CN108159404B - 重组人甲状旁腺激素制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物制剂领域，提供了一种重组人甲状旁腺激素制剂及其制备方法。该重组人甲状旁腺激素制剂，其是将原料与注射用水混合而成的配制液，原料包括在配制液中的浓度为10‑500μg/ml的重组人甲状旁腺激素原液在配制液中的浓度为8‑30mmol/L的缓冲液，在配制液中的浓度为40‑50mg/ml的渗透压调节剂，在配制液中的浓度为2.4‑3.3mg/ml的抑菌剂。该制备方法包括将上述原料与注射用水混合均匀形成配制液。本实施例提供的重组人甲状旁腺激素制剂在室温条件下具有良好的稳定性，具有更好的安全性。此外，该制备方法简单，操作容易，容易实现。

Description

重组人甲状旁腺激素制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及药物制剂领域，具体而言，涉及一种重组人甲状旁腺激素制剂及其制备方法。

背景技术

随着人类寿命的延长，人口老龄化越趋明显，骨质疏松将成为大规模的全球性健康问题。据欧盟1998年的报道，骨质疏松性骨折终生危险，女性高达40％，男性占13％；到2050年，髋骨骨折人数将由1990年的170万人增至630万人。据统计，骨质疏松症影响到2800万美国人，每年因骨质疏松及相关问题的医药费及经济损失达60-100亿美元。英国约有50万骨质疏松症患者；欧洲每年50岁以上的居民有1/8因骨质疏松而发生骨折，414000例发生骨质疏松症性髋部骨折；预计欧洲骨质疏松症治疗相关医疗费用在50年内将增加1倍。

据了解，我国已经成为全球骨质疏松症患者最多的国家，其严重性仅次于心血管疾病。全国性大规模流行病学调查也显示，国内骨质疏松症总患病率为12.4％，老年人患病比例超过一半以上，其中骨折发生率接近33％。预计到2020年，我国骨质疏松和低骨量患者人数将增加至2.8亿。

人甲状旁腺激素(parathyroid hormone，甲状旁腺激素，PTH)是维持机体血钙平衡的重要激素之一，其基本生理作用是通过增加成骨细胞及破骨细胞数目，促进骨吸收及生长。大量临床应用研究表明，PTH是目前治疗骨质疏松症的最重要药物之一。2002年Lilly公司的(化学名：特立帕肽注射液)获得美国FDA批准上市，2011年3月份，被国家食品药品监督管理局批准在中国上市，用于治疗严重骨质疏松的绝经后女性患者。重组人甲状旁腺激素的使用将给中国骨质疏松症患者提供全新的治疗方案，帮助改善患者的生活质量，也有助于提高我国骨质疏松症的治疗水平，市场前景广阔。但现有的重组人甲状旁腺激素其稳定性不佳，容易导致药剂量的变化从而影响疗效。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组人甲状旁腺激素制剂，其在室温条件下具有良好的稳定性，具有更好的安全性。

本发明的另一目的在于提供一种重组人甲状旁腺激素制剂的制备方法，其制备方法简单，操作容易，容易实现。

本发明的实施例是这样实现的：

一种重组人甲状旁腺激素制剂，其是将原料与注射用水混合而成的配制液，原料包括重组人甲状旁腺激素原液、缓冲液、渗透压调节剂以及抑菌剂，

其中，重组人甲状旁腺激素原液在配制液中的浓度为10-500μg/ml，缓冲液在配制液中的浓度为8-30mmol/L，渗透压调节剂在配制液中的浓度为40-50mg/ml，抑菌剂在配制液中的浓度为2.4-3.3mg/ml。

一种重组人甲状旁腺激素制剂的制备方法，其包括将重组人甲状旁腺激素原液、缓冲液、渗透压调节剂以及抑菌剂作为原料与注射用水混合均匀形成配制液，其中，重组人甲状旁腺激素原液在配制液中的浓度为10-500μg/ml，缓冲液在配制液中的浓度为8-30mmol/L，渗透压调节剂在配制液中的浓度为40-50mg/ml，抑菌剂在配制液中的浓度为2.4-3.3mg/ml。

本发明实施例的重组人甲状旁腺激素制剂及其制备方法的有益效果是：

本实施例提供的重组人甲状旁腺激素制剂中通过在注射用水中复配重组人甲状旁腺激素原液、缓冲液、渗透压调节剂以及抑菌剂，有效地增加重组人甲状旁腺激素制剂的稳定性，其在室温条件下具有良好的稳定性，具有更好的安全性。并且本实施例中，通过限定上述重组人甲状旁腺激素原液、缓冲液、渗透压调节剂以及抑菌剂在配制液中的浓度，能够达到最佳的稳定效果。

