CN108130277A

CN108130277A - 一种以木质素为主体的白腐真菌培养基及其配制方法

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Publication number: CN108130277A
Application number: CN201711250061.3A
Authority: CN
Inventors: 姬丹丹; 臧立华; 侯立鹏; 李肖玲
Original assignee: Qilu University of Technology
Current assignee: Qilu University of Technology
Priority date: 2017-12-01
Filing date: 2017-12-01
Publication date: 2018-06-08

Abstract

本发明提供了一种以成品木质素为主体的白腐真菌培养基及其制备方法。白腐真菌主要涉及黄孢原毛平革菌、云芝、香菇、平菇。该培养基原料及其浓度如下：成品木质素0.05‑0.20g/L、葡萄糖3‑6g/L，KH₂PO₄1‑3g/L，MgSO₄ 0.20‑0.30g/L，CaCl₂ 0.05‑0.15g/L，MnSO₄0.005g/L，VB₁0.005g/L，酒石酸铵0.1‑0.3g/L，微量元素130‑160mL/L。本发明解决了现有白腐真菌培养基工艺复杂、周期长、长势差的问题。同时提供了一种营养均衡、利于菌种生长的培养基；培养基的主体使用了成品木质素，可作为木质素处理的标准培养基，可以使用不同废液废料中的木质素。

Description

一种以木质素为主体的白腐真菌培养基及其配制方法

技术领域

本发明属于木质素资源化利用技术领域，具体地涉及一种以成品木质素为主体的白腐真菌培养基及其配制方法。

背景技术

植物光合作用在地球上每年产生总量达1440-1800亿吨的生物质，其中绝大部分是植物细胞壁组分中的木质纤维素类生物质。木质纤维素被认为是地球上存在最广泛的可再生性生物质资源，其主要成分是纤维素、半纤维素和木质素。在木质纤维素中，纤维素组成微细纤维，进而构成纤维细胞壁的网状骨架，而木质素与半纤维素以共价键形式结合，将纤维素包埋在其中，形成一种天然屏障，使微生物不易与纤维素接触。

用生物法降解木质素可以减轻环境污染，节省能耗，还可以变废为宝，实现废弃植物资源再利用。木质素的生物降解研究表明，白腐真菌(White rotfungi)是目前唯一能将木质素降解为二氧化碳和水的一类微生物，其分泌木质素降解酶的同时还分泌纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶等酶类，比木霉、曲霉等更适合分解天然的木质纤维素物质，故利用白腐真菌选择性降解木质素是目前生物技术研究中的热点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种以成品木质素为主体的白腐真菌培养基，并提供其制备方法。

为达到上述目的，本发明的技术方案是：

本发明一种液体培养基，培养基按浓度包括以下组分：

优选的，所述培养基的pH值为4.5-7.0。

所述的真菌为白腐真菌，用于降解利用废弃物中的木质素。

所述VB₁为维生素B₁的简称。

该培养基原料及其浓度如下：成品木质素(纯木质素或脱碱木质素)0.08-0.16g/L、葡萄糖3-5g/L，KH₂PO₄1-3g/L，MgSO₄ 0.22-0.28g/L，CaCl₂ 0.08-0.12g/L，MnSO₄0.005g/L， VB₁0.005g/L，酒石酸铵0.1-0.3g/L，微量元素溶液135-155mL/L。

优选的，所述微量元素以溶液的形式使用。微量元素溶液组分及浓度为：NaCl1.0g/L， FeSO_4`7H₂O 100mg/L，CoSO_4`7H₂O 100mg/L，ZnSO_4`7H₂O 100mg/L，CuSO_4`5H₂O 10mg/L， KAl(SO₄)₂ 100mg/L，H₃BO₃ 10mg/L，Na₂MoO₄ 10mg/L。

所述培养基的制备方法为：

(1)预处理：用Klason法测定成品木质素纯度；

(2)将上述组分按照所述配比充分混合；

(3)根据浓度加入一定量水后，调节pH值为4.5-7.0即可使用。

所述成品木质素为常见木质素：碱木质素、脱碱木质素、纯木质素。更优选的，所述木质素为纯木质素。

所述成品木质素可以是各种来源的木质素，如废液废料中提取的木质素；所述的含量是折合为纯木质素或脱碱木质素的含量。

本发明还提供所述培养基的用途，用于白腐真菌的培养基。

优选的，所述培养基的用途，将制作完毕的培养基，在无菌条件下接种白腐真菌，并放入恒温培养振荡器中，设定温度37℃，转速120rpm。

本发明中所应用的白腐真菌为：黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、云芝(Coriolus versicolor)、香菇(Lentinusedodes)、平菇(Pleurotusostreatus)。

