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CN108137689A - 用于降低gdf15的活性的制剂 - Google Patents

用于降低gdf15的活性的制剂 Download PDF

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CN108137689A
CN108137689A CN201680046272.2A CN201680046272A CN108137689A CN 108137689 A CN108137689 A CN 108137689A CN 201680046272 A CN201680046272 A CN 201680046272A CN 108137689 A CN108137689 A CN 108137689A
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seq
polypeptide
gdf15
amino acid
qrfpr
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Application number
CN201680046272.2A
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O·A·布洛克泽尔
J·E·S·弗雷德里克松
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Base Argonne Treatment Co
Original Assignee
Base Argonne Treatment Co
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Abstract

本发明涉及用于降低GDF15的活性的制剂，并且特别是此类制剂治疗或预防与升高的或不希望的GDF15水平相关的症状的用途。本发明基于GDF15与受体CLPTM1和QRFPR结合的发现，并且提供了用于此类用途的结合剂形式的制剂，所述结合剂形式的制剂能够与受体结合并抑制GDF15和所述受体之间的相互作用。另外的制剂包括源自所述受体的多肽，所述多肽能够与GDF15结合并抑制其与所述受体的相互作用。还提供了基于检测相互作用或其效应的诊断方法，以及被修饰为具有降低的CLPTM1水平和/或活性的细胞毒性免疫细胞。

Description

用于降低GDF15的活性的制剂
技术领域
本发明涉及用于降低GDF15的活性的制剂，包括可以用于受试者从而对抗(即治疗或预防)与身体中升高、过量或不希望的GDF15水平和/或活性有关的症状的治疗剂。本发明基于身体中GDF15的两种不同受体的发现，并且因此基于新型GDF-15受体的这种鉴定，本发明更具体提供了针对GDF15的所述受体的片段以及结合GDF15受体的抗体或其他亲和结合试剂，用于阻止GDF15与其受体结合和/或以其他方式抑制GDF15在该两种受体的一者或二者处的效应(即GDF15的结合的效应)。
背景技术
生长和分化因子15(GDF15)，也被称为巨噬细胞抑制因子(MIC1)，是TGF-β超家族的成员，并且与TGF-β超家族的其他成员具有相对低(24％)的序列同源性。升高的GDF15水平与癌症、神经性厌食症、骨质疏松症、肾紊乱、肺动脉高压和心血管疾病有关，并且还与恶病质有关，并且更普遍地与食欲不振或食欲的抑制有关。GDF15是由任何原因导致的死亡率的标志物。
还已经发现GDF15在镰状细胞疾病，铁过载紊乱诸如遗传性球形红细胞症、I型(Tamary等2008.Blood 112,5241–5244)和II型先天性红细胞生成异常性贫血、地中海贫血(Tanno等2007.Nat Med 13,1096-1101)、难治性贫血伴环形铁粒幼红细胞(RARS)(Ramirez等2009.Br J Haematol 144,251-262)和丙酮酸激酶缺乏症(Finkenstedt等2009.Br JHaematol.144,789–793)中过表达。
尽管GDF15在1997年就首次被克隆，但GDF15的受体至今仍难以找到。
GDF15在肿瘤病理中具有双重作用：配体在早期肿瘤中引起细胞凋亡，然而它在晚期癌症包括前列腺癌、乳腺癌、胃癌((Kim等,2008.Carcinogenesis 29,704-712)、结肠直肠癌和胶质母细胞瘤(Albertoni等,2002.Oncogene 21,4212-4219)中大量分泌。在晚期疾病中，GDF15有助于肿瘤转移，并且是转移性前列腺癌中骨参与的最重要的生物标志物(Selander等,2007.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 16,532-537；Wakchoure等,2009.Prostate 69,652-661)。
文献中的证据描述了取决于转移部位的GDF15表达的上调，在浸润骨的前列腺癌症细胞亚群中具有显著升高的水平。还已知GDF15影响破骨细胞和成骨细胞两者(Wakchoure等2009.Prostate 69,652-661)。
