CN108138146A

CN108138146A - 制备原代细胞样品的方法

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Publication number: CN108138146A
Application number: CN201680061008.6A
Authority: CN
Inventors: L·G·莱恩; B·里驰; A·丹大帕特
Original assignee: Celcuity Inc
Current assignee: Celcuity Inc
Priority date: 2015-10-20
Filing date: 2016-10-20
Publication date: 2018-06-08
Also published as: US11591573B2; AU2016341938B2; EP3365436A1; AU2016341938A1; JP7202613B2; CA2999054A1; JP2021175415A; KR102757122B1; JP2018531021A; EP3365436B1; HK1252635A1; US20180230434A1; US12215356B2; US20230235293A1; KR20180057653A; WO2017070353A1; DK3365436T3

Abstract

本发明提供了一种制备从人类受试者获得的用于临床试验的活病变细胞样品的方法，其中所述方法抑制失巢凋亡和/或细胞中的失巢凋亡，同时维持细胞在体内时的生理功能和基因组组成。在本发明的方法中，在抗失巢凋亡气氛条件例如大于2％且小于20％氧气的条件下，在包含至少一种失巢凋亡抑制剂(优选至少一种内在失巢凋亡途径抑制剂和至少一种外在失巢凋亡途径抑制剂)的培养基中培养原代细胞。还提供了将多种培养条件组合的方法，包括在抑制失巢凋亡的条件下的表面附着。还提供了用于本发明方法的组合物和试剂盒。

Description

制备原代细胞样品的方法

相关申请

本申请要求于2015年10月20日提交的申请号为62/243,765的美国临时申请的优先权日的权益，其内容通过引用整体并入本文。

背景技术

当直接从人体组织样本获得细胞时，许多限制条件使得难以获得适合用作临床试验样品的活人类病变细胞。这在很大程度上解释了使用从组织提取的活人类细胞的临床试验为什么很少(如果有的话)。通常情况下，活病变细胞样品的制备必须在与从患者移出样本不同的位置进行。这需要将组织在保持细胞活力的收集容器中运送很长一段时间。另外，可用于测试的患病组织的量受限。当在活检过程中获得样本时，那么可能只有5-10毫克以下的患病组织可用。从这种尺寸的组织样本提取活细胞的传统技术产生很少活细胞。临床试验需要更多一些活病变细胞，这将需要将提取的细胞扩增以具有反映患者肿瘤的合适数量。这意味着多个附加的限制。首先，可用于扩增细胞的时间有限。临床检测结果在采集患者样本后的几天内才理想可用，以确保及时选择合适的治疗方案。在极少数情况下，临床结果在从患者获得样本30天后可能仍然有用。在大多数情况下，临床试验必须被设计为在不到两周的时间内产生结果才能有用。理想地，这需要能够在不到两周的时间内提取和扩增从样本中提取的少量活细胞以提供足够数量的活病变细胞的方法。

此外，为了使临床试验结果可靠，必须以维持样本中最初发现的病变细胞分布的方式提取和扩增细胞。这是因为涉及人类样本的任何临床试验都需要来源于代表原始样本本身的样本的试样。例如，肿瘤样本由不同的上皮细胞类型-管腔细胞、肌细胞、基底细胞、干细胞-以彼此的一定比例组成；从其获得的样品应该以大致相似比例包含这些细胞类型。然而，当提取并扩增直接从人类样本中获得的细胞样品时，一种细胞类型可能以比其它细胞更大的速度增殖，或者另一种细胞类型取决于所采用的条件可能根本不会扩增。如果发生这种情况，则所得到的样品将不能代表原始样本，因此作为临床样品可能会欠妥。

制备细胞样品的相关要求是所得到的病变细胞保留其体内基因组和生理活性特性，从而使得它们保留待测试的生理特性或基因组特性。例如，为了测量细胞粘着或细胞信号传导途径活性，离体细胞的途径必须保留其体内功能。否则，将有损临床试验结果的准确性。另一个要求是用于制备细胞样品的任何方法必须能够从高百分比的所得样本产生可检测的细胞样品。

科学文献中描述的从组织中获取原代细胞用于研究的当前实践报道，从肿瘤组织获得活细胞样品的成功率低于50％(参见例如Crystal,AS等人(2014)Science 346:1480-1486)。临床医生对于临床试验结果等待两周的意愿要求：成功试验的可能性高到足以证明推迟对其患者的治疗是合理的。由于延迟对患者的治疗承担风险，因此临床医生不可能在没有合理的可能性(高效用的测试结果将可用)的情况下采用具有这种风险的临床试验。

因此，考虑到制备用于临床试验的活病变细胞样品的独特要求-在转运期间保持细胞的存活力、保持仅少量样本的可用性、保持短时间可用于扩增病变细胞、维持细胞样品组成与原始肿瘤一致、产生高百分比的可试验细胞样品、保持生理和基因组特性-需要开发制备源自人类组织样品的原代细胞样品的新方法，使得样品适用于临床试验。

发明内容

本文所述的方法解决了制备适用于临床试验的活病变细胞样品的障碍。本发明提供了通过在包含失巢凋亡抑制剂(例如，内在失巢凋亡抑制剂和/或外在失巢凋亡抑制剂)的培养基、和/或在抗失巢凋亡的降低应激表面(例如，水合细胞外基质蛋白组合)、和/或在抗失巢凋亡的降低应激的气氛条件(例如大于2％且小于20％氧气)下培养活病变细胞(即原代细胞)样品，特别是在最有可能导致活病变细胞进入失巢凋亡的试验样品制备期间，以制备活病变细胞样品的组合物和方法。本发明的方法允许在足够短的时间内制备足够数量的原代人类细胞，其保持细胞在体内的生理特性和基因组特性，使得可以在临床相关时限内对它们进行高度精确的临床试验。

因此，在一个方面，本发明提供了制备从人类受试者获得的用于临床试验的活病变细胞样品的方法，所述方法包括：

在包含大于2％且小于20％氧气的条件下，在包含至少一种失巢凋亡抑制剂的培养基中培养从人类受试者获得的活病变细胞样品；以及

对活病变细胞样品进行临床试验。

另一方面，本发明提供了制备从人类受试者获得的用于临床试验的活病变细胞样品的方法，所述方法包括：

在包含6-17％氧气(例如10％氧气)的条件下，在包含至少一种失巢凋亡抑制剂的培养基中将从人类受试者获得的活病变细胞样品培养例如至少1小时(例如3小时)；

在包含6-17％氧气(例如10％氧气)的条件下，在包含至少一种失巢凋亡抑制剂且不具有消化酶的培养基中将样品培养例如至少1小时(例如3小时)；以及

在包含20％氧气的条件下，在不具有失巢凋亡抑制剂的培养基中培养样品，从而制备用于临床试验的样品。

在涂覆有水合细胞外基质(ECM)的细胞培养皿表面上，在包含6-17％氧气(例如10％氧气)的条件下，在包含至少一种失巢凋亡抑制剂的培养基中培养从人类受试者获得的活病变细胞样品。

在涂覆有水合细胞外基质(ECM)的细胞培养皿表面上，在包含6-17％氧气(例如10％氧气)的条件下，在包含至少一种失巢凋亡抑制剂的培养基中培养从人类受试者获得的活病变细胞样品；以及

将活病变细胞样品附着到包含水合细胞外基质(ECM)的表面，其中所述ECM包括：(i)纤连蛋白和胶原蛋白；(ii)胶原蛋白和层粘连蛋白332(层粘连蛋白V)或(iii)层粘连蛋白332(层粘连蛋白V)，从而制备用于临床试验的样品。

在又一方面，本发明提供了制备从人类受试者获得的用于临床试验的活病变细胞样品的方法，所述方法包括：

在包含6-17％氧气(例如10％氧气)的条件下，在包含至少一种半胱天冬酶抑制剂、至少一种MMP3抑制剂和至少一种Rho相关激酶抑制剂的培养基中培养从人类受试者获得的活病变细胞样品，从而制备用于临床试验的样品。

又一方面，本发明提供了制备从人类受试者获得的用于使用生物传感器进行临床试验的活病变细胞样品的方法，所述方法包括：

将活病变细胞样品附着至包含水合细胞外基质(ECM)的表面，所述水合细胞外基质(ECM)包含纤连蛋白和胶原蛋白；以及

使用生物传感器对活病变细胞样品进行临床试验。

在又一方面，本发明涉及制备从人类受试者获得的用于临床试验的活病变细胞样品的方法，其包括：

在包含6-17％氧气(例如，10％氧气)的条件下，在包含至少一种失巢凋亡抑制剂(例如，至少一种内在失巢凋亡途径抑制剂和至少一种外在失巢凋亡途径抑制剂)的培养基中培养从人类受试者获得的活病变细胞样品；

在包含6-17％氧气(例如10％氧气)的条件下，在包含至少一种失巢凋亡抑制剂的培养基中继续培养附着于表面的样品。

在一个实施方式中，将样品在包含至少一种内在失巢凋亡途径抑制剂和至少一种外在失巢凋亡途径抑制剂的培养基中培养。在另一个实施方式中，将样品在包含至少一种内在失巢凋亡途径抑制剂和/或至少一种外在失巢凋亡途径抑制剂或其组合的培养基中培养。在一个实施方式中，所述至少一种凋亡抑制剂抑制抗失巢凋亡途径。在一个实施方式中，将样品在包含至少一种失巢凋亡途径抑制剂的培养基中培养。

在一个实施方式中，所述至少一种失巢凋亡抑制剂选自由激酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、应激抑制剂、死亡受体抑制剂、细胞色素C抑制剂和失巢凋亡抑制剂组成的组。在另一个实施方式中，至少一种失巢凋亡抑制剂选自由Rho相关激酶抑制剂、ALK5抑制剂、半胱天冬酶抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、氧化还原缓冲剂、活性氧物质抑制剂、TNFα抑制剂、TGFβ抑制剂、细胞色素C释放抑制剂、无钙通道活化的碳酸酐酶拮抗剂、整联蛋白稳定剂、整联蛋白配体、Fas抑制剂、FasL抑制剂、Bax抑制剂和Apaf-1抑制剂所组成的组。本文进一步描述了失巢凋亡抑制剂的多个非限制性示例。在某些实施方式中，培养细胞样品的培养基包含两种以上失巢凋亡抑制剂，诸如2、3、4、5或更多种失巢凋亡抑制剂。例如，在一个实施方式中，将样品在包含组合使用的至少三种失巢凋亡抑制剂例如Rho相关激酶抑制剂、半胱天冬酶抑制剂和MMP3抑制剂的培养基中培养。本文进一步描述了失巢凋亡抑制剂组合的多种其它非限制性示例。

在一个实施方式中，将样品在包含6-17％氧气的条件下培养。在另一个实施方式中，将样品在包含10％氧气的条件下培养。在又一个实施方式中，将样品在包含17-19％氧气的条件下培养。在某些实施方式中，将样品在不同时间在两种以上不同的气氛条件下培养，例如首先在包含6-17％氧气(例如在10％氧气下)的条件下培养一段时间，然后将样品转移到例如包含1-5％氧气或17-19％氧气或20％氧气不同的气氛条件。本文进一步描述了各种合适的抗失巢凋亡的降低应激的气氛条件。

在某些实施方式中，使活病变细胞样品在培养之前与消化培养基接触一段时间，其中消化培养基消化组织而不引起失巢凋亡、细胞表面粘着分子损伤或非失巢凋亡方式的细胞死亡。通常，消化培养基包含一种或多种消化酶。在某些实施方式中，消化培养基还包含至少一种失巢凋亡抑制剂并且可以包含多种失巢凋亡抑制剂(例如，至少一种内在失巢凋亡途径抑制剂和/或至少一种外在失巢凋亡途径抑制剂)。在某些实施方式中，消化培养基还包含至少一种失巢凋亡抑制剂。

本发明的方法可以包括将细胞样品在多种不同的培养基中培养不同的时间段和/或将细胞样品在除了失巢凋亡抑制剂之外还包含其它组分的培养基中培养。例如，在一个实施方式中，将活病变细胞样品在包含至少一种促进粘着途径活化的组分的培养基中培养。在本文中进一步描述了这些组分的非限制性示例。在另一个实施方式中，将活病变细胞样品在无血清培养基中培养，所述无血清培养基包含至少一种保持活病变细胞的生理特性或基因组特性的组分。在本文中进一步描述了这些组分的非限制性示例。在另一个实施方式中，将活病变细胞样品在无血清培养基中培养，所述无血清培养基包含至少一种促进细胞生长、细胞分裂或细胞循环以促进细胞增殖的组分。在本文中进一步描述了这些组分的非限制性示例。在另一个实施方式中，将活病变细胞样品在包含至少一种促进粘着暂时消退的组分的培养基中培养，以便于将细胞从一个培养皿转移到另一个培养皿。在本文中进一步描述了这些组分的非限制性示例。

在某些实施方式中，在进行临床试验之前，将活病变细胞样品转移到不具有失巢凋亡抑制剂的培养基中。在一个实施方式中，将活病变细胞样品在包含至少一种失巢凋亡抑制剂的培养基中培养至少120小时，然后将其转移至不具有失巢凋亡抑制剂的培养基中。在其它实施方式中，将样品在包含至少一种失巢凋亡抑制剂的培养基中培养至少24-96小时，然后将其转移至不具有失巢凋亡抑制剂的培养基中。在一个实施方式中，将活病变细胞样品在包含20％氧气的条件下转移至不具有失巢凋亡抑制剂的培养基中。

在某些实施方式中，在进行临床试验之前，将活病变细胞样品附着于包含水合细胞外基质(ECM)的表面。在一个实施方式中，水合ECM是折叠的。在一个实施方式中，水合细胞外基质(或水合和折叠ECM)包含纤连蛋白和胶原蛋白，优选其中纤连蛋白和胶原包含原纤维性且亲水性表面。在另一个实施方式中，水合细胞外基质(或水合和折叠ECM)包含胶原蛋白-层粘连蛋白332(层粘连蛋白V)共结构。在又一个实施方式中，水合细胞外基质(或水合和折叠ECM)包含层粘连蛋白332(层粘连蛋白V)。在一个实施方式中，表面是生物传感器表面。在另一个实施方式中，细胞表面是细胞培养皿表面。该方法可以进一步包括使用生物传感器对活病变细胞样品进行临床试验。

