CN108144067B - 四价铂化合物-双环双键两亲性聚合物前药、其纳米胶束及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种四价铂化合物‑双环双键两亲性聚合物前药，其具有式(I)所示结构：

其中，m＝1时，

表示

m＝0时，

表示

R表示‑CH₃或‑CH₂CH₃，L₁和L₂相互独立地为Cl、N₃、NO₃、

或

n为10至80。还公开其制备方法，该方法包括使轴向双羟基配位的四价铂化合物与双环双键原酸酯前体进行反应的步骤。另外，还公开由其形成的纳米胶束及其应用。本发明的优点在于：本发明的两亲性聚合物前药和由其形成的胶束具有pH超敏和还原双重响应性，并且由其制备的抗肿瘤纳米药物新制剂具有良好的生物降解性能、优秀的肿瘤细胞毒性、相对长时间血液循环的稳定性以及一定的肿瘤靶向功能。

Description

四价铂化合物-双环双键两亲性聚合物前药、其纳米胶束及制 备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，更具体涉及一种四价铂化合物-双环双键两亲性聚合物前药、其纳米胶束及制备方法和应用。

背景技术

癌症作为威胁人类健康的主要疾病之一，实际上是恶性肿瘤中最常见的一类，其发病率及致死率不断升高，治疗肿瘤的方法也在不断更新。近年来，广泛研究的治疗肿瘤的方法包括光热疗法、免疫治疗等非传统方法，其治疗效果显著。光热疗法大部分都是依赖光敏剂将肿瘤溶解氧转化为活性氧从而起到治疗肿瘤的效果，然而肿瘤内部缺氧的环境极大地限制了光热疗法在治疗肿瘤上的应用；此外，在光热疗法中所使用的激光对机体也产生了一定的损伤，导致机体内的功能容易发生紊乱。免疫治疗旨在预防恶性肿瘤复发，并不能对肿瘤起到本质的治疗作用；并且免疫治疗过程中使用的外源的免疫物质(如蛋白、多肽、DNA、RNA及其类似物或免疫因子等)可能会因机体的免疫原性，对机体造成伤害；此外，当今的免疫治疗操作流程较复杂并且治疗费用昂贵，免疫治疗仍然面临着巨大的挑战。由于非传统方法的上述缺陷，传统的治疗癌症的方法仍有着不可替代的地位，主要包括手术切除、放疗、化疗，其中化疗是化学药物治疗的简称，是利用化学药物阻止癌细胞的增殖、浸润、转移，直至最终杀灭癌细胞的一种治疗方式，在癌症治疗中尤为重要。然而，在传统的化疗中，经常使用小分子抗癌药物，比如：阿霉素、顺铂(Cisplatin，CDDP)、喜树碱、紫杉醇、阿霉素、5-氟尿嘧啶、依托泊甙、博来霉素等。在这些抗癌药物中，顺铂因其在各种肿瘤(例如头、脖子、宫颈、睾丸、子宫等肿瘤，尤其是睾丸肿瘤)治疗上的显著效果，而在近年的化疗临床用药中占据接近50％。尽管顺铂及其他小分子抗癌药物在临床上的应用十分广泛，但是其往往具有代谢快、半衰期短、血药浓度低、无肿瘤靶向性等缺点，因而使得在治疗过程中实际可以到达肿瘤部位的药物很少，从而需要多次给药来提高到达肿瘤部位的药物浓度，以达到更好的治疗效果，但是长时间给药必然也会使细胞产生耐药性。

近年对抗癌药物的大量研究主要集中在制备可以短暂钝化药物的传递系统，其包括脂质体、胶束、聚合物和无机纳米粒子等。所有非靶向纳米药物载体可以很好地通过实体瘤的高通透性和滞留效应(enhanced permeability and retention effect，EPR)在肿瘤部位富集，但是由于机体存在自我清除机制，因此很大程度地限制了药物传递系统的治疗效果。

为了抗癌药物的克服上述缺陷，研究热点主要集中在制备出可以在血液循环中相对长时间循环的高稳定性纳米药物载体以及负载量高且能达到显著治疗效果的纳米药物载体。因此，PEG化和前药纳米药物载体被广泛研究和应用。基于顺铂的众多优点，比如，其在肿瘤治疗上的显著效果、其半衰期可随电位变化调控以及其自身的氯元素也为其进入到肿瘤细胞提供了一定的靶向性，四价铂(Pt)前药的纳米药物载体也成为抗肿瘤药物研究中的热点。四价铂Pt(IV)前药的纳米药物载体的优点主要包括：(1)相对高剂量的四价铂聚合物的毒性也低于相对低剂量的顺铂，可以消除顺铂带来的毒副作用；(2)前药聚合物可以提高药物利用率，从而提高肿瘤部位的药物浓度，达到更好的肿瘤治疗效果；(3)前药聚合物形成的纳米药物缓控释载体能够保护药物的活性，提高了药物的稳定性；(4)提高了药物在血液中的循环时间，有利于药物在肿瘤部位聚集，减少给药次数，从而降低了患者的痛苦；(5)药物释放缓慢，减少了人体对药物的对抗作用，从而提高了药物的有效性和安全性；(6)可以通过主动靶向和被动靶向的方式聚集在肿瘤部位；(7)被还原成的二价顺铂和治疗肿瘤的试剂协同作用可以显著增强治疗效果，可负载一种或者多种抗肿瘤药物，免疫因子，光敏剂，干扰因子等；(8)有一定的概率可以治愈肿瘤，极大限度地延长寿命。

