考马斯亮蓝染色脱色后观察结果、拍照记录；
（4）根据步骤（2）、（3）所得的观察记录结果判断出具有蛋白酶活性的菌株、具有纤维素酶活性的菌株，或者同时具有蛋白酶活性和纤维素酶活性的菌株。
本发明克服现有技术的不足，提供一种同时筛选蛋白酶和纤维素酶的培养基及方法，采用同时添加蛋白酶底物明胶蛋白和纤维素酶底物羧甲基纤维素的方式，制备培养基，结合先碘熏后考马斯亮蓝染色的方法，建立同时检测和筛选纤维素酶和蛋白酶活性菌株的快捷方法。蛋白酶筛选用的较多的是脱脂奶粉，直接可以看出透明圈，但是如果和其他方法结合起来的话，容易造成干扰，本发明选用了明胶蛋白，使用考马斯亮蓝染色，经过试验是可行的；而筛选纤维素酶活性，通常用的是底物羧甲基纤维素或者微晶纤维素，然后刚果红或碘液浸染的方法，碘液浸染比刚果红灵敏，但是需要消耗大量的碘液且对环境有一定影响，碘液浸染改为碘液熏染同样灵敏快速，而且碘液耗量减少，而且对环境污染少，所以在本发明中，综合起来用明胶蛋白和羧甲基纤维素结合，然后先碘熏后考马斯亮蓝的染色方法，两者结合起来可以筛选蛋白酶和纤维素酶，考虑到碘熏可能会对考马斯亮蓝染色造成结果，实验做了一下，两者没有干扰，故此方法是可行的，这也为后续再添加其他底物筛选其他活性奠定基础。
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明环境友好，能同时检测和筛选纤维素酶和蛋白酶活性菌株，操作简单高效。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
培养基配方如下：2g 硝酸钠 1g 磷酸氢二钾 0.5g硫酸镁 0.5g氯化钾 2g羧甲基纤维素或2g微晶纤维素 10g明胶 2g酵母浸粉 17g琼脂或琼脂糖，加水定容至1000ml。
实施例2
培养基配方如下：1g 硝酸钠、0.8g 磷酸氢二钾、0.4g硫酸镁 0.6g氯化钾、3g羧甲基纤维素或3g微晶纤维素、8g明胶、1g酵母浸粉、18g琼脂或琼脂糖，加水定容至1000ml。
实施例3
培养基配方如下：3g 硝酸钠、1.2g 磷酸氢二钾、0.6g硫酸镁、0.6g氯化钾、1g羧甲基纤维素或1g微晶纤维素、12g明胶、1g酵母浸粉、16g琼脂或琼脂糖，加水定容至1000ml。
实施例4
（1）将实施例1培养基制成琼脂糖凝胶平板，选择两个平板并接种相同的菌株或其发酵液培养24h；
（2）对一平板先进行碘熏5~10分钟（将该平板倒扣在装有革兰氏碘液的平皿盖子上碘熏5~10分钟，纤维素酶的筛选通常是采用以羧甲基纤维素（CMC）或微晶纤维素（Avicel）为底物制成的琼脂糖凝胶平板结合刚果红或碘液染色的方法），用于验证碘熏是否对后来的考马斯亮蓝染色造成影响，随后观察结果，拍照记录；碘熏颜色褪去后再进行考马斯亮蓝染色脱色观察结果，拍照记录结果。
（3）对另一平板直接进行考马斯亮蓝染色脱色后观察结果、拍照记录；
（4）根据步骤（2）、（3）所得的观察记录结果判断出具有蛋白酶活性的菌株、具有纤维素酶活性的菌株，或者同时具有蛋白酶活性和纤维素酶活性的菌株；其中，用明胶代替脱脂奶粉配筛选蛋白酶的培养基，接种菌株或其发酵液后，肉眼不能观察溶解圈，可以用考马斯亮蓝溶液对平板染色脱色，有溶解圈的周围没有蛋白，染色脱色后蓝色褪去，没有溶解圈的地方则有大量的蛋白就会染成蓝色。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种同时筛选蛋白酶和纤维素酶的培养基，其特征在于，该培养基包括以下组分：1~3g 硝酸钠、0.8~1.2g 磷酸氢二钾、0.4~0.6g硫酸镁、0.4~0.6g氯化钾、1~3g羧甲基纤维素或微晶纤维素、8~12g明胶、1~3g酵母浸粉、16~18g琼脂或琼脂糖，加水定容至1000ml。
2.如权利要求1所述的同时筛选蛋白酶和纤维素酶的培养基，其特征在于，该培养基包括以下组分：2g 硝酸钠、1g 磷酸氢二钾、0.5g硫酸镁、0.5g氯化钾、2g羧甲基纤维素或微晶纤维素、10g明胶、2g酵母浸粉、17g琼脂或琼脂糖，加水定容至1000ml。
3.一种同时筛选蛋白酶和纤维素酶的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
（1）将权利要求1或1权利要求2所述的培养基制成琼脂糖凝胶平板，选择两个平板并接种相同的菌株或其发酵液培养24h；
（2）对一平板先进行碘熏5~10分钟，随后观察结果，拍照记录，碘熏颜色褪去后再进行考马斯亮蓝染色脱色观察结果，拍照记录结果；
（3）对另一平板直接进行考马斯亮蓝染色脱色后观察结果、拍照记录；
（4）根据步骤（2）、（3）所得的观察记录结果判断出具有蛋白酶活性的菌株、具有纤维素酶活性的菌株，或者同时具有蛋白酶活性和纤维素酶活性的菌株。
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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