CN108138169B - 抗Eva1蛋白质抗体 - Google Patents

Abstract

为了提供对癌等发挥高治疗和预防效果的抗体，制作了对来源于人的Eva1蛋白质显示高亲和性的3种小鼠单克隆抗体。另外，也制作了将它们的恒定区替换为来源于人的恒定区的嵌合抗体。然后也发现，这些小鼠抗体和嵌合抗体具有高的ADCC活性和/或CDC活性。进而明确了，通过对施与了黑素瘤细胞的小鼠施与这些抗体，该细胞向肺的转移等被抑制，从而完成了本发明。

Description

抗Eva1蛋白质抗体

技术领域

本发明涉及抗Eva1蛋白质抗体，更详细地说，涉及保持包含特定的氨基酸序列的互补决定区(CDR)且与来源于人的Eva1蛋白质结合的抗体、和以该抗体为有效成分的抗癌剂等药物组合物。

另外，本申请主张日本专利申请2015-152941号(2015年7月31日申请)的优先权，该申请的公开内容通过参照而引入本申请说明书中。

背景技术

癌与冠状动脉疾病一并是发达国家的主要死因，其比例也逐年增加。因此，要求迅速开发癌的根治法。

癌的根治法的开发中，癌干细胞的存在近年来受到重视。癌干细胞虽然仅存在于癌的组织的极少一部分中，但通过重复自我复制进一步分化而成为创造大多数癌细胞的元凶。另外，在具有这样强的肿瘤形成能力的同时，还显示癌干细胞对化疗法、放疗法具有强的耐性能力。因此，即使通过化疗法、放疗法而能够杀灭癌组织中的大部分癌细胞，也由于癌干细胞残存，从而癌发生复发、转移等。然而如果能够以癌干细胞作为靶标将其也杀灭，则能期待开发出对防止癌的转移、复发等有用的治疗法。

鉴于这种状况，本发明者们作为在神经胶质瘤及其癌干细胞中高表达的蛋白质，成功地鉴定出Eva1蛋白质。并且弄清楚了，该Eva1蛋白质的表达与神经胶质瘤的恶性度相关，神经胶质瘤患者的生存率与来自该患者的神经胶质瘤中的Eva1基因的表达之前有强相关。另外还发现，Eva1基因的功能的抑制，对于抑制神经胶质瘤细胞的增殖能力、肿瘤形成能力和组织浸润能力、以及神经胶质瘤干细胞的肿瘤块形成能力是有效的(专利文献1)。

另外，癌中该神经胶质瘤这数十年间以手术为基础并以放疗和化疗法作为辅助疗法的治疗基本没有改变，特别是针对中枢神经系统组织中的恶性神经胶质瘤中恶性度最高的多形性成胶质细胞瘤(GBM，glioblastoma multiforme)，尚未发现有效的治疗法。进而，作为针对恶性神经胶质瘤的标准治疗药使用替莫唑胺(Temozolomide)，但本发明者们确认了，神胶质瘤干细胞即使对有效血中浓度的数倍的替莫唑胺(Temozolomide)也是非敏感性的。另外，不限于神经胶质瘤，暴露于这样的化疗剂的癌细胞大多会对该化疗剂产生耐性，对其他多种化疗剂也同样产生交差耐性。进而，化疗剂多对正常细胞也造成细胞伤害，为了降低这样的副作用，化疗剂的用量或用法多数情况下受到制约。

由于这样的现状，近年来抗体作为抗癌剂的利用受到瞩目，其重要性逐渐被认可。例如，如果是以癌特异性抗原为靶标的抗体，则推定施与的抗体聚集在癌组织中，因此能够期待通过抗体依赖的细胞毒(ADCC)活性、补体依赖的细胞毒(CDC)活性，介由免疫系统对癌细胞进行攻击。另外，通过预先使抗体与细胞毒性物质、放射性核素等药剂结合，能够将结合的药剂有效地送达肿瘤部位。由此，能够减少向其他组织的药剂到达量，进而能够预计副作用的减轻。在癌特异性抗原具有诱导细胞死亡的活性的情况下，通过施与具有激动活性的抗体，另外，在癌特异性抗原参与细胞的增殖和生存的情况下，通过施与具有中和活性的抗体，能够期待通过肿瘤特异性抗体的聚集和抗体的活性而使癌的增殖停止或退缩。由于这样的特性，认为抗体适合作为抗癌剂应用。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2012/043747号

发明内容

发明要解决的课题

本发明是鉴于这样的状况而做出的，目的是提供以在神经胶质瘤等癌、特别是癌干细胞中高表达的Eva1蛋白质作为靶标的抗体，并且提供以该抗体作为有效成分的抗癌剂等药物组合物。

用于解决课题的方法

本发明者们为了实现上述目的反复进行了深入研究，结果成功地获得了对来源于人的Eva1蛋白质显示高亲和性的3种小鼠单克隆抗体(B2E5-48抗体、C3抗体、A5D11-10抗体)。另外，对于B2E5-48抗体和C3抗体，也制作了将它们的恒定区替换为来源于人的恒定区的嵌合抗体。然后也发现，这些小鼠抗体和嵌合抗体具有高的ADCC活性和/或CDC活性。进而明确了，通过对施与了黑素瘤细胞的小鼠施与这些抗体，该细胞向肺的转移等被抑制，从而完成了本发明。

本发明更详细地提供以下的发明。

＜1＞一种抗体，与来源于人的Eva1蛋白质结合，并且具有下述(a)～(c)的任一项所记载的特征，

(a)保持作为CDR包含以下氨基酸序列的可变区，所述氨基酸序列是选自由序列号4～6所记载的氨基酸序列，与序列号4～6所记载的氨基酸序列有80％以上的同源性的氨基酸序列，在序列号4～6所记载的至少任一氨基酸序列中替换、缺失、添加和/或插入了1个或数个氨基酸的氨基酸序列，序列号10～12所记载的氨基酸序列，与序列号10～12所记载的氨基酸序列有80％以上的同源性的氨基酸序列，以及在序列号10～12所记载的至少任一氨基酸序列中替换、缺失、添加和/或插入了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的组中的至少1种氨基酸序列；

(b)保持作为CDR包含以下氨基酸序列的可变区，所述氨基酸序列是选自由序列号16～18所记载的氨基酸序列，与序列号16～18所记载的氨基酸序列有80％以上的同源性的氨基酸序列，在序列号16～18所记载的至少任一氨基酸序列中替换、缺失、添加和/或插入了1个或数个氨基酸的氨基酸序列，序列号22～24所记载的氨基酸序列，与序列号22～24所记载的氨基酸序列有80％以上的同源性的氨基酸序列，以及在序列号22～24所记载的至少任一氨基酸序列中替换、缺失、添加和/或插入了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的组中的至少1种氨基酸序列；

(c)保持作为CDR包含以下氨基酸序列的可变区，所述氨基酸序列是选自由序列号27～29所记载的氨基酸序列，与序列号27～29所记载的氨基酸序列有80％以上的同源性的氨基酸序列，在序列号27～29所记载的至少任一氨基酸序列中替换、缺失、添加和/或插入了1个或数个氨基酸的氨基酸序列，序列号32～34所记载的氨基酸序列，与序列号32～34所记载的氨基酸序列有80％以上的同源性的氨基酸序列，以及在序列号32～34所记载的至少任一氨基酸序列中替换、缺失、添加和/或插入了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的组中的至少1种氨基酸序列。

＜2＞一种抗体，与来源于人的Eva1蛋白质结合，并且具有下述(a)～(c)的任一项所记载的特征，

(a)保持以下轻链可变区和重链可变区，

所述轻链可变区包含序列号3所记载的氨基酸序列，与序列号3所记载的氨基酸序列有80％以上的同源性的氨基酸序列，或在序列号3所记载的氨基酸序列中替换、缺失、添加和/或插入了1个或数个氨基酸的氨基酸序列，

所述重链可变区包含序列号9所记载的氨基酸序列，与序列号9所记载的氨基酸序列有80％以上的同源性的氨基酸序列，或在序列号9所记载的氨基酸序列中替换、缺失、添加和/或插入了1个或数个氨基酸的氨基酸序列；

(b)保持以下轻链可变区和重链可变区，

所述轻链可变区包含序列号15所记载的氨基酸序列，与序列号15所记载的氨基酸序列有80％以上的同源性的氨基酸序列，或在序列号15所记载的氨基酸序列中替换、缺失、添加和/或插入了1个或数个氨基酸的氨基酸序列，

所述重链可变区包含序列号21所记载的氨基酸序列，与序列号21所记载的氨基酸序列有80％以上的同源性的氨基酸序列，或在序列号21所记载的氨基酸序列中替换、缺失、添加和/或插入了1个或数个氨基酸的氨基酸序列；

(c)保持以下轻链可变区和重链可变区，

所述轻链可变区包含序列号26所记载的氨基酸序列，与序列号26所记载的氨基酸序列有80％以上的同源性的氨基酸序列，或在序列号26所记载的氨基酸序列中替换、缺失、添加和/或插入了1个或数个氨基酸的氨基酸序列，

所述重链可变区包含序列号31所记载的氨基酸序列，与序列号31所记载的氨基酸序列有80％以上的同源性的氨基酸序列，或在序列号31所记载的氨基酸序列中替换、缺失、添加和/或插入了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。

＜3＞根据＜1＞或＜2＞所述的抗体，具有来源于人的恒定区。

＜4＞根据＜1＞～＜3＞的任一项所述的抗体，具有选自ADCC活性和CDC活性中的至少1种细胞毒活性。

＜5＞一种药物组合物，包含＜1＞～＜4＞的任一项所述的抗体作为有效成分。

＜6＞根据＜5＞所述的药物组合物，是抗癌剂。

其中，B2E5-48抗体的轻链可变区的氨基酸序列是序列号3所记载的氨基酸序列，B2E5-48抗体的轻链CDR1～3的氨基酸序列是序列号4～6所记载的氨基酸序列，B2E5-48抗体的重链可变区的氨基酸序列是序列号9所记载的氨基酸序列，B2E5-48抗体的重链CDR1～3的氨基酸序列是序列号10～12所记载的氨基酸序列。另外，C3抗体的轻链可变区的氨基酸序列是序列号15所记载的氨基酸序列，C3抗体的轻链CDR1～3的氨基酸序列是序列号16～18所记载的氨基酸序列，C3抗体的重链可变区的氨基酸序列是序列号21所记载的氨基酸序列，C3抗体的重链CDR1～3的氨基酸序列是序列号22～24所记载的氨基酸序列。另外，A5D11-10抗体的轻链可变区的氨基酸序列是序列号26所记载的氨基酸序列，A5D11-10抗体的轻链CDR1～3的氨基酸序列是序列号27～29所记载的氨基酸序列，A5D11-10抗体的重链可变区的氨基酸序列是序列号31所记载的氨基酸序列，A5D11-10抗体的重链CDR1～3的氨基酸序列是序列号32～34所记载的氨基酸序列。