此外，本实施例提供的重组人甲状旁腺激素制剂的制备方法，其制备方法简单，操作容易，容易实现。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例提供的重组人甲状旁腺激素制剂稳定性对比实验中加速稳定性考察的蛋白浓度变化的趋势图；

图2为本发明实施例提供的重组人甲状旁腺激素制剂稳定性对比实验中加速稳定性考察的主峰变化趋势图；

图3为本发明实施例提供的重组人甲状旁腺激素制剂稳定性对比实验中长期稳定性考察的蛋白浓度趋势图；

图4为本发明实施例提供的重组人甲状旁腺激素制剂pH的选择实验中25℃含量变化趋势图；

图5为本发明实施例提供的重组人甲状旁腺激素制剂pH的选择实验中25℃主药纯度变化趋势图；

图6为本发明实施例提供的重组人甲状旁腺激素制剂pH的选择实验中37℃含量变化趋势图；

图7为本发明实施例提供的重组人甲状旁腺激素制剂pH的选择实验中37℃主药纯度变化趋势图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的重组人甲状旁腺激素制剂及其制备方法进行具体说明。

一种重组人甲状旁腺激素制剂，其是将原料与注射用水混合而成的配制液，原料包括重组人甲状旁腺激素原液、缓冲液、渗透压调节剂以及抑菌剂。

重组人甲状旁腺激素原液能够刺激骨形成和骨吸收，可减少绝经后妇女骨折的发生率，连续输注可导致甲状旁腺素PTH浓度持续增高，因此比仅引起血清甲状旁腺素PTH浓度短暂增高的每日注射法产生的骨吸收作用更强。此外，本药不抑制二磷酸腺苷诱导途径或者胶原诱导途径的血小板聚集反应。本实施例中，以重组人甲状旁腺激素原液作为主药，能够有效治疗骨质疏松。

重组人甲状旁腺激素由北京博康健基因科技有限公司自行制备，通过全合成重组人甲状旁腺激素的基因序列，将目的基因整合到表达质粒pET32a(+)中并转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，经过筛选获得高效表达可用于产业化的重组人甲状旁腺激素工程菌株，工程菌株经培养和诱导表达后离心收集含目的蛋白的菌体，菌体经破碎、纯化后，获得高纯度的重组人甲状旁腺激素。

其中，重组人甲状旁腺激素原液在配制液中的浓度为10-500μg/ml，优选为50-300μg/ml，更优选为250μg/ml。经发明人研究发现，重组人甲状旁腺激素原液在配制液中的浓度在上述范围值内时，重组人甲状旁腺激素制剂的稳定性最佳，浓度低于10μg/ml时，会存在稳定性变差的问题，当重组人甲状旁腺激素原液的浓度超过5.0mg/ml，会存在回收率较低的问题。

进一步的，本实施例中，在重组人甲状旁腺激素原液作为主药的同时，复配了缓冲液、渗透压调节剂以及抑菌剂作为辅料。

其中，缓冲液能有效阻碍溶液pH的变化，使重组人甲状旁腺激素制剂处于最佳的pH值内。缓冲液在配制液中的浓度为8-30mmol/L，优选为8-16mmol/L，更优选为8mmol/L。经发明人研究发现，缓冲液在配制液中的浓度在上述范围值内时，重组人甲状旁腺激素制剂的稳定性最佳，浓度低于25μg/ml，会存在稳定性变差的问题，当重组人甲状旁腺激素原液的浓度超过5.0mg/ml，会存在回收率较低的问题。具体到本实施例中，缓冲液也可以为醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或者柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中的一种。

此外，还需要说明的是，本实施例中的醋酸-醋酸钠缓冲液是由冰醋酸和三水合醋酸钠组成，在醋酸-醋酸钠缓冲液中，冰醋酸和三水合醋酸钠的浓度比为5-6:1。在该浓度比例下配制而成的醋酸-醋酸钠缓冲液的缓冲液更加稳定。同样的，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，柠檬酸和柠檬酸钠的浓度比也为5-6:1。

渗透压调节剂有利于调节配制液的渗透压，保持渗透压处于合理范围内，避免过低引起的溶血反应以及过高引起的细胞脱水反应等等。本实施例中，渗透压调节剂包括甘露醇注射液、甘氨酸、甲硫氨酸、葡萄糖以及蔗糖中的至少一者。也即是，渗透压调节剂可以选自单一的甘露醇注射液、甘氨酸、甲硫氨酸、葡萄糖和蔗糖，也可以选自甘露醇注射液、甘氨酸、甲硫氨酸、葡萄糖和蔗糖中任意2-5者的组合。