本发明的方法适用于可从人类受试者获得的多种活病变细胞。在优选的实施方式中，活病变细胞是癌细胞。此外，本发明的方法适用于制备用于各种体外临床试验(包括诊断试验、基因试验和治疗方案试验等)的原代人类细胞。在一个实施方式中，使用生物传感器进行临床试验。在一个实施方式中，临床试验包括使活病变细胞样品与至少一种试剂接触，并在样品与该至少一种试剂接触之前和之后测量细胞粘着或附着。

另一方面，本发明涉及细胞培养组合物，其包括在包含大于2％且小于20％氧气(例如6-17％氧气、10％氧气)的条件下在包括至少一种失巢凋亡抑制剂的培养基中培养的原代人类癌细胞。在细胞培养组合物的一个实施方式中，培养基包含至少一种内在失巢凋亡途径抑制剂和至少一种外在失巢凋亡途径抑制剂，并且其中将细胞在包含6-17％氧气(例如10％氧气)的条件下培养。在细胞培养组合物的另一个实施方式中，培养基包含至少三种失巢凋亡抑制剂(例如，Rho相关激酶抑制剂、半胱天冬酶抑制剂和MMP3抑制剂)，并且将细胞在包含6-17％氧气(例如，10％氧气)的条件下培养。

另一方面，本发明涉及一种生物传感器表面，其包含通过水合细胞外基质(ECM)附着于生物传感器表面的原代人类癌细胞，其中ECM包含：(i)纤连蛋白和胶原蛋白；(ii)胶原蛋白和层粘连蛋白332(层粘连蛋白V)或(iii)层粘连蛋白332(层粘连蛋白V)。在生物传感器表面的一个实施方式中，ECM包含纤连蛋白和胶原蛋白，所述纤连蛋白和胶原蛋白包含原纤维性且亲水性表面。在一个实施方式中，水合ECM是折叠的。

另一方面，本发明涉及一种细胞培养皿表面，其包含通过水合细胞外基质(ECM)附着于细胞培养皿表面的原代人类癌细胞，其中ECM包含：(i)纤连蛋白和胶原蛋白；(ii)胶原蛋白和层粘连蛋白332(层粘连蛋白V)或(iii)层粘连蛋白332(层粘连蛋白V)。在细胞培养皿表面的一个实施方式中，ECM包含纤连蛋白和胶原蛋白，所述纤连蛋白和胶原蛋白包含原纤维性且亲水性表面。在一个实施方式中，水合ECM是折叠的。

用于实施本发明方法的试剂盒以及用于优化培养来自人原代细胞样品的活病变细胞的细胞培养条件的方法也包括在本发明中。

在下面的说明书中阐述了本发明的多个实施方式的细节。从说明书和附图以及权利要求中，本发明的其它特征、目的和优点将变得显而易见。

具体实施方式

本发明描述了制备从人类受试者获得的组织样本中提取的活病变细胞样品的方法，所述样品随后在细胞可用于临床试验时使用。当从组织中提取人类初级活病变细胞样品、进行培养并制备用于测试时，这些方法降低进入失巢凋亡的病变(例如癌症)细胞的百分比。迄今为止关于失巢凋亡的研究主要集中在利用细胞凋亡系统杀死癌细胞，同时保持健康的细胞功能。失巢凋亡研究尚未解决暂时停止失巢凋亡的相反功能，以获得可用的原代人类细胞(例如肿瘤样品中的活癌细胞)培养物的稳定可检测状态。

为了获得和测试活细胞，必须首先将其从刚刚移出患者的组织中分离出来。本发明描述了一旦将细胞从其天然组织中分离就开始停止失巢凋亡过程的方法，使得可以重获反映其体内状态的足够活细胞。本发明还描述了用于制备具有与病变细胞在体内时相当的生理功能和基因组组成的细胞样品的方法。本发明还描述了以防止细胞粘着途径干扰细胞信号传导途径功能的方式制备附着于培养基表面的细胞样品的方法。本发明的方法涉及包含失巢凋亡抑制剂的培养基的用途，和/或抗失巢凋亡的应激降低的环境条件和/或将细胞附着到抗失巢凋亡的应激降低的表面和/或其组合的用途。

通过比较不同培养基与本发明的实验结果，本发明的效用和独特优点是显而易见的。具体而言，本发明提供了能够从毫克量的病变组织得以快速培养以提供统一临床试验结果的异质细胞群体。使用本发明的组合物和方法培养的细胞的形态学分析和生物标记物分析证明，存在充满了与疾病同义的标记物(雌激素受体、孕酮受体、ErbB族受体、CD10、封闭蛋白(claudin)4、CD49f和本文所述的其它标记物)的多种病变细胞类型(管腔细胞、基底细胞、干细胞、间叶细胞)，而本领域已知的和市售的其它培养基不能产生用于临床试验的病变细胞的合适样品。其它培养基类型不支持通常表征病变细胞患者样品的管腔病变细胞类型的增殖。此外，其它培养基类型仅支持健康细胞或干细胞或鳞状细胞类型，这些细胞类型不符合本发明对于来自患者样品的病变细胞的异质混合物的期望结果。总之，本发明提供了异质类型的细胞，其具有来自适合于临床试验的受试者的原发病变细胞样品的识别标记物，而本领域已知的其它培养基则不能提供。

本发明的各个方面在下面的分段中被进一步描述。

抑制失巢凋亡

成功培养原代细胞(例如来自受试者的活病变细胞样品，该样品使得细胞能够用于临床试验中)的障碍是失巢凋亡，其是细胞的自然控制系统的一部分，用于使死亡程序化。程序性死亡可能是由响应于许多因素(潜在共同作用)引起的，包括但不限于：无法耐受的突变数积聚、pH值、细胞年龄、环境因素、各种形式的应激例如氧分压上限或下限，与细胞因子、趋化因子、细胞信号传导分子、蛋白质和各种RNA接触，以及细胞生长超出已建立的组织边界。程序性细胞死亡活性的平衡通过互连的蛋白质途径在细胞中获得，所述互连的蛋白质途径为促失巢凋亡性或促血管生成性的。例如，诸如BAX和BAK的多结构域的促失巢凋亡家族成员一旦被激活，就可以使线粒体透化而触发失巢凋亡，而抗失巢凋亡的BCL-2家族成员保持线粒体的完整性。BH3-only分子(BH3)通过激活BAX-BAK或使抗失巢凋亡成员失活而促进失巢凋亡。

已经描述了两种形式的失巢凋亡途径，内在的和外在的(参见例如Fulda,S.和Debatin,K.M.(2006)Oncogene 7:4798-4811)。内在失巢凋亡途径的特征在于线粒体膜透化、细胞色素c释放和响应于细胞毒素刺激的凋亡体形成。响应于配体与TNF-超家族的死亡受体的结合，外在失巢凋亡途径被激活。示例性配体包括TNFα和FasL。死亡受体活化可导致线粒体膜透化、细胞色素c释放，并且通过半胱天冬酶依赖性切割和促失巢凋亡蛋白Bid向线粒体的易位，失巢凋亡后期得以进展。内在和外在途径都涉及线粒体膜透化、细胞色素C释放和半胱天冬酶活化作为共有部分。

为了抑制效率，本发明中对失巢凋亡的抑制目的在于预防和解决早期的初发失巢凋亡事件。失巢凋亡过程的中断可以在细胞死亡之前的较晚时间点进行，也可以期望使已经进入失巢凋亡晚期阶段的细胞培养样品复活。对病变原代细胞的pH和氧化还原电位和金属离子浓度(特别是钙的释放)的缓冲优选是防止失巢凋亡的早期点。失巢凋亡的早期抑制点优选包括破坏线粒体透化和抑制细胞色素c释放。在失巢凋亡过程中干预稍后期点优选包括破坏半胱天冬酶活性级联和破坏其它蛋白酶。通过对Bcl-2家族的抗失巢凋亡分子的表达增加或减少促失巢凋亡分子例如Bax、Apaf-1或半胱天冬酶-8来解除失巢凋亡是可以被组合用于抑制失巢凋亡的另外的实施方式。

因此，在本发明的方法中，将从受试者获得的活病变细胞样品在包含至少一种失巢凋亡抑制剂的培养基中培养。在某些实施方式中，培养基包含至少一种内在失巢凋亡抑制剂和至少一种外在失巢凋亡抑制剂。在其它实施方式中，所述培养基包含至少一种内在失巢凋亡抑制剂和至少一种外在失巢凋亡抑制剂。在其它实施方式中，选择凋亡抑制剂以抑制抗失巢凋亡途径。

在对组织样本进行用于获得适于培养的细胞的任何初始准备步骤(在下面进一步讨论)之后，将从样本提取的细胞在包括失巢凋亡抑制剂、更优选包括失巢凋亡抑制剂的组合、最优选包括选自内在的和/或外在的促失巢凋亡途径抑制剂和/或抗失巢凋亡激活剂的组合的培养基中培养。

下面的表1示出了失巢凋亡抑制剂的一般类型的非限制性示例和属于这些类型的示例性抑制剂种类，以及特定试剂的示例；以及抑制剂是否影响内在失巢凋亡途径、外在失巢凋亡途径或对于两种途径共同的部分(在本文中称为“共有途径”失巢凋亡抑制剂)。

表1：示例性失巢凋亡抑制剂分子

在一个实施方式中，所述至少一种失巢凋亡抑制剂是Rho相关激酶抑制剂，其非限制性示例包括Y-27632、GSK429286A和RKI-1447。在一个实施方式中，所述至少一种失巢凋亡抑制剂是半胱天冬酶抑制剂，诸如泛半胱天冬酶抑制剂(例如Z-VAD-FMK)、半胱天冬酶3抑制剂(例如Z-DEVD-FMK、Q-VD-OPh)、半胱天冬酶3抑制剂(例如Z-IETD-FMK、Ac-LETD-CHO、Q-VD-OPh)和/或半胱氨酸蛋白酶9抑制剂(例如Z-LEHD-CHO、Ac-LETD-CHO、Q-VD-OPh)。在一个实施方式中，所述至少一种失巢凋亡抑制剂是细胞色素C抑制剂，其非限制性示例包括褪黑激素和醋甲唑胺。在一个实施方式中，所述至少一种失巢凋亡抑制剂是基质金属蛋白酶(MMP3)抑制剂，其非限制性示例是UK-356618。在一个实施方式中，所述至少一种失巢凋亡抑制剂是ALK5抑制剂，其非限制性示例包括色瑞替尼、RepSox、艾乐替尼、AP26113、GW788388、SD-208和Galunisertib(LY2157299)。在一个实施方式中，所述至少一种失巢凋亡抑制剂是TNFα抑制剂，其非限制性示例包括R-7050、英夫利昔单抗、戈利木单抗、阿达木单抗、塞妥珠单抗和依那西普。在一个实施方式中，所述至少一种失巢凋亡抑制剂是TGFβ抑制剂，其非限制性示例包括非苏木单抗；以及TGFβ途径信号传导抑制剂，例如色瑞替尼、RepSox、艾乐替尼、AP26113、GW788388、SD-208和Galunisertib(LY2157299)。在一个实施方式中，所述至少一种失巢凋亡抑制剂是氧化应激还原剂(即，活性氧物种抑制剂)，其非限制性示例包括谷胱甘肽、谷胱甘肽乙酯、蛋氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、谷氨酸和甘氨酸。在一个实施方式中，所述至少一种失巢凋亡抑制剂是氧化还原缓冲剂，其非限制性示例包括烟酸、烟酸相关化合物、钙化醇、β-胡萝卜素和维生素C。在一个实施方式中，所述至少一种失巢凋亡抑制剂是粘着相关失巢凋亡抑制剂，其非限制性示例包括纤维蛋白原、纤连蛋白和四碘甲状腺原氨酸。在一个实施方式中，所述至少一种失巢凋亡抑制剂是Fas和/或FasL抑制剂，其非限制性示例包括三碘甲状腺原氨酸和四碘甲状腺原氨酸。在一个实施方式中，所述至少一种失巢凋亡抑制剂是Bax抑制剂，其非限制性示例包括Bax抑制剂-1和V5肽。在一个实施方式中，所述至少一种失巢凋亡抑制剂是Apaf-1抑制剂，其非限制性示例包括QM31和米诺环素。

在其它实施方式中，将细胞与两种以上失巢凋亡抑制剂例如2、3、4、5、6、7、8、9或10种失巢凋亡抑制剂一起培养。任何上述的失巢凋亡抑制剂可以组合使用。例如，在一个实施方式中，将细胞与Rho相关激酶抑制剂和半胱天冬酶抑制剂一起培养。在另一个实施方式中，将细胞与Rho相关激酶抑制剂和MMP3抑制剂一起培养。在另一个实施方式中，将细胞与半胱天冬酶抑制剂和MMP3抑制剂一起培养。在另一个实施方式中，细胞与Rho相关激酶抑制剂、半胱天冬酶抑制剂和MMP3抑制剂一起培养。在另一个实施方式中，将细胞与Rho相关激酶抑制剂、半胱天冬酶抑制剂、MMP3抑制剂和死亡受体抑制剂(例如TNFα抑制剂、TNFR1抑制剂、TGFβ抑制剂、ALK5/TGFBR1抑制剂、Fas抑制剂或FasL抑制剂)一起培养。在另一个实施方式中，将细胞与下列中的每一个一起培养：激酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、应激抑制剂、死亡受体抑制剂、细胞色素C抑制剂和失巢凋亡抑制剂，其非限制性示例包括在表1和上面列出的试剂。可以使用本文提供的指导方案(例如参见实施例3-5)确定失巢凋亡抑制剂的其它合适组合。

根据病变细胞样品中细胞的量，通常将抑制剂以每100000个细胞0.001-0.1微摩尔，优选每100000-10000000个细胞0.01-0.1微摩尔的浓度添加到培养基中。