GDF15还在恶病质，由慢性疾患造成的身体的消耗中具有作用，并且特别是与晚期癌症的食欲不振和恶病质有关。通常使用食欲刺激剂来补偿患有晚期癌症的患者的食欲不振，但是迄今为止，目前仍不存在临床上可用的靶向GDF15的分子机制的制剂。因此，肿瘤引起的恶病质难以逆转。最近的评估显示，癌症中高达25％的致命结果可以归因于恶病质。
认为GDF15通过中枢神经系统机制，通过作用于下丘脑回路在恶病质中发挥其作用。已经发现GDF15的全身性施用导致下丘脑的弓状核中的NPY(一种关键的食欲刺激肽)的表达减少以及POMC(一种食欲抑制剂α-MSH的前体)的表达增加。弓状核调节进食行为并且位于临近最后区处，在所述最后区处血-脑屏障(BBB)允许全身性因子。因此，已经显示，升高的水平的GDF15与食欲的抑制有关。另外，患有晚期前列腺癌症的患者的重量减轻的程度与6个月的时间段内GDF15的血清水平相关，但和与恶病质有关的其他因子诸如TNF-a、IL-6或IL-8的血清水平不相关。
发明内容
Breit在US 2009/000481中提出了使用增加或减少身体中的GDF15的量或活性的GDF15(MIC-1)调节剂作为调节食欲或体重的方式，包括使用抗GDF15抗体或其片段来治疗与癌症或其中GDF15过表达的其他症状有关的降低的食欲和/或重量减轻的用途。虽然迄今为止GDF15的这些和其他生理作用和病理作用已经被阐明，该生理上重要的蛋白的受体(或多种受体)的身份仍难以找到。发明人已经利用串联亲和纯化(TAP)测定首次鉴定到GDF15的两种不同且在结构上不相关的受体，并且基于这些发现提出用于降低GDF15的效应的新型治疗剂。
在本申请中已经鉴定到两种GDF15受体：焦谷氨酰化的RF酰胺肽受体(QRFPR)和唇腭裂跨膜蛋白1(CLPTM1)。
QRFPR也被称为食欲促进性神经肽QRFP受体或G蛋白偶联受体103(GPR103)，为包含N-末端细胞外结构域和3个另外的细胞外结构域(或环)的7次跨膜G蛋白偶联蛋白受体。人QRFPR的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。QRFPR的拓扑学的计算机模拟预测表明，QRFPR(ECD1)的细胞外N末端结构域包含残基1-46(SEQ ID NO.3)；细胞外结构域2(ECD2；环1)包含残基103-120(SEQ ID NO.4)；细胞外结构域3(ECD3；环2)包含残基184-212(SEQ IDNO.5)；并且细胞外结构域4(ECD 4；环3)包含残基293-311(SEQ ID NO.12)。QRFPR是在下丘脑的弓状核中高表达的食欲促进性或食欲刺激性受体(Bruzzone等,2007.J Comp Neurol503,573-591；Ukena等2013.Gen Comp Endocrinol 190,42-46)。配体RF酰胺43与QRFPR的结合引起食欲刺激肽NPY的表达并抑制POMC表达(一种食欲抑制剂)，刺激进食行为并调节血压(Takayasu等,2006.Proc Natl Acad Sci U S A 103,7438-7443)。因此RF酰胺43和GDF15在NPY和POMC的表达中具有相反的作用，并因此在食欲的调控中具有相反的作用。GDF15可以充当该受体处的拮抗剂，拮抗内源激动剂配体的效应，作为本发明的基础的上述发现(下文更详细地报告)因此与已知的增加的GDF15水平和降低的食欲/恶病质的关系是一致的。
我们提出，GDF15和QRFPR的相互作用干扰QRFPR的食欲刺激功能，暗示了对进食行为的负调控。然后这导致为本发明的基础的以下提议：干扰GDF15和QRFPR的相互作用的制剂可以治疗性地用于治疗或预防与食欲抑制和/或重量减轻有关的状况，诸如恶病质。
除了调控食欲之外，QRFPR受体调控骨形成(Baribault等,2006.Mol Cell Biol26,709-717)。QRFPR敲除小鼠是消瘦的，并表现出骨质量的丢失。而且，破骨细胞的数目减少。已知QRFPR在骨细胞(特别包括成骨细胞)中表达，并且我们已经示出QRFPR不仅在很多不同的原发性骨癌并且还在继发性骨微转移中上调。因此，我们现在进一步提出，GDF15和QRFPR之间的相互作用在骨病或涉及骨的疾病(包括原发性骨癌和其他癌症(例如前列腺癌)向骨的转移两者)中可能是重要的，并且干扰该相互作用的制剂代表了治疗或预防此类症状的新型治疗模式。
在引导至本发明的工作中，我们已经示出GDF15能够与QRFPR结合并通过双重机制引起其在细胞表面的表达水平的降低。GDF15引起受体内化并被蛋白酶体降解，并且还通过QRFPR阳性外泌体的分泌引起受体从细胞表面脱落。尽管不希望被理论束缚，认为GDF15和QRFPR之间的相互作用通过下调细胞表面的可用QRFPR的水平来干扰QRFPR的活性。因此阻断GDF15和QRFPR之间的相互作用被提议为用于与升高的GDF15水平有关的病理(诸如以上讨论的那些)的可能的治疗。