发明的效果

根据本发明，能够提供对来源于人的Eva1蛋白质显示高亲和性、并具有高ADCC和/或CDC活性的抗体。进而，本发明的抗体在体内(in vivo)也显示高抗肿瘤活性，因此能够实现包含癌的转移抑制和复发抑制等在内的癌的治疗或预防。

附图说明

图1是显示本发明的抗Eva1蛋白质抗体B2E5-48抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的氨基酸序列的图。图中，附有下划线的氨基酸序列表示各可变区中的CDR1～3。另外，B2E5-48抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别是序列号3和9所记载的氨基酸序列。

图2是显示本发明的抗Eva1蛋白质抗体C3抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的氨基酸序列的图。图中，附有下划线的氨基酸序列表示各可变区中的CDR1～3。另外，C3抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别是序列号15和21所记载的氨基酸序列。

图3是显示本发明的抗Eva1蛋白质抗体A5D11-10抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的氨基酸序列的图。图中，附有下划线的氨基酸序列表示各可变区中的CDR1～3。另外，A5D11-10抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别是序列号26和31所记载的氨基酸序列。

图4是显示本发明的抗Eva1蛋白质小鼠抗体对表达人Eva1蛋白质的Daudi细胞的ADCC活性的分析结果的图。图中，纵轴显示所述细胞的溶解率，横轴显示对所述细胞添加的抗体的浓度(以下，关于图中的标记在图5～14中也同样)。

图5是显示本发明的抗Eva1蛋白质嵌合抗体对表达人Eva1蛋白质的Daudi细胞的ADCC活性的分析结果的图。

图6是显示本发明的抗Eva1蛋白质小鼠抗体对MKN28细胞的ADCC活性的分析结果的图。

图7是显示本发明的抗Eva1蛋白质嵌合抗体对MKN28细胞的ADCC活性的分析结果的图。

图8是显示本发明的抗Eva1蛋白质小鼠抗体对表达人Eva1蛋白质的Daudi细胞的ADCC活性的分析结果的图。

图9是显示本发明的抗Eva1蛋白质小鼠抗体对表达人Eva1蛋白质的Daudi细胞的CDC活性的分析结果的图。

图10是显示本发明的抗Eva1蛋白质嵌合抗体对表达人Eva1蛋白质的Daudi细胞的CDC活性的分析结果的图。

图11是显示本发明的抗Eva1蛋白质小鼠抗体(B2E5-48小鼠抗体)对MKN28细胞的CDC活性的分析结果的图。

图12是显示本发明的抗Eva1蛋白质嵌合抗体(B2E5-48嵌合抗体)对MKN28细胞的CDC活性的分析结果的图。

图13是显示本发明的抗Eva1蛋白质小鼠抗体(C3小鼠抗体)对MKN28细胞的CDC活性的分析结果的图。

图14是显示本发明的抗Eva1蛋白质嵌合抗体(C3嵌合抗体)对MKN28细胞的CDC活性的分析结果的图。

图15是显示对在施与表达人Eva1蛋白质的B16黑素瘤细胞1日后开始施与B2E5-48小鼠抗体的小鼠的肺中形成的黑素瘤的集落进行观察的结果的照片。图中，下部显示施与B2E5-48小鼠抗体的结果，上部显示取代该抗体施与其同型对照抗体的结果。

图16是显示对在施与表达人Eva1蛋白质的B16黑素瘤细胞1日后开始施与B2E5-48小鼠抗体的小鼠的肺中形成的黑素瘤的集落数进行测量的结果的图。图中，纵轴显示各抗体施与组每1只的肺中形成的集落的平均数(关于图中的标记在图18、20和24中也同样)。

图17是显示对在施与B16黑素瘤细胞1日后开始施与B2E5-48小鼠抗体的小鼠的肺中形成的黑素瘤的集落进行观察的结果的照片。图中，右侧显示施与B2E5-48小鼠抗体的结果，左侧显示代替该抗体施与其同型对照抗体的结果。

图18是显示对在施与B16黑素瘤细胞1日后开始施与B2E5-48小鼠抗体的小鼠的肺中形成的黑素瘤的集落数进行测量的结果的图。

图19是显示对在施与B16黑素瘤细胞1日后开始施与B2E5-48嵌合抗体的小鼠的肺中形成的黑素瘤的集落进行观察的结果的照片。图中，右侧显示施与B2E5-48嵌合抗体的结果，左侧显示代替该抗体施与其同型对照抗体的结果。

图20是显示对在施与B16黑素瘤细胞1日后开始施与B2E5-48嵌合抗体的小鼠的肺中形成的黑素瘤的集落数进行测量的结果的图。

图21是显示对在施与B16黑素瘤细胞14日后开始施与B2E5-48小鼠抗体的小鼠的肺中形成的黑素瘤的集落进行观察的结果的照片。图中，右侧显示施与B2E5-48小鼠抗体的结果，左侧显示代替该抗体施与其同型对照抗体的结果。

图22是显示对在施与B16黑素瘤细胞14日后开始施与B2E5-48小鼠抗体的小鼠的肺中形成的黑素瘤的集落数进行测量的结果的图。图中，横轴显示肺中形成的集落的数(左起依次为少于50个、50个以上且少于100个、100个以上)，纵轴显示根据形成的集落数分类的各抗体小鼠的只数。

图23是显示对在施与表达人Eva1蛋白质的B16黑素瘤细胞1日后开始施与C3小鼠抗体的小鼠的肺中形成的黑素瘤的集落进行观察的结果的照片。图中，右侧显示施与C3小鼠抗体的结果(2例)，左侧显示代替该抗体施与其同型对照抗体的结果(2例)。

图24是显示对在施与表达人Eva1蛋白质的B16黑素瘤细胞1日后开始施与C3小鼠抗体的小鼠的肺中形成的黑素瘤的集落数进行测量的结果的图。

具体实施方式

＜针对来源于人的Eva1蛋白质的抗体＞

如后述的实施例所示，本发明者们成功地获得了对来源于人的Eva1蛋白质显示高亲和性的3种小鼠单克隆抗体(B2E5-48抗体、C3抗体、A5D11-10抗体)。还发现所述抗体具有高ADCC活性和/或CDC活性。另外还弄清楚了，通过对施与了黑素瘤细胞的小鼠施与所述抗体，该细胞向肺的转移等被抑制。进而，还确定了这些抗体的轻链可变区和重链可变区的各个互补决定区(CDR)1～3的序列。

本发明基于上述事项，提供与来源于人的Eva1蛋白质结合、且具有以下特征的抗体：保持作为CDR包含下述任一氨基酸序列、与下述任一氨基酸序列有80％以上、优选85％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上(例如，96％以上、97％以上、98％以上、99％以上)的同源性的氨基酸序列、或在下述任一氨基酸序列中替换、缺失、添加和/或插入了1个或数个氨基酸的氨基酸序列的可变区。

B2E5-48抗体的轻链CDR1～3的氨基酸序列(序列号4～6所记载的氨基酸序列)、B2E5-48抗体的重链CDR1～3的氨基酸序列(序列号10～12所记载的氨基酸序列)、C3抗体的轻链CDR1～3的氨基酸序列(序列号16～18所记载的氨基酸序列)、C3抗体的重链CDR1～3的氨基酸序列(序列号22～24所记载的氨基酸序列)、A5D11-10抗体的轻链CDR1～3的氨基酸序列(序列号27～29所记载的氨基酸序列)、A5D11-10抗体的重链CDR1～3的氨基酸序列(序列号32～34所记载的氨基酸序列)。此外，本说明书中“同源性”包含“同一性”。

另外，作为本发明的更优选方式，可列举以下抗体。

与来源于人的Eva1蛋白质结合、且具有下述(a)～(c)的任一项所记载的特征的抗体，

(a)保持以下轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含序列号4～6所记载的氨基酸序列作为轻链CDR1～3，所述重链可变区包含序列号10～12所记载的氨基酸序列作为重链CDR1～3；

(b)保持以下轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含序列号16～18所记载的氨基酸序列作为轻链CDR1～3，所述重链可变区包含序列号22～24所记载的氨基酸序列作为重链CDR1～3；

(c)保持以下轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含序列号27～29所记载的氨基酸序列作为轻链CDR1～3，所述重链可变区包含序列号32～34所记载的氨基酸序列作为重链CDR1～3。

其中，上述CDR均还可以是与各自的序列号所特定的氨基酸序列有80％以上、优选85％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上(例如，96％以上、97％以上、98％以上、99％以上)的同源性(或同一性)的氨基酸序列，或在各自的序列号所特定的氨基酸序列中替换、缺失、添加和/或插入了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。

另外，作为本发明的进一步优选的方式可列举以下抗体。与来源于人的Eva1蛋白质结合、且具有下述(a)～(c)的任一项所记载的特征的抗体，

(a)保持B2E5-48抗体的轻链可变区的氨基酸序列(序列号3所记载的氨基酸序列)、和B2E5-48抗体的重链可变区的氨基酸序列(序列号9所记载的氨基酸序列)；

(b)保持C3抗体的轻链可变区的氨基酸序列(序列号15所记载的氨基酸序列)、和C3抗体的重链可变区的氨基酸序列(序列号21所记载的氨基酸序列)；

(c)保持A5D11-10抗体的轻链可变区的氨基酸序列(序列号26所记载的氨基酸序列)、和A5D11-10抗体的重链可变区(序列号31所记载的氨基酸序列)。

其中，上述CDR均还可以是与各自的序列号所特定的氨基酸序列有80％以上、优选85％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上(例如，96％以上、97％以上、98％以上、99％以上)的同源性(或同一性)的氨基酸序列，或在各自的序列号所特定的氨基酸序列中替换、缺失、添加和/或插入了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。

其中，关于氨基酸的改变(替换、缺失、添加和/或插入)参照后述。另外，这些抗体中，从后述的ADCC活性和CDC活性更高这样的观点出发，优选具有上述(a)的特征的抗体。

本发明中，“Eva(上皮V样抗原，Epithelial V-like antigen)1蛋白质”是一次跨膜型的细胞膜蛋白质，是也被称为MPZL2(髓鞘蛋白零样蛋白2，Myelin protein Zero-like2)的与细胞骨架系统有关的分子。作为来源于人的Eva1蛋白质，典型地为包含序列号36所记载的氨基酸序列的蛋白质(由序列号35所记载的核苷酸序列编码的蛋白质)。然而，基因的DNA序列通过其突变等而在自然界(即，非人工地)发生变异，由其编码的蛋白质的氨基酸序列也随之改变。因此，本发明所涉及的“Eva1蛋白质”不特定为包含上述典型的氨基酸序列的蛋白质，也包含这样的天然变异体。