在某些实施方式中，在培养基中使用单一的失巢凋亡抑制剂为某些细胞类型提供了益处。然而，在具体实施方式中，组合内在、外在和失巢凋亡抑制组分的益处提供了用于制备用于临床试验的样品的最佳条件。已经观察到，抗失巢凋亡组分的这种组合使得来自绝大多数不同患者的样本的异质病变细胞群适合于活病变细胞的临床试验。每个患者样本可能因之前描述的许多不同的各个原因或组合原因中的任一个而进入失巢凋亡，每个原因都具有快速和灾难性地使样本不能用于任何类型的活细胞试验的能力。只有通过将这些到失巢凋亡的途径组合显著衰减，才可以在从组织中取出时使得异质病变细胞的样品稳定地用于活细胞试验。临床试验要求被接收用于试验的大多数样本可靠地为医生提供检测结果信息，以指导对其患者的治疗。本发明提供了完成这个要求的手段。

抗失巢凋亡气氛条件

影响体外培养的原代细胞是否进入失巢凋亡的另一因素已被发现是培养细胞所在的气氛条件。现已发现，在大于2％且小于20％氧气的条件下，将培养基中至少一种失巢凋亡抑制剂与培养物结合使用有助于进一步抑制活病变细胞样品中原代细胞的失巢凋亡。虽然不受机制约束，但认为在大于2％且小于20％氧气的气氛条件下培养细胞降低了与氧化应激相关的失巢凋亡。在另一个实施方式中，将细胞样品保持在允许有助于细胞增殖的糖酵解和线粒体功能的气氛条件下。在更优选的实施方式中，将细胞培养物保持在平衡对与氧化应激相关的失巢凋亡的降低和对有助于细胞增殖的氧气的需求的气氛条件下。最优选的实施方式是将细胞样品保持在包含6％-17％氧气的气氛条件下，所述范围变化介于细胞在体内经历的低氧条件(1-5％氧气)和细胞在暴露于大气中时经历的常氧条件(20％氧气)之间。在另一个实施方式中，将细胞在包含10％氧气的条件下培养。在又一实施方式中，将细胞在包含6-9％氧气、9-11％氧气、8-12％氧气、7-13％氧气、6-14％氧气、11-13％氧气、13-15％氧气、15-17％、9-15％氧气、6％氧气、7％氧气、8％氧气、9％氧气、11％氧气、12％氧气、13％氧气、14％氧气、15％氧气、16％氧气或17％氧气的条件下培养。在另一个实施方式中，将细胞在包含1-5％氧气的条件下培养。

在某些实施方式中，将细胞在两种以上不同的气氛条件下培养不同的时间段。例如，可以首先将细胞在包含6-17％氧气(例如10％氧气)的条件下培养，然后在包含1-5％氧气或包含17-19％氧气或包含18-20％氧气或包含20％氧气的条件下培养。

用于细胞培养的气氛条件和温度的其它方面是通常用于培养哺乳动物(例如人类细胞)的那些。例如，通常将细胞在包含至少5％二氧化碳、相对湿度(RH)为40％-100％(例如85％RH)和温度为37℃的气氛条件下培养。

失巢凋亡的表面附着和抑制

大多数非转化和许多癌症上皮细胞类型在它们失去与水合细胞外基质(ECM)的接触时发生失巢凋亡，这种现象称为粘着相关失巢凋亡。维持上皮细胞的结构和功能完整性需要涉及不同类型的表面受体的高度动态细胞-细胞和细胞-基质相互作用。在这些受体当中有粘着分子，如钙粘蛋白和整联蛋白，它们通过识别相邻细胞上的其它细胞粘着受体并与其相互作用，并通过结合ECM的组分发挥主要作用。除了为细胞提供机械锚定之外，这些结构也具有功能重要性；它们转导来自ECM和邻近细胞的信号，这些信号对于存活和增殖至关重要。已经证明ECM的组成、构型和结构性质对于恢复和/或建立哺乳动物细胞的存活力至关重要。这些接触或信号的减少或丢失或其完整性经常引发失巢凋亡。

降低上皮细胞失巢凋亡对于制备活病变细胞的均匀样品至关重要，特别是对于临床试验目的而言。粘着相关失巢凋亡是通过从周围组织细胞外基质(ECM)变得脱落的锚定依赖性细胞(如上皮细胞)在体内起始的一种失巢凋亡形式。由于邻近细胞之间以及细胞与ECM之间的通信提供了用于生长或存活的基本信号，所以通常细胞保持靠近它们所属的组织。当细胞从ECM脱落时，失去正常细胞-基质相互作用，导致形成内在失巢凋亡和外在失巢凋亡。由于其本身性质，病变细胞通常具有不均匀的附着稳定性。在癌症中，不良附着的病理特征是转移，是该疾病的高度致命形式。用于临床试验的均匀病变细胞样品的制备必然涉及在它们的天然环境中从其ECM中将其去除，因此这可诱导失巢凋亡。

因此，本发明方法的多个实施方式用恢复细胞-细胞和细胞-ECM接触的体外ECM代替从中除去细胞的ECM，从而抑制或减少失巢凋亡。此外，可以将一种或多种组分添加到培养基中以促进对细胞-细胞和/或细胞-ECM粘着的恢复和/或活化并防止失巢凋亡。

因此，本发明方法的某些实施方式包括包含至少一种促进对细胞-细胞和/或细胞-ECM粘着的恢复和/或活化并防止失巢凋亡的组分的培养基的用途。防止这种形式的失巢凋亡活性的粘着途径激活剂可以选自但不限于由以下所组成的组：Ca²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、三碘甲状腺原氨酸、四碘甲状腺原氨酸、胎球蛋白、溶液形式(例如纤维蛋白原)或细胞外基质组分涂层、或这些组分(例如纤连蛋白、胶原、层粘连蛋白、玻连蛋白、胞间CAM、血管CAM、MAdCAMS、糖胺聚糖、蛋白聚糖或其衍生物和/或肽)的组合。生长因子，例如用于增加局灶性粘着激酶活性并在整联蛋白破坏后阻碍PTEN失巢凋亡促进作用的EGF，也包括在本发明中。

在某些实施方式中，可以将上述两种以上抑制失巢凋亡的组分用于培养基中。例如，在一个实施方式中，将活病变细胞样品在包含至少一种内在失巢凋亡抑制剂和至少一种外在失巢凋亡抑制剂的培养基中培养。

在另一个实施方式中，通过细胞外基质将活细胞样品附着于培养表面，例如培养皿(例如，将培养板分成孔、T25烧瓶、T75烧瓶和T150烧瓶、多级培养皿等)或测试表面(例如生物传感器表面)。在其它实施方式中，将活细胞样品通过水合ECM(其中ECM保留足够的水，使得ECM完全润湿并且在使用前决不允许脱水)附着到细胞培养皿或测试表面。在另外的实施方式中，将活细胞样品经由水合和折叠ECM附着于细胞培养皿或测试表面，由此ECM由其蛋白质组分的有序、结构化且可重现布置组成。在实施方式中，将活细胞的细胞样品附着于原纤维性的和亲水性的组合胶原蛋白和纤连蛋白表面，所述原纤维性的和亲水性的组合胶原蛋白和纤连蛋白表面被制备为维持这些蛋白的天然体内样结构，其可以被特定整联蛋白识别和/或通过例如钙粘蛋白或粘着蛋白以促进细胞-细胞相互作用。在某些实施方式中，胶原蛋白和纤连蛋白形成亲水性原纤维，并且双蛋白相互作用包括特定的氨基酸序列结合位点。在实施方式中，细胞-ECM附着形成胶原-层粘连蛋白332共结构。层粘连蛋白332也被称为层粘连蛋白V并且在某些实施方式中可以被用作培养表面上的单独ECM。在一些实施方式中，待用ECM涂覆的表面是塑料、玻璃、或特别是印有金电极的玻璃、或涂覆有钛的塑料、或形成为波导的涂覆有可选活性金属的玻璃或塑料、涂覆有金的玻璃。其它优选的实施方式中，待用ECM涂覆的表面是用于临床试验目的的生物传感器。

在涉及表面附着的每个实施方式中，使用本领域技术人员已知的标准方法制备表面涂层。例如，制备水合ECM或水合和折叠ECM的方法在本领域中已被充分建立(参见例如Anderson,D.G.等(2004)Nat.Biotechnol.22:863-866；Flaim,C.J.等(2005)Nat.Methods2:119-125；Falsey,J.R.等(2001)Bioconjug.Chem.12:346-353；Kuschel,C.等(2006)Biotechniques 40:523-531；Reticker-Flynn,N.E.等(2012)Nat.Commun.3:1122)。

在其它实施方式中，细胞到表面的附着被优化以确保细胞附着水平不受使细胞应激的条件或增加失巢凋亡的条件驱动，这可导致干扰细胞信号传导活性的细胞附着。在其它实施方式中，细胞到表面的附着被优化以确保细胞外涂层和粘着机制与相关的信号传导途径匹配。

因此，在某些实施方式中，本发明的用于制备用于进行临床试验的原代细胞的方法包括将细胞样品附着至包含水合细胞外基质(ECM)的表面的步骤。在一个实施方式中，ECM包含纤连蛋白和胶原蛋白。在一个实施方式中，使用折叠ECM。在另一个实施方式中，纤连蛋白和胶原包含原纤维性且亲水性表面。在一个实施方式中，ECM由原纤维性且亲水性胶原-层粘连蛋白332(层粘连蛋白V)共结构组成。在另一个实施方式中，ECM由层粘连蛋白332(层粘连蛋白V)组成。本发明提供了制备用于进行临床试验的原代细胞的方法，所述方法包括：

将活病变细胞样品附着到包含水合细胞外基质(ECM)或水合和折叠ECM的生物传感器表面，其中所述ECM包含：(i)纤连蛋白和胶原蛋白；(ii)胶原蛋白和层粘连蛋白332(层粘连蛋白V)或(iii)层粘连蛋白332(层粘连蛋白V)；以及

使用生物传感器对活病变细胞样本进行临床试验。

在某些实施方式中，活病变细胞样品可以在不同的时间段附着到两个以上不同的表面。例如，首先可以将细胞附着于包含如上所述的抗失巢凋亡的降低应激的ECM细胞表面例如培养板、培养瓶或其它培养皿并培养一段时间。然后，将细胞可以从该表面分离(例如，如下面进一步描述的)并随后附着到另一个表面，例如用于临床试验的生物传感器表面。该生物传感器表面也可以包含如上所述的抗失巢凋亡的降低应激的ECM。

结合使用多种培养条件

已知对体内细胞活力和功能的调节非常复杂，依赖于多个信号输入和响应以维持稳定的细胞进展。细胞微环境对细胞的影响尤其如此。在实验室环境中培养人类原代细胞的特点在于失败，并且普遍认为可高度重现的原发性组织培养是不可能的，尤其是对于病变细胞。迄今为止，这种思维方式也阻碍了任何活体原代细胞功能临床试验的发展。仔细权衡这种失败的历史，一直没有考虑到需要解决原代细胞建立离体可行培养所需的多重信号输入和响应。当不同的病变细胞被离体培养时，它们将经历失巢凋亡，因为它们的天然调节控制信号传导被破坏。为了克服用于制备临床试验用病变细胞的这种调节控制，需要方法组合来解决调节信号维持需求并防止失巢凋亡。本发明用于制备原代细胞的方法包括将多种不同的培养基和/或培养条件组合使用以制备用于临床试验的原代细胞。组合使用不同的培养基和/或培养条件进一步改善了原代细胞的制备，使得在足够的时间段内获得足够数量的细胞，同时维持细胞的生理和基因组特征，使得它们在临床试验中提供可靠的结果。

在某些实施方式中，将细胞样品首先在包含失巢凋亡抑制剂的培养基中培养，然后在不包含失巢凋亡抑制剂的培养基中培养。在某些实施方式中，将细胞样品首先保持在包含大于2％且小于20％氧气(例如，大于3％且小于19％氧气、6-17％氧气、10％氧气或本文以上描述的大于2％且低于20％的任何其它气氛条件)的气氛中并随后将其保持在包含20％氧气的气氛中。在某些实施方式中，将细胞样品在包含失巢凋亡抑制剂的培养基中培养的时间段范围为：1-10小时、10-20小时、20-30小时、30-40小时、40-50小时、或50小时以上。例如，可以将细胞样品在包含失巢凋亡抑制剂的培养基中培养至少12小时、至少24小时、至少48小时、至少96小时、至少120小时、24-48小时、24-96小时或24-120小时。

在其它实施方式中，在将细胞从一个培养皿转移到另一个培养皿后将细胞样品保持在包含大于2％且小于20％氧气的气氛中一段时间。在某些实施方式中，在将细胞从一个培养皿转移到另一个培养皿后，将细胞样品保持在包含大于2％且小于20％氧气的气氛中的时间段范围为：1-10小时、10-20小时、20-30小时、30-40小时、40-50小时或50小时以上。一个优选的实施方式是，在将细胞从一个培养皿转移到另一个培养皿后，将细胞样品在包含6％-17％氧气的气氛条件下培养。在某些实施方式中，在将细胞样品转移至新培养皿后所保持的气氛条件所包括的氧气范围为1-5％、6-9％、9-11％、8-12％、7-13％、6-14％、11-14％、14-17％或17％-20％，或气氛条件为6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％或17％氧气。在实施方式中，在将细胞从一个培养皿转移到另一个培养皿后，将细胞样品首先保持在包含大于2％且小于20％氧气的气氛中，然后置于包含20％氧气的气氛中。

在其它实施方式中，在将细胞从一个培养皿转移到另一个培养皿中后，将细胞样品在包含失巢凋亡抑制剂的培养基中培养一段时间。在某些实施方式中，在将细胞从一个培养皿转移到另一个培养皿中后，将细胞样品在包含失巢凋亡抑制剂的培养基中培养的时间段范围为1-10小时、10-20小时、20-30小时、30-40小时、40-50小时或50小时以上。在实施方式中，在将细胞从一个培养皿转移到另一个培养皿中后，将细胞样品首先在包含失巢凋亡抑制剂的培养基中培养，然后将其置于不包含失巢凋亡抑制剂的培养基中。