本发明所涉及的白腐真菌培养基，可在保证白腐真菌生长过程所需养分的供给的同时优化培养工艺，缩短培养周期，降低生产成本以及有利于推广白腐真菌生物预处理工业化的利用。

本发明具有以下几个优点：(1)本发明按照白腐真菌的生长需求，提供一种营养均衡、价格低廉并有利于菌种产酶的真菌培养基；解决了现有白腐真菌培养基工艺复杂、周期长、长势差的问题。(2)本发明所涉及的白腐真菌培养基的制备，可在保证白腐真菌在生长过程中供给所需养分的同时优化培养工艺，缩短培养周期，降低生产成本，有利于推广白腐真菌生物预处理木质素废弃物工业化的利用。(3)本发明所提供的培养基以成品木质素为主体，利用白腐真菌对木质素的选择降解性，提高了木质素降解效率，为不同废液废料中的木质素生物降解提供理论依据。本发明解决了现有白腐真菌培养基工艺复杂、周期长、长势差的问题。同时按照白腐真菌营养需要，提供了一种营养均衡、利于菌种生长的培养基；培养基的主体使用了成品木质素，可作为木质素处理的标准培养基，可以使用不同废液废料中的木质素，生物降解提供理论依据。

具体实施方式

实施例1：

一种含纯木质素含量50mg/L的黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)培养基

包括以下重量/体积的组分：

成品纯木质素0.05g，葡萄糖5g，KH₂PO₄ 2g，微量元素溶液150mL，MgSO₄ 0.25g，酒石酸铵0.2g，CaCl₂ 0.1g，MnSO₄ 0.005g，VB₁ 0.005g。

微量元素成分配比：NaCl 1.0g/L，FeSO_4`7H₂O 100mg/L，CoSO_4`7H₂O 100mg/L，ZnSO_4`7H₂O 100mg/L，CuSO_4`5H₂O 10mg/L，KAl(SO₄)₂ 100mg/L，H₃BO₃ 10mg/L， Na₂MoO₄10mg/L。

制备方法为：用Klason法测定成品木质素纯度，用去离子水溶解，加入上述质量或体积各物料充分溶解并加水定容至1L，修正pH值为6.0，即可使用。培养过程中，培养基置于37℃恒温培养振荡器中，转速120rpm。

在无菌条件下，取出经过一段时间培养的培养基20mL,可按照铁氰化钾法法测定基质中木质素含量，与培养前含量进行对比既可得到培养过程中木质素降解率。

本发明的纯木素培养基中不仅包含传统培养基所含有的碳源、氮源、无机盐(包括微量元素)以及维生素等营养元素，而且木质素作为自然界中唯一能被白腐真菌完全降解的生物质，可以提供充足的营养元素，促使白腐真菌产生多种降解酶，从而使白腐真菌大量繁殖。

通过测定培养前后基质中木质素含量可以得知，本发明所提供的培养基可高效培养黄孢原毛平革菌并降解木质素，同时菌丝长势要比传统培养基的长势饱满的多，而且菌丝的生长速度提前8-10天。

实施例2：

一种含纯木质素含量200mg/L的黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)培养基

包括以下重量(体积)份的组分：

成品纯木质素0.20g，葡萄糖3g，KH₂PO₄ 3g，微量元素溶液135mL，酒石酸铵0.1g，MgSO₄ 0.25g，CaCl₂ 0.1g，MnSO₄ 0.005g，VB₁ 0.005g。

制备方法为：用Klason法测定成品木质素纯度，用去离子水溶解，加入上述质量各物料充分溶解并加水定容至1L，修正pH值为6.0，即可使用。培养过程中，培养基置于37℃恒温培养振荡器中，转速120rpm。

培养过程中测定黄孢原毛平革菌培养过程产酶特性。具体实施方式：

黄孢原毛平革菌能够产生胞外氧化酶来降解秸秆中的木质素，其主要包括锰过氧化物酶(MnP)、木质素过氧化物酶(LiP)、漆酶(Lac)。在此以锰过氧化物酶为例进行说明。