本发明中的“抗体”包含免疫球蛋白的全部型和亚型。“抗体”是包含多克隆抗体、单克隆抗体，另外也包含抗体的功能性片段的含义。“多克隆抗体”是包含针对不同表位的不同抗体的抗体制备物。另外，“单克隆抗体”是指由实质上均匀的抗体的集团得到的抗体(包含抗体片段)。与多克隆抗体相比，单克隆抗体识别抗原上的单一决定簇。本发明的抗体优选为单克隆抗体。本发明的抗体是从自然环境的成分中分离和/或回收(即，单离)的抗体。

本发明的抗体针对人Eva1蛋白质的亲和性优选K_D (解离常数)值为10^-8以下，更优选为10^-9以下，进一步还优选k_d (解离速率常数)值为10^-3以下。其中，K_D 值和k_d 值如后述的实施例中所示，可以通过利用表面等离子体共振法的分析来求。另外，本发明的抗体可以是除了人Eva1蛋白质以外，还与来源于其他动物的Eva1蛋白质(例如，小鼠Eva1蛋白质(典型为包含序列号38所记载的氨基酸序列的蛋白质、由序列号37所记载的核苷酸序列编码的蛋白质))结合的抗体。

期望本发明的与人Eva1蛋白质结合的抗体具有选自ADCC活性和CDC活性的至少1种细胞毒活性，更期望具有ADCC活性和CDC活性。

本发明中“ADCC活性(抗体依赖的细胞毒活性)”是指抗体与靶标细胞的细胞表面抗原结合时，通过效应细胞(NK细胞、单核细胞等免疫细胞)进一步与该抗体的Fc区域结合，从而该细胞被激活，随之释放因子而杀伤靶标细胞的活性。另一方面，“CDC活性(补体依赖的细胞毒活性)”是指抗体与靶标细胞结合则补体体统被激活，其结果溶解靶标细胞的活性。

另外，本发明的抗体优选为以0.01μg/mL对表达人Eva1蛋白质的靶标细胞具有ADCC活性的抗体。本发明的抗体是否具有这样的ADCC活性，例如，可以通过后述的实施例所记载的方法测定，更具体地，在以表达人Eva1蛋白质的Daudi细胞作为靶标细胞，利用其细胞溶解率评价ADCC活性的情况下，使用0.01μg/mL的本发明的抗Eva1抗体时的ADCC活性优选细胞溶解率为30％以上，更优选50％以上，进一步优选70％以上。

另外，本发明的抗体优选为以0.30μg/mL、更优选0.01μg/mL对表达人Eva1蛋白质的靶标细胞具有CDC活性的抗体。本发明的抗体是否具有这样的CDC活性，例如，可以通过后述的实施例所记载的方法测定，更具体地，在以表达人Eva1蛋白质的Daudi细胞作为靶标细胞，利用其细胞溶解率评价CDC活性的情况下，使用0.30μg/mL的本发明的抗Eva1抗体时的CDC活性优选细胞溶解率为20％以上，更优选40％以上，进一步优选60以上，更优选80％以上。

期望本发明的抗体进一步具有抗癌活性。本发明中“抗癌活性”是指抑制癌细胞增殖的活性、诱导癌细胞死亡的活性和抑制癌细胞转移的活性中的至少任一种活性。抗癌活性例如，可以通过使用了后述的实施例所记载那样的荷癌模型(接种了B16黑素瘤细胞的小鼠等)的分析来评价。更具体地，将B16黑素瘤细胞对小鼠进行静脉内施与等之后，从施与的翌日或数周后开始，每日或每隔数日将抗Eva1抗体进行静脉内施与等。然后，通过测量肺中形成的B16黑素瘤细胞的集落数，从而可以评价体内(in vivo)的抗癌活性。作为阴性对照，可以施与具有同一同种型的对照抗体，还可以施与PBS等。并且，在抗Eva1抗体施与组中的集落形成数比阴性对照施与组中的少的情况下(设阴性对照施与组中的集落形成数为100％时，优选60％以下、更优选40％以下、进一步优选20％以下、更优选10％以下)，可以判定该抗Eva1抗体具有抗癌活性。

本发明的抗体只要与上述的人Eva1蛋白质结合即可，对其来源、种类、形状等不特别限定。具体包含来源于非人动物的抗体(例如，小鼠抗体、大鼠抗体、骆驼抗体)、来源于人的抗体、嵌合抗体、人源化抗体、和这些抗体的功能性片段。在将本发明的抗体作为药物施与人的情况下，从降低副作用的观点出发，期望嵌合抗体或人源化抗体。

本发明中“嵌合抗体”是指将某种抗体的可变区和与其异种的抗体的恒定区连接而成的抗体。嵌合抗体例如可以通过对小鼠免疫抗原，由该小鼠单克隆抗体的基因切下与抗原结合的抗体可变部(可变区)，使其与来源于人骨髓的抗体恒定部(恒定区)基因结合，将其插入到表达载体并导入宿主使其产生，从而获得(例如，日本特开平8-280387号公报、美国专利第4816397号公报、美国专利第4816567号公报、美国专利第5807715号公报)。

嵌合抗体的恒定区通常使用来源于人的抗体的恒定区。例如重链中可以利用Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、和Cε作为恒定区。另外轻链中可以使用Cκ、Cλ作为恒定区。这些恒定区的氨基酸序列、以及编码它们的碱基序列是公知的。另外，为了改善抗体自身的稳定性、或抗体产生的稳定性，可以替换、缺失、添加和/或插入来源于人的抗体恒定区中的1或数个的氨基酸。

本发明中“人源化抗体”是指将非人(小鼠等)来源的抗体的抗原结合部位(CDR)的基因序列移植(CDR移植)到来源于人的抗体基因中而得的抗体，其制作方法有重叠延伸PCR等，是公知的(例如，欧洲专利申请公开第239400号说明书、欧洲专利申请公开第125023号说明书、国际公开第90/07861号、国际公开第96/02576号)。抗体的可变区通常由4个FR夹着3个CDR构成。CDR是实质上确定抗体的结合特异性的区域。CDR的氨基酸序列富于多样性，另一方面构成FR的氨基酸序列多在具有不同结合特异性的抗体的之间也显示高同源性。因此，一般认为通过CDR移植，能够将某种抗体的结合特异性移植到其他抗体。另外，从维持CDR的功能的观点出发，非人来源CDR向人FR的移植选择与来源于该非人动物的FR同源性高的人FR。即，CDR内的氨基酸不仅识别抗原，还与位于CDR附近的FR的氨基酸配位，参与CDR的环(loop)结构的维持，因此优选利用包含与邻近要移植的CDR的FR的氨基酸序列同源性高的氨基酸序列的人FR。

与来源于非人动物的FR同源性高的公知的人FR的检索，可以利用例如能够通过互联网利用的对抗体特化的检索系统(http://www.bioinf.org.uk/abysis/)来进行。为了与这样得到的人FR的序列一致，可以在非人来源的抗体的CDR以外的序列中导入变异。或者，在能够获得编码通过检索得到的人FR的氨基酸序列的基因(cDNA)的情况下，也可以在其序列中导入非人来源CDR。变异的导入等可以使用核酸合成、定点诱变等本领域公知的技术进行。

通过定性或定量地测定、评价这样制作的人源化抗体对抗原的结合活性，能够适当选择介由CDR连接时该CDR能形成良好的抗原结合部位那样的来源于人的抗体的FR。另外根据需要，还可以按照Sato,K.et al.,Cancer Res,1993,53,851-856等所记载的方法替换FR的氨基酸残基使得人源化抗体的CDR形成适当的抗原结合部位，进而通过测定并评价替换了该氨基酸的变异型抗体对抗原的结合活性，可以选择具有所期望的性质的变异FR序列。

本发明中抗体的“功能性片段”是指作为抗体的一部分(部分片段)的、特异性地识别来源于人的Eva1蛋白质的片段。具体可列举Fab、Fab’、F(ab’)2、可变区片段(Fv)、二硫键Fv、单链Fv(scFv)、sc(Fv)2、双特异性抗体、多特异性抗体、和它们的聚合物等。

这里“Fab”是指包含一条轻链和重链一部分的免疫球蛋白的一价抗原结合片段。可以通过抗体的木瓜蛋白酶消化得到，另外，可以通过重组方法得到。“Fab’”包含抗体的铰链区的1个或更多半胱氨酸，由于重链CH1结构域的羧基末端的少量残基的添加而与Fab不同。“F(ab’)2”是指包含两轻链和两重链的部分的免疫球蛋白的二价抗原结合片段。

“可变区片段(Fv)”是具有完全的抗原识别和结合部位的最小的抗体片段。Fv是重链可变区和轻链可变区通过非共价键强连接而成的二聚体。“单链Fv(scFv)”包含抗体的重链可变区和轻链可变区，这些区域存在于单一的多肽链。“sc(Fv)2”是2个重链可变区和2个轻链可变区通过接头等结合形成单链而成的。“双特异性抗体”是具有二个抗原结合部位的小的抗体片段，该片段在同一多肽链中包含与轻链可变区结合的重链可变区，各区域与其他链的互补区域形成配对。“多特异性抗体”是对至少2个不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体。例如，可以通过二个重链具有不同特异性的二个免疫球蛋白重链/轻链对的同时表达来制备。

本发明的抗体包含在不减少期望的活性(对抗原的亲和性、ADCC活性、CDC活性、抗癌活性、和/或其他生物学的特性)的前提下其氨基酸序列被修饰的抗体。这样的氨基酸序列变异体例如，可以通过对编码后述的B2E5-48抗体、C3抗体或A5D11-10抗体的抗体链的DNA导入变异、或通过肽合成来制作。这样的修饰包含例如，抗体的氨基酸序列内的残基的替换、缺失、添加和/或插入。关于抗体的氨基酸序列改变的部位，只要与改变之前的抗体具有同等的活性，就既可以是抗体的重链或轻链的恒定区，还可以是可变区(FR和CDR)。虽然认为除了CDR以外的氨基酸的改变对与抗原的结合亲和性的影响相对少，但现在改变CDR的氨基酸而筛选对抗原的亲和性提高了的抗体的方法是公知的(PNAS，102：8466-8471(2005)、Protein Engineering,Design&Selection,21：485-493(2008)、国际公开第2002/051870号、J.Biol.Chem.,280:24880-24887(2005)、Protein Engineering,Design&Selection,21：345-351(2008)、MAbs.Mar-Apr；6(2)：437-45(2014))。另外，现在通过利用综合计算化学系统等(例如，Molecular Operating Enviroment、加拿大CCG公司制)也能够模型化出对抗原的亲和性提高了的抗体(例如，参照http://www.rsi.co.jp/kagaku/cs/ccg/products/application/protein.html)。进而，如Protein Eng Des Sel.2010Aug；23(8):643-51所记载的那样，在对抗原的亲和性中，已知重链可变区的CDR1和轻链可变区的CDR3不参与的例子。另外同样地，Molecular Immunology 44:1075-1084(2007))报告了大部分抗体中轻链可变区的CDR2不参与对抗原的亲和性。这样，在抗体对抗原的亲和性中，即使不需要全部的重链可变区和轻链可变区的各CDR1～3，也能够发挥同等的活性。实际上，Biochem Biophys Res Commun.2003Jul 18；307(1):198-205、J Mol Biol.2004Jul 9；340(3):525-42、J Mol Biol.2003Aug 29；331(5):1109-20中报告了通过保持原抗体的至少1个CDR而维持对抗原的亲和性的例子。因此，本发明的抗体也包含含有后述的B2E5-48抗体、C3抗体或A5D11-10抗体的至少1个CDR的抗体。