在某些实施方式中，将细胞在补充有各种组分的基础培养基中培养。在一个实施方式中，基础培养基是无血清基础培养基。在另一个实施方式中，基础培养基包含如本文所述的失巢凋亡抑制剂并且可以包含如下所述用于附加功能的另外的组分。无血清基础培养基的非限制性示例可以通过添加本文所述的组分(包括DMEM、F12、50％DMEM/50％F12、MEGM、MCDB-170)进行改性。

在其它实施方式中，将细胞在无血清培养基中培养，所述培养基包含促进生长、分裂或细胞循环以促进细胞增殖的至少一种组分。包含这种类型组分的培养基可以与包含失巢凋亡抑制剂的培养基相同，或者可以是细胞所转移到的不同培养基。促进生长、分裂或细胞循环以促进细胞增殖的这些组分的非限制性示例包括与肿瘤微环境相关的生长因子、HGF、FGF(1-4型)、外来体、miRNA、其它小的非蛋白编码RNA、更长的非蛋白编码RNA、激素、IGF、VEGF、EGF、白细胞介素、细胞因子、趋化因子以及由在病变细胞内和周围的细胞产生的例如可以被称为自分泌因子或旁分泌因子的其它因子。

在其它实施方式中，培养基包括至少一种促进粘着活性暂时消退以促进细胞培养物从一个培养皿平缓转移到另一个培养皿的组分。包含这种类型组分的培养基可以与包含失巢凋亡抑制剂的培养基相同，或者可以是细胞所转移到的不同培养基。促进粘着活性暂时消退以促进细胞培养物从一个培养皿平缓转移到另一个培养皿的组分的非限制性示例包括非酶促和酶促处理剂、Ca²⁺、Mg²⁺和/或Mn²⁺的螯合剂例如EGTA、EDTA、和本领域技术人员已知的其它二价金属离子螯合剂、以及另外的分散酶、TrypLE、胰蛋白酶、细胞消化液、艾克迈斯(accumax)、胶原酶、透明质酸酶、弹性蛋白酶、胰蛋白酶抑制剂、STEMxyme、链霉蛋白酶、脱氧核糖核酸酶。在不同的温度下以不同时间量施加的不同浓度的该组成员的组合包括在本实施方式中。

在其它实施方式中，培养基是无血清培养基，其包含至少一种保持病变细胞的生理特征或基因组特征的组分。包含这种类型组分的培养基可以是与包含失巢凋亡抑制剂的培养基相同，或者可以是细胞所转移到的不同培养基。这种保持病变细胞的生理特征或基因组特征的组分的非限制性示例包括必需氨基酸和非必需氨基酸、维生素(特别是B族维生素)、稀有必需金属、pH缓冲剂(例如N-[2-羟基乙基]哌嗪-N'-[2-乙磺酸](也称为HEPES)、NaHPO₄、NaH₂PO₄)、盐(Na+、K+、Fe、Zn、Cu、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Cl、CO₃、SO₄)、亚硒酸盐、硅酸盐、葡萄糖或糖或其它生物实用碳源、脂质、脂肪酸如硫辛酸、丙酮酸盐、BSA(例如还包括诸如Albumax或其它血清白蛋白的试剂)、转铁蛋白、生长因子、趋化因子、细胞因子、分裂素、乙醇胺、磷酸乙醇胺、白蛋白、激素(例如孕酮、睾酮、雌二醇-尤其是17β-雌二醇、氢化可的松，胰岛素)、腐胺、丙酮酸盐、胸苷、亚油酸、叶酸、亚叶酸、胆碱、盐酸吡哆醛、生物素、次黄嘌呤、嘌呤和嘌呤衍生物、嘧啶和嘧啶衍生物、抗生素、抗真菌剂、抑霉物。可以选择培养基组分以支持患病上皮细胞生长，并且所述选择的组分可以引起与健康无病上皮细胞的生长无关的分离。根据病变细胞样品中细胞的量，生长因子、细胞因子和趋化因子的添加量为每100000个细胞0.001-0.1nmol，优选每100000-1000000个细胞0.01-0.1nmol。

在本发明的用于制备从人类受试者获得的用于临床试验的活病变细胞样品的组合方法的一个实施方式中，所述方法包括：

在包含6-17％氧气(例如10％氧气)的条件下，在包含至少一种内在失巢凋亡途径抑制剂和至少一种外在失巢凋亡途径抑制剂的培养基中培养从人类受试者获得的活病变细胞样品；以及

对活病变细胞样品进行临床试验。

在本发明的用于制备从人类受试者获得的用于临床试验的活病变细胞样品的组合方法的另一个实施方式中，所述方法包括：

在包含6-17％氧气(例如10％氧气)的条件下，在包含至少一种消化酶的培养基中培养从人类受试者获得的活病变细胞样品例如至少1小时(例如1-3小时、3小时或不超过3小时)；

在包含6-17％氧气(例如10％氧气)的条件下，在包含至少一种失巢凋亡抑制剂且不具有消化酶的培养基中培养样品例如至少10小时、或至少24小时、或至少48小时或至少96小时、或至少120小时、或24-48小时、或24-96小时或24-120小时；以及

在包括20％氧气的条件下，在不具有失巢凋亡抑制剂的培养基中培养样品，从而制备用于临床试验的样品。

在包含6-17％氧气(例如10％氧气)的条件下，在包含至少一种内在失巢凋亡抑制剂和至少一种外在失巢凋亡途径抑制剂的培养基中培养从人类受试者获得的活病变细胞样品；以及

将活病变细胞样品附着到包含水合细胞外基质(ECM)的表面，其中所述ECM包括：(i)纤连蛋白和胶原蛋白；(ii)胶原蛋白和层粘连蛋白332(层粘连蛋白V)或(iii)层粘连蛋白332(层粘连蛋白V)。

在一个实施方式中，活病变细胞样品所附着的表面是生物传感器表面，所述方法还包括使用生物传感器在活病变细胞样品上进行临床试验。

在包含6-17％氧气(例如10％氧气)的条件下，在包含至少一种失巢凋亡抑制剂的培养基中培养从人类受试者获得的活病变细胞样品；

在包含6-17％氧气(例如，10％氧气)的条件下，在包含至少一种失巢凋亡抑制剂的培养基中继续培养附着于表面的样品。

在一个实施方式中，将样品与至少一种内在失巢凋亡途径抑制剂和至少一种外在失巢凋亡途径抑制剂一起培养。在一个实施方式中，活病变细胞样品所附着的表面是生物传感器表面，所述方法还包括使用生物传感器对活病变细胞样品进行临床试验。

在本发明的用于制备从人类受试者获得的用于临床试验的活病变细胞样品的组合方法的又一个实施方式中，所述方法包括：

在包含6-17％氧气(例如10％氧气)的条件下，在包含至少一种消化酶(例如胶原酶和透明质酸酶)和至少一种失巢凋亡抑制剂(例如，内在失巢凋亡抑制剂和/或外在失巢凋亡抑制剂)的培养基中培养从人类受试者获得的活病变细胞样品不超过三小时；

将活病变细胞样品铺板到细胞培养皿表面上，所述细胞培养皿表面包含由人类胶原蛋白I和人类纤连蛋白组成的水合和折叠细胞外基质(ECM)；并将其在包含6-17％氧气(例如，10％氧气)的条件下在包含至少一种失巢凋亡抑制剂(例如内在失巢凋亡抑制剂和/或外在失巢凋亡抑制剂)的培养基中培养；以及

在无血清基础培养基中培养样品，直到对活病变细胞进行临床试验或直到达到活病变细胞的50％-80％汇集。

这种组合方法可以在最后的培养步骤之后包括额外的步骤。例如，在一个实施方式中，在活病变细胞到表面的附着消退且不损害细胞的粘着组分的情况下，通过在包含至少一种促进粘着活性暂时消退的组分(例如最小酶和二价金属离子缀合培养基)的培养基中培养细胞不超过10分钟来收获原代细胞。在另一个实施方式中，组合方法可以进一步包括将收获的细胞转移至包含水合和折叠细胞外基质(ECM)(例如，由人类胶原蛋白I和/或人类纤连蛋白组成)的表面(例如第二培养皿或生物传感器表面)并在包含6-17％氧气(例如10％氧气)的条件下在包含至少一种失巢凋亡抑制剂的培养基中培养至少1-8小时，例如直至观察到显著的附着和扩散。

在根据本发明的用于制备用于临床试验的细胞的方法培养原代细胞之后，所述方法还可以包括对病变细胞群的鉴定和表征。在一个实施方式中，例如通过FACS或通过qPCR方法通过检测特定标记物(例如表2中列出的标记物)来鉴定和/或表征病变细胞群。另外或可选地，可以例如使用生物传感器，通过测试粘着和/或细胞信号传导途径活性来鉴定和/或表征病变细胞群。

细胞样品及其初步制备

本发明的方法可以应用于各种各样的原代细胞，特别是原代人类细胞，特别是来自人类受试者的活病变细胞。在一个实施方式中，细胞是来自肿瘤样品的癌细胞。

在实施方式中，从鲜活固体癌组织样本中提取细胞样品，所述鲜活固体癌组织样本从芯针活检、细针抽吸、真空辅助的芯针活检、图像引导的芯针活检、手术活检、手术切除或任何其它合适的医学过程获得。

在实施方式中，细胞样品从任何患病或正常的生物组织或体液类型获得。

在优选的实施方式中，患病上皮细胞可以源自乳腺组织、胃组织、结肠/肠组织、肺组织、头部组织、颈部组织、腮腺组织、卵巢组织、子宫组织、子宫颈组织、前列腺组织、胰腺组织、肾/肾组织、或骨和/或骨髓。在具体的实施方式中，组织来自具有典型乳腺癌病理类型的患者-例如通过临床病理学标记物描述的那些：ER+/HER2-、ER+/HER2+、ER-/HER2+、ER-/HER2-。

在实施方式中，在细胞制备的不同阶段使用包括不同组分或不同浓度组分的培养基。在实施方式中，使用一种、两种、三种、四种或四种以上的不同培养基来制备细胞样品。在实施方式中，在细胞制备的不同阶段在包含不同浓度氧气的气氛条件下保持细胞样品。在实施方式中，在细胞制备的不同阶段使用一种、两种、三种、四种或四种以上的不同气氛条件。在其它实施方式中，将不同的培养基和失巢抑制剂以及气氛条件和附着条件以任何组合一起使用。

为了制备病变细胞样品，通常首先将组织样本机械分成较小的块并置于包含已知用于消化组织的酶促消化剂(即消化酶)的消化培养基中，其中不会引起失巢凋亡、细胞表面粘着分子损伤或其它非失巢凋亡方式的细胞死亡。因此，在某些实施方式中，在从受试者获得样品后，使活病变细胞样品与包含一种或多种酶促进剂的消化培养基接触一段时间，其中消化培养基消化组织而不会引起失巢凋亡、细胞表面粘着分子损伤或非失巢凋亡方式的细胞死亡。酶促进剂可以选自以下非限制性示例：任何已知类型的胶原酶、透明质酸酶、木瓜蛋白酶、分散酶、弹性蛋白酶、胰蛋白酶及其任何组合。在一个实施方式中，消化培养基包含胶原酶和透明质酸酶的混合物。当组合使用时，可以以不同比例使用酶促进剂以优化产率并减少对细胞的损害。可以将组织样本置于包含上述任何试剂的消化培养基中不同的时间段，包括数分钟至多天。在最优选的实施方式中，选择酶促进剂以限制细胞对酶的暴露时间并优化异源活细胞群的产率。

在其它实施方式中，用至少一种失巢凋亡抑制剂补充消化培养基。一个优选的实施方式是用至少一种针对内在失巢凋亡途径诱导的失巢凋亡抑制剂和至少一种针对外在途径诱导的抑制剂补充消化培养基。也可以用至少一种失巢凋亡抑制剂补充消化培养基。另一个实施方式是在提取过程中基于连续或间歇使用任何失巢凋亡抑制剂或失巢凋亡抑制剂的组合。在一个实施方式中，在从受试者获得组织样品后，优选在大于2％且小于20％氧气(更优选6-17％氧气，更优选10％氧气)的条件下，将细胞在包含至少一种消化酶(例如胶原酶和透明质酸酶)并包含至少一种失巢凋亡抑制剂的培养基中培养。将细胞在该培养基中培养一段时间(例如，至少1小时、至少2小时、至少3小时或1至5小时或3小时)，然后将细胞在相同培养基中(即，包含失巢凋亡抑制剂)但不含消化酶的情况下进行培养。

在实施本发明的组合物或方法时对相关病变细胞存在的确定可以通过检查鉴定特定细胞类型的标记物的表达来进行。用于细胞类型鉴定的标记物的非限制性示例包括下表2中列出的那些。使用一种或多种对于一般细胞类型或相关疾病特异性的标记物(紧记在许多情况下样品存在异质性)是最理想的。通过例如FACS、定量方法或其它PCR方法、质谱或聚丙烯酰胺凝胶而检查蛋白、mRNA水平、其它较小RNA水平(例如siRNA、lncRNA、microRNA、调节RNA)可以对标记物进行表达表征、定量或存在性检验。

表2：用于原代细胞样品的细胞鉴定的示例性标记物

细胞的转化对于与某些原代细胞材料一起生效以满足与本发明无关的其它研究或商业目标可能是期望的。由于原代细胞的转化可能产生不代表体内肿瘤功能活性的细胞状态，因此本发明排除了将细胞的遗传、表观遗传或疾病功能改性的细胞转化，使得体内状态不存在。