在诸多纳米药物缓控释载体中，具有环境敏感性的纳米药物载体被广泛研究。其中，在pH敏感型药物载体的研究中，由于原酸酯键相比于其他酸敏感化学键如缩醛、缩酮、乙烯基醚等具有更高的酸敏感性，可通过调节聚原酸酯的分子量以及疏水性来调控原酸酯的降解速度，从而调节药物的释放速率，因此备受关注。在还原敏感型纳米药物载体的研究中，四价铂化合物一旦进入肿瘤细胞内，就会很快被还原成二价顺铂原药，从而更快、更高效的起到肿瘤治疗的作用。基于以上考虑，本发明有望通过pH敏感键和可还原的高含量四价铂的调控，制得一种完全治愈肿瘤的聚合物前药纳米药物新剂型。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供了一种具有pH超敏和还原双重响应性的四价铂化合物-双环双键两亲性聚合物前药、其纳米胶束及制备方法和应用。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：

一方面，提供一种四价铂化合物-双环双键两亲性聚合物前药，其具有式(I)所示结构：

其中，m＝1时，

表示

m＝0时，

表示

R表示-CH₃或-CH₂CH₃，L₁和L₂相互独立地为Cl、N₃、NO₃、

等，n为10至80。

优选地，所述四价铂化合物-双环双键两亲性聚合物前药为：

在式(Ia)和式(Ib)中，R表示-CH₃或-CH₂CH₃，n为10至80。

还提供上述四价铂化合物-双环双键两亲性聚合物前药的制备方法，所述方法包括使如式(II)所示的轴向双羟基配位的四价铂化合物(oxoplatin)与如式(III)所示的双环双键原酸酯前体进行反应的步骤，反应方程式如下：

在式(II)中，L₁和L₂相互独立地为Cl、N₃、NO₃、

等；

在式(III)中，m＝1时，

表示

m＝0时，

表示

R₁表示-H或-CH₃；

在式(I)中，m＝1时，

表示

m＝0时，

表示

R表示-CH₃或-CH₂CH₃，L₁和L₂相互独立地为Cl、N₃、NO₃、

等，n为10至80。

优选地，上述四价铂化合物-双环双键两亲性聚合物前药的制备方法包括如下步骤：将轴向双羟基配位的四价铂化合物和双环双键原酸酯前体混合，然后向其中加入溶于溶剂中的对甲苯磺酰胺，最后加入二甲基亚砜，在氮气保护下反应，终止反应后获得四价铂化合物-双环双键两亲性聚合物前药。

优选地，所述双环双键原酸酯前体选自4,4-二亚甲氧基-二-(2-甲基-1,3-二氧戊烷)(OMMD)、3,9-二亚甲基-2,4,8,10-四氧螺-[5.5]十一烷(DMTU)、(Z)-2-亚乙基-4-[(E)-2-亚乙基-1,3-二氧戊环-4-基-甲氧基-甲基]-1,3-二氧戊烷(EEDMMD)或3,9-二乙烯基-2,4,8,10-四氧螺-[5.5]十一烷(DETOSU)。

优选地，以摩尔比计，所述轴向双羟基配位的四价铂化合物：双环双键原酸酯前体：对甲苯磺酰胺＝1：1：2‰。

优选地，所述反应的过程为30～60℃搅拌反应24～72h。

优选地，所述终止反应的步骤为滴加三乙胺。

优选地，在所述溶于溶剂中的对甲苯磺酰胺中，所述溶剂为二甲基亚砜或二甲基甲酰胺。

优选地，式(Ia)所示的四价铂化合物-双环双键两亲性聚合物前药的制备反应方程式如下：

其中，R₁表示-H或-CH₃，R表示-CH₃或-CH₂CH₃，n为10至80。

式(Ib)所示的四价铂化合物-双环双键两亲性聚合物前药的制备反应方程式如下：

其中，R₁表示-H或-CH₃，R表示-CH₃或-CH₂CH₃，n为10至80。

另一方面，提供上述四价铂化合物-双环双键两亲性聚合物前药形成的纳米胶束。

还提供上述纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：在避光条件下，将四价铂化合物-双环双键两亲性聚合物前药置于截留分子量为3500的透析袋中在介质中避光透析48～72h，冷冻干燥后获得纳米胶束。

优选地，在避光透析过程中每4～8h更换一次介质，所述介质为用三乙胺校正pH为8～10的去离子水溶液。

优选地，所述四价铂化合物-双环双键两亲性聚合物前药为：

在式(Ia)中，R表示-CH₃或-CH₂CH₃，n为10至80。其中R＝-CH₃，所制备的纳米胶束为CPJ；R＝-CH₂CH₃，所制备的纳米胶束为CCPJ。

在式(Ib)中，R表示-CH₃或-CH₂CH₃，n为10至80。其中R＝-CH₃，所制备的纳米胶束为FCPJ；R＝-CH₂CH₃，所制备的纳米胶束为FCCPJ。

又一方面，提供上述纳米胶束作为药物载体在制备抗肿瘤纳米药物新制剂中的应用。

优选地，所述应用通过下步骤实现：将纳米胶束溶于二甲基亚砜中，向其中加入负载物，待充分溶解后置于截留分子量为3500的透析袋中在介质中避光透析48～72h，冷冻干燥后获得抗肿瘤纳米药物新制剂。在透析的过程中，由于聚合物具有两亲性，于是将疏水性负载物包载进纳米胶束的内核，从而形成抗肿瘤纳米药物新制剂。