另外，对于本发明的抗体，改变的氨基酸数优选为10个氨基酸以内，更优选5个氨基酸以内，最优选3个氨基酸以内(例如，2个氨基酸以内、1个氨基酸)。氨基酸的改变优选为保守的替换。本发明中“保守的替换”是指用具有化学上同样的侧链的其他氨基酸残基替换。具有化学上同样的侧链的氨基酸残基的组是本发明的所述的技术领域中熟知的。例如，可以以酸性氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)、碱性氨基酸(赖氨酸·精氨酸·组氨酸)、中性氨基酸中具有烃链的氨基酸(甘氨酸·丙氨酸·缬氨酸·亮氨酸·异亮氨酸·脯氨酸)、具有羟基的氨基酸(丝氨酸·苏氨酸)、含硫氨基酸(半胱氨酸·甲硫氨酸)、具有酰胺基的氨基酸(天冬酰胺·谷氨酰胺)、具有亚氨基的氨基酸(脯氨酸)、具有芳香基的氨基酸(苯丙氨酸·酪氨酸·色氨酸)进行分类。

另外，即使是具有包含改变后的氨基酸序列与后述的B2E5-48抗体、C3抗体或A5D11-10抗体的抗体链在氨基酸序列水平上有80％以上的同源性的氨基酸序列的抗体链的抗体，只要与改变前的抗体具有同等的活性，就也包含在本发明的抗体中。作为所述同源性，可以是至少80％，但优选85％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上(例如，96％以上、97％以上、98％以上、99％以上)。另外，序列的同源性可以利用BLASTP(氨基酸水平)的程序(Altschul et al.J.Mol.Biol.,215:403-410,1990)来确定。该程序基于Karlin和Altschul的算法BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:2264-2268,1990、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5873-5877,1993)。在通过BLASTP分析氨基酸序列时，参数例如为score＝50，wordlength＝3。另外，在使用Gapped BLAST程序分析氨基酸序列时，可以如Altschul等(Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997)所记载的那样进行。在使用BLAST和Gapped BLAST程序时使用各程序的默认参数。这些分析方法的具体方法是公知的。

另外，“具有同等的活性”是指对抗原的亲和性、ADCC活性、CDC活性或抗癌活性与对象抗体(代表地为B2E5-48抗体、C3抗体、A5D11-10抗体)同等(例如，70％以上、优选80％以上、更优选90％以上)。

另外，本发明的抗体的改变例如可以是使糖基化部位的数量或位置变化等的抗体的翻译后加工的改变。由此，能够提高例如抗体的ADCC活性。抗体的糖基化典型地为N-键合或O-键合。抗体的糖基化较大地依赖于用于表达抗体的宿主细胞。糖基化图谱的改变可以通过参与糖生产的特定酶的导入或缺失等的公知的方法来进行(日本特开2008-113663号公报、美国专利第5047335号、美国专利第5510261号、美国专利第5278299号、国际公开第99/54342号)。进而，本发明中，为了增加抗体的稳定性等目的，也可以通过将可被脱酰胺化的氨基酸或与可被脱酰胺化的氨基酸相邻的氨基酸替换成其他氨基酸来抑制脱酰胺化。另外，将谷氨酸替换成其他氨基酸也能够增加抗体的稳定性。本发明还提供这样经稳定化后的抗体。

本发明的抗体如后述的实施例所示，可以通过杂交瘤法制作，还可以通过重组DNA法制作。作为杂交瘤法，代表性地可列举Kohler和Milstein的方法(Kohler&Milstein,Nature,256:495(1975))。该方法中的细胞融合工序中使用的抗体产生细胞是经抗原(来源于人的Eva1蛋白质、其部分肽、在来源于人的Eva1蛋白质或其部分肽上融合有Fc蛋白质等的蛋白质、或表达它们的细胞等)免疫的动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猴、山羊)的脾细胞、淋巴细胞、外周血白细胞等。也可以使用在培养基中使抗原与从未免疫的动物预先分离的上述细胞或淋巴细胞等作用而得的抗体产生细胞。作为骨髓瘤细胞可以使用公知的各种细胞株。抗体产生细胞和骨髓瘤细胞只要它们能够融合，则也可以是不同动物种起源的，但优选为同一动物种起源的。杂交瘤例如通过由经抗原免疫的小鼠得到的脾细胞、与小鼠骨髓瘤细胞之间的细胞融合产生，然后通过筛选，可以获得产生对来源于人的Eva1蛋白质特异的单克隆抗体的杂交瘤。针对来源于人的Eva1蛋白质的单克隆抗体可以通过培养杂交瘤获得，另外，可以从施与了杂交瘤的哺乳动物的腹水获得。

重组DNA法是从杂交瘤、B细胞等克隆编码上述本发明的抗体的DNA，插入适当载体中，将其导入宿主细胞(例如，HEK细胞等哺乳类细胞株、大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞等)，使本发明的抗体作为重组抗体产生的方法(例如，P.J.Delves,AntibodyProduction:Essential Techniques,1997WILEY、P.Shepherd and C.Dean MonoclonalAntibodies,2000OXFORD UNIVERSITY PRESS、Vandamme A.M.et al.,Eur.J.Biochem.192:767-775(1990))。在编码本发明的抗体的DNA的表达中，可以将编码重链或轻链的DNA分别插入表达载体并转化宿主细胞，也可以将编码重链和轻链的DNA插入单一表达载体并转化宿主细胞(参照国际公开第94/11523号公报)。本发明的抗体，可以培养上述宿主细胞，从宿主细胞内或培养液分离、纯化，以实质上纯粹且均匀的形态获得。抗体的分离、纯化可以使用通常的多肽纯化中使用的方法。如果使用转基因动物制作技术制作插入了抗体基因的转基因动物(牛、山羊、绵羊、猪等)，则也可以从该转基因动物的乳汁中大量获得来源于抗体基因的单克隆抗体。

本发明还提供上述编码本发明的抗体的DNA、包含该DNA的载体、保持该DNA的宿主细胞、和包括培养该宿主细胞并回收抗体的步骤的抗体的生产方法。

＜包含抗Eva1抗体的组合物等＞

本发明的抗体如后述的实施例所示，对来源于人的Eva1蛋白质显示高亲和性，另外发挥ADCC活性和/或CDC活性等，因此能够在与Eva1蛋白质有关的疾病的治疗或预防中利用。因此，本发明还提供以本发明的抗体作为有效成分的药物组合物(例如，以本发明的抗体作为有效成分的抗癌剂)，以及包含将治疗上或预防上有效量的本发明的抗体施与包括人在内的哺乳类的工序的与Eva1蛋白质相关的疾病(例如，癌)的治疗或预防方法。

与作为本发明的抗体的靶标的Eva1蛋白质有关的疾病只要是Eva1蛋白质的表达与其发病、症状的发展、恶化等有关的疾病即可，例如，可列举癌。

另外，作为本发明的抗体的靶标的癌只要是表达Eva1蛋白质、另外本发明的抗体能发挥ADCC活性、CDC活性、或抗癌活性的癌，就不特别限制，可列举例如，神经胶质瘤(由神经干细胞、神经系统前体细胞和神经胶质细胞产生的肿瘤，例如，多形性成胶质细胞瘤(GBM)、星形细胞瘤(astrocytoma)、髓母细胞瘤、室管膜瘤、少枝神经胶质瘤、脉络丛乳头状瘤、特别是间变星形细胞瘤、间变少枝星形细胞瘤、间变少枝神经胶质瘤)、胃癌、黑素瘤(黑色素瘤)、淋巴瘤、乳癌。另外，这样的癌可以是原发性的，也可以是转移性的，进而本发明所涉及的癌还包含癌干细胞。

以本发明的抗体作为有效成分的药物组合物可以以含有本发明的抗体和任意成分、例如生理盐水、葡萄糖水溶液或磷酸盐缓冲液等的组合物的形态使用。本发明的药物组合物根据需要可以以液体或冷冻干燥的形态制形化，还可以任意含有药学上容许的担载体或介质，例如，稳定剂、防腐剂、等渗剂等。

作为药学上容许的担载体，在冷冻干燥的制剂的情况下，可列举甘露糖醇、乳糖、蔗糖、人白蛋白等为例，在液状制剂的情况下，可列举生理盐水、注射用水、磷酸盐缓冲液、氢氧化铝等为例，但不限于这些。

药物组合物的施与方法根据施与对象的年龄、体重、性别、健康状态等不同而不同，可以通过非经口施与(例如，静脉施与、动脉施与、局部施与)、经口施与的任一施与途径施与。优选的施与方法为非经口施与，更优选静脉施与。药物组合物的施与量可以根据患者的年龄、体重、性别、健康状态、症状的发展程度和施与的药物组合物的成分不同而变动，但一般在静脉内施与的情况，成人为每1kg体重1日0.1～1000mg、优选1～100mg。

此外，在治疗对象为脑的情况下，血脑屏障(BBB)的存在屡次成为问题。然而，由于患有多形性成胶质细胞瘤(GBM)等的患者在发生血管新生的脑肿瘤内血管中不形成正常脑中的BBB，因而可以将所述抗体通过静脉注射等送达GBM。

另外，即使在BBB发挥功能的情况下，也可以通过回避该功能来施与本发明的抗体。例如，通过定位脑手术方法插入插管等，经由该插管对神经胶质瘤等进行直接施与的方法。另外，可列举将包含本发明的抗体的药物传递系统(Drug delivery system)埋入脑内的方法(Gill et al.,Nature Med.9:589-595(2003)等)。进而，包括利用包含编码本发明的抗体的基因的载体进行的跨越BBB的神经元转染(美国专利申请公开第2003/0083299号等)。

另外，除了上述回避BBB的方法之外，还可以利用使本发明的抗体含有或结合血脑屏障透过物质而施与的方法。作为血脑屏障透过物质，可列举例如，结合了可与BBB的血管内皮上的受体结合的抗体结合片段的核糖体(美国专利申请公开第20020025313号等)、低密度脂蛋白颗粒(美国专利申请公开第20040204354号等)、载脂蛋白E(美国专利申请公开第20040131692号等)、转铁蛋白(美国专利申请公开第2003/0129186号等)、来源于狂犬病病毒的由29个氨基酸组成的糖蛋白质(参照Kumar等，Nature，2007年7月5日、448卷、39～43页)。