其中，甘露醇注射液中甘露醇为单糖，在体内不被代谢，经肾小球滤过后在肾小管内甚少被重吸收，起到渗透利尿作用。有利于提高血浆渗透压，导致组织内水分进入血管内，从而减轻组织水肿，降低眼内压、颅内压和脑脊液容量及其压力。同样的，甘氨酸、甲硫氨酸、葡萄糖和蔗糖都能起到一定的渗透压调节的作用。经过申请人研究发现，选择甘露醇注射液作为渗透压调节剂，其渗透效果佳。

本实施例中，渗透压调节剂在配制液中的浓度为40-50mg/ml，优选为42-47mg/ml，更优选为45mg/ml。经发明人研究发现，渗透压调节剂在配制液中的浓度在上述范围值内时，重组人甲状旁腺激素制剂的稳定性最佳，浓度低于35mg/ml，会存在稳定性变差的问题，当渗透压调节剂的浓度大于50mg/ml时，会存在蛋白聚集，不溶性颗粒增多的问题。

抑菌剂能够有效防止细菌滋生，有利于保持重组人甲状旁腺激素制剂的稳定制剂的稳定性，进而延长其存放时间。本实施例中，抑菌剂在配制液中的浓度为2.4-3.3mg/ml；优选为2.6-3mg/ml，更优选为3mg/ml；抑菌剂包括间甲酚和苯甲醇中的至少一种。经发明人研究发现，抑菌剂在配制液中的浓度在上述范围值内时，重组人甲状旁腺激素制剂的稳定性最佳，浓度低于2.4mg/ml，会存在抑菌效力不达标的问题，当抑菌剂的浓度超过3.5mg/ml时，会存在产生毒副作用的问题。

其中，1％间甲酚溶液可以通过以下方法配制(配制量1.0L)：使用玻璃吸管量取间甲酚，放置于已清洁的烧杯内，加水定容至1000ml，使用磁力搅拌器进行搅拌，时间应≥20min至完全溶解。使用0.2μm滤器进行过滤操作，过滤后液体存放于灭菌蓝盖瓶待用。

此外，在配制上述配制液时，检测配制液的pH值并记录，是否满足pH为3.5-5.0，如果不满足，则使用1.0mol/L氢氧化钠或1.0mol/L盐酸调节配制液pH至3.5-5.0，加入氢氧化钠或盐酸时应缓慢并边加入边轻缓搅拌。优选地，pH为3.5-4.5，更优选为4.0。

本实施例还提供了一种重组人甲状旁腺激素制剂的制备方法，其包括将重组人甲状旁腺激素原液、缓冲液、渗透压调节剂以及抑菌剂作为原料与注射用水混合均匀形成配制液。具体来说，包括以下步骤：

S1：原料预处理

在加入重组人甲状旁腺激素原液之前，将置于-25～-15℃下存放的重组人甲状旁腺激素原液置于温度为20-30℃的水浴中，摇动至重组人甲状旁腺激素原液溶解。

将重组人甲状旁腺激素原液置于-25～-15℃下存放，有利于保持其稳定性，接着在投料前，对其进行水浴升温，使其溶解，有利于后续与其他原料的混合。

S2：按顺序投料。

向注射用水中依次加入缓冲液、渗透压调节剂、抑菌剂以及重组人甲状旁腺激素原液混合均匀。

在加入缓冲液后，利用玻璃棒将瓶内液体搅拌至完全溶解，在加入抑菌剂后，利用IKA顶置式搅拌器进行搅拌，并调节转速为100-150转/min对瓶内的液体搅拌6-10min；在加入重组人甲状旁腺激素原液后，继续对瓶内的液体进行搅拌，搅拌时间为6-10min，搅拌转速为60-90转/min。此步完成后瓶内液体即为配制液。

本实施例中，通过两次不同转速的搅拌速度对液体进行搅拌，能够保证液体的混合均匀性，同时，第一次搅拌时，采用较快的速度100-150转/min进行搅拌，有利于加快溶液的均匀混合，而第二次搅拌，采用较慢的速度60-90转/min进行搅拌，究其原因是因为加入了重组人甲状旁腺激素原液，低速搅拌能够有效避免重组人甲状旁腺激素原液产生泡沫，进而保持配制液的均匀和稳定。