优选地，所述负载物选自抗肿瘤药物、免疫因子、光敏剂和干扰因子中的一种或多种；所述抗肿瘤药物选自喜树碱、紫杉醇、多西他赛、阿霉素、5-氟尿嘧啶、依托泊甙和博来霉素中的一种或多种；所述免疫因子选自乳清蛋白、溶菌酶、富含脯氨酸的多肽中的一种或多种；所述光敏剂选自血卟啉衍生物、5-氨基酮戊酸、间-四羟基苯基二氢卟酚中的一种或多种；所述干扰因子选自IFN-α1型、IFN-α2型、罗扰素、惠福仁和组合干扰素中的一种或多种；在避光透析过程中每4～8h更换一次介质，所述介质为用三乙胺校正pH为8～10的去离子水溶液。

本发明相比现有技术具有以下优点：本发明的两亲性聚合物前药中包含高浓度的四价铂，而且其电位被调控到可以延长药物半衰期的合适值，使得其可以长时间稳定地存在于血液中；在高含量四价铂的基础上，四价铂化合物自身的氯离子可以为胶束进入肿瘤细胞提供一定的靶向性，从而使药物在肿瘤部位高效富集；在可还原的四价铂的基础上引入了具有pH敏感性的原酸酯键，使得药物对环境更加敏感，释放更加快，治疗效果更佳；此外，由本发明的两亲性聚合物前药制备的纳米胶束可包埋一种或者多种抗肿瘤试剂从而制成抗肿瘤纳米药物新制剂，通过静脉注射给药，从而达到更好的治疗肿瘤的效果并且达到完全治愈固体肿瘤的效果(治愈率达到80％)；本发明的制备方法相对简单，经济实惠和易操作。

附图说明

图1A为实施例3制备的纳米胶束CPJ的¹H NMR图；

图1B和1C为实施例3制备纳米胶束CPJ的相关物质以及CPJ的FT-IR图；

图2A为实施例9中的纳米胶束CPJ的临界胶束曲线；

图2B和2C分别为实施例9中纳米胶束CPJ和载药胶束CPJ/DOX的平均粒径分布；

图2D-2G分别为实施例9中纳米胶束CPJ、CCPJ、FCPJ和FCCPJ的透射电镜图；

图3为实施例10中纳米胶束CPJ通过酸降解或还原后的HPLC图谱以及降解机制图，其中A部分为纳米胶束CPJ通过酸降解或还原后的HPLC图谱，B部分为纳米胶束CPJ的降解机制图；

图4为实施例11中纳米胶束CPJ降解后元素Pt(4A和4B)、N(4C)和Cl(4D)的X射线光电子能普(XPS)曲线；

图5A为实施例12中纳米胶束CPJ及其载药胶束CPJ/DOX的pH降解后的粒径变化图；

图5B为实施例12中纳米胶束CPJ及其载药胶束CPJ/DOX在血清中的粒径变化图；

图5C和5D为实施例12中纳米胶束CPJ及其载药胶束CPJ/DOX在血清中72h后的透射电镜图；

图5E-5J为实施例12中纳米胶束CPJ及其载药胶束CPJ/DOX在小鼠血液中2、4、8、12、24、48h后的透射电镜图；

图6A为实施例13中纳米胶束CPJ的Pt及其载药胶束CPJ/DOX的阿霉素(DOX)在不同pH环境下的释放曲线；

图6B为实施例13中在DTT存在下纳米胶束CPJ及其载药胶束CPJ/DOX在不同pH环境下Pt及阿霉素(DOX)的释放曲线；

图7A为实施例14中不同药物在MCF-7、A549和HepG2细胞中摄取的Pt含量随时间变化图；

图7B为实施例14中MCF-7、A549和HepG2细胞摄取不同药物后的激光共聚焦显微镜图；

图7C为实施例14中MCF-7、A549和HepG2细胞摄取不同药物后的流式细胞仪定量摄取图；

图8A-8F为实施例15中不同药物对MCF-7、A549和HepG2细胞的细胞存活率影响图；

图9A和9B为实施例16中MCF-7多细胞球体的倒置显微镜图；

图9C为实施例16中阿霉素在MCF-7细胞中渗透情况的激光共聚焦显微镜图；

图10为实施例17中不同药物对MCF-7多细胞球体的生长抑制情况的显微镜图；

图11A-11C为实施例18中不同药物中铂在小鼠体内的分布情况图；

图11D-11E为实施例18中不同药物中阿霉素在小鼠体内的分布情况图；

图12为实施例19中单次给药后小鼠的肿瘤体积(12A)、肿瘤质量(12B)和小鼠体重(12C)随时间变化图；

图13为实施例20中多次给药后小鼠的肿瘤体积(13A)和小鼠体重(13B)随时间变化图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

轴向双羟基配位的四价铂化合物(oxoplatin)的制备，具体步骤如下：将200mg二价顺铂(CDDP)，6mL去离子水和6.5mL 30％双氧水加入到50mL的反应瓶中，在避光条件下65-75℃(优选70℃)反应10-12h，旋蒸浓缩后，冰水冷却抽虑得到产物，依次用冰水、乙醇、乙醚洗涤反应产物后真空干燥，得到轴向双羟基配位的四价铂化合物Pt(IV)-(OH)₂(oxoplatin)。

实施例2

(1)六元环双键原酸酯前体的制备：

DMTU：8.5g(76mmol)的叔丁醇钾和70mL的叔丁醇加入到装有回流冷凝管、磁力搅拌子的三口烧瓶中，并且充入氮气保护。室温下待固体消失后加入3,9-二溴甲基-2,4,8,10-四氧螺-[5.5]十一烷(BBTU)(12g，35mmol)，在回流温度下反应12h。先常压蒸出叔丁醇，再减压蒸馏除净叔丁醇。加入60mL的无水石油醚，在回流温度下搅拌，1h后将温度降至40度。抽虑除去固体。液体放入冰箱冷冻过夜，再用石油醚重结晶两次。得到白色的产物3,9-二亚甲基-2,4,8,10-四氧螺-[5.5]十一烷(DMTU)，产率为83％。