进而，通过控制受体或通道的活性施与本发明的抗体，也能够使该抗体通过BBB而送达神经胶质瘤等。作为该方法，可列举例如，使用糖皮质激素阻断药增加血脑屏障的透过性(美国专利申请公开第2002/0065259号、美国专利申请公开第2003/0162695号、美国专利申请公开第2005/0124533号等)，激活钾通道(美国专利申请公开第2005/0089473号等)、抑制ABC药物转运蛋白(美国专利申请公开第2003/0073713号等)、将本发明的抗体阳离子化(美国专利第5,004,697号等)。

以上，以神经胶质瘤等脑中的疾病作为对象进行了说明，但该疾病中的本发明的抗体的施与方法不限于这些，另外，对于其他疾病，也与上述脑中的疾病同样地，本领域技术人员能够适当选择适合该疾病的公知方法，使本发明的抗体作用于患部。

＜用于导弹疗法的药剂＞

以上对于本发明的抗体的优选实施方式进行了说明，但本发明的抗体不限于上述实施方式。由于作为本发明的抗体的靶标的Eva1蛋白质在癌、特别是癌干细胞中高表达，因而，结合了例如光敏物质、毒性肽、化疗剂或放射性化学物质等细胞伤害性物质的本发明的抗体在所谓导弹疗法中是有用的。

作为与本发明的抗体结合而发挥细胞伤害活性的功能的光敏物质，可以是被光照射激活从而其自身变成显示细胞伤害性(细胞毒性)的形态的物质，另外也可以是产生细胞伤害性物质(细胞毒性物质)的物质，例如，二氢卟酚(chlorins)、二氢卟酚e6、卟吩姆钠、他拉泊芬钠、维替泊芬、和它们的前体和衍生物。作为毒性肽，可列举例如，皂草素(サポリン)、篦麻毒素、志贺毒素等核糖体钝化蛋白(RIP)。作为化疗剂也不特别限制，可列举例如，替莫唑胺(Temozolomide)、博来霉素、顺铂、伊立替康、地塞米松、泰素(taxol)。另外，放射性化学物质是指包含放射性同位素的化学物质，作为含有的放射性同位素不特别限定，可列举例如，³²P、¹⁴C、¹²⁵I、³H、¹³¹I、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re。

另外，这样的细胞伤害性物质也可以与1种或2种以上抗体结合，细胞伤害性物质与抗体的结合可以适当选择公知的方法进行。例如，光敏物质、化疗剂等低分子化合物可以利用共价键或非共价键与抗体结合。另外，毒素肽等可以通过基因工程学方法与抗体结合。此外，这样的抗体的修饰方法已经确立。

＜诊断方法、诊断药＞

另外，本发明的抗体不限于上述的治疗方法、预防方法、和用于这些方法的药剂的方式，也可以作为诊断方法、和用于该方法的药剂利用。

作为本发明的诊断方法的具体例之一，可列举包括使用本发明的抗体检测从受试者分离的样本中的Eva1蛋白质的表达的工序的、与Eva1蛋白质相关的疾病的诊断方法。

作为本发明所涉及的样本，只要是可能包含Eva1蛋白质的样本就不特别限制，可列举例如，组织、细胞、血液、间质液、血浆、血管外液、脑脊液、滑液、胸膜液、血清、淋巴液、唾液、尿。另外，不仅这样的从人体采集的组织或细胞，而且固定化有它们的标本或细胞的培养液等也包含在本发明所涉及的样本中。

本发明中，在样本中检测到Eva1蛋白质的情况下，以其水平作为指标诊断所述疾病。具体地，在与健常者等阴性对照相比样本中检测到的Eva1蛋白质的量较多的情况下，显示受检者患有该疾病、或将来患病的可能性高。

本发明中，Eva1蛋白质可以通过使用本发明的抗体的免疫学方法检测。作为这样的免疫学方法，可列举例如，免疫组织化学法、酶联免疫吸附法(ELISA)、放射免疫测定、荧光免疫测定、蛋白质印迹(Western blot)、免疫沉淀法。

另外，在本发明的诊断方法中，还可以利用本发明的抗体在生物体内检测表达Eva1蛋白质的细胞。为了追踪施与生物体内的抗体，可以使用被进行了可检测标记的抗体。该方法例如包括将结合了标记物质的本发明的抗体施与受检者的工序，和检测该标记物质是否聚集的工序。例如，作为标记物质，使用放射性同位素、荧光物质或发光物质，通过追踪经它们标记的抗体在生物体中的行为，能够在生物体内检测上述细胞。在作为标记物质使用放射性同位素的情况下，通过追踪其放射活性，能够将抗体的定位图像化。另外，经荧光物质、发光物质标记的抗体可以利用内窥镜、腹腔镜进行观察。

为了在生物体内检测细胞，作为标记抗体的放射性同位素，可以利用正电子释放核素。例如，可以用⁶⁴Cu、¹⁸F、⁵⁵Co、⁶⁶Ga、⁶⁸Ga、⁷⁶Br、⁸⁹Zr和¹²⁴I那样的正电子释放核素标记抗体。利用这些正电子释放核素的抗体的标记可以使用公知的方法(Nucl Med Biol.1999；26(8)：943-50.、J Nucl Med.2013；54(11)：1869-75.等)。另外，经正电子释放核素标记的抗体施与人之后，通过PET(正电子断层摄影装置)从体外测量由放射性核素放射的放射线，通过计算机X射线断层摄影(computer tomography)的方法转换成图像。

这样，由于结合了所述标记物质的本发明的抗体在上述的诊断方法中有用，因而本发明还提供结合了放射性同位素、荧光物质或发光物质的本发明的抗体。

实施例

以下，基于实施例更具体地说明发明，但本发明不限于以下实施例。

(实施例1)

通过以下所记载的方法制作对人Eva1蛋白质显示高亲和性的来源于小鼠的单克隆抗体(后述的B2E5-48抗体、C3抗体、A5D11-10抗体)。进而确定这些抗体的可变区的氨基酸序列，并且鉴定互补决定区(CDR1～3)。另外，对于B2E5-48抗体和C3抗体，以这些抗体为基础制作保持来源于人的恒定区的嵌合抗体。

＜产生抗Eva1抗体的杂交瘤的制备＞

为了获得亲和性高的抗Eva1抗体，应制备其抗原，首先，使EK293细胞表达在作为人Eva1蛋白质的细胞外结构域的由27～150位的氨基酸组成的区域融合了免疫球蛋白的Fc部位的蛋白质(以下也称为“Fc融合Eva1”)。

即首先，将编码所述区域的DNA插入pINFUS-EmIgG2bFc载体(InvivoGen公司制)中，制作编码Fc融合Eva1的pINFUSE-hEva1-mIgG2bFc载体。接着，将质粒载体转染HEK293细胞，使Fc融合Eva1一过性表达。接下来，将这样得到的HEK293细胞的培养上清1L用亲和柱rProtein A Sepharose(GE health care公司制)处理，使Fc融合Eva1吸附后，为了除去非特异的蛋白而将柱用20mM Tris-HCl(pH7.5),300mM NaCl的溶液洗涤。接下来，使用100mM精氨酸溶液(pH4.0～2.0)使上述柱中的pH从中性(pH4.0)阶段性地变到酸性侧(pH2.0)，使Fc融合Eva1溶出。溶出后立即加入溶出体积的1/10的1M Tris-HCl(pH9.0)调整成接近中性的pH。接下来，将溶出流分进行蛋白电泳(SDS-PAGE)，鉴定出Fc融合Eva1溶出了的流分，浓缩该流分的蛋白质。然后，在20mM Tris-HCl(pH8.0),150mM NaCl,2mM DTT的溶液下使用HiLoad 16/60superdex200(GE health care公司制)进行超滤，最终作为抗原蛋白质获得2.92mg的纯化物。

接着，将这样制备而得的抗原蛋白质与佐剂一起免疫小鼠脚底。然后，从免疫后的小鼠采集所属淋巴，分离淋巴细胞。接下来，使该淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞P3U1融合，制备杂交瘤。使这样制备而得的1000个杂交瘤的培养上清中的抗体与强制表达人Eva1蛋白质的2B4细胞反应，从而首先筛选出产生显示阳性反应的抗体的61个杂交瘤。然后，挑选产生显示更强的亲和性的抗体的20个杂交瘤。进而，通过有限稀释法最终确立了28个克隆(包含来源于同一亲株的4个克隆)。

＜通过表面等离子体共振分析筛选抗Eva1抗体＞

为了从上述28个杂交瘤中挑选产生抗原亲和性更高的抗体的杂交瘤，进行表面等离子体共振分析(surface plasmon resonance assay)装置Biacore，对于各抗体(以下也称为“候选抗体”)计算出K_D 值等。具体地，首先，将捕获小鼠IgG的抗体固定化在涂布了葡聚糖的传感芯片(CM5，GE health care公司制)上。接下来，介由该抗体将各候选抗体捕获到传感芯片上之后，流过作为抗原的Eva1蛋白质。此外，在流过抗原时，使用10mM-Tris-HCl(pH7.5),150mM-NaCl,3mM-EDTA(pH8.0)溶液，另外作为用于使抗原从候选抗体解离的溶液(捕获的候选抗体复苏溶液)使用10mM甘氨酸溶液(pH1.7)。然后，使用这样的溶液，通过Biacore检测各候选抗体与抗原的结合反应、解离反应，使用附带软件进行分析，从而计算出解离常数(K_D )、结合速率常数(k_a )、解离速率常数(k_d )。其结果从由上述28个杂交瘤产生的抗体中，筛选出显示高亲和性(K_D 的值小)、且解离慢(k_d 的值小)的4种高级抗体(C3抗体、B1E4-32抗体、B2E5-48抗体、A5D11-10抗体)。此外，分析结果表明，这些抗体中C3抗体与B1E4-32抗体是同一起源的抗体，因此，以后的分析中以C3抗体、B2E5-48抗体和A5D11-10抗体作为对象。

将这3种抗体针对人Eva1蛋白质的K_D 、k_a 和k_d 示于表1。

表1

另外，对于这些抗体使用表面等离子体共振法进行了竞争实验。具体地，将捕获小鼠抗体的抗体固定化在涂布了葡聚糖的CM5传感芯片上，首先流过抗Eva1小鼠单克隆抗体，将这些抗Eva1抗体分别捕获在传感芯片上。接下来，流过人Eva1蛋白质，使其被上述抗Eva1抗体捕捉。进而，针对形成在该芯片上的由各抗Eva1抗体与人Eva1蛋白质组成的复合体流过与该抗Eva1抗体不同克隆的抗Eva1抗体，从而分析人Eva1蛋白质上各抗体之间的识别部位中的有无竞争。

其结果表明C3抗体与A5D11-10抗体彼此竞争。因此提示，两者在人Eva1蛋白质上的识别部位完全或部分地一致。另外，B2E5-48抗体与C3抗体和A5D11-10抗体任一者都不竞争，由此表明B2E5-48抗体与这些抗体识别完全不同的表位。