GDF15的鉴定的第二种受体是CLPTM1(人类中该受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)。CLPTM1是具有～350个氨基酸的细胞外结构域(人CLPTM1的ECD的氨基酸序列如SEQID NO.14所示并且具有353个氨基酸(代表SEQ ID NO：1的氨基酸2-354))的跨膜蛋白。CLPTM1具有不寻常的表达模式，并且例如在免疫系统的细胞中表达。特别是，已知CLPTM1在自然杀伤细胞(NK细胞)和巨噬细胞中表达，并且我们已经另外示出它可以由免疫系统的其他细胞，诸如多种类别的淋巴细胞、特别是多种类别的T-淋巴细胞表达；CD4+、CD8+T细胞的特定亚组可以表达CLPTM1，CD3-CD45+非T细胞的特定亚组也可以表达CLPTM1。因此，CLPTM1可以由多种免疫细胞表达。
不像QRFPR，与CLPTM1结合的GDF15并不导致来自细胞表面的受体的损失。而是，在为本发明的基础的工作中，已经发现NK-92细胞被GDF15刺激引起TGFbRI(ALK5)和TGFbRII与CLPTM1的共定位，并导致GSK3b的磷酸化。之前GDF15已经与GSK3磷酸化有关，并且磷酸化的(9/21)GSK3B与固有免疫系统的细胞的降低的活性和细胞毒性有关。在用GDF15刺激后CLPTM1与TGBb受体复合物缔合的观察结果从而解释了GDF15如何可以降低NK细胞细胞毒性。这支持了以下提议：通过抑制GDF15与其受体(特别包括可以在多种免疫细胞上表达的CLPTM1)的相互作用，GDF15的免疫抑制效应可以被降低。
在正常生理中，高水平的GDF15由胎盘细胞分泌。我们认为GDF15可能在胎盘中发挥免疫调控的生理作用，下调对胎盘细胞的免疫响应并保护胎盘免于免疫攻击。巨噬细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)两者对胎盘的“外来”细胞造成严重威胁并且必须在局部被抑制。GDF15可以以包含前肽前GDF15的未处理的形式分泌，其被认为与分泌它的细胞的细胞外基质的组分缔合，在细胞附近产生潜在的GDF15的集合(pool)。我们提出，GDF15在胎盘的细胞表面的局部高浓度具有降低巨噬细胞和NK细胞两者以及潜在的其他GDF15响应免疫细胞的活性的潜力。重要地，我们还认为GDF15可以由癌症在免疫逃避中发挥相似的作用。大量的肿瘤分泌GDF15，以与在胎盘中相似的方式有效地增加GDF15在肿瘤间质中和转移部位处的局部浓度。通过靶向QRFPR和/或CLPTM1，肿瘤可以降低NK、巨噬细胞和/或其他免疫细胞的活性，并从而保护它们免于细胞免疫响应。因此我们现在提出抑制GDF15和受体QRFPR和/或CLPTM1之间的相互作用的制剂在抑制癌症的免疫逃避或由癌症引起的免疫耐受、特别是在抑制转移中的另外的效用，以及抑制GDF15引起的免疫抑制的更一般性的效用。
特别地，我们在以下实施例中示出了，来自QRFPR的第三和第四细胞外结构域(ECD)(QRFPR的环2和环3)两者的肽能够与GDF15结合。我们因此提出QRFPR中的GDF15结合位点位于ECD3(SEQ ID NO.5)和ECD4(SEQ ID NO.12)两者，所述GDF15结合位点被认为区别于内源激动剂配体的结合位点。这些蛋白环各自包含～20个氨基酸，并且认为当与该受体结合时，GDF15与这两种环同时结合。在以下实施例中报告的研究进一步表明，包含与这些环的氨基酸序列具有高度序列同一性的序列的肽，在阻止GDF15引起的QRFPR从细胞表面的损失同时还容留QRFPR被其天然配体活化的能力方面是有效的，表明这些肽能够通过与GDF15结合而特异性地阻断GDF15-QRFPR相互作用。因此，源自QRFPR的细胞外结构域3和4(环2和3)的肽代表了用于阻断GDF15和其受体之间的相互作用的有前途的潜在治疗剂。此外，在以下实施例中，结合QRFPR的细胞外结构域的抗体还显示出能够阻止GDF15引起的QRFPR从细胞表面的损失，而不影响受体活性，从而提供了潜在的另外的或可选的用于阻断GDF15-QRFPR相互作用的制剂。因此，能够与QRFPR的细胞外结构域结合的制剂代表了用于阻断其与GDF15的相互作用的另外的潜在治疗剂。
包含CLPTM1的细胞外结构域(SEQ ID NO.14)的区域的肽在以下的实施例中显示出在‘拉下(pull-down)’测定中与GDF15相互作用，并以比包含QRFPR的区域的肽更高的亲和力与GDF15结合。因此，包含CLPTM1的细胞外结构域的区域的肽代表了用于阻断GDF15和其受体之间的相互作用的另外的治疗剂。实施例还表明，与CLPTM1的细胞外结构域结合的抗体的预孵育能够抑制GSK3b磷酸化，表明特异性地阻断与CLPTM1结合的GDF15-CLPTM1相互作用是可能的。能够与CLPTM1的细胞外结构域结合的制剂代表了用于阻断其与GDF15的相互作用的另外的潜在治疗剂。
因此，明显的是，GDF15可以至少部分地通过本申请鉴定的两种受体发挥其包括对骨发育、恶病质、癌症建立和转移以及降低的免疫功能的生理效应。因此，阻断GDF15和这些受体之间的相互作用以治疗或预防以上指出的医疗症状，或事实上与升高的或不希望的GDF15水平相关的任何症状将是期望的，特别是当GDF15的水平升高时。本发明解决了该需要，并因此涉及抑制GDF15与其受体之间的相互作用或该相互作用的效应的治疗剂的提供。