另外，小鼠模型中的致肿瘤性已经成为确定分离细胞样品中存在癌细胞的标准。尽管通过这种实验已经获得了相当大的成果和知识，但本发明认识到许多内在肿瘤类型尚未达到体内疾病的可靠再现的可接受水平，以及可用于患者临床实践中的小鼠生长一致性的可接受水平。许多肿瘤类型不会在小鼠体内可靠地生长；小鼠在细胞水平的基本方式不同于人(例如，关键蛋白在两种哺乳动物中可能具有相同的名称，但具有改变并影响细胞途径功能的不同序列、结构、功能和位置)；并且获得足够的小鼠异种移植材料的时间量不符合有用临床试验结果的时间要求。如此，作为测试或提供用于临床试验的有用细胞的手段的异种移植模型排除在本发明之外。

在一个实施方式中，在将要进行临床试验的地点(例如实验室、医院)进行细胞样品的制备。如此，可以将细胞保存在公知的转移培养基中，以将从受试者取出起至开始本文所述的细胞样品制备方法的时间缩短。在另一个实施方式中，在不同于从患者取出样本的位置进行细胞样品的制备，需要在样本收集试剂盒中运送样本。将样本运送到制备细胞样品的位置所需的时间可以在1-36小时的范围内和36小时以上。

培养基的制备

用于本发明方法的培养基可以通过标准方法制备，其中将组分以所需浓度加入到基础培养基中。用于本发明的培养基的制备可以通过在水溶液或有机溶液(优选不超过0.3％最终有机溶剂组合物)中以液体或固体形式添加各个组分来制备。在最终制备工作培养基之前可以将组分组合以制备超高速(bullet)浓缩储备溶液以用于储存并且便于均匀地制备。在使用超高速浓缩储备溶液来实施本发明的组合物或方法的情况下，优选地将试剂按水溶解度水平组合，即将盐和更多的水溶性组分储存为水性超高速类型，并且将水溶性较小、疏水性组分储存为乙醇、二甲基甲酰胺和/或二甲亚砜储备物。包含非蛋白组分的储备液的组合物可以理想地在-30℃至-80℃下储存在密封的不透光容器中以延长它们的使用寿命。

通过置于10％O₂、5％CO₂、37℃的环境条件下，在施用于活病变细胞样品之前，可以进一步调节包含一种或多种失巢凋亡抑制剂(可选地包括如上所述的其它组分)的培养基以进一步降低对细胞的潜在失巢凋亡。

在所有实施方式中，培养基以无菌或基本上无菌的形式使用。该形式可以通过本领域技术人员已知的各种方法产生，但是优选以对组合物和/或各个组分无破坏性的方式进行。例如，优选的方法是使用0.1-1.0微米孔径的低蛋白结合膜过滤器进行的过滤除菌。

在对本领域普通技术人员显而易见的实施方式中，给定组分的浓度可以增加或减少超出所列表格中列出的范围，并且可以使用常规经验实验来确定增加或减少浓度的影响。对于任何特定的病变细胞或组织类型，可以使用经验方法(例如滴定、添加、删除或实验设计(DOE)或这些的组合)进行对本发明培养基配方的优化。

培养条件的优化

为了优化细胞制备条件，包括培养基的组成、培养基组分的浓度、所使用培养基或气氛条件的时间长度、所应用的处理条件的阶段/步骤、所使用的不同类型的培养基或细胞所附着的表面类型，可以进行一系列实验来评价在这些条件的任何组合下的细胞扩增速率、细胞样品中的活细胞类型、细胞样品中的细胞类型比例，其导致细胞是否附着于表面、细胞的存活力、细胞的线粒体活性或细胞制备的任何其它测量结果。来自这些实验的结果可用于选择对于特定临床试验、疾病、细胞类型或组织类型的需求最佳的细胞制备条件。

在本文的指导下，其它合适的优化方法和分析对于普通技术人员是显而易见的。

组分和试剂盒

也包括用于本发明方法的组合物，以及用于实施本发明方法的试剂盒。

在一个实施方式中，本发明提供了适用于分离活病变细胞的试剂盒和对制备原代细胞的方法的实施。该试剂盒可以提供用于本文所述的环境条件的说明书和用于制备任何形式的本发明组合物的说明书，包括培养基和包含ECM组分的附着表面。例如，试剂盒可以提供分离的储备组分，其可以被组合并在合适的水溶液中稀释。在某些实施方式中，试剂盒的至少一些组分以不同温度储存或者作为液体或粉末。在某些实施方式中，试剂盒包括用于在降低失巢凋亡少表面上培养病变细胞的涂覆表面，例如本文所述的包含ECM组分的表面。

另一方面，本发明提供了细胞培养组合物，其包括在包含大于2％且小于20％氧气的条件下在包含至少一种失巢凋亡抑制剂的培养基中培养的原代人类癌细胞。在细胞培养组合物的一个实施方式中，培养基包含至少一种内在失巢凋亡途径抑制剂和至少一种外在失巢凋亡途径抑制剂，并且其中将细胞在包含6-17％氧气(例如10％氧气)的条件下培养。在细胞培养组合物的另一个实施方式中，培养基包含至少一种内在失巢凋亡途径抑制剂、至少一种外在失巢凋亡途径抑制剂，并且其中将细胞在包含6-17％氧气(例如10％氧气)的条件下培养。在其它实施方式中，所述培养基包含一种或多种如上文关于组合使用多种培养基的部分所述的另外组分。

另一方面，本发明提供了一种生物传感器表面，其包含经由水合细胞外基质(ECM)附着于生物传感器表面的原代人类癌细胞，其中所述ECM包含：(i)纤连蛋白和胶原蛋白；(ii)胶原蛋白和层粘连蛋白332(层粘连蛋白V)或(iii)层粘连蛋白332(层粘连蛋白V)。在一个实施方式中，ECM包含纤连蛋白和胶原蛋白，所述纤连蛋白和胶原蛋白优选包含原纤维性且亲水性表面。在另一个实施方式中，ECM包含胶原蛋白和层粘连蛋白332(层粘连蛋白V)。在又一个实施方式中，ECM包含层粘连蛋白332(层粘连蛋白V)。在一个实施方式中，水合ECM是折叠的。

另一方面，本发明提供了一种细胞培养皿表面，其包含经由水合细胞外基质(ECM)附着于细胞培养皿表面的原代人类癌细胞，其中ECM包含：(i)纤连蛋白和胶原蛋白；(ii)胶原蛋白和层粘连蛋白332(层粘连蛋白V)或(iii)层粘连蛋白332(层粘连蛋白V)。在一个实施方式中，ECM包含纤连蛋白和胶原蛋白，所述纤连蛋白和胶原蛋白优选包含原纤维性且亲水性表面。在另一个实施方式中，ECM包含胶原蛋白和层粘连蛋白332(层粘连蛋白V)。在又一个实施方式中，ECM包含层粘连蛋白332(层粘连蛋白V)。在一个实施方式中，水合ECM是折叠的。

临床试验

本发明的用于制备用于临床试验的原代细胞的方法可以可选地包括在培养步骤之后进行细胞样品的临床试验的步骤。因此，在试验前的适当时间，可从上述抗脱失巢凋亡制备条件中移出活病变细胞样品，以对样品进行一个或多个临床试验。临床试验可以是使用旨在提供临床相关和/或有用结果的原代细胞的任何临床试验，包括但不限于诊断试验、遗传试验和确定特定治疗方案的试验。

在一个实施方式中，使用生物传感器进行临床试验。因此，根据本发明的方法，活病变细胞样品可以在临床试验之前附着到生物传感器表面(例如使用本文所述的抗失巢凋亡附着条件)。可以使用本发明提供的培养的初级细胞所进行的基于生物传感器的测定的非限制性示例包括用于确定试剂是否引起活病变细胞的细胞粘着改变和信号传导途径活性改变的测定，例如在Laing等的美国专利公开20130330761和20150125894中描述的测定，两者的全部内容通过引用整体明确并入本文。

在一个实施方式中，评价根据本文所述的任何培养方法制备的活病变细胞样品以确定添加的试剂是否引起活病变细胞的细胞粘着改变和信号传导途径活性改变。在某些实施方式中，将这些细胞制备方法与评价作为靶向治疗剂的第一试剂是否对其旨在解决的信号传导途径起作用以确定靶向治疗剂是否在患者癌细胞中起作用的方法组合。这种方法可以包括：

在不含血清的培养基中培养从受试者获得的活癌细胞样品，其中所述培养基还可以包含本文所述的任何抗失巢凋亡成分或条件；

使样品与第一试剂和第二试剂接触，所述第二试剂已知选择性地影响第一试剂旨在解决的相同信号传导途径，从而根据对细胞粘着或附着的影响所测量的而上调或下调信号传导途径，以产生与第一试剂和第二试剂两者接触的样品；

相对于从样品单独与第一试剂或第二试剂接触的受试者获得的活癌细胞样品，连续测量在与第一试剂和第二试剂两者接触的样品中的活细胞的细胞粘着或附着；

通过连续测量的数学分析确定了与单独接触第一试剂或第二试剂的样品相比，在与第一试剂和第二试剂两者接触的样品中是否发生了细胞粘着或附着变化；以及

选择在受试者体内用于治疗用途的第一试剂，其中与单独的第一试剂或第二试剂相比，第一试剂与第二试剂的组合引起细胞粘着或附着变化，表明第一试剂在受试者癌细胞的细胞信号传导途径中起作用。

在其它实施方式中，将这些细胞制备方法与评价靶向HER家族受体的治疗剂在从受试者获得的活癌细胞样品中是否起作用的方法组合。这种评价方法可以包括：

在不含血清和生长因子的培养基中培养从受试者获得的活癌细胞样品；

(1)使样品的第一部分与靶向HER家族受体的治疗剂和神经调节蛋白接触，和/或(2)使样品的第二部分与靶向HER家族受体的治疗剂和表皮生长因子接触；

(1)相对于样品与治疗剂或神经调节蛋白单独接触的从受试者获得的活癌细胞样品，在与治疗剂和神经调节蛋白两者接触的样品的第一部分中的活细胞的细胞粘着或附着，和/或(2)相对于样品与治疗剂或表皮生长因子单独接触的从受试者获得的活癌细胞样品，在与治疗剂和表皮生长因子接触的样品的第二部分中，连续测量活细胞的细胞粘着或附着；

(1)与单独接触治疗剂或神经调节蛋白的样品相比，在与治疗剂和神经调节蛋白两者接触的第一部分中，和/或(2)与单独接触治疗剂或表皮生长因子的样品相比，在与治疗剂和表皮生长因子两者接触的第二部分中，通过连续测量的数学分析确定是否发生细胞粘着或附着变化；以及

选择用于治疗受试者的治疗剂，其中(1)与单独的治疗剂或神经调节蛋白相比，在第一部分中，和/或(2)与单独的治疗剂或神经调节蛋白相比，在第二部分中，发生细胞粘着或附着变化，表明治疗剂在受试者癌细胞中起作用。

在实施方式中，评价根据本文所述的任何培养方法制备的活病变细胞样品以确定添加试剂是否引起活病变细胞的细胞粘着改变和信号传导途径活性改变。在某些实施方式中，将这些细胞制备方法与评价作为靶向治疗剂的第一试剂是否对其旨在解决的信号传导途径有影响以确定靶向治疗剂是否在受试者癌细胞中起作用的方法组合。这种方法可以包括：

在不含血清并含有所选择的已知影响细胞信号传导功能的天然试剂或因子的培养基中培养从受试者获得的活癌细胞样品，所述细胞信号传导功能可导致对靶向治疗剂或第二试剂的敏感性或抗性；

相对于样品单独与第一试剂或第二试剂接触的从受试者获得的活癌细胞样品，连续测量在与第一试剂和第二试剂两者接触的样品中的活细胞的细胞粘着或附着；

选择在受试者体内用于治疗用途的第一试剂，其中与单独的第一试剂或第二试剂相比，第一试剂与第二试剂的组合引起细胞粘着或附着变化，表明在抗性或敏感性试剂或因子存在下第一试剂在受试者癌细胞的细胞信号传导途径中起作用。

使用根据本文所述的方法制备的原代细胞和/或使用本文所述的组合物(例如，原代细胞培养物、细胞培养皿表面、生物传感器表面)所进行的临床试验可用于诊断目的，例如用于诊断从中获得原代细胞样品的受试者是否具有特定的疾病或病症(例如癌症、自身免疫性疾病等)，其中已经确定了基于临床试验结果的诊断标准。

此外，基于临床试验的结果可以治疗从中获得原代细胞样品的受试者(例如，可以基于临床试验的结果来选择治疗方案)。例如，在一个实施方式中，将本文所述的细胞制备方法和组合物与治疗诊断患有癌症的人类受试者的方法组合，其中所选择的治疗方案基于使用本文所述的细胞制备方法和组合物的临床试验结果。在一个实施方式中，治疗被诊断患有癌症的人类受试者的这种方法包括：

通过包括以下步骤的方法向受试者施用第一试剂，该第一试剂已经被确定为在受试者癌细胞中在其旨在解决的信号传导途径中具有治疗活性的靶向治疗剂：

培养(例如，根据本文所述的培养方法)包含从受试者获得的活癌细胞(例如，原代癌细胞和/或转移癌细胞)的样品；

相对于样品单独与第一试剂或第二试剂接触的从受试者获得的活癌细胞样品，连续测量在与第一试剂和第二试剂两者接触的样品中的活原发性或转移性癌细胞的细胞粘着或附着(例如，使用生物传感器，其中根据本文所述的方法，活细胞附着于生物传感器表面)；

通过连续测量的数学分析确定输出值，其表示为百分比，其表征了与单独接触第一试剂或第二试剂的样品相比，在与第一试剂和第二试剂两者接触的样品中是否已经发生细胞粘着或附着变化；以及

向受试者施用第一试剂，其中表征细胞粘着或附着变化的输出值等于或大于阈值(例如50％)，表明第一试剂在受试者癌细胞的细胞信号传导途径中具有治疗活性。

定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的具有相同含义。如果本部分中阐述的定义与在通过引用并入本文中的专利、申请、公开申请和其它出版物中陈述的定义相反或不一致，则本部分阐述的定义优先于通过引用并入本文的定义。本文中使用的以下术语意在具有以下定义。