另外，Eva1蛋白质是在小鼠与人的种间高度保守的蛋白质，彼此序列上不同的氨基酸仅为12个氨基酸，具有高同源性(86.99％)。因此，为了分析各抗体的种特异性，使用表面等离子体共振法，对来源于人的Eva1蛋白质和来源于小鼠的Eva1蛋白质分别评价亲和性。其结果表明，C3抗体和A5D11-10抗体对人Eva1蛋白质和小鼠Eva1蛋白质双方均显示亲和性。此外，关于C3抗体，对人Eva1蛋白质的亲和性与对小鼠Eva1蛋白质的亲和性相比，K_D 值强10-¹左右。另外表明，B2E5-48抗体仅与人Eva1蛋白质特异性地结合，完全不与小鼠Eva1蛋白质结合。

进而，型检查的结果是，B2E5-48抗体为小鼠IgG2b，C3抗体为小鼠IgG1。

＜B2E5-48抗体的表位分析＞

虽然人Eva1与小鼠Eva1的同源性极高，但如上所述，B2E5-48抗体仅特异性地识别人Eva1蛋白质，与小鼠Eva1蛋白质未发现结合性。因此，由该结果提示，B2E5-48抗体可能识别在人Eva1蛋白质与小鼠Eva1蛋白质之间不保守的12个氨基酸的任一个。

于是，对于在Eva1蛋白质中在人与小鼠之间不保守、且侧链向着表面的氨基酸，制作了将人Eva1的该氨基酸替换为小鼠的对应氨基酸而成的变异体。即，制作了(A43V，S96V，Q85R)、(R33G，V34A，V134L，I135V，E137T)、(L68R，P72R)、(I81M)的共计4种人Eva1变异体，利用表面等离子体共振法进行了结合实验。

其结果是，这些变异体中，仅对(L68R和P72R)的双变异体没有发现B2E5-48抗体的结合性。因此提示，包含该68位和72位的氨基酸的区域是B2E5-48抗体的表位。为了进一步压缩发挥作用的氨基酸，对于各个部位制作单变异体(L68R或P72R)，利用表面等离子体共振法进行了结合实验。其结果是，对P72R变异体，B2E5-48抗体的结合性完全丧失。另一方面，对L68R变异体，维持着与野生型同样的K_D 值。因此表明，至少72位的脯氨酸是包含在B2E5-48抗体的表位中的识别氨基酸。

＜A5D11-10抗体的表位分析＞

对于A5D11-10抗体的Fab与人Eva1蛋白质的复合体，以

的分辨能力确定其晶体结构。由该结构表明，A5D11-10抗体识别人Eva1蛋白质的30位的酪氨酸、31位的苏氨酸、33位的精氨酸、46位的赖氨酸、48位的苏氨酸、49位的苯丙氨酸、51位的丝氨酸、102位的谷氨酸、103位的精氨酸、104位的酪氨酸。接着，对于由上述结构分析的结果认为对于结合重要的人Eva1蛋白质上的30位的酪氨酸、46位的赖氨酸、102位的谷氨酸、103位的精氨酸、104位的酪氨酸，制作了将各氨基酸替换为丙氨酸的变异体，使用它们利用表面等离子体共振法进行结合实验，确认A5D11-10抗体的表位，并分析该抗体所识别的各氨基酸在结合中的重要性。其结果是，对Y30A变异体，A5D11-10抗体的结合性丧失。上述结构分析的结果表明，该30位的酪氨酸与A5D11-10抗体的重链CDR3的103位的甘氨酸和104位的甘氨酸的主链形成疏水键。另外认为侧链部分与自身的50位的丝氨酸形成氢键，有助于结构维持。因此认为，由于替换成丙氨酸，通过酪氨酸侧链的环结构部分形成的疏水键完全被切断，失去了有助于稳定化的氢键，从而A5D11-10抗体对人Eva1蛋白质的结合性也完全丧失。另外，K46A变异体和Y104A变异体中，K_D 值与人Eva1蛋白质(野生型)相比提高10^-2左右，确认了亲和性降低。上述结构分析的结果是，该46位的赖氨酸的侧链与轻链CDR3的天冬氨酸的侧链和主链双方以氢键结合，与轻链CDR1的32位的酪氨酸形成分子间相互作用。另外关于上述104位的酪氨酸，通过侧链部分与重链CDR1的32位的精氨酸的侧链和主链双方形成氢键，与重链CDR3的102位天冬氨酸、103位甘氨酸形成分子间相互作用。因此认为，由于所述丙氨酸替换，数个键被切断，作为其结果K_D 值变大10^-2。进而，在晶体结构中102位的谷氨酸和103位的精氨酸与抗体侧连接着多个键，但对它们各自的丙氨酸替换体，确认了K_D 值上升25倍左右。上述结构分析的结果是，102位的谷氨酸与A5D11-10抗体的重链CDR2的57位的丝氨酸的侧链和主链分别连接着氢键，并且与55位的甘氨酸、56位的甘氨酸的主链也连接着氢键。另一方面，由结构分析表明，103位的精氨酸通过A5D11-10抗体的重链CDR以外的侧链、59位的天冬氨酸形成氢键而被固定，并且与53位的色氨酸之间通过分子间相互作用而生成键，综合地生成强结合。因此，上述K_D 值的上升为25倍左右，推测完全丧失结合是因为将103位的精氨酸替换为丙氨酸的变异体中虽然弱但仍然与重链CDR2的53位的色氨酸之间保持着分子间力。另外，在将形成多个氢键的人Eva1蛋白质上的102位的谷氨酸替换为丙氨酸的变异体中，虽然预想失去了全部氢键，但K_D 值上升25倍，这说明该侧链对抗原-抗体结合的贡献低。

＜C3抗体的表位分析＞

如上所述，认为C3抗体在人Eva1蛋白质上的识别部位完全或一部分与A5D11-10抗体竞争。于是，与上述A5D11-10抗体的表位分析同样地，使用丙氨酸变异体利用表面等离子体共振法进行了结合实验。其结果表明，C3抗体识别人Eva1蛋白质中的46位的赖氨酸、96位的丝氨酸和103位的精氨酸。C3抗体所识别的人Eva1蛋白质上的46位的赖氨酸、96位的丝氨酸和103位的精氨酸也是A5D11-10抗体的识别氨基酸，与这2种抗体在与人Eva1蛋白质的结合中竞争的事实一致。然而，人Eva1蛋白质中的Y104A变异显著降低A5D11-10抗体的结合性，但不影响C3抗体的结合性。另一方面，S96A变异不影响A5D11-10抗体的结合性，但影响与C3抗体的结合，由此认为这些抗体虽然识别部位部分重叠，但识别机制不同。

＜编码抗Eva1抗体的基因的克隆和序列确定＞

对于B2E5-48和C3，由各杂交瘤按照常规方法提取RNA。然后，以它们为模板使用SMART或RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech公司制)进行5’RACE PCR，扩增VHDHJH区域的抗体重链可变区(VH链)和VLJL区域的轻链可变区(VL链)的cDNA。

另外，对于A5D11-10，由其杂交瘤按照常规方法提取RNA，使用AccuScriptpfuUltra II RT-PCR试剂盒(Agirent Technologies公司制)进行RT-PCR，扩增编码该抗体的DNA。在RT-PCR中，使用以作为可变区的开始部分特征地出现的AA序列为基础设计的10种混合的Primer mix作为Fw侧的引物，Rev侧的引物使用与在上述RACE中也使用的相同的引物。

然后，对于这样制备的编码各抗体的cDNA进行测序分析。另外，基于这样得到的序列，按照Kabat编号法确定CDR和FR。进而，将所得的序列进行NCBI的IgBLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)，结果表明，编码B2E5-48抗体的基因与重链基因IGHV1S81＊02/IGHD1-2＊01/IGHJ2＊01和轻链基因IGKV4-68＊01/IGKJ5＊01同源性最高。另外表明，编码C3抗体的基因与重链基因IGHV5-12-2＊01/IGHD3-1＊01、IGHD3-2＊01/IGHJ4＊01和轻链基因IGKV6-32＊01/IGKJ1＊01同源性最高。表明编码A5D11-10抗体的基因与重链基因IGHV2-2＊02/IGHD2-9＊01/IGHJ4＊01和轻链基因IGKV10-96＊01/IGKJ1＊01同源性最高。

对于B2E5-48抗体的重链可变区，与上述同源性最高的生殖细胞系列基因相比，13个碱基有替换，其结果在氨基酸序列中，31位丝氨酸变为天冬酰胺、39位谷氨酰胺变为亮氨酸、45位亮氨酸变为苯丙氨酸、54位丝氨酸变为苏氨酸、57番精氨酸变为甘氨酸、59位天冬酰胺变为天冬氨酸、66位丝氨酸变为精氨酸、86位脯氨酸变为亮氨酸、97位丙氨酸变为苏氨酸。另外，对于轻链可变区，与上述同源性最高的生殖细胞系列基因相比，5个碱基有替换，其结果在氨基酸序列中，18位赖氨酸变为精氨酸、21位甲硫氨酸变为亮氨酸、30位丝氨酸变为甘氨酸、40位精氨酸变为甘氨酸、49位亮氨酸变为缬氨酸。

对于C3抗体的重链可变区，与上述同源性最高的生殖细胞系列基因相比，6个碱基有替换，其结果在氨基酸序列中，52位丝氨酸变为苏氨酸、53位天冬酰胺变为苏氨酸、55位甘氨酸变为丙氨酸、57位丝氨酸变为精氨酸。

对于A5D11-10抗体的重链可变区，与上述同源性最高的生殖细胞系列基因相比，2个碱基有替换，其结果在氨基酸序列中，5位的谷氨酸替换为谷氨酰胺、30位的精氨酸替换为丝氨酸。另外，对于轻链可变区，与上述同源性最高的生殖细胞系列基因相比，4个碱基有替换，其结果在氨基酸序列中，68位的精氨酸替换为甘氨酸、69位的异亮氨酸替换为苏氨酸。

将这样得到的经鉴定的B2E5-48抗体、C3抗体和A5D11-10抗体的可变区和CDR的氨基酸序列等用以下所示的序列号在序列表中显示。另外，图1～3中也显示这些抗体的可变区和CDR的氨基酸序列。此外，如上所述，对于A5D11-10，与其他2个克隆不同，没有通过5’RACE PCR分析确定序列，因此对于信号序列未鉴定。