第一类治疗剂是基于本文鉴定的GDF15受体的配体结合结构域的多肽。这些多肽充当‘诱饵’受体分子(“诱饵肽”)，并且能够与在循环中游离的、或与ECM和/或间质缔合的GDF15结合，并阻止其与受体结合。第二类治疗剂是结合剂，所述结合剂与GDF15受体的细胞外结构域结合并从而起到抑制GDF15与受体结合的作用，并因此阻断GDF15和其受体之间的相互作用，或者所述结合剂以其他方式抑制GDF15在两种受体的一者或二者处的效应。
因此，在本发明的第一方面，提供了一种能够与GDF15结合并抑制其与受体-QRFPR和/或CLPTM1相互作用的多肽，其中所述多肽：
(i)具有或包含SEQ ID NO:5(QRFPR的细胞外结构域3)、SEQ ID NO:12(QRFPR的细胞外结构域4)或SEQ ID NO:14(CLPTM1的细胞外结构域)所示的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14具有至少75％序列同一性的氨基酸序列；或
(ii)为或包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14的部分，所述部分包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14的至少6个连续氨基酸；或
(iii)包含对应于SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14的至少6个连续氨基酸的至少6个氨基酸，并与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14中的等效氨基酸序列具有至少75％的序列同一性。
如此请求保护的本发明的多肽不包括天然QRFPR或CLPTM1受体本身(更特别地来自任何物种的任何天然或野生型全长QRFPR或CLPTM1受体被排除)。因此，所述多肽并不包括由以下序列组成或包含以下序列的多肽：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。它也不包括由以下序列组成或包含以下序列的多肽：代表全长(即完整或整个)天然或野生型QRFPR或CLPTM1的氨基酸序列，其为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的同源物或直系同源物，即来自任何其他物种的受体。因此，如此请求保护的本发明的多肽不由以下序列组成或包含以下序列：SEQ ID NO:287或SEQ ID NO:288。如以下讨论的，在特定的实施方案中，如此请求保护的本发明的多肽也不是由SEQ ID NO:243-249中的任一种氨基酸序列组成的多肽。
就这点而言，SEQ ID NO:243-245代表QRFPR受体的片段，其大于如被公开为WO01/87930中的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的单个细胞外结构域(即，它们代表包含QRFPR的ECD3或ECD4的受体片段)。因此，在一种实施方案中，本发明的多肽不包括大于QRFPR的ECD3或ECD4或大于CLPTM1的ECD的受体片段(如以下进一步讨论的，CLPTM1的ECD可以或可以不包括N-末端甲硫氨酸，例如如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:315所示)。WO 01/87930关注被称为“甘丙肽样GCPR(G蛋白偶联受体)”的受体，其在一种实施方案中至少看起来对应于QRFPR-该文件聚焦于甘丙肽与受体的结合的调控并且未公开该受体与GDF15的任何相互作用。SEQ ID NO:246-249为WO 2005/124342中鉴定的两种不同的GPR103受体序列(QRFPR也被称为GPR103)的片段，或源自该两种不同的GPR103受体序列的多肽，并且分别对应于WO 2005/124342的SEQ ID NO:409、SEQ ID NO:411、SEQ ID NO:422和SEQ ID NO:426。本申请的SEQ ID NO:287和SEQ ID NO:288对应于在WO 2005/124342中分别被鉴定为SEQID NO:106和SEQ ID NO:107的GPR103受体序列。除很多其他的之外，该文件关注在筛选中使用受体序列鉴定引起软骨细胞中的软骨合成的化合物。在该文件中，未公开GPR103/QRFPR与GDF15的任何相互作用。因此，将看出，所述多肽以及QRFPR的整个或完整细胞外结构域和细胞外结构域3和4(ECD3或ECD4)的片段或部分或者CLPTM1的ECD可以是或可以包含具有如下氨基酸序列的多肽：其基于或源自QRFPR的ECD3或ECD4或者CLPTM1的ECD或其一部分，但其是针对天然分子的序列修饰的，例如通过一个或多个氨基酸置换、添加和/或删除。因此，包括功能上等效的分子，其可以具有针对于ECD的天然序列或其部分的变体或修饰的序列。功能上等效意指多肽保留与GDF15结合的能力并抑制其与受体的相互作用。