DETOSU：在200mL的带有温度计套管和冷凝器的光化学反应器中，并且充入氮气保护。100mL的正戊烷和20.72g(97.6mmol)的3,9-二乙烯基-2,4,8,10-四氧螺十一烷加入到反应器中，在回流温度下搅拌40min除去溶剂中的气体。然后将0.059mL(87.9mg)的五羰基铁加入混合物中，回流温度下继续搅拌15min。反应液在回流温度下，用450W的中压石英泵蒸气弧灯反光罩下照射30min，然后撤去光罩，继续回流温度下反应90min。然后光照反应40min，撤去光罩，继续反应6h，当原料显示被消耗完并且异构体材料低于5％，将反应液冷却搅拌过夜。最后加入0.5mL的三乙胺，通过蒸馏将正戊烷除掉，通过真空干燥得到粗糙的3,9-二亚乙基-2,4,8,10-四氧螺十一烷(DETOSU)粗产物，然后通过正庚烷溶解蒸馏三次得到纯净的DETOSU。

(2)五元环双键原酸酯前体的制备：

OMMD：①将二甘油(33.2g，0.2mol)、二溴-1,1-二甲氧基乙烷(76.4g，0.454mol)、对甲苯磺酸(p-TSA，0.36g，2.11mmol)和80mL二甘醇二甲醚加入到装有氏蒸馏头、磁力搅拌粒的三口烧瓶中。加热到110℃反应3h后，升温至150℃。持续2h后除去大量的甲醇等。将温度降至110℃，开始减压蒸去剩余的甲醇及二甘醇二甲醚。将剩余的反应物在110℃下，逐渐滴加到强烈搅拌的冰水中。抽滤，并用冰水冲洗。使用丙酮重结晶两次得到为4,4-二亚甲氧基-二-(2-溴甲基-1,3-二氧戊烷)(OMBD)，收率为85.2％。②利用如上述DMTU的制备方法制备OMMD，区别在于用OMBD替换BBTU，产率为80％。

EEDMMD：①将二甘油(11.25g，0.068mol)、3,3-二乙氧基丙烯(20.0g，0.154mol)、对甲苯磺酸(p-TSA，0.12g，0.72mmol)和100mL的甲苯或苯加入到带有冷凝回流分水器的三口烧瓶中，氮气保护，加热到溶剂的沸点，搅拌5-8h,待溶剂除净后，用乙酸乙酯：正己烷(v/v)＝5-20:1的比例过凝胶柱，获得4,4-二亚甲氧基-二-(2-乙烯基-1,3-二氧戊烷)(OMVD)，产率为81.3％。②利用如上述DETOSU的制备方法制备EEDMMD，区别在于用OMVD替换3,9-二乙烯基-2,4,8,10-四氧螺十一烷，产率为80％。

实施例3

(1)两亲性聚合物前药的制备：将50mg(0.27mmol)实施例2制备的3,9-二亚甲基-2,4,8,10-四氧螺-[5.5]十一烷(DMTU)和90.7mg(0.27mmol)实施例1制备的轴向带两个羟基的四价铂化合物(oxoplatin)加入到100mL反应瓶中，将9.2mg的对甲苯磺酰胺(p-TSA)溶于100mL的无水二甲基亚砜(DMSO)中获得对甲苯磺酰胺的二甲基亚砜溶液，然后向反应瓶中加入1mL的对甲苯磺酰胺的二甲基亚砜溶液，最后加入5～10mL无水DMSO，在氮气保护的环境下60℃搅拌反应24h，反应结束后滴加2～3滴三乙胺终止反应，获得两亲性聚合物前药。

(2)纳米胶束CPJ的制备：将步骤(1)制备的两亲性聚合物前药转移到截留分子量为3500的透析袋中在用三乙胺校正pH为8的去离子水溶液中避光透析48～72h，期间每4～8h换一次校正pH为8的去离子水溶液，冷冻干燥后获得白色粉末状纳米胶束CPJ。在透析的过程中，由于聚合物具有两亲性，于是逐渐形成纳米胶束粒子。

用核磁共振氢谱仪和傅氏转换红外线光谱分析仪检测前药纳米胶束CPJ，检测条件为：在室温下，将样品与KBr混合研磨均匀，以2mm/秒的速度在范围500-4000cm^-1扫描。结果如图1所示，其中图1A为CPJ的¹H NMR图：可以看到制备的纳米胶束CPJ对应的质子峰在¹HNMR上都有相应的归属，说明结构是正确的；图1B和1C为制备CPJ的相关物质以及CPJ的的FT-IR图：可以看到四价铂化合物在相应的位置处出现了轴向两端羟基的伸缩振动峰，而在反应过后，其轴向两端羟基振动峰几乎消失，而且六元环双键单体的双键伸缩振动峰随着其消耗也逐渐消失，进一步的说明结构的正确性。

实施例4

(1)两亲性聚合物前药的制备：将80mg(0.38mmol)实施例2制备的3,9-二亚乙基-2,4,8,10-四氧螺-[5.5]十一烷(DETOSU)和126.9mg(0.38mmol)实施例1制备的oxoplatin加入到100mL反应瓶中，将13.0mg的对甲苯磺酰胺(p-TSA)溶于无水二甲基亚砜(DMSO)中获得对甲苯磺酰胺的二甲基亚砜溶液，然后向反应瓶中加入1mL的对甲苯磺酰胺的二甲基亚砜溶液，最后加入6～12mL无水DMSO，在氮气保护的环境下50℃搅拌反应72h，反应结束后滴加2～3滴三乙胺终止反应，获得两亲性聚合物前药。