本文中使用的术语“约”意指大致地、在其左右、粗略地或在其附近。当术语“约”与数值范围结合使用时，它通过扩大在所述数值之上和之下的边界来修饰该范围。一般而言，术语“约”在本文中用于修饰高于和低于所述值10％变量的数值。在一个方面中，术语“约”是指正在使用的数字的数值加或减20％。因此，约50％是指在45％-55％的范围内。本文中通过端点列举的数值范围包括包含在该范围内的所有数字和分数(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.90、4和5)。

与细胞结合的术语“活化剂”、“活化”或“干扰剂”、“干扰”是指使用试剂、有机分子、信号传导因子、生物化学物质、核酸或本领域技术人员熟知的对细胞具有作用的蛋白等对细胞进行生理学操纵的特定对象或活性。该作用是指对细胞生理活性的任何调节，并且可以包括但不限于上调或下调。

术语“失巢凋亡”是指导致静息、衰老的活性并且最终可以导致细胞死亡，其通过锚定依赖性细胞的粘着分子的信号传导来诱导，因为锚定依赖性细胞与周围的细胞外基质(ECM)和相邻细胞分离。通常细胞保持靠近它们所属的组织，因为近端细胞之间以及细胞与ECM之间的连通为调节生长和存活提供了重要信号。当细胞从其本身的ECM或其相邻者分离时，正常的细胞-基质和细胞-细胞相互作用丧失，并且细胞将启动失巢凋亡信号传导。本发明的目的在于防止原代细胞的失巢凋亡信号传导和原代患者病变细胞的失巢凋亡相关活性，使得所述细胞可以用于患者的功能细胞的临床试验中，其可依赖于通过粘着相关介导的信号传导测量对干扰剂的反应。

术语“抗生素”是指抑制非哺乳动物细胞生长的分子量较低的天然或合成化学物质。首先发现它们天然地由各种微生物如细菌、放线菌和真菌产生，它们可以化学合成，或者可以将天然化合物化学修饰以产生半合成抗生素。抗生素的主要种类是：(1)β-内酰胺类，包括青霉素、头孢菌素和单菌霉素；(2)氨基糖苷类，例如庆大霉素、妥布霉素、奈替米星和阿米卡星；(3)四环素类；(4)磺胺类和甲氧苄氨嘧啶；(5)氟喹诺酮类，例如环丙沙星、诺氟沙星和氧氟沙星；(6)万古霉素；(7)大环内酯类，包括例如红霉素、阿奇霉素和克拉霉素；以及(8)其它抗生素，例如多粘菌素、氯霉素和林可酰胺。包括市售混合物(例如P/S/A-青霉素-链霉素-两性霉素B，也称为抗生素-抗霉菌溶液)。

术语“细胞凋亡”是指程序性细胞死亡并且是组织体内平衡的生理生长控制和调节的关键调控系统。细胞凋亡在调节肿瘤形成中起关键作用。许多抗癌疗法被设计用于激活癌细胞中的细胞凋亡信号转导途径。在一些细胞中，细胞凋亡可以是失巢凋亡之后的阶段。

术语“失巢凋亡抑制剂”是指抑制促失巢凋亡功能或使得内在或外在信号转导途径的抗失巢凋亡激活并由此抑制失巢凋亡的分子或条件。本发明中优选的抑制剂在一段时间后是可逆的。在这种情况下，可逆抑制剂涉及通过施用试剂而引起的抑制，所述试剂在除去试剂时不会维持对失巢凋亡的作用。可逆抑制剂被期望使得患者样品在试验前返回到其体内样状态。

术语“测定”是指用于确定例如靶标的存在、不存在、量、程度、动力学、动态学或类型的分析，诸如在用外在刺激(例如治疗剂)进行刺激时细胞的光学或生物阻抗响应。

术语“附着”是指例如通过物理吸收、化学键合、化学吸引等连接到表面的本公开的表面改性物质、细胞、配体候选化合物等实体，或其组合。特别地，“细胞附着”、“细胞粘着”或“细胞样品附着”是指例如通过培养或与细胞锚定材料相互作用等使细胞结合在一起或与表面相互作用。

术语“附着图案”是指细胞或细胞样品与表面的连接的可观察特征或特性。附着图案可以是定量的，例如附着位点的数量。附着图案也可以是定性的，例如优选的与水合细胞外基质附着的分子位点。

术语“基础形态”是指在引入试剂或刺激之前细胞或细胞样品的形式和结构。

术语“基线测量”是指待测试的一组细胞的生理起始点，并且基于对在添加药物之前一段时间内的测量的评价。

术语“生物传感器”是指测量分析物或细胞中分析物或生理条件变化的器件。在实施方式中，生物传感器通常包含三部分：结合或鉴定分析物的生物组分或元件(包括非限制性示例，例如细胞外基质、细胞信号传导分子或细胞增殖、组织、细胞、代谢物、分解代谢产物、生物分子、离子、氧气、二氧化碳、碳水化合物、蛋白质等)、检测器元件(以物理化学方式例如光学、压电、电化学、温度计或磁性方式操作)以及与这两种部件相关联的换能器。术语“生物传感器”包括光学生物传感器和阻抗生物传感器。术语“光学生物传感器”是指测量荧光、吸收、透过率、密度、折射率和光反射的器件。在实施方式中，光学生物传感器可以包括用于将活细胞中的分子识别或分子刺激事件、病原体或其组合转变为可定量信号的光学换能器。另外，实施方式可以包括光子晶体器件、光波导器件和表面等离子体共振器件。术语“阻抗生物传感器”是指测量活患者细胞的复阻抗变化(ΔZ或dZ)的器件，其中阻抗(Z)与电压和电流的比率相关，如欧姆定律所述(Z＝V/I)。它对与细胞的电极接口处的局部离子环境敏感，并检测根据电压和电流波动的这些变化。由于细胞正常功能或对细胞干扰引起的细胞生理变化导致电极周围电流的可量化变化，并影响所测信号的幅度和特性。在实施方式中，阻抗生物传感器可以包括用于将活细胞中的分子识别或分子刺激事件、病原体或其组合转换成可定量信号的电极或电路。在实施方式中，ISFET生物传感器可以包括用于将活细胞中的分析物识别或细胞刺激事件、病原体或其组合转换为可定量信号的离子选择性场效应电换能器。当ISFET生物传感器中的分析物浓度改变时，晶体管中的电流改变，这产生量化信号。

术语“细胞粘着”是指细胞与另一细胞、细胞外基质组分或表面(例如微量滴定板)的接合。

术语“细胞增殖”是指由于细胞生长和细胞分裂引起的细胞数量增加。

术语“细胞样品”是指从特定受试者分离的细胞，其中细胞分离自受试者的生物体液、排泄物或组织。从组织分离的细胞可以包括肿瘤细胞。从组织分离的细胞包括均化组织、细胞提取物及其组合。细胞样品包括但不限于乳腺组织、胃组织、结肠/肠组织、肺组织、头部组织、颈部组织、腮腺组织、卵巢组织、子宫组织、子宫颈组织、前列腺组织、胰腺组织、肾/肾组织或骨和/或骨髓、血液、血清、血浆、尿液、精子、精液、精浆、前列腺液、预射精液(考珀氏液)、排泄物、眼泪、唾液、汗液、任何实际形式的活检、腹水、手术切除部、脑脊液、淋巴液、骨髓或头发。

术语“细胞信号传导”是指信息的细胞内或细胞间转移。细胞信号传导可以通过细胞之间、细胞与ECM之间的直接接触或通过由另一个细胞摄取的一个细胞所释放的物质来实现。细胞间信号传导可以通过两个分子(例如配体和受体)之间的相互作用发生。受体结合可触发细胞内信号传导级联(例如启动细胞内生物化学变化或修饰膜电位)。

术语“细胞存活”是指通过用于执行特定功能例如新陈代谢、生长、运动、繁殖、某种形式的反应性和适应性的能力所表征的细胞的存活力。

术语“化学上定义的”是指化学组合物内的各个单独组分的结构、化学式、组成以及百分比是已知的或可以定义的。为此，在本发明中，培养基不含通常为组织培养目的而制备的任何动物血清。它也不含具有未知/未定义化学成分的任何组织提取物。化学上定义了支持来自各个患者的异质病变细胞类型群体的所需生长/增殖所需的所有必要组分。

术语“细胞支架组织”是指细胞内部支架的排列。细胞的细胞支架包含用于支持细胞质或膜元件和/或细胞内细胞器的丝状体。细胞支架也有助于保持细胞的形状。

术语“病变细胞样品”或“病变细胞群”或“病变细胞”是指病变细胞的混合物，尤其是从个体患者的肿瘤或病变组织或体液中提取的上皮细胞的混合物。病变细胞样品可以来自特征为异常生长的组织或体液。细胞样品在特定亚型的组成方面是异质的，并且可以包括例如分化的或未分化的管腔细胞、肌细胞、基底细胞、干细胞、上皮间叶细胞连续体上的细胞，或特别是所有上述的混合物(在它们代表了患者肿瘤的体内状况的情况下)。已经认识到特定的癌症内在亚型可能具有不同百分比的某些类型病变细胞，例如，ER+乳腺癌被称为管腔上皮细胞癌，并且因此可能具有高比例的管腔谱系的提取细胞和较少百分比的其它上皮细胞类型。另一个示例-三阴性乳腺癌被称为基底上皮细胞癌，因此可能具有较高比例的基底细胞谱系的提取病变细胞和较少百分比的其它上皮细胞类型。样品尤其可以包含活的、或复制能力强的、或分裂的、或非分裂的细胞、或处于细胞循环中的任何点或组合点处。细胞可以进入或不进入失巢凋亡，或完全处于失巢凋亡的任何级别。可以根据其疾病途径活性选择细胞样品。

术语“细胞外基质组分”或“ECM组分”是指存在于动物的细胞外基质中的分子。该分子可以是来自任何物种和任何组织类型的细胞外基质的组分。细胞外基质组分的非限制性示例包括层粘连蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白、其它糖蛋白、肽、糖胺聚糖、蛋白多糖等。细胞外基质组分还可以包括生长因子。

术语“细胞外基质涂层”是指细胞培养表面上的涂层，其包含可存在于细胞外基质中的一种或多种作为天然存在的生物分子或生物化学物质的分子，或衍生自或基于一种或多种天然存在的生物分子或生物化学物质的生物化学物质。例如，细胞外基质涂层可包含例如纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、其它糖蛋白、肽、糖胺聚糖、蛋白聚糖、玻连蛋白、细胞间CAM、血管CAM、MAdCAM)或其衍生物，或可包含生物化学物质例如聚赖氨酸或聚鸟氨酸，它们是基于天然存在的生物化学物质赖氨酸和鸟氨酸的聚合物分子。基于天然存在的生物化学物质例如氨基酸的聚合物分子可以使用天然存在的生物化学物质的异构体或对映异构体。涂层还可以包括对所述细胞表面蛋白具有亲和性的细胞表面受体或细胞表面同源结合蛋白。理想地，通过将ECM分子与特定细胞类型和信号传导途径匹配，从可用的属和种中选择用于涂层的细胞外基质。

术语“外在失巢凋亡”是指与活细胞的外在信号转导途径有关的活性。外在途径可以被质膜上的死亡受体(例如肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)和Fas/CD95)激活。当配体与这些受体结合时，形成死亡诱导信号传导复合物(DISC)，导致启动酶级联(其中半胱天冬酶级联是其成员)和进一步的下游失巢凋亡事件。

术语“外在失巢凋亡抑制剂”是指通过影响(例如干扰)外在失巢凋亡途径来抑制失巢凋亡的试剂，例如抑制质膜上的死亡受体活性的试剂(例如TNFR1、ALK5/TGFBR1、Fas/CD95)。外在失巢凋亡抑制剂的非限制性示例包括结合到死亡受体或以其它方式抑制死亡受体活性的试剂，例如抗体和Ig融合蛋白(例如针对TNFR1、ALK5/TGFβR1或Fas/CD95)，以及结合到死亡受体配体或以其它方式抑制死亡受体配体活性的试剂，例如抗体和Ig融合蛋白(例如针对TFNα、TGFβ或FasL)。外在失巢凋亡抑制剂的其它非限制性示例包括抑制死亡受体的信号传导的小分子试剂(例如抑制通过TNFR1、ALK5/TGFBR1或Fas/CD95的信号传导)、WNT信号传导激动剂。外在失巢凋亡抑制剂的其它非限制性示例包括抑制失巢凋亡的整联蛋白稳定剂和整联蛋白配体。

术语“折叠细胞外基质”是指ECM，其是可再现的、有序且结构化排列的包含ECM的天然状态的蛋白组分。

术语“健康细胞样品”是指这样的细胞样品，其中细胞不具有正在测试的疾病或从不具有正在测试的疾病的组织中提取。例如，当对于针对受试者乳腺癌的治疗剂的作用测试特定受试者时，非癌细胞或来自非乳腺组织的细胞被认为是“健康的”。术语“健康细胞样品”不是对受试者整体健康状态的确定或反映。

术语“水合细胞外基质”是指从细胞外基质组分制备的细胞外基质，所述细胞外基质组分已经被施用于预期供人类细胞附着的表面，并且在施用至表面之后保留足够的水，使得ECM完全润湿并且在使用前决不允许脱水。

术语“低氧”是指小于20.094％氧分压(所谓的常氧)的细胞样品条件。大气中的氧分压在海平面处为20.094％，据报道大多数癌细胞经历的体内氧分压小于2％。据报道，非常低的氧含量和高含氧量(例如常氧，20％氧气)导致大多数细胞特别是原代细胞进入失巢凋亡。

术语“内在失巢凋亡”是指与活细胞的内在信号转导途径有关的活性。内在失巢凋亡途径的特征在于，线粒体膜的透化作用和细胞色素c释放到细胞质中。细胞色素c然后可以形成多蛋白复合物并启动半胱天冬酶级联的激活和进一步的下游失巢凋亡事件。

术语“内在失巢凋亡抑制剂”是指通过影响(例如干扰)内在途径抑制失巢凋亡的试剂，例如抑制线粒体膜透化作用和/或细胞色素C释放到细胞质中的试剂。内在失巢凋亡抑制剂的非限制性示例包括应激抑制剂，例如氧化还原缓冲剂和活性氧类抑制剂。