特别地，本发明的多肽可以包含至少6个氨基酸，并且可以由以下组成或包含以下：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14中的任一个所示的氨基酸序列的一部分，所述部分包含至少6个连续氨基酸；或与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14中的任一个或与所述部分具有至少75％序列同一性的氨基酸序列的一部分。在一种实施方案中，SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14中的任一个所示的氨基酸序列的一部分包含至少6个连续氨基酸，并相对于SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14包含至少2个连续或非连续氨基酸的删除。类似地，为与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14中的任一个具有至少75％序列同一性的氨基酸序列的一部分的多肽可以包含至少6个连续氨基酸和相对于对应于SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14的功能等效的变体序列的至少2个连续或非连续氨基酸的删除。
因此，如以下进一步描述的，SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14的部分可以被鉴定，并用作或用于根据本发明的多肽，或者本发明的多肽可以具有或包含与任何所述部分具有至少75％序列同一性的氨基酸序列，例如如以下鉴定的。
代表SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14中的任一个的部分的代表性或示例性序列在以下列出，并且包括例如SEQ ID NO:6至9和11(SEQ ID NO.5的部分；QRFPR的ECD3)、SEQ ID NO.13(SEQ ID NO.12的C末端部分；QRFPR的ECD4)和SEQ ID NO.15至18(SEQID NO.14的部分，CLPTM1的ECD)。本发明的多肽可以具有或包含与代表SEQ ID NO:5、SEQID NO:12或SEQ ID NO:14的一部分的前述序列具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。在另外的实施方案中，如以下所列，例如表1中或任何以下实施例中，本发明的多肽可以具有或包含与代表SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14的一部分的任何序列具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。
本发明的另外的方面提供了能够与受体QRFPR和/或CLPTM1结合用于治疗的结合剂，其中所述结合剂能够抑制GDF15和所述受体之间的相互作用。
特别地，多肽和/或结合剂用于治疗或预防与升高的或不希望的GDF15水平相关的症状。
此类症状在以下更详细地被描述，但在某些优选的实施方案中包括癌症、恶病质、免疫抑制和骨病。
结合剂可以是任何蛋白质分子或非蛋白质分子，但如以下进一步讨论的，将优选地是抗体。
在一个优选的实施方案中，所述结合剂不与如本文限定的本发明的多肽结合。在一个另外的优选的实施方案中，所述结合剂另外地或可选地不抑制内源激动剂配体与受体的结合，特别地其中所述受体是QRFPR。
本发明的一个仍然另外的方面提供了如前文限定的本发明的多肽和/或如前文限定的本发明的结合剂用于制备用于治疗或预防与升高的或不希望的GDF15水平有关的症状的药物的用途。
根据本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含：如前文限定的本发明的多肽和/或如前文限定的本发明的结合剂，连同至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的又一个另外的方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含如前文限定的本发明的多肽和如前文限定的本发明的结合剂。
所述试剂盒的组分可以被提供或配制为用于药物递送(即用于治疗用途)并因此可以被提供为包含多肽或结合剂和一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物的形式。所述组分可以被配制或提供为用于分开施用，包括顺序地或同时地。所述试剂盒可以被用于治疗或预防与不希望的GDF15水平有关的症状。
因此，本发明的另一个方面提供了一种产品，所述产品包含作为组合制品的如前文限定的本发明的多肽和如前文限定的本发明的结合剂，用于在治疗或预防与不希望的GDF15水平有关的症状中分开、顺序或同时使用。
还提供了一种治疗或预防与升高的或不希望的GDF15水平有关的症状的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用有效量的如前文限定的本发明的多肽和/或如前文限定的本发明的结合剂。