取125mmol/L的酒石酸钠缓冲液(pH＝3.0)1mL、0.160mmol/L的Azure B溶液0.5mL、木质素培养基液0.5mL；30℃下加入2mmol/L的过氧化氢溶液0.5mL启动反应；用紫外分光光度计测定反应最初3min内，波长651nm处吸光度变化。(1个酶活力单位用每分钟木质素培养基液增加0.1OD来表示)

表1黄孢原毛平革菌在不同培养基上LiP酶活性活动变化(U/mL)

表1中200mg/L木质素培养基，各成分按质量分数计，成品木质素3.2％、葡萄糖47.6％、 KH₂PO₄ 31.7％、微量元素8.6％、MgSO₄ 4.0％、酒石酸铵3.2％、CaCl₂ 1.6％、MnSO₄0.08％、 VB₁ 0.08％。

表1中普通白腐真菌培养基，各成分按质量分数计，葡萄糖61.7％、KH₂PO₄ 25.2％、微量元素6.2％、MgSO₄ 3.1％、酒石酸铵2.5％、CaCl₂ 1.3％、MnSO₄ 0.06％、VB₁ 0.06％。

从表中可以分析得到，在培养后的第2d，200mg/L木质素培养基开始表现出Lip活性，并且两种培养基均呈现升高的趋势，在培养的第7d达到高峰，200mg/L木质素培养基和普通白腐真菌培养基酶活分别高达0.05U/mL和0.03U/mL。

本发明所提供的液体真菌培养基在培养过程中与传统培养基相比，相同培养时间内木质素氧化物酶的产率明显提高，说明其对基质中木质素选择降解性更好，黄孢原毛平革菌生长更加旺盛，生物量更加丰富。并且菌丝长势要比传统固体培养基的长势一样浓密、粗壮，而且菌丝的生长速度略有提前。

Claims

1.一种液体培养基，培养基按浓度包括以下组分：

成品木质素 0.05-0.20g/L；

葡萄糖 3-6g/L；

KH₂PO₄ 1-3g/L；

微量元素溶液 130-160mL/L；

酒石酸铵 0.1-0.3g/L；

MgSO₄ 0.20-0.30g/L；

CaCl₂ 0.05-0.15g/L；

MnSO₄ 0.005g/L；

VB₁ 0.005g/L。

2.如权利要求1所述的液体培养基，其特征在于，所述培养基的pH值为4.5-7.0。

3.如权利要求1或2所述的液体培养基，其特征在于，所述成品木质素为：碱木质素、脱碱木质素或纯木质素。

4.如权利要3所述的液体培养基，其特征在于，所述木质素为纯木质素。

5.如权利要求1-4任一项所述的液体培养基，其特征在于，该培养基原料及其浓度如下：成品木质素(纯木质素或脱碱木质素)0.08-0.16g/L、葡萄糖3-5g/L，KH₂PO₄1-3g/L，MgSO₄ 0.22-0.28g/L，CaCl₂ 0.08-0.12g/L，MnSO₄0.005g/L，VB₁0.005g/L，酒石酸铵0.1-0.3g/L，微量元素溶液135-155mL/L。

6.如权利要求1-5任一项所述的液体培养基，其特征在于，所述微量元素以溶液的形式使用；微量元素溶液组分及浓度为：NaCl 1.0g/L，FeSO_4`7H₂O 100mg/L，CoSO_4`7H₂O 100mg/L，ZnSO_4`7H₂O 100mg/L，CuSO_4`5H₂O 10mg/L，KAl(SO₄)₂ 100mg/L，H₃BO₃ 10mg/L，Na₂MoO₄10mg/L。

7.如权利要求1-6任一项所述的培养基的制备方法，包括下列步骤：

(1)预处理：用Klason法测定成品木质素纯度；

(2)将上述组分按照所述配比充分混合；

(3)根据浓度加入一定量水后，调节pH值为4.5-7.0即可使用。

8.如权利要求1-6任一项所述的培养基的用途，用于白腐真菌的培养基。

9.如权利要求8所述的培养基的用途，将制作完毕的培养基，在无菌条件下接种白腐真菌，并放入恒温培养振荡器中，设定温度37℃，转速120rpm。

10.如权利要求8或9所述的培养基的用途，所述的白腐真菌为：黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、云芝(Coriolus versicolor)、香菇(Lentinusedodes)、平菇(Pleurotusostreatus)。