(2)纳米胶束CCPJ的制备：将步骤(1)制备的两亲性聚合物前药转移到截留分子量为3500的透析袋中在用三乙胺校正pH为9的去离子水溶液中避光透析48～72h，期间每4～8h换一次校正pH为9的去离子水溶液，冷冻干燥后获得白色粉末状纳米胶束CCPJ。

实施例5

(1)两亲性聚合物前药的制备：将100mg(0.64mmol)实施例2制备的4,4-二亚甲氧基-二-(2-甲基-1,3-二氧戊烷)(OMMD)和213.9mg(0.64mmol)实施例1制备的oxoplatin加入到100mL反应瓶中，将21.9mg的对甲苯磺酰胺(p-TSA)溶于100mL的无水二甲基亚砜(DMSO)中获得对甲苯磺酰胺的二甲基亚砜溶液，然后向反应瓶中加入1mL的对甲苯磺酰胺的二甲基亚砜溶液，最后加入10～15mL无水DMSO，在氮气保护的环境下55℃搅拌反应48h，反应结束后滴加2～3滴三乙胺终止反应，获得两亲性聚合物前药。

(2)纳米胶束FCPJ的制备：将步骤(1)制备的两亲性聚合物前药转移到截留分子量为3500的透析袋中在用三乙胺校正pH为10的去离子水溶液中避光透析60h，期间每4～8h换一次校正pH为10的去离子水溶液，冷冻干燥后获得白色粉末状纳米胶束FCPJ。

实施例6

(1)两亲性聚合物前药的制备：将100mg(0.54mmol)的实施例2制备的(Z)-2-亚乙基-4-[(E)-2-亚乙基-1,3-二氧戊环-4-基-甲氧基-甲基]-1,3-二氧戊烷(EEDMMD)和181.3mg(0.54mmol)实施例1制备的oxoplatin加入到100mL反应瓶中，将18.5mg的对甲苯磺酰胺(p-TSA)溶于100mL的无水二甲基亚砜(DMSO)中获得对甲苯磺酰胺的二甲基亚砜溶液，然后向反应瓶中加入1mL的对甲苯磺酰胺的二甲基亚砜溶液，最后加入5～10mL无水DMSO，在氮气保护的环境下53℃搅拌反应52h，反应结束后滴加2～3滴三乙胺终止反应，获得两亲性聚合物前药。

(2)纳米胶束FCCPJ的制备：将步骤(1)制备的两亲性聚合物前药转移到截留分子量为3500的透析袋中在用三乙胺校正pH为9.5的去离子水溶液中避光透析52h，期间每4～8h换一次校正pH为9.5的去离子水溶液，冷冻干燥后获得白色粉末状纳米胶束FCCPJ。

实施例7

抗肿瘤纳米药物新制剂(包载阿霉素的前药胶束，CPJ/DOX、CCPJ/DOX、FCPJ/DOX和FCCPJ/DOX)的制备：分别称取20mg实施例3至6制备的纳米胶束CPJ、CCPJ、FCPJ和FCCPJ，然后分别将其加入到0.4mL无水DMSO中充分溶解后，继续加入4mg阿霉素共同溶解，然后转移到截留分子量为3500的透析袋中在用三乙胺校正pH的去离子水溶液中避光透析52h，期间每4h换一次校正pH为9的去离子水溶液，冷冻干燥后获得抗肿瘤纳米药物新制剂(包载阿霉素的前药胶束，载药胶束CPJ/DOX、CCPJ/DOX、FCPJ/DOX和FCCPJ/DOX)。通过波长为481nm的酶标仪测定包载阿霉素的前药胶束的载药量和包封率，结果如表1所示，计算公式如下：

载药量(DLC％)＝载药胶束中阿霉素的量/载药纳米胶束的总量×100％；

包封率(DLE％)＝载药胶束中阿霉素的量/加入的阿霉素的总量×100％。

通过动态光散射仪以6mM的激光器，633nm的入射光和173度散射角测量4种包载阿霉素的前药胶束的电位(Zeta)，结果如表1所示。

表1：包载阿霉素的前药胶束的载药量、包封率和电位

备注：a表示通过酶标仪测得，b表示通过动态光散射仪测得。

从表1中可以看出，上述所制备的四种聚合物前药胶束都能有效的包载药物阿霉素；并且电位接近中性，很适合在血液循环中保持稳定的特性。

实施例8

实施例3至6制备的纳米胶束CPJ、CCPJ、FCPJ和FCCPJ的分子量及其分布的检测和产率的计算：分别称取一定量的纳米胶束CPJ、CCPJ、FCPJ和FCCPJ用色谱级的二甲基甲酰胺(DMF)溶解并且保证终浓度为2mg/mL，用孔径为0.45μm的有机相滤头进行过滤，通过Waters1515GPC检测其分子量(数均分子量Mn，重均分子量Mw)及分子量分布(多分散系数PDI，Mw与Mn之比)，其中以DMF为流动相，流速为1mL/min，进样量为60μL；通过上述方法测得的分子量，可以计算出所得纳米胶束的产率，结果如下表2所示。

通过动态光散射仪以6mM的激光器，633nm的入射光和173度散射角测量实施例3至6制备的纳米胶束CPJ、CCPJ、FCPJ和FCCPJ的浓度为1mg/mL的电位(Zeta)，结果如下表2所示。