在备料时，需满足重组人甲状旁腺激素原液在配制液中的浓度为10-500μg/ml，缓冲液在配制液中的浓度为8-30mmol/L，渗透压调节剂在配制液中的浓度为40-50mg/ml，抑菌剂在配制液中的浓度为2.4-3.3mg/ml。

S3：调节pH。

检测配制液的pH值并记录，是否满足pH为3.5-5.0，如果不满足，则使用1.0mol/L氢氧化钠或1.0mol/L盐酸调节配制液pH至3.5-5.0，加入氢氧化钠或盐酸时应缓慢并边加入边轻缓搅拌。优选地，pH为3.5-4.5，更优选为4.0。

S4：除菌过滤。

在制得配制液后，还包括对配制液进行除菌过滤，过滤压力为0.01-0.1Mpa，过滤时间为5-20min。经发明人研究发现，采用一定压力下进行过滤，能够有效对配制液进行除菌过滤，过滤效果更加，过滤后的配制液更加澄清，其稳定性得到进一步保障。

S5：灌装及加塞。

灌装加塞，分装，分装容器为无菌3ml卡式瓶，灌装装量为2.55ml/支，分装精度±1％。灌装速度为50-100支/min。

S6：轧盖。

轧盖操作每10min应使用3指法抽取连续的12支产品检查轧盖情况，轧盖应紧固。对于灌装过程中所取得的样品应单独进行轧盖。

S7：灯检。

操作人员视力应在4.9以上(矫正视力5.0以上)，对轧盖完成的产品应进行全目检，灯检操作台照度应满足1000-1500lx的要求，灯检检出率应≥98％。

S8：包装.

帖签后转运至2-8℃冷库内暂存，检测。

以下结合实施例对本发明的重组人甲状旁腺激素制剂及其制备方法进一步进行阐述。

实施例1

本实施例提供了一种重组人甲状旁腺激素制剂及其制备方法。

原料包括：重组人甲状旁腺激素原液、醋酸-醋酸钠、甘露醇注射液、间甲酚以及注射用水。在备取重组人甲状旁腺激素原液之前，将置于-25～-15℃下存放的重组人甲状旁腺激素原液置于温度为20-30℃的水浴中，摇动至重组人甲状旁腺激素原液溶解。

制备方法：向注射用水中加入醋酸-醋酸钠，利用玻璃棒将瓶内液体搅拌至完全溶解，接着加入甘露醇注射液，继续搅拌，然后加入间甲酚，调节IKA顶置式搅拌器的转速为100转/min对瓶内的液体搅拌6min；然后加入重组人甲状旁腺激素原液，继续对瓶内的液体进行搅拌，搅拌时间为6min，搅拌转速为80转/min，混合均匀。然后使用1.0mol/L氢氧化钠或1.0mol/L盐酸调节pH至4，即得配制液，在过滤压力为0.05Mpa下进行除菌过滤10min。

在制得的配制液中，重组人甲状旁腺激素原液的浓度为250μg/ml；醋酸-醋酸钠的浓度为8mmol/L；甘露醇注射液的浓度为45mg/ml、间甲酚的浓度为3mg/ml。

实施例2-5

实施例2-5提供了一种重组人甲状旁腺激素制剂及其制备方法。其原料和制备方法与实施例1相同，其区别在于：本实施例中，原料在配制液中的浓度不同：

在实施例2中，制得的配制液中，重组人甲状旁腺激素原液的浓度为10μg/ml；柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的浓度为30mmol/L；甘露醇注射液的浓度为40mg/ml、间甲酚的浓度为2.4mg/ml，配制液的pH值为3.5。

在实施例3中，制得的配制液中，重组人甲状旁腺激素原液的浓度为50μg/ml；柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的浓度为8mmol/L；甘露醇注射液的浓度为42mg/ml、间甲酚的浓度为2.6mg/ml，配制液pH值为5。

在实施例4中，制得的配制液中，重组人甲状旁腺激素原液的浓度为300μg/ml；醋酸-醋酸钠缓冲液的浓度为16mmol/L；甘露醇注射液的浓度为47mg/ml、间甲酚的浓度为2.8mg/ml，配制液pH值为4.5。

在实施例5中，制得的配制液中，重组人甲状旁腺激素原液的浓度为500μg/ml；柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的浓度为10mmol/L；甘露醇注射液的浓度为50mg/ml、间甲酚的浓度为3.3mg/ml，配制液pH值为3.5。