本发明还可以具有非医疗用途，并因此抑制GDF15与受体QRFPR和/或CLPTM1的相互作用的非治疗方法构成本发明的一个另外的方面。此类方法可以包括使包含根据本发明的受体和GDF15的细胞或无细胞系统与根据本发明的多肽和/或结合剂接触。因此，在该方面，本发明提供了如前文限定的本发明的多肽和/或如前文限定的本发明的结合剂体外抑制GDF15与受体QRFPR和/或CLPTM1的相互作用的用途。
术语“多肽”在本文广泛地使用以包括肽、多肽或蛋白分子，包括任何蛋白质分子，所述蛋白质分子可以包含其他化学基团或部分，例如只要存在蛋白/肽/多肽部分。如以上提到的，本发明的多肽包含至少6个氨基酸残基。
术语“抑制”包括降低以及阻止，并且因此包括降低、减少或减弱所主张的活性或特性(例如GDF15与两种受体中的一者或二者的相互作用)的任何效应，或本文讨论的任何治疗效应、生物学效应或生理效应或活性。因此，换一种方式表述，本发明的多肽和/或结合剂可以阻断GDF15与两种受体中的一者或二者的相互作用，但这并不必然地需要或要求受体结合和/或功能的完全阻断，仅仅是降低。作为代表性示例，GDF15与受体的结合和/或由此类结合导致或引起或刺激的受体功能的任何效应或方面可以与在本发明的多肽和/或结合剂不存在下观察到的结合和/或受体活性或功能相比，降低20％、30％、40％、50％、60％或70％或更多。因此，将看出，GDF15在受体处的效应可以被抑制，不论GDF15与受体的结合是否被抑制。因此，本发明的多肽可以在抑制或不抑制GDF15与受体的结合下，抑制GDF15与受体的相互作用或该相互作用的效应。
术语“相互作用”包括GDF15与两种受体中的一者或二者的结合，和/或受体活性或在受体处的任何效应的刺激或引发。因此，抑制GDF15与受体QRFPR和/或CLPTM1的相互作用包括抑制GDF15与受体的结合的(即所引起的)效应，而如以上表明的，不必然抑制GDF15与受体的结合。
GDF15与受体的结合可以利用如在文献中广泛描述和报道的已知的配体结合分析来评价或确定，包括如在以下实施例中描述的结合分析。可以通过确定或评价由GDF15和/或本发明的多肽或结合剂与受体的结合导致或引起或刺激的任何效应，来评价或确定GDF15结合受体的效应，或更特别地本发明的多肽或结合剂对与受体结合的GDF15的效应。因此，例如，GDF15与QRFPR的结合可以导致受体的内化和/或受体从细胞表面脱落-此类效应可以通过确定外泌体中的受体和/或外泌体的存在和/或量来评价或确定，例如通过确定QRFPR阳性外泌体或内体的存在或量来确定，例如如以下实施例中描述的。本发明的多肽或结合剂可以引起此类QRFPR阳性内体或外泌体的减少。
还可以在GDF15的存在下以及本发明的多肽或结合剂的存在或不存在下评价或确定受体活性的任何其他方面，例如可以通过确定由表达受体的免疫细胞(例如NK细胞或巨噬细胞)展现的细胞介导的细胞毒性的程度或量，来评价或确定GDF15的免疫抑制效应的降低。或者，在本发明的结合剂或多肽的存在或不存在下可以评价并比较由受体被GDF15刺激导致的信号传导的其他方面，例如GSK3b磷酸化。
术语“治疗”在本文被广泛使用以包括改善或减轻罹患或具有症状的受试者的症状或临床状态的任何方面。因此，不要求症状的完全治愈，并且“治疗”包括改善症状的任何方面、参数或征兆。
相似地，术语“预防”在本文被广泛使用以包括减少或延迟症状或症状的发生或进展的任何方面。因此，预防不要求症状的发展的完全或绝对的阻止，并且可以包括延迟或减缓症状的任何方面、征兆或参数的进展或发生。征兆、参数或方面的严重度可以降低和/或可以在发展方面延迟。在一个特定的实施方案中，预防可以包括阻止(或减少)癌症的转移，更特别地癌症向骨的转移。在其他实施方案中，症状的一个或更多个征兆或方面的进展或发展可以被延迟、或减少或事实上被阻止免于发展，例如罹患慢性症状或疾患(例如癌症或炎性症状(例如类风湿性关节炎))的受试者中的恶病质可以被阻止免于发展或可以被延迟和/或在严重度上减弱。
如上表明，本发明的多肽基于受体的细胞外结构域(ECD)并且可以包括天然ECD的序列变体及其片段(包括ECD的部分的序列变体)。
因此，换一种方式限定，本发明的多肽可以是一种能够与GDF15结合并抑制其与受体QRFPR和/或CLPTM1的相互作用的多肽，其中所述多肽具有或包含如下序列
(a)X1X2X3X4X5X6X7X8X9；(式I)
其中：
X1是芳香族氨基酸；
X2是脂肪族氨基酸；
X5是碱性氨基酸；并且
X3、X4、X6、X7、X8和X9可以独立地是任何氨基酸(SEQ ID NO:337)；或
(b)X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10(式II)
其中
X1是酸性氨基酸，例如D或E；
X2是碱性氨基酸，例如K、R或H，优选K或R；
X3是酸性氨基酸，例如D或E；
X4是芳香族氨基酸，例如F、W或Y；
X5是酸性氨基酸，例如D或E；
X6是酸性氨基酸，例如D或E；
X7是脂肪族氨基酸，例如L、V、I、A或M，优选L、V或I；
X8是A、S或T；
X9是脂肪族氨基酸，例如L、V、I、A或M，优选L、V或I；并且
X10是芳香族氨基酸，例如R、K或H，优选R或K(SEQ ID NO:404)。