表2：实施例3至6制备的纳米胶束的产率、分子量、分子量分布及其电位

备注：a表示通过二甲基甲酰胺(DMF)相的凝胶渗透色谱仪(GPC)测得；b表示通过动态光散射仪测得。

从表2中可以看出，四种纳米胶束的分子量增大其产率有所增加，能说明其反应活性增加，而且其分子量分布较均匀；四种纳米胶束的电位都为负电位，可能由于顺铂本身带的负电荷很高，其也相对增加了药物在血液循环中的稳定性。

实施例9

利用尼罗红检测法测定实施例3制备的纳米胶束CPJ的临界胶束浓度，其临界胶束曲线如图2A所示。通过光子相关光谱(DLS)检测实施例3制备的纳米胶束CPJ和实施例7制备的载药胶束CPJ/DOX的粒径分布，结果如图2B和2C所示。通过透射电镜检测实施例3至6制备的纳米胶束CPJ、CCPJ、FCPJ和FCCPJ的形貌，结果如图2D、2E、2F、2G所示。

从图2可以看出，制备的纳米胶束CPJ，其临界胶束浓度在.2.7×10^-4mg/mL，说明所制备的胶束粒子较稳定而且制备简单；前药胶束粒子和载药后的前药胶束粒子其粒径在100～200nm左右，适合作为纳米药物载体输送药物治疗肿瘤，而且分布较为均一；从透射图中可以看出所制备的四种胶束粒子其形态呈大小均一且规则的球形。

实施例10

纳米胶束的pH降解和还原：将实施例3制备的纳米胶束CPJ分别配成终浓度为1mg/mL、pH 5.0的PBS溶液和20mM的二硫苏糖醇(DTT)溶液，经过共处理24h后，通过高效液相色谱法(HPLC)检测其出峰时间来判断其结构，结果如图3所示。

从图3可以看出，通过酸降解或DTT还原后，由于其得到的产物不同，因此出峰的时间位置也不同。从降解机制图可以看出，酸降解的产物仍然以四价铂化合物的形式存在，而由于其降解产物较为复杂，于是其出峰时间位置有所差异，但是通过DTT还原为二价顺铂的产物和原药顺铂的出峰时间位置基本相同，可以看出聚合物前药在酸性或还原条件下可以降解并且能被还原成原药顺铂。

实施例11

纳米胶束的pH降解和还原后的价态测定：pH降解和还原的方法同实施例10，在纳米胶束CPJ被降解和还原后，将其全部产物进行冷冻干燥后，通过XPS检测其Pt、N、Cl元素的价态，其结果如图4所示。从图4中可以看出，不同pH处理的，产物仍然是呈+4价，而通过DTT还原后其产物都为+2价，和二价顺铂相同，所以可以证明上述降解机制是成立的；而其他元素的价态可以看出并无变化。

实施例12

CPJ及其载药胶束的pH粒径变化及其在血清中的稳定性和载药胶束在体内血液循环中的稳定性测试：将实施例3制备的纳米胶束CPJ和实施例7制备的载药胶束CPJ/DOX分别用pH 5.0、6.5和7.4的磷酸盐缓冲液处理不同时间，通过DLS测其粒径随时间变化趋势，所得结果如图5A所示。将实施例3制备的纳米胶束CPJ和实施例7制备的载药胶束CPJ/DOX分别用血清处理不同时间，测其粒径随时间变化趋势，所得结果如图5B所示；通过透射电镜观察二者在血清中处理72h后的状态，结果如图5C和5d所示。将载药胶束CPJ/DOX以治疗剂量(Pt的量/小鼠体重为6mg/kg)通过静脉注射到小鼠体内，分别在2h、4h、8h、12h、24h和48h后取其血，然后通过透射电镜观察其不同时间点的胶束粒子变化，如图5E-J所示。

从图5可以看出，在pH 5.0、6.5和7.4的条件下，呈现很明显差别，酸性越强，其降解速度越快，而且在6.5的情况下，也呈现很快的降解速度，可以看出胶束粒子对pH超敏；而在7.4的条件下，其在缓冲液和血清中都很稳定，而且随后的透射电镜图也证实了这一点。通过体内血液循环后，也能看出其在血液中的能长时间循环。

实施例13

纳米胶束和载药胶束的体外释放检测：将实施例3制备的纳米胶束CPJ和实施例7制备的载药胶束CPJ/DOX分别悬浮于不同pH的磷酸盐缓冲液中，制成悬浮液，然后分别取1mL悬浮液于截留分子量为3500的透析袋中，用棉线扎紧透析袋，放入到50mL的EP管中，再在EP管中加入10mL pH分别为5.0、6.5和7.4的缓冲液，设3个重复，在37℃、120rpm条件下振荡，分别在预先设定好的时间点取出EP管中10mL旧的缓冲液，并加入等量的新鲜缓冲液，然后取3组200微升旧的缓冲液测定其阿霉素浓度，然后计算阿霉素的释放量，而Pt含量的测定是通过ICP-MS测定来计算药物的释放量。对于在还原环境中，采用上述pH环境下的释放测定方法，其区别在于：在配置缓冲液时，向其中加入DTT配置成20mM的pH分别为5.0、6.5和7.4的缓冲液，并且利用截留分子量为8kD～14kD的透析袋，通过检测载药胶束CPJ/DOX的Pt元素的量和阿霉素的量来计算其释放量。结果如图6所示。

从图6中可以看出，在独立的pH条件下，空白的CPJ胶束粒子，通过ICP-MS测得的Pt含量而得出其释放量曲线，而包载阿霉素后是通过酶标仪测定阿霉素的量来计算阿霉素的释放量；而在pH与还原条件下，测定药物释放的方法同上述相同，可以看出，在还原条件存在的情况下，其释放速率较pH条件下大幅增加。