编码B2E5-48抗体的信号肽和L链(轻链)可变区的碱基序列：序列号1

B2E5-48抗体的信号肽和L链可变区的氨基酸序列：序列号2

B2E5-48抗体的L链可变区的氨基酸序列：序列号3

B2E5-48抗体的L链CDR1～3的氨基酸序列：序列号4～6

编码B2E5-48抗体的信号肽和H链(重链)可变区的碱基序列：序列号7

B2E5-48抗体的信号肽和H链可变区的氨基酸序列：序列号8

B2E5-48抗体的H链可变区的氨基酸序列：序列号9

B2E5-48抗体的H链CDR1～3的氨基酸序列：序列号10～12

编码C3抗体的信号肽和L链(轻链)可变区的碱基序列：序列号13

C3抗体的信号肽和L链可变区的氨基酸序列：序列号14

C3抗体的L链可变区的氨基酸序列：序列号15

C3抗体的L链CDR1～3的氨基酸序列：序列号16～18

编码C3抗体的信号肽和H链(重链)可变区的碱基序列：序列号19

C3抗体的信号肽和H链可变区的氨基酸序列：序列号20

C3抗体的H链可变区的氨基酸序列：序列号21

C3抗体的H链CDR1～3的氨基酸序列：序列号22～24

编码A5D11-10抗体的L链可变区的碱基序列：序列号25

A5D11-10抗体的L链可变区的氨基酸序列：序列号26

A5D11-10抗体的L链CDR1～3的氨基酸序列：序列号27～29

编码A5D11-10抗体的H链可变区的碱基序列：序列号30

A5D11-10抗体的H链可变区的氨基酸序列：序列号31

A5D11-10抗体的H链CDR1～3的氨基酸序列：序列号32～34。

＜抗体的纯化＞

将分别产生C3抗体、B2E5-48抗体和A5D11-10抗体的杂交瘤移植到裸小鼠，从该小鼠采集腹水。接下来，将腹水用4M硫酸铵处理，将所得的沉淀透析、可溶化后，使用蛋白G柱纯化这些抗体(以下，为了与下述嵌合抗体相区别，也称为C3小鼠抗体、B2E5-48小鼠抗体、A5D11-10小鼠抗体)。

＜嵌合抗体的制作＞

如下制作将上述来源于小鼠的C3抗体和B2E5-48抗体的恒定区替换为来源于人的抗体的恒定区而成的嵌合抗体。

将人IgG1抗体的重链恒定区的cDNA、和人IgCκ抗体的轻链恒定区的cDNA分别插入pcDNA3.4载体(Life Technologies公司制)中。接下来，在前者的载体中插入经PCR扩增的编码B2E5-48抗体或C3抗体的重链可变区的cDNA，在后者的载体中插入经PCR扩增的编码B2E5-48抗体或C3抗体的轻链可变区的cDNA。然后，将这样制作的2种载体一起导入Expi293F细胞(Life Technologies公司制)中，用Expi293表达培养基(Life Technologies公司制)在37℃、8％CO₂的条件下搅拌培养7天。然后，从这些培养上清回收、纯化嵌合抗体(以下也称为C3嵌合抗体、B2E5-48嵌合抗体)。纯化使用蛋白G柱，在酸性条件(100mM精氨酸溶液、pH 4.0-2.0)下阶段性地溶出，立即用1/10体积的1M Tris-HCl(pH9.0)进行中和。然后对20mM Tris-HCl(pH8.0),150mM NaCl的溶液1L进行透析、浓缩。

另外，对于B2E5-48嵌合抗体，与上述的小鼠抗体同样地，利用Biacore检测与抗原的结合反应、解离反应，计算出解离常数(K_D )、结合速率常数(k_a )、解离速率常数(k_d )。将所得的结果示于上述表1。

(实施例2)

对于如上所述制备的、对人Eva1蛋白质显示高亲和性的小鼠抗体、和嵌合抗体，通过以下所记载的方法分析ADCC活性、CDC活性、体内(in vivo)的抗肿瘤活性。

＜ADCC活性分析＞

对于如上所述制备的、C3小鼠抗体、B2E5-48小鼠抗体、C3嵌合抗体和B2E5-48嵌合抗体，分析ADCC活性(抗体依赖的细胞毒活性)。即，对于是否通过在这些抗体的Fc部位介由Fc-γ受体结合效应细胞，从而该细胞被激活、随之能够溶解该抗体所识别的靶标细胞，通过以下的方法进行分析。

首先，作为靶标细胞，准备MKN28细胞(人胃癌细胞)、和强制表达人Eva1蛋白质的Daudi细胞(人伯基特淋巴瘤细胞)。此外，MKN28细胞中表达Eva1蛋白质，Daudi细胞中本来不表达。另外，虽未图示，但通过流式细胞术确认对强制表达人Eva1蛋白质的Daudi细胞(以下也称为“Daudi-hEva1细胞”)和MKN28细胞，C3小鼠抗体、B2E5-48小鼠抗体、C3嵌合抗体、B2E5-48嵌合抗体和A5D11-10小鼠抗体均分别能够结合。进而，Daudi细胞表达成为后述的利妥昔单抗的靶标的CD20，但MKN28细胞中不表达。

另外，在使这些靶标细胞如后所述与抗Eva1抗体接触之前，对各细胞1×10⁶细胞/mL添加钙黄绿素-AM 10μL(1mg/ml)，在37℃孵育1小时。此外，钙黄绿素-AM基本不显示荧光，但具有细胞膜透过性，通过细胞内的酯酶水解而变成钙黄绿素。钙黄绿素是膜不透过性的化合物，显示强的黄绿色荧光。如果通过ADCC活性而细胞被杀伤，则钙黄绿素从细胞内释放而发出荧光。另外，作为效应细胞，准备了导入了来源于小鼠的Fc-γ受体III基因的KHYG-1细胞(NK细胞淋巴瘤细胞)、和导入了来源于人的Fc-γ受体IIIa基因的KHYG-1细胞。

然后，在96孔板的各孔中添加上述抗体(添加浓度：0.01、0.1、1或10μg/ml)和摄入了上述钙黄绿素-AM的靶标细胞(1×10⁴个)，使其共计为100μL，在37℃、5％CO₂的条件下静置30分钟。另外，准备分别添加了同型对照抗体(小鼠IgG2b抗体、人IgG1抗体和小鼠IgG1抗体)代替上述抗体的孔、以及未添加抗体的孔作为阴性对照组。进而，抗人CD20人-小鼠嵌合抗体利妥昔单抗已知具有ADCC和CDC活性，因此准备添加了该抗体的孔作为阳性对照组。接下来，在37℃、5％CO₂的条件下孵育后，在各孔中添加效应细胞50μL(上述靶标细胞的添加数的十倍：1×10⁵个)，最终制成200μL的培养液，在37℃、5％CO₂的条件下培养3小时。然后，通过多层读取装置ALVO X3检测由于ADCC活性造成的杀伤而从细胞内释放的钙黄绿素的荧光值、从细胞内自主释放的钙黄绿素的荧光值、由于TritonX-100(最终浓度1％)造成的杀伤而从细胞内释放的钙黄绿素的荧光值。

接下来，基于所得的荧光值如下计算而求出溶解率。

溶解率(％)＝(由于ADCC活性造成的杀伤而从细胞内释放的钙黄绿素的荧光值﹣从细胞内自主释放的钙黄绿素的荧光值/由于TritonX(最终浓度1％)造成的杀伤而从细胞内释放的钙黄绿素的荧光值-从细胞内自主释放的钙黄绿素的荧光值)×100。所得的结果示于图4～7。

由图4所示的结果表明，B2E5-48小鼠抗体和C3小鼠抗体都对Daudi-hEva1细胞显示强ADCC活性。另外，C3小鼠抗体的ADCC活性与利妥昔单抗(Rituximab)为同程度，但B2E5-48小鼠抗体显示比它们更强的ADCC活性。进而，由图5所示的结果表明，即使是嵌合抗体也维持着对Daudi-hEva1细胞的强ADCC活性。

另外，由图6和7所示的结果表明，B2E5-48小鼠抗体、B2E5-48嵌合抗体、C3小鼠抗体和C3嵌合抗体对MKN28细胞也都显示ADCC活性。特别是B2E5-48小鼠抗体和B2E5-48嵌合抗体对MKN28细胞显示强ADCC活性。

另外作为靶标细胞使用上述Daudi-hEva1细胞，作为效应细胞使用导入了来源于小鼠的Fc-γ受体III基因的KHYG-1细胞，与上述同样地对于B2E5-48小鼠抗体、C3小鼠抗体和A5D11-10小鼠抗体分析了ADCC活性。所得的结果示于图8。

如图8所示，表明了A5D11-10小鼠抗体也与B2E5-48小鼠抗体和C3小鼠抗体同样地，对Daudi-hEva1细胞显示强ADCC活性。

＜CDC活性分析＞

对于如上所述制备的C3小鼠抗体、B2E5-48小鼠抗体、C3嵌合抗体和B2E5-48嵌合抗体，通过以下方法分析在补体的存在下溶解该抗体所识别的靶标细胞的活性(CDC活性：补体依赖性细胞毒活性)。

靶标细胞与ADCC活性分析同样地使用上述2种细胞，对各细胞1×10⁶细胞/mL添加钙黄绿素-AM 10μL(1mg/ml)，在37℃孵育1小时。另外，作为补体准备Low-Tox(注册商标)-M兔补体(Cedarlane Laboratories公司制、制品编码：CL3051)。

然后，在96U孔板的各孔中添加上述抗体(添加浓度：0.01、0.03、0.1、0.3、1、3或10μg/ml)和上述靶标细胞(1×10⁴个)使其共计为100μL，在37℃、5％CO₂的条件下培养30分钟。另外，准备分别添加了同型对照抗体(小鼠IgG2b抗体和人IgG1抗体)代替上述抗体的孔、以及不添加抗体的孔作为阴性对照组。进而，准备添加了利妥昔单抗的孔作为阳性对照组。接下来，在冰上的各孔中添加上述补体50μL(稀释率：1/64)，直接在37℃、5％CO₂的条件下孵育2小时。然后，将板在2000rpm、5分钟的条件下离心沉淀，从各孔采集100μL的上清，添加在96孔平井板的各孔中并静置。接下来，对于由于补体活性造成的杀伤而从细胞内释放的钙黄绿素的荧光值、从细胞内自主释放的钙黄绿素的荧光值、由于TritonX-100(最终浓度1％)造成的杀伤而从细胞内释放的钙黄绿素的荧光值，通过多层读取装置ALVO X3(Elmer公司)在ex.485nm和em.535nm的条件下检测荧光发色。接下来，基于所得的荧光值如下计算而求出溶解率。

溶解率(％)＝(由于补体活性造成的杀伤而从细胞内释放的钙黄绿素的荧光值﹣从细胞内自主释放的钙黄绿素的荧光值/由于TritonX(最终浓度1％)造成的杀伤而从细胞内释放的钙黄绿素的荧光值-从细胞内自主释放的钙黄绿素的荧光值)×100。将所得的结果示于图9～14。

由图9所示的结果表明，B2E5-48小鼠抗体对Daudi-hEva1细胞显示强CDC活性，特别是低浓度侧的活性强度显著高于利妥昔单抗。另一方面，对于C3小鼠抗体，未确认针对Daudi-hEva1细胞的CDC活性。