芳香族氨基酸可以独立地选自苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)、叔丁基甘氨酸、环己基丙氨酸、叔丁基苯丙氨酸、联苯基丙氨酸、三叔丁基色氨酸。
碱性氨基酸可以独立地选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)、鸟氨酸(Orn)、甲基赖氨酸(MeK)和乙酰基赖氨酸(AcK)。
脂肪族氨基酸可以独立地选自亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)甲硫氨酸(M)和正亮氨酸(Nor)。
在一个更特定的实施方案中，在式I的多肽中
X1是F、W或Y；
X2是L、V、I、A或M，优选L、V或I；
X5是K、R或H，优选K或R(SEQ ID NO:338)。
另外地或可选地，在式I的多肽中
X3是芳香族氨基酸，优选F、W或Y；和/或
X4是酸性氨基酸，优选E或D(SEQ ID NO:339-344)。
另外，在式I的多肽中，另外地或可选地
X6是酸性氨基酸，优选E或D；和/或
X7是碱性氨基酸，优选K、R或H，更优选K或R(SEQ ID NO:345-369)。
另外，在式I的多肽中，另外地或可选地
X8是脂肪族氨基酸，优选L、V、I、A或M，更优选L、V或I；和/或
X9是任何氨基酸，优选C(SEQ ID NO:370-402)。
在一个特定的实施方案中，式I的多肽可以具有或包含序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9(SEQID NO:403)，其中：
X1是F、W或Y；
X2是L、V或I；
X3是F、W或Y；
X4是D或E；
X5是K、R或H；
X6是D或E；
X7是K、R或H；
X8是L、V或I；并且
X9是C。
在一个另外的实施方案中，在式I的多肽中，序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9在一侧或两侧的侧翼可以为1个至10个氨基酸，优选其中所述侧翼氨基酸序列包含能够形成α螺旋或β片层的氨基酸。
在一个式I的多肽的此类代表性实施方案中，残基X1的侧翼为包含能够形成α螺旋的氨基酸的氨基酸序列，和/或残基X9的侧翼为包含能够形成β片层的氨基酸的氨基酸序列，优选其中X9的侧翼为C。
在式II的一个特定的实施方案中，X1是D或E；X2是K、R或H；X3是D或E；X4是F、W或Y；X5是D或E；X6是D或E；X7是L、V或I；X8是A、S或T；X9是L、V或I；并且X10是R、K或H(SEQ ID NO:405)。
在一个根据本发明的多肽的任何方面的特定的实施方案中，所述多肽可以包含SEQ ID NO:210所示的序列(FLYEK)。
在一个根据本发明的多肽的任何方面的另外的实施方案中，所述多肽可以包含SEQ ID NO.211所示的序列的残基(对应于SEQ ID NO：1的残基255-257WTS)。
如上表明，在代表性实施方案中，本发明的多肽可以具有或包含代表或对应于SEQID NO.5、SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.14的ECD序列中的任一个的部分的序列。此类序列可以与SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.14的氨基酸序列中的任一个的一部分具有至少75％的序列同一性，包括例如以下中的任一种：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO.7或SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9，代表源自QRFPR的ECD3的序列；SEQ ID NO.13，代表源自QRFPR的ECD4的序列；SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：15(YISEHEH)或SEQ ID NO：16(LFWEQH)，代表源自CLPTM1的ECD的序列。
在一个另外的实施方案中，本发明的多肽可以包含SEQ ID NO:15(YISEHEH)所示的序列或与其具有至少75％序列同一性的序列，和SEQ ID NO：16(LFWEQH)所示的序列或与其具有至少75％序列同一性的序列。
根据本发明的其他代表性多肽可以具有或包含以下表1所示的氨基酸序列，或与任何此类序列具有至少75％序列同一性的序列，或适用时为任何此类序列的一部分的序列，其中所述部分包含至少6个连续氨基酸。
表1
本发明相应地提供了治疗剂(结合剂和多肽)，所述治疗剂能够通过阻断GDF15与其受体之间的相互作用降低受试者中的GDF15的活性或效应。此类制剂选自由以下组成的组：GDF15受体QRFPR或CLPTM1的细胞外结构域的部分、特别是可溶部分，或基于或源自其ECD或部分的多肽，以及可以与这些GDF15受体之一的细胞外结构域特异性结合的结合剂。