实施例14

细胞培养：分别将人乳腺癌细胞(MCF-7)、人肺腺癌细胞(A549)和人肝癌细胞(HepG2)加入到标准的6孔板中，保证每孔10⁵个细胞左右，培养过夜后，去除培养基，加入1.8mL新鲜培养基，制成细胞培养液。

(1)纳米胶束的细胞摄取检测：

药物：顺铂(CDDP)、实施例1制备的四价铂化合物(oxoplatin)、实施例3制备的纳米胶束CPJ、实施例10中经pH降解的纳米胶束CPJ-pH。

药物处理：在3种细胞培养液中分别添加0.2mL上述4种药物(最终Pt浓度均为2μg/mL)共培养4h和8h后，去除培养基，PBS冲洗2次，然后用细胞裂解液处理。

检测方法：通过ICP-MS测定Pt元素含量，其中通过BCA方法测得细胞中的蛋白含量，最后评定在一定的蛋白含量中摄取的Pt含量，结果如图7A所示。

(2)载药胶束的细胞摄取检测：

药物：阿霉素(DOX)、实施例7制备的载药胶束CPJ/DOX。

药物处理：在3种细胞培养液中分别添加0.2mL上述2种药物(最终阿霉素浓度都为16μg/mL)共培养4h后，去除培养基，PBS冲洗2次，4％多聚甲醛液固定细胞(5min左右)，PBS冲洗2次，染核试剂染细胞核(5min)，PBS洗2次。

检测方法：其细胞的摄取情况通过激光共聚焦来定性观察，如图7B所示，可以看出，细胞对裸阿霉素和载药胶束粒子都能进行有效的摄取；通过流式细胞仪对其摄取进行定量测量，结果如图7C所示，从图中可以看出，其对应上述的定性摄取情况是吻合的，并且可以看出A549细胞相对裸阿霉素，其摄取效果较好。

实施例15

纳米胶束和载药胶束的细胞毒性检测：

细胞培养：细胞培养：分别将人乳腺癌细胞(MCF-7)、人肺腺癌细胞(A549)和人肝癌细胞(HepG2)加入到标准的6孔板中，保证每孔4,000个细胞左右，贴壁24h后，去除培养基，加入180μl的新鲜培养基，制成细胞培养液。

药物：顺铂(CDDP)、实施例1制备的四价铂化合物(oxoplatin)、实施例3制备的纳米胶束药CPJ、实施例10中经pH降解的纳米胶束CPJ-pH和CPJ-DTT；阿霉素(DOX)、实施例7制备的载药胶束CPJ/DOX。

药物处理：在3种细胞培养液中分别添加20μl上述前5种药物(Pt的含量相同)和后2种药物(阿霉素的含量相同)共培养24h后，然后去除培养基，加入180μl的新鲜培养基和20μl MTT(5mg/mL)共培养4h后，去除培养基，加入150μl的DMSO，震荡10min后，在570nm波长下检测，通过酶标仪测得其对应的OD值，根据与对照组的比较得出其每一组的细胞存活率，结果如图8所示。从图8中可以看出，小分子药物、包载阿霉素胶束粒子及聚合物前药降解后的产物对细胞在一定的药物浓度下，都有很好的杀伤癌细胞的效果，但是聚合物前药胶束对癌细胞的杀伤有一定的滞后性，是因为在摄取，降解到起作用的这个过程导致的。

实施例16

体外模拟载药胶束的3-D渗透：将人乳腺癌细胞(MCF-7)养成直径约为200～300μm的多细胞球体，分别用倒置显微镜和扫描电子显微镜观察，结果如图9A和9B所示。将1.8mL培养好的包含多细胞球体的培养基随机分配到两支5mL EP管中，每支EP管大约有8～10个多细胞球，再分别将0.2mL阿霉素(DOX)和实施例7制备的载药胶束CPJ/DOX(阿霉素最终浓度为16μg/mL)加入到两支EP管中，分别在共培养2、4、8、12和24h后，通过激光共聚焦观察其渗透情况，结果如图9C所示。通过图9可以看出，细胞团的培养是很成功的，而且其载药胶束粒子可以随着时间的延长从细胞团外层逐渐的渗透到内部从而可以很好的杀伤细胞团中癌细胞。

实施例17

体外模拟多细胞3-D球生长抑制实验：参照实施例16的方法培养乳腺癌细胞(MCF-7)多细胞球体，将其与不同药物(DOX、顺铂、实施例3制备的CPJ和实施例7制备的CPJ/DOX)在96孔板中共培养0、1、3、5和7天后，通过倒置显微镜进行拍照，记录细胞球的形态与大小的变化，结果如图10所示。从图10可以看出，对照组细胞团随着时间的延长，其细胞团一直呈增长的趋势，而给药组却能很好的抑制细胞团的增长，并且能有效的杀死癌细胞；并且从图中可以很明显的看出粒子组及载药粒子组要比小分子药物组的杀伤抑制效果好。