术语“样品”是指可包含要使用本公开的装置、微孔板或方法分离、操作、测量、量化、检测或分析的部分的任何物质。样品可以是生物样品，例如生物体液或生物组织。生物体液的示例包括细胞在诸如细胞培养基等的培养基中的悬浮液、尿液、血液、血浆、血清、唾液、精液、粪便、痰、脑脊液、眼泪、粘液或羊水等。生物组织是细胞的聚集体，通常是特定种类的细胞与形成人、动物、植物、细菌、真菌或病毒结构的结构材料之一的其细胞间质一起的聚集体，包括结缔组织、上皮组织、肌肉组织和神经组织。生物组织的示例还包括器官、肿瘤、淋巴结、动脉和个体细胞。生物样品可进一步包括细胞悬浮液、包含生物分子(例如蛋白、酶、核酸、碳水化合物、结合生物分子的化学分子)的溶液。

术语“无血清”或“不含血清的培养基”是指基本上不含血清或组织提取物的细胞培养基。在某些实施方式中，培养基中存在0％(完全不含)或少于约0.001％、0.005％、0.01％、0.10％或1.0％的总血清。血清类型的示例包括：各种形式的牛血清(小牛血清、胎牛血清、牛小牛血清、供体牛小牛血清、定义的胎牛血清、新生牛小牛血清等)、马血清和人血清、葡聚糖提取的血清、热灭活的血清、γ-照射的血清、热失活-葡聚糖提取的血清。

术语“共有途径失巢凋亡抑制剂”是指通过影响(例如干扰)由内在和外在失调途径共有的细胞信号传导途径或组分而抑制失巢凋亡以使得共有的抑制剂可有效抑制外在失巢凋亡和内在失巢凋亡的试剂。共有途径失巢凋亡抑制剂的非限制性示例包括Rho相关激酶抑制剂、半胱天冬酶抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、WNT信号传导激动剂和细胞色素C抑制剂。

术语“基本上不含”是指从其它组分中分离出的至少约90％、优选95％、99％或更多的百分比。组分例如可以是本文所述的其它细胞、试剂、蛋白、肽、化合物或组合物。

术语“协同作用”或“协同效应”是指两种以上试剂的相互作用，其中两种以上试剂的组合作用大于每种试剂的各自(单独)作用的总和。

术语“靶向途径药物”、“途径药物”或“靶向药物”是指具有治疗能力的任何分子或抗体，其被设计为与参与疾病过程的特定生物分子(例如蛋白质)结合，从而调节其活性。

术语“治疗剂”是指任何合成的或天然存在的生物活性化合物或物质组合物，当其施用于生物体(人类或非人类动物)时，通过局部和/或全身作用诱导期望的药理学、免疫原性和/或全身作用。该术语包括那些传统上被认为是药物的化合物或化学品、疫苗和包括如蛋白、肽、激素、核酸、基因构建体的分子生物药物等。该试剂可以是用于医疗(包括兽医应用)和农业方面(例如用于植物)以及其它领域的生物活性剂。术语治疗剂还包括但不限于药物；维生素；矿物质补充剂；用于治疗、预防、诊断、治愈或缓解疾病或病患的物质；或影响身体结构或功能的物质；或在置于预定生理环境后具有生物活性或更具活性的前药。治疗剂包括但不限于抗癌治疗剂、抗精神病药、抗炎剂和抗生素。

在给定范围的情况下，包括端点。此外，应该理解的是，除非另外指出或者从本领域普通技术人员的背景和理解中显而易见，作为范围表达的值可以采取在本发明的不同实施方式中的所述范围内的任何具体值或子范围，到该范围下限单位的十分之一，除非上下文另有明确规定。

所有引用的资料，例如专利、专利出版物、参考文献、出版物、数据库、数据库条目和本文中引用的技术，均通过引用整体并入本申请中，即使引用时没有明确说明。在所引用资料和本申请发生冲突的情况下，本申请中的陈述应予以主导。

实施例

通过参考以下实施例将更全面地理解本发明。然而，它们不应被解释为限制本发明的范围。应该理解，这里描述的实施例和实施方式仅用于说明的目的，并且对于本领域技术人员将暗示对其的各种修改或改变，这些将被包括在本申请的精神和权限以及所附权利要求的范围内。

实验设计讨论

将如本发明所述获得和培养原代病变细胞的方法用于制备用于临床试验的病变细胞。

通常理解，蛋白结合和失巢凋亡的生物化学原理在附着至ECM的不同细胞类型中是通用的，与它们的来源组织无关。因此，本文所述的方法广泛适用于可附着于ECM的所有细胞类型，而不管其来源组织任何。

以下提供的三个实施例证明了用于制备本文所述的用于临床试验的原代细胞的方法的各种实施方式。具体而言，这些实施例证明了当培养细胞样品时使用1)10％氧气条件，或2)一种或多种失巢凋亡抑制剂，或3)水合和折叠ECM时具有优点。使用“一次一个变量”方法，将这三个变量中的每一个相对于传统条件进行独立评价。当这些变量在三个实施例中被隔离时，它们被标记用于讨论目的作为“改进”条件，以及它们所比较的条件被标记为“常规”条件。

实施例1-对在不同氧气条件下的培养方法的比较

实施例2-对具有和不具有一种或多种失巢凋亡抑制分子的培养方法的比较

实施例3-对具有和不具有水合和折叠ECM的培养方法的比较

实施例中使用的因子

组织：在这些实施例中使用从两个不同患者样本获得的病变乳腺组织(C54、C517A)。肥厚型乳腺癌组织提供了示例性的组织模型，因为它们的失巢凋亡和失巢凋亡调节机制代表了其它病变组织类型。此外，乳腺癌占美国每年诊断的所有癌症的20％以上，并且它是女性中最常见的癌症形式。如本文所述使用组织样本收集技术获得来自患者的组织。所测试的每个细胞样品是从单独的等份病变乳腺组织中提取的。每个样本等份包括30毫克组织。

细胞：选择从患者乳腺组织样本提取的病变上皮细胞进行测试。上皮细胞是示例性的细胞模型，因为发现它们的失巢凋亡和失巢凋亡调节机制代表了其它肿瘤细胞类型。

失巢凋亡抑制剂。在这些实验中使用三种失巢凋亡抑制剂分子-单独和组合使用Rho-激酶抑制剂、半胱天冬酶抑制剂和MMP3抑制剂。这些中的每个影响不同的失巢凋亡调节途径及其相关功能(包括它们如何广泛互联、通过结合调节)，涉及酶活性如蛋白切割、磷酸化和去磷酸化，以及控制关键的细胞功能。

细胞外基质(ECM)涂层。评价两种类型的ECM涂层：1)水合和折叠的；2)非水合和非折叠的。每个涂层包含人胶原蛋白I和人纤连蛋白。

氧气。评价具有三种不同氧气浓度的气氛条件：1)2％氧气；2)10％氧气；3)20％氧气。

评价培养条件

培养病变细胞样品的两个关键目标是扩大细胞集落的大小和可用于测试的细胞数量。与来自不同条件组的结果相比，导致细胞数量和细胞集落尺寸更高的培养条件组是优异的。

在以下三个实施例的每一个中，除了一个变量外，在相同的条件下培养细胞样品，然后进行比较。为了比较特定培养条件变量对从同一患者获得的细胞样品的影响，使用两种不同的度量-细胞计数和细胞集落大小改变。细胞计数允许并行比较不同培养条件下产生的细胞数量的增加。细胞集落大小允许比较不同培养条件下产生的细胞集落大小的变化。每个度量都提供了对培养后细胞样品状态的不同见解。细胞计数提供了对培养条件的短期评价，而细胞集落尺寸改变给出关于细胞样品总体长期稳健性的指示。

三个不同实施例的每一个都被设计用来区分三个关键变量-气氛氧气浓度、存在或不存在失巢凋亡抑制剂、以及ECM涂层类型中的每一个对细胞样品的影响。在每个实施例中，相对于“常规”条件测试“改进”条件。改进条件旨在通过降低失巢凋亡对细胞样品的有害作用来改善细胞培养的结果。在每个实施例中，在细胞样品已经被培养多天后测量细胞计数和细胞集落大小，以测量细胞样品内改善失巢凋亡的效果。如果一组条件导致更高的细胞计数和细胞集落大小，则那些条件相对于其比较物而言将被认为是优异的。

细胞计数。使用电子细胞计数仪Countess(Life Technologies)来计数每次实验结束时细胞样品中的细胞数量。在每个实施例中，在两种不同条件下并行测试来自同一患者的两种单独的组织等份的两种细胞样品。在计数之前，将细胞样品用台盼蓝处理以使得能够区分活细胞和死细胞。仅计数活细胞(不被台盼蓝染色的细胞)。培养五天后，对所有细胞样品重复计数，并记录细胞计数。通过计算“改进”细胞培养和“常规”细胞培养之间的相对百分比差异来比较来自并行培养的每种细胞样品的细胞计数。5天后相对于其比较物产生更高的细胞数量的细胞培养条件被认为是优异的。

细胞集落大小。为了量化细胞样品中细胞集落大小的变化，在培养开始后的第一天(早期)对四个细胞集落的大小进行评价，并与第二天(后期)那四个集落的大小进行比较。在培养开始后48小时拍摄第一图像，后48-96小时拍摄第二图像。为了测量菌落大小，使用40x倒置显微镜制作菌落图像，然后通过确定每个菌落覆盖的像素数量来定量细胞集落的面积。对于在两种不同条件下的每个细胞样品计算第一图像和第二图像之间的四个菌落总大小的绝对变化并记录。然后通过计算“改进”细胞培养与“常规”细胞培养之间的相对百分比差异来比较菌落大小的这种变化。相对于其比较物产生更大的细胞集落大小变化的细胞培养条件被认为是优异的。

实施例1：在三种不同的氧气条件下比较培养方法

在该实施例中，在三种不同的氧气条件：1)10％氧气条件(“改进”条件)；2)低氧(2％)氧气条件；3)常氧(20％)条件下，在提取培养基和初始培养基中制备来自患者C517的原代细胞样品，所述培养基在包含水合和折叠ECM涂层的细胞培养表面上含有至少一种失巢凋亡抑制剂。2％和20％氧气条件代表“常规”条件。

本实施例的细胞样品制备如下：

获得人类病变组织样本，并通过去除明显脂肪部分并将样本切成1-4mm大小的碎片来进行初步制备。然后将切碎的样本分成等份，每份30毫克大小。

通过将样品在提取培养基中翻滚至少三小时(“提取期”)而从切碎的样本样品中提取病变细胞，该提取培养基不含血清并且包括DMEM/F12培养基、胶原酶和透明质酸酶的混合物(消化酶)和至少一种失巢凋亡抑制剂分子。此外，培养基包含另外的成分，包括：表皮生长因子、雌二醇、Ca2+、Mg2+、三碘甲状腺原氨酸、四碘甲状腺原氨酸、谷胱甘肽、腺嘌呤。

从提取培养基中回收从组织样品中提取的细胞，并将其铺板在包含由胶原蛋白和纤连蛋白的组合组成的水合和折叠细胞外基质的表面上。

然后将细胞样品在用于提取的培养基(如上所述)中培养，但该培养基中去除了消化酶(胶原酶和透明质酸酶)。

将所有组织样品在37℃、5％CO₂、85％相对湿度和2％、10％或20％氧气(评价变量条件)下培养。

然后通过用温和的酶去除过程处理以将细胞从培养皿中取出，然后洗涤并转移到试验容器中。

所培养的三种样品的结果显示在表3和表4中。在每个表中，将“改进”条件(10％氧气)与常规条件(2％或20％氧气)进行比较。记录细胞计数和细胞集落大小变化，并记录优化条件与常规条件之间的百分比差异。以像素记录细胞集落大小变化。

表3

10％氧气相比于2％氧气

与2％的条件相比，在10％氧气条件下的细胞计数和细胞集落大小都显著更高。这些证明了培养活细胞样品时使用10％氧气相比于2％氧气(低氧)条件的优异性。

表4

10％氧气相比于20％氧气

与20％的条件相比，在10％氧气条件下的细胞计数和细胞集落大小都显著更高。因此，这些结果证明了在培养活细胞样品时使用10％氧气相比于20％氧气(常氧)条件的优异性。

总之，这些实施例证明了在常氧条件(20％)以下和低氧气条件(2％)以上的气氛条件下培养细胞的优异性。2％和20％条件的结果是相当的，这表明细胞样品结果随着氧气浓度集中到10％而改善。因此，本领域普通技术人员将容易地理解本文呈现的结果，即高于2％且低于20％的任何氧气浓度优于通常用于培养细胞的低氧(2％)或常氧(20％)氧气浓度。

实施例2：对具有和不具有一种或多种失巢凋亡抑制分子的培养方法的比较

在这个实施例中，测试了来自两名患者C54和C517的原代细胞样品以区分失巢凋亡抑制剂分子对细胞计数和细胞集落大小的影响。将每种细胞样品在包含水合和折叠ECM涂层的细胞培养表面上并在10％氧气条件下培养。将样品在五种不同培养基之一中培养，所述培养基的不同之处仅在于不存在任何失巢凋亡抑制剂分子，或单独存在三种不同失巢凋亡抑制剂分子之一，或组合存在三种不同失巢凋亡抑制剂分子，如下：1)没有失巢凋亡抑制剂分子；2)半胱天冬酶抑制剂；3)MMP3抑制剂；4)Rho相关激酶抑制剂；5)半胱天冬酶、MMP3和Rho相关激酶抑制剂的组合。

本实施例的细胞样品制备如下：

通过将样品在提取培养基中翻滚至少三小时(“提取期”)而从切碎的样本样品中提取病变细胞，该提取培养基不含血清并且包括DMEM/F12培养基、胶原酶和透明质酸酶的混合物(消化酶)，以及：1)没有失巢凋亡抑制剂；2)半胱天冬酶抑制剂；3)MMP3抑制剂；4)Rho相关激酶抑制剂；或5)半胱天冬酶、MMP3和Rho相关激酶抑制剂的组合(评价变量条件)。此外，所评价的五种不同可选培养基中的每一种培养基包含另外的组分，包括：表皮生长因子、雌二醇、Ca2+、Mg2+、三碘甲状腺原氨酸、四碘甲状腺原氨酸、谷胱甘肽、腺嘌呤。