与QRFPR或CLPTM1的细胞外结构域的一部分具有高度序列同一性的多肽可以被称为‘基于’或‘源自’，或被称为具有或包含‘基于’或‘源自’GDF15受体的细胞外结构域的序列。因此此类多肽可以包含或具有如下序列：其对应于ECD或其部分，但其与SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.14所示的天然人ECD序列相比包括一些序列变异或修饰。因此“对应”序列可以与SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.14的ECD内包含的序列(即与所述序列的一部分)相关联或对齐，但可以相对于所述序列包含一个或多个序列变异。
本发明的多肽可以包括获取自或源自来自其他物种的QRFPR或CLPTM1受体的变体或同源物。因此，多肽可以源自或基于来自其他物种(特别是其他哺乳动物物种，例如狗或小鼠)的等效或相应受体的ECD。
在本发明中鉴定的两种受体均是跨膜蛋白，并且因此在本发明的多个方面的优选的实施方案中，本文描述的多肽代表或包含蛋白的细胞外结构域或结构域的细胞外部分(part)或部分(portion)。因此，所述多肽优选不是或不包含全长蛋白，并且特别地不是或不包含全长野生型或天然受体蛋白，例如所述多肽不具有以下序列(或不由以下序列组成)：SEQ ID NO:l或SEQ ID NO:2所示的序列或来自另一种物种(例如小鼠或大鼠等)的等效序列。在其他实施方案中，所述多肽不具有或不包含SEQ ID NO:287或SEQ ID NO:288所示的序列。
在某些优选的实施方案中，所述多肽不包含源自或获取自受体的氨基酸序列(即对应于受体序列的氨基酸序列)，该氨基酸序列不形成各自的受体蛋白的细胞外结构域的部分，即形成各自的受体蛋白的跨膜和/或细胞内结构域的氨基酸序列。具体地，在优选的实施方案中，源自QRFPR的多肽可以不包含QRFPR的细胞外结构域的N末端和/或C末端的残基(氨基酸序列)或其部分，并且特别是QRFPR的ECD 3和/或ECD4的N末端和/或C末端的残基(氨基酸序列)(即SEQ ID NO:1内由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:12表示的序列的N末端或C末端的残基/序列或其部分)，并且源自CLPTM1的多肽可以不包含CLPTM1的细胞外结构域的C末端的残基(氨基酸序列)或其部分(即SEQ ID NO:2内的由SEQ ID NO:14表示的序列的C末端的残基/序列或其部分)。因此，在某些实施方案中，所述多肽不包含SEQ ID NO:1的第1-183、213-292或312-431位氨基酸(对于源自QRFPR的多肽)。在其他实施方案中，所述多肽不包含SEQ ID NO:2的第355-669位氨基酸(对于源自CLPTM1的多肽)。
在本发明的多个方面中的任一个的某些实施方案中，所述多肽不由代表整个天然细胞外结构域的氨基酸序列组成。即，在此类实施方案中，所述多肽不由QRFPR的ECD3和ECD4或CLPTM1的ECD组成。因此，在一种此类实施方案中，所述多肽不由SEQ ID NO:5、SEQID NO:12或SEQ ID NO:14中的任一个序列组成。在其他实施方案中，所述多肽可以包含整个天然细胞外结构域连同一个或多个另外的氨基酸序列，所述一个或多个另外的氨基酸序列不源自或不对应于QRFPR或CLPTM1序列。换言之，所述多肽可以由QRFPR的ECD3或ECD4和/或CLPTM1的ECD(或事实上任何此类ECD的一部分)连同一个或多个氨基酸序列组成，所述一个或多个氨基酸序列不是来自天然QRFPR或CLPTM1受体的序列，或更特别地所述一个或多个氨基酸序列不是天然受体中的各自的ECD的侧翼或紧密邻接天然受体中的各自的ECD的序列。在该方面，另外的氨基酸序列可以包含2个或更多个氨基酸。将看出，在此类实施方案中，除了源自或对应于QRFPR的ECD3和/或ECD4或其一部分和/或CLPTM1的ECD或其一部分的序列，所述多肽不包含源自或对应于天然/野生型QRFPR或CLPTM1受体的任何氨基酸序列。
因此，在其中所述多肽包含ECD或其一部分作为更长的氨基酸序列的部分的某些实施方案中，ECD或其部分的序列可以被包含在“非天然”序列背景中；即对应于ECD或其部分的氨基酸序列的一侧或两侧的侧翼序列不是ECD或其部分获取自或源自或者它对应的天然全长受体中的(例如SEQ ID NO.1(全长QRFPR)或CLPTM1(全长CLPTM1)中的)ECD或其部分(例如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14或其一部分)的序列的侧翼序列。因此，在某些实施方案中，为SED ID NO:5或SEQ ID NO：12的侧翼(N末端和/或C末端)的至少2、3、4、5、6或7个连续氨基酸并非来自SEQ ID NO:1。在某些其他的实施方案中，为SED ID NO:14的侧翼(C末端)的至少2、3、4、5、6或7个连续氨基酸并非来自SEQ ID NO:2。由此将理解的是，侧翼氨基酸为紧密邻接由SEQ ID NO:1中的SED ID NO:5、SED ID NO:12或SEQ ID NO:2中的SED ID NO:14限定的细胞外结构域的那些氨基酸。
在本发明多个方面的任一方面的仍然另外的实施方案中，本发明的所述多肽可以是以下(即可以由以下组成)或可以包含以下：QRFPR的ECD3和/