然而，如图10所示，C3抗体通过嵌合化而发挥CDC活性。另外，对于B2E5-48抗体，作为嵌合抗体也维持着对Daudi-hEva1细胞的CDC活性。

另一方面，由图11～14所示的结果表明，C3小鼠抗体、B2E5-48小鼠抗体、C3嵌合抗体和B2E5-48嵌合抗体任一者均未发现对MKN28细胞的CDC活性。

此外，认为B2E5-48小鼠抗体的CDC活性中的Daudi-hEva1细胞与MKN28细胞的差异是由于CDC活性的耐性。关于CDC活性的耐性，报告了在从靶标分子的抗体结合区域到细胞膜的距离变远的情况(J.Immunol..174，5706-5712，2005)，或者由于CD46、CD55、CD59等补体活性抑制细胞受体的表达而诱导了补体活性阻碍的情况(FEBS 587，645-651，2013；FEBS586，776-771，2012；Trends in Immunology，25，496-503，2004)。由这些报告推测，对MKN28细胞未发现、对Daudi-hEva1细胞发现的CDC活性阻碍可能由于MKN28细胞上的补体活性抑制细胞受体的表达。

＜使用癌转移模型小鼠的分析＞

为了评价如上所述制备的抗Eva1抗体的体内(in vivo)抗肿瘤活性，如下将该抗体施与癌转移模型小鼠进行分析。

首先，制备对小鼠接种使其转移的细胞。即，将B16黑素瘤细胞(小鼠B16/BL6黑素瘤、从RIKEN RBC领取)利用添加了10％FCS、2mM GlutaMAX、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基(全部为ナカライテスク社制)在37℃、5％CO₂条件下维持。

此外，B16黑素瘤细胞在培养条件下不表达Eva1蛋白质。考虑该性状，为了强制B16黑素瘤细胞表达Eva1蛋白质，在pCMS-EGFP(Clontech公司制)中插入编码人Eva1蛋白质的DNA，制备pCMS-EGFP-human Eva1载体。然后，使用AMAXA细胞核转染装置(Lonza公司制)将pCMS-EGFP-human Eva1或pCMS-EGFP导入B16黑素瘤细胞。接下来，以这些转化细胞为对象反复使用流式细胞术(使用的流式细胞仪：FACSAria II、BD Bioscience公司制)纯化GFP阳性细胞。以下，将导入pCMS-EGFP-human Eva1、纯化而得的细胞也称为“B16-Eva1”，另外将导入pCMS-EGFP、纯化而得的细胞也称为“B16-GFP”。

接着，以下述(1)～(4)所记载的各条件对小鼠接种上述GFP阳性B16黑素瘤细胞，进而施与如上所述制备的抗Eva1抗体，从而评价这些抗体在体内(in vivo)的抗肿瘤活性。

(1)对5～8周龄的C57BL/6小鼠尾静脉内施与1×10⁵个B16-Eva1。在该黑素瘤接种1日后开始、每隔3日在尾静脉内施与B2E5-48小鼠抗体各100μg，共计施与4次。然后，从接种黑素瘤开始13日后采集肺，测量形成的黑素瘤的集落数(n＝5)。将所得的结果示于图15和16。

(2)对5～8周龄的C57BL/6小鼠尾静脉内施与各1×10⁵个B16-GFP。在该黑素瘤接种1日后开始、每隔3日在尾静脉内施与B2E5-48小鼠抗体或B2E5-48嵌合抗体各100μg，共计施与4次。然后，从接种黑素瘤开始13日后采集肺，测量形成的黑素瘤的集落数(n＝5)。将所得的结果示于图17～20。

(3)对5～8周龄的C57BL/6小鼠尾静脉内施与各1×10⁵个B16-GFP。在该黑素瘤接种13日后开始、每隔3日在尾静脉内施与B2E5-48小鼠抗体各100μg，共计施与3次。从接种黑素瘤开始22日后采集肺，测量形成的黑素瘤的集落数(n＝5)。另外，根据形成的集落数将小鼠分组，也测量各组的只数。将所得的结果示于图21～22。

(4)对5～8周龄的C57BL/6小鼠尾静脉内施与1×10⁵个B16-Eva1。在该黑素瘤接种1日后开始、每隔4日在尾静脉内施与C3小鼠抗体各100μg，共计施与4次。然后，从接种黑素瘤开始14日后采集肺，测量形成的黑素瘤的集落数(n＝5)。

将所得的结果示于图23和24。

(5)对5～8周龄的C57BL/6小鼠尾静脉内施与1×10⁵个B16-GFP。在该黑素瘤接种1日后开始、每隔4日在尾静脉内施与C3小鼠抗体各100μg，共计施与4次。然后，从接种黑素瘤开始14日后采集肺，测量形成的黑素瘤的集落数(n＝5)。

将所得的结果示于图23和24。

此外，集落数的测量按照Nakamura K.等，Life Sciences、2002年、70卷、791～798页所记载的方法进行。另外，任一分析中均准备同型对照抗体施与组作为对照组。然后，将所得的结果使用微软公司制软件Excel通过学生t检验法进行分析计算出P值，对于与上述对照组的差异的显著性进行评价。

如图15和16所示，表明了在施与了B2E5-48小鼠抗体的小鼠中，能够显著抑制强制表达Eva1蛋白质的B16黑素瘤细胞在肺中的集落形成。另外，鉴于该结果是在黑素瘤接种1日后施与抗体而得的结果，提示了B2E5-48小鼠抗体对癌的转移发挥预防的效果。

如上所述，B16黑素瘤细胞在培养条件下不表达Eva1蛋白质。然而，由图17～20所示的结果表明，即使对于这样的不强制表达Eva1蛋白质的B16黑素瘤细胞，B2E5-48小鼠抗体和B2E5-48嵌合抗体也显著抑制肺中的集落形成。

于是，使用抗Eva1多克隆抗体通过流式细胞术分析接种了B16黑素瘤细胞的小鼠中的肺，确认该细胞中有无Eva1蛋白质。其结果未图示，但表明了在转移到肺的B16黑素瘤细胞中，Eva1蛋白质表达。因此提示，对上述B16黑素瘤细胞确认的B2E5-48抗体的抗肿瘤效果介由施与到小鼠体内后获得的Eva1蛋白质的表达而发挥。

另外，如图18和20所示，表明了该针对B16黑素瘤细胞的抗肿瘤效果由于将B2E5-48抗体嵌合化而提高。

进而，即使将接种B16黑素瘤细胞之后开始施与抗体的时期从上述的接种1日后推迟到14日后，也如图21和22所示，表明了在施与了B2E5-48小鼠抗体的小鼠中，能够显著抑制B16黑素瘤细胞在肺中的集落形成，另外，鉴于该结果是从接种黑素瘤开始经过14日后施与抗体而得的结果，提示了B2E5-48小鼠抗体对转移的癌发挥治疗的效果。

另外，由图23和24所示的结果表明，与B2E5-48小鼠抗体同样地，对于C3小鼠抗体也确认了体内(in vivo)的抗肿瘤活性。

产业可利用性

如以上说明的那样，本发明的抗体对来源于人的Eva1蛋白质显示高亲和性，另外具有高ADCC和/或CDC活性。进而，本发明的抗体在体内(in vivo)也显示高抗肿瘤活性，因此作为用于治疗或预防癌的药剂、用于抑制癌转移的药剂等是有用的。

另外，本发明不受上述发明的实施方式和实施例的说明任何限制。在不超出权利要求的记载、本领域技术人员能够想到的范围内的各种变形方式也包含在本发明中。本申请说明书中引用的论文和公开专利公报等的内容在所有目的下其全体通过参照而在本说明书引用。

序列表自由文本

序列号1

＜223＞信号肽和轻链可变区(B2E5-48)

序列号3

＜223＞轻链可变区(B2E5-48)

序列号4

＜223＞轻链可变区的CDR1(B2E5-48)

序列号5

＜223＞轻链可变区的CDR2(B2E5-48)

序列号6

＜223＞轻链可变区的CDR3(B2E5-48)

序列号7

＜223＞信号肽和重链可变区(B2E5-48)

序列号9

＜223＞重链可变区(B2E5-48)

序列号10

＜223＞重链可变区的CDR1(B2E5-48)

序列号11

＜223＞重链可变区的CDR2(B2E5-48)

序列号12

＜223＞重链可变区的CDR3(B2E5-48)

序列号13

＜223＞信号肽和轻链可变区(C3)

序列号15

＜223＞轻链可变区(C3)

序列号16

＜223＞轻链可变区的CDR1(C3)

序列号17

＜223＞轻链可变区的CDR2(C3)

序列号18

＜223＞轻链可变区的CDR3(C3)

序列号19

＜223＞信号肽和重链可变区(C3)

序列号21

＜223＞重链可变区(C3)

序列号22

＜223＞重链可变区的CDR1(C3)

序列号23

＜223＞重链可变区的CDR2(C3)

序列号24

＜223＞重链可变区的CDR3(C3)

序列号25

＜223＞轻链可变区(A5D11-10)

序列号27

＜223＞轻链可变区的CDR1(A5D11-10)

序列号28

＜223＞轻链可变区的CDR2(A5D11-10)

序列号29

＜223＞轻链可变区的CDR3(A5D11-10)

序列号30

＜223＞重链可变区(A5D11-10)

序列号32

＜223＞重链可变区的CDR1(A5D11-10)

序列号33

＜223＞重链可变区的CDR2(A5D11-10)

序列号34

＜223＞重链可变区的CDR3(A5D11-10)

序列号35

＜223＞人Eva1

序列号37

＜223＞小鼠Eva1

Claims (6)

1.抗体，与来源于人的Eva1蛋白质结合，并且具有下述(a)～(c)的任一项所记载的特征，

(a)保持以下轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含序列号4～6所记载的氨基酸序列作为CDR1～3，所述重链可变区包含序列号10～12所记载的氨基酸序列作为CDR1～3；

(b)保持以下轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含序列号16～18所记载的氨基酸序列作为CDR1～3，所述重链可变区包含序列号22～24所记载的氨基酸序列作为CDR1～3；

(c)保持以下轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含序列号27～29所记载的氨基酸序列作为CDR1～3，所述重链可变区包含序列号32～34所记载的氨基酸序列作为CDR1～3。

2.抗体，与来源于人的Eva1蛋白质结合，并且具有下述(a)～(c)的任一项所记载的特征，

(a)保持以下轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含序列号3所记载的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列号9所记载的氨基酸序列，

(b)保持以下轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含序列号15所记载的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列号21所记载的氨基酸序列，

(c)保持以下轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含序列号26所记载的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列号31所记载的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的抗体，具有来源于人的恒定区。

4.根据权利要求1～3的任一项所述的抗体，具有选自ADCC活性和CDC活性中的至少1种细胞毒活性。

5.药物组合物，包含权利要求1～4的任一项所述的抗体作为有效成分。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，是抗癌剂。

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