将所有组织样品在37℃、5％CO₂、85％相对湿度和10％氧气下培养。

然后通过用温和的酶去除过程处理以将细胞从培养皿中取出，然后洗涤并转移到测试容器中。

所培养的三个样品的结果显示在表5-8中。在每个表中，将“改进”条件(一种或多种失巢凋亡抑制剂)与常规条件(无失巢凋亡抑制剂)进行比较。记录细胞计数和细胞集落大小变化，并记录优化条件与常规条件之间的百分比差异。以像素记录细胞集落大小变化。

表5

Rho-激酶失巢凋亡抑制剂相比于无失巢凋亡抑制剂分子(患者C517)

表6

半胱天冬酶失巢凋亡抑制剂相比于无抑制剂(患者C54)

表7

MMP3失巢凋亡抑制剂相比于无抑制剂(患者C54)

表8

三种失巢凋亡抑制剂相比于无抑制剂分子(患者C517)

与在无失巢凋亡抑制剂的情况下培养的细胞样品比较物相比，在包含一种或多种失巢凋亡抑制剂分子的培养基中制备的每个细胞样品中的细胞计数和细胞集落大小都更高。因此，这些结果证明了在培养活细胞样品时在培养基中使用一种或多种失巢凋亡抑制剂的优异性。此外，由于评价了影响三种不同失巢凋亡相关途径的三种不同失巢凋亡抑制剂分子，并且发现每种失巢凋亡抑制剂分子都产生了优异的结果，所以该实施例证明使用失巢抑制剂分子的优点在本质上是一般性的，并且不限于一种特定分子或一类失巢凋亡抑制剂。

实施例3：对具有和不具有水合和折叠ECM的培养方法的比较

在该实施例中，测试来自患者C54的原代细胞样品以区分用水合和折叠ECM涂覆细胞培养表面对细胞计数和细胞集落大小的影响。将每种细胞样品在10％氧气条件下在包含至少一种失巢凋亡抑制剂的培养基中在涂覆有1)水合和折叠ECM；或2)非水合非折叠ECM的细胞培养皿中培养。

本例的细胞样品制备如下：

获得人肿瘤组织样本，并通过去除明显脂肪部分并将样本切成1-4mm大小的碎片来进行初步制备。然后将切碎的样本分成等份，每份30毫克大小。

通过将样品在提取培养基中翻滚至少三小时(“提取期”)而从切碎的样本样品中提取病变细胞，该提取培养基不含血清并且包括DMEM/F12培养基、胶原酶和透明质酸酶的混合物(消化酶)，和至少一种失巢凋亡抑制剂分子。此外，培养基还包含另外的成分，包括：表皮生长因子、雌二醇、Ca2+、Mg2+、三碘甲状腺原氨酸、四碘甲状腺原氨酸、谷胱甘肽、腺嘌呤。

从提取培养基中回收从组织样品中提取的细胞，并将其铺在包含：1)由胶原蛋白和纤连蛋白的组合组成的水合和折叠细胞外基质；或2)非水合非折叠细胞外基质(评价变量条件)的表面上。

所有组织样品在37℃、5％CO₂、85％相对湿度和10％氧气下培养。

所培养的两个样品的结果显示在下面的表9中。在该表中，将“改进的”条件(水合和折叠ECM)与常规条件(非水合非折叠ECM)进行比较。记录细胞计数和细胞集落大小变化，并记录优化条件与常规条件之间的百分比差异。以像素记录细胞集落大小变化。

表9

水合/折叠ECM相比于非水合/非折叠ECM

与使用非水合和非折叠ECM制备的细胞样品相比，使用水合和折叠ECM制备的每个细胞样品中的细胞计数和细胞集落大小都更高。因此，这些结果证明了在培养活细胞样品时使用涂覆有水合和折叠ECM的细胞培养皿的优异性。

Claims

1.一种制备从人类受试者获得的用于临床试验的活的病变细胞样品的方法，所述方法包括：

在包含大于2％且小于20％氧气的条件下，在包含至少一种失巢凋亡抑制剂的培养基中培养从人类受试者获得的活的病变细胞样品；以及

对所述活的病变细胞样品进行临床试验。

2.一种制备从人类受试者获得的用于临床试验的活的病变细胞样品的方法，所述方法包括：

在包含6-17％氧气的条件下，在包含至少一种消化酶和至少一种失巢凋亡抑制剂的培养基中培养从人类受试者获得的活的病变细胞样品；

在包含6-17％氧气的条件下，在包含至少一种失巢凋亡抑制剂并且不具有消化酶的培养基中培养所述样品。

3.一种制备从人类受试者获得的用于临床试验的活的病变细胞样品的方法，所述方法包括：

在涂覆有水合细胞外基质(ECM)的细胞培养皿表面上，在包含6-17％氧气的条件下，在包含至少一种失巢凋亡抑制剂的培养基中培养从人类受试者获得的活的病变细胞样品。

4.一种制备从人类受试者获得的用于临床试验的活的病变细胞样品的方法，所述方法包括：

在包含水合细胞外基质(ECM)的细胞培养皿表面上，在包含6-17％氧气的条件下，在包含至少一种失巢凋亡抑制剂的培养基中培养从人类受试者获得的活的病变细胞样品；以及

将所述活的病变细胞样品附着到包含水合细胞外基质(ECM)的生物传感器表面，其中所述ECM包含：(i)纤连蛋白和胶原蛋白；(ii)胶原蛋白和层粘连蛋白332(层粘连蛋白V)或(iii)层粘连蛋白332(层粘连蛋白V)，从而制备用于临床试验的所述样品。

5.一种制备从人类受试者获得的用于临床试验的活的病变细胞样品的方法，所述方法包括：

在包含6-17％氧气的条件下，在包含至少一种半胱天冬酶抑制剂、至少一种MMP3抑制剂和至少一种Rho相关激酶抑制剂的培养基中培养从人类受试者获得的活的病变细胞样品，从而制备用于临床试验的所述样品。

6.一种制备从人类受试者获得的用于利用生物传感器进行临床试验的活的病变细胞样品的方法，所述方法包括：

将活的病变细胞样品附着到包含水合细胞外基质(ECM)的生物传感器表面，所述水合细胞外基质(ECM)包含纤连蛋白和胶原蛋白；以及

使用生物传感器对所述活的病变细胞样品进行临床试验。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，在包含6-17％氧气的条件下培养所述样品。

8.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，在包含10％氧气的条件下培养所述样品。

9.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，在包含至少一种内在失巢凋亡途径抑制剂和至少一种外在失巢凋亡途径抑制剂的培养基中培养所述样品。

10.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述至少一种失巢凋亡抑制剂激动抗失巢凋亡途径。

11.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述至少一种失巢凋亡抑制剂选自激酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、应激抑制剂、死亡受体抑制剂、细胞色素C抑制剂和粘附相关失巢凋亡抑制剂。

12.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述至少一种失巢凋亡抑制剂选自Rho相关激酶抑制剂、ALK5抑制剂、半胱天冬酶抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、WNT信号传导激动剂、氧化还原缓冲剂、活性氧物质抑制剂、TNFα抑制剂、TGFβ抑制剂、细胞色素C释放抑制剂、无钙通道活化的碳酸酐酶拮抗剂、整联蛋白稳定剂、整联蛋白配体、Fas抑制剂、FasL抑制剂、Bax抑制剂和Apaf-1抑制剂。

13.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，在包含至少三种失巢凋亡抑制剂的培养基中培养所述样品。

14.根据权利要求1和3-5中任一项所述的方法，其中，使所述活的病变细胞样品在培养之前与消化培养基接触一段时间，其中，所述消化培养基消化组织而不引起失巢凋亡、细胞表面粘附分子损伤或非失巢凋亡方式的细胞死亡。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述消化培养基包含至少一种失巢凋亡抑制剂。

16.根据权利要求1和3-5中任一项所述的方法，其中，将所述活的病变细胞样品在包含至少一种失巢凋亡抑制剂的培养基中培养至少1小时。

17.根据权利要求16所述的方法，其中，在包含20％氧气的条件下，将所述活的病变细胞样品转移至不具有失巢凋亡抑制剂的培养基中。

18.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，将所述活的病变细胞样品在包含促进粘附途径激活的至少一种组分的培养基中培养。

19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述至少一种组分选自Ca²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、三碘甲状腺原氨酸、四碘甲状腺原氨酸、胎球蛋白、细胞外基质组分的溶液形式、纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、细胞间CAM、血管CAMS、MAdCAMS、糖胺聚糖、蛋白多糖和生长因子。

20.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，将所述活的病变细胞样品在包含促进粘附暂时消退的至少一种组分的培养基中培养，以利于将细胞从一个培养皿转移到另一个培养皿。

21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述至少一种组分选自Ca²⁺、Mg²⁺和/或Mn²⁺的螯合剂例如EGTA、EDTA、二价金属离子螯合剂、分散酶、TrypLE、胰蛋白酶、Accutase、Accumax、胶原酶、透明质酸酶、弹性蛋白酶、胰蛋白酶抑制剂、STEMxyme、链霉蛋白酶和脱氧核糖核酸酶。

22.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，将所述活的病变细胞样品在无血清培养基中培养。

23.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，将所述活的病变细胞样品在包含保持所述活的病变细胞的生理特性或基因组特性的至少一种组分的培养基中培养。

24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述保持所述活的病变细胞的生理特性或基因组特性的至少一种组分选自必需氨基酸和非必需氨基酸、维生素、稀有基本金属、pH缓冲剂、盐(Na+、K+、Fe、Zn、Cu)、亚硒酸盐、硅酸盐、葡萄糖或其它生物实用碳源、脂质、脂肪酸如硫辛酸、丙酮酸盐、转铁蛋白、生长因子、趋化因子、细胞因子、分裂素、乙醇胺、白蛋白、激素(例如孕酮、睾酮、雌二醇)、腐胺、丙酮酸盐、胸苷、亚油酸、叶酸、亚叶酸、胆碱、盐酸吡哆醛、生物素、次黄嘌呤、嘌呤和嘌呤衍生物、嘧啶和嘧啶衍生物。

25.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，将所述活的病变细胞样品在无血清培养基中培养以促进细胞增殖，所述无血清培养基包含促进细胞生长、细胞分裂或细胞循环的至少一种组分。

26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述促进细胞生长、细胞分裂或细胞循环的至少一种组分选自与肿瘤或病变微环境相关的生长因子、HGF、FGF(1-4型)、外来体、miRNA、其它小的非蛋白编码RNA、更长的非蛋白编码RNA、激素、IGF、VEGF、白细胞介素、细胞因子、趋化因子以及由在病变细胞内和病变细胞周围的细胞产生的自分泌因子或旁分泌因子。

27.根据权利要求1、2和5中任一项所述的方法，其中，将所述活的病变细胞样品附着于包含水合细胞外基质(ECM)的表面。

28.根据权利要求3、4、6和27中任一项所述的方法，其中，所述ECM是水合和折叠的。

29.根据权利要求27所述的方法，其中，所述表面是生物传感器表面。

30.根据权利要求27所述的方法，其中，所述表面是细胞培养皿表面。

31.根据权利要求3、4和27中任一项所述的方法，其中，所述水合细胞外基质包含纤连蛋白和胶原蛋白。

32.根据权利要求31所述的方法，其中，所述细胞外基质是水合和折叠的。

33.根据权利要求6或权利要求31所述的方法，其中，所述纤连蛋白和胶原蛋白包含原纤维性且亲水性表面。

34.根据权利要求3、4和27中任一项所述的方法，其中，所述水合细胞外基质包含层粘连蛋白332(层粘连蛋白V)或胶原蛋白-层粘连蛋白332(层粘连蛋白V)共结构。

35.根据权利要求34所述的方法，其中，所述ECM是水合和折叠的。

36.根据权利要求1-6和29中任一项所述的方法，其中，使用生物传感器对所述样品进行临床试验。

37.根据权利要求36所述的方法，其中，所述临床试验包括使所述活的病变细胞样品与至少一种试剂接触，并且在使所述样品与所述至少一种试剂接触之前和之后测量细胞粘附或细胞附着。

38.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述活的病变细胞是癌细胞。

39.一种细胞培养组合物，其包含在包含6-17％氧气的条件下在包含至少一种失巢凋亡抑制剂的培养基中培养的原代人类癌细胞。

40.根据权利要求39所述的细胞培养组合物，其中，所述培养基包含至少三种失巢凋亡抑制剂，并且其中将所述细胞在包含10％氧气的条件下培养。

41.一种生物传感器表面，其包含经由水合细胞外基质(ECM)附着于所述生物传感器表面的原代人类癌细胞，其中，所述ECM包含：(i)纤连蛋白和胶原蛋白；(ii)胶原蛋白和层粘连蛋白332(层粘连蛋白V)或(iii)层粘连蛋白332(层粘连蛋白V)。

42.根据权利要求41所述的生物传感器表面，其中，所述水合ECM包含纤连蛋白和胶原蛋白，所述纤连蛋白和胶原蛋白包含原纤维性且亲水性表面。

43.一种细胞培养皿表面，其包含经由水合细胞外基质(ECM)附着于所述细胞培养表面的原代人类癌细胞，其中，所述ECM包含：(i)纤连蛋白和胶原蛋白；(ii)胶原蛋白和层粘连蛋白332(层粘连蛋白V)或(iii)层粘连蛋白332(层粘连蛋白V)。

44.根据权利要求43所述的细胞培养皿表面，其中，所述水合ECM包含纤连蛋白和胶原蛋白，所述纤连蛋白和胶原蛋白包含原纤维性且亲水性表面。

45.根据权利要求41-44中任一项所述的方法，其中，所述水合ECM是折叠的。