实施例18

药物分布检测：分别将顺铂、实施例3制备的纳米胶束CPJ和实施例7制备的载药胶束CPJ/DOX以Pt的量/小鼠体重为6mg/kg的量通过静脉注射的方式注入到不同小鼠体内；然后分别在2、4、8、12、24和48小时将小鼠处死，取其各器官和血液，通过酶标仪或者ICP-MS测定其铂分布，结果如图11A-11C所示。另外，分别将阿霉素和实施例7制备的载药胶束CPJ/DOX以阿霉素的量/小鼠体重为6mg/kg的量通过静脉注射的方式注入到不同小鼠体内；然后分别在2、4、8、12、24和48小时将小鼠处死，取其各器官和血液，通过酶标仪或者ICP-MS测定其阿霉素分布，结果如图11D-11E所示。从图11中可以看出，小分子药物，对心脏及其其他器官毒性较大，而且不能在血液内长时间循环，于是不能有效的在肿瘤内富集，起到很好的治疗效果；然而胶束粒子及其载药胶束粒子，能在血液中长时间保持稳定，而且心脏及其他器官毒性较小，在肿瘤部位能有效富集起到很好的治疗肿瘤的效果。

实施例19

单次给药的治疗效果评估：按照上述的方法，通过静脉注射(Pt的量/小鼠体重为6mg/kg)将不同铂化合物(包括cisplatin、cisplatin/DOX、CPJ)、自由阿霉素(6mg/kg)和实施例7制备的载药胶束(CPJ/DOX)经过小鼠体内循环代谢。然后在不同的时间点，对小鼠肿瘤体积、肿瘤质量和小鼠体重进行记录，结果如图12所示。从图12可以看出，粒子组及载药粒子组对小鼠的毒副作用较小，小鼠体重呈增长趋势，而肿瘤有明显的抑制效果甚至治疗效果；而小分子药物对小鼠肿瘤有一定的抑制效果，但是其毒副作用较大。

实施例20

多次给药的治疗效果评估：在第一次治疗效果评估的基础上，对其进一步多次给药，然后进行效果评估。待小鼠肿瘤长到40mm³后，分别以每7天一个周期，对一组的12只老鼠进行给药，然后记录小鼠肿瘤体积与小鼠体重随时间的变化，此外还设置一组生理盐水作为平行对照，结果如图13所示。从图13中可以看出，分别在第0、7、14天给药及生理盐水对照，可以看出小鼠体重与肿瘤大小的变化，并且在给药组中，肿瘤得到非常显著的抑制以及完全治愈，并且体重随着时间增长逐渐稳定并且增长，而生理盐水组，其肿瘤体积不断增大，而且期间有小鼠死亡，并且体重在一定的时间后，有下降的趋势。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种四价铂化合物-双环双键两亲性聚合物前药，其特征在于，具有式(I)所示结构：

其中，m＝1时，

表示

m＝0时，

表示

R表示-CH₃或-CH₂CH₃，L₁和L₂相互独立地为Cl，n为10至80。

2.权利要求1所述的四价铂化合物-双环双键两亲性聚合物前药的制备方法，其特征在于，所述方法包括使如式(II)所示的轴向双羟基配位的四价铂化合物与如式(III)所示的双环双键原酸酯前体进行反应的步骤；

在式(II)中，L₁和L₂相互独立地为Cl；

在式(III)中，m＝1时，

表示

m＝0时，

表示

R₁表示-H或-CH₃。

3.根据权利要求2所述的四价铂化合物-双环双键两亲性聚合物前药的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将轴向双羟基配位的四价铂化合物和双环双键原酸酯前体混合，然后向其中加入溶于溶剂中的对甲苯磺酰胺，最后加入二甲基亚砜，在氮气保护下反应，终止反应后获得四价铂化合物-双环双键两亲性聚合物前药。

4.根据权利要求2或3所述的四价铂化合物-双环双键两亲性聚合物前药的制备方法，其特征在于，所述双环双键原酸酯前体选自4,4-二亚甲氧基-二-(2-甲基-1,3-二氧戊烷)、3,9-二亚甲基-2,4,8,10-四氧螺-[5.5]十一烷、(Z)-2-亚乙基-4-[(E)-2-亚乙基-1,3-二氧戊环-4-基-甲氧基-甲基]-1,3-二氧戊烷或3,9-二乙烯基-2,4,8,10-四氧螺-[5.5]十一烷；

以摩尔比计，所述轴向双羟基配位的四价铂化合物：双环双键原酸酯前体：对甲苯磺酰胺＝1：1：0.002。

5.根据权利要求3所述的四价铂化合物-双环双键两亲性聚合物前药的制备方法，其特征在于，所述反应的过程为30～60℃搅拌反应24～72h；

所述终止反应的步骤为滴加三乙胺；

在所述溶于溶剂中的对甲苯磺酰胺中，所述溶剂为二甲基亚砜或二甲基甲酰胺。

6.权利要求1所述的四价铂化合物-双环双键两亲性聚合物前药形成的纳米胶束。

7.权利要求6所述的纳米胶束的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将四价铂化合物-双环双键两亲性聚合物前药置于截留分子量为3500的透析袋中在介质中避光透析48～72h，冷冻干燥后获得纳米胶束；

在所述避光透析过程中每4～8h更换一次介质，所述介质为用三乙胺校正pH为8～10的去离子水溶液。

8.权利要求6所述的纳米胶束作为药物载体在制备抗肿瘤纳米药物制剂中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用通过下步骤实现：将纳米胶束溶于二甲基亚砜或二甲基甲酰胺中，向其中加入负载物，待充分溶解后置于截留分子量为3500的透析袋中在介质中避光透析48～72h，冷冻干燥后获得抗肿瘤纳米药物制剂；

所述负载物选自抗肿瘤药物；所述抗肿瘤药物选自喜树碱、紫杉醇、多西他赛、阿霉素、5-氟尿嘧啶、依托泊甙和博来霉素中的一种或多种；在所述避光透析过程中每4～8h更换一次介质，所述介质为用三乙胺校正pH为8～10的去离子水溶液。

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