实施例6-10

实施例6-10提供了一种重组人甲状旁腺激素制剂及其制备方法。其原料和制备方法与实施例1相同，其区别在于：本实施例中，原料在渗透压调节剂以及抑菌剂的选择不同：

实施例6中，渗透压调节剂为甘氨酸，抑菌剂为苯甲醇。

实施例7中，渗透压调节剂为甲硫氨酸，抑菌剂为间甲酚和苯甲醇，间甲酚和苯甲醇的质量比为1:2。

实施例8中，渗透压调节剂为氯化钠和葡萄糖的混合物，抑菌剂为苯甲醇。

实施例9中，渗透压调节剂为甘氨酸、甲硫氨酸、氯化钠、葡萄糖以及蔗糖的混合物，抑菌剂为间甲酚。

实施例10中，渗透压调节剂为甘露醇注射液、甘氨酸、甲硫氨酸、氯化钠、葡萄糖以及蔗糖的混合物，抑菌剂为间甲酚和苯甲醇，间甲酚和苯甲醇的质量比为1:2。

一、稳定性对比实验

A：实施例1；

B：对比例1，实施例1中的抑菌剂为间甲酚，对比例1中将间甲酚替换为常规抑菌剂羟苯甲酯钠；

C：对比例2，实施例1中缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液，对比例2中将醋酸-醋酸钠缓冲液替换为柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。

D：对比例3，复泰奥注射液。

(一)加速稳定性实验

重组人甲状旁腺激素注射液备选处方加速稳定性(25±2℃)实验，如图1、图2所示，实施例1(A)从T0-3M外观、蛋白浓度以及主峰％等的变化相较于对比例1(B)和对比例2(C)略小，与对比例3(D)复泰奥相比，变化趋势相似。

(二)长期稳定性实验

重组人甲状旁腺激素注射液备选处方长期稳定性(5±3℃)实验，如图3所示，实施例1(A)蛋白浓度从T0-3M降低程度最小，对比例1(B)下降幅度最大，对比例1明显优于对比例1和2。

综合比较反复冻融、加速稳定性(25±2℃)、长期稳定性(5±3℃)条件下的主峰％、主药相关杂质(RRT0.85、RRT0.90、RRT0.98、RRT1.08、RRT1.13)、外观、pH条件下的数据，本实施例提供的实施例1明显优选对比例1、对比例2和对比例3，其稳定效果佳。

二、pH的选择实验

配制不同pH的缓冲液体系，pH分别为4、5、6。然后在25℃与37℃条件下测试加速含量纯度变化的趋势。请参阅图4-7。

A1：实施例1，pH值为4。

Aa：对比例4，pH值为5。

Ab：对你了5，pH值为6。

根据图4、图5、图6和图7可以看出实施例1提供的pH4.0缓冲液处方在25℃与37℃加速过程中含量纯度均较对比例4和5提供的pH5.0与6.0处方稳定。

综上所述，本实施例提供的重组人甲状旁腺激素制剂中通过在注射用水中复配重组人甲状旁腺激素原液、缓冲液、渗透压调节剂以及抑菌剂，有效地增加重组人甲状旁腺激素制剂的稳定性，其在室温条件下具有良好的稳定性，具有更好的安全性。并且本实施例中，通过限定上述重组人甲状旁腺激素原液、缓冲液、渗透压调节剂以及抑菌剂在配制液中的浓度，能够达到最佳的稳定效果。

此外，本实施例提供的重组人甲状旁腺激素制剂的制备方法，其制备方法简单，操作容易，容易实现。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种重组人甲状旁腺激素制剂的制备方法，其特征在于，其包括向注射用水中依次加入浓度比为5-6:1的冰醋酸和三水合醋酸钠的缓冲液、渗透压调节剂甘露醇、抑菌剂间甲酚，100-150转/min搅拌6-10min；再加入重组人甲状旁腺激素原液，60-90转/min搅拌6-10min，混合均匀形成配制液，其中，所述重组人甲状旁腺激素原液在所述配制液中的浓度为250μg/ml，所述缓冲液在所述配制液中的浓度为8mmol/L，所述渗透压调节剂在所述配制液中的浓度为45mg/ml，所述抑菌剂在所述配制液中的浓度为3mg/ml；所述的配制液的pH为4.0。

2.根据权利要求1所述的重组人甲状旁腺激素制剂的制备方法，其特征在于，在制得所述配制液后，还包括对所述配制液进行除菌过滤，过滤压力为0.01-0.1Mpa，过滤时间为5-20min。

3.根据权利要求1所述的重组人甲状旁腺激素制剂的制备方法，其特征在于，在加入所述重组人甲状旁腺激素原液之前，将置于-25~-15℃下存放的所述重组人甲状旁腺激素原液置于温度为20-30℃的水浴中，摇动至所述重组人甲状旁腺激素原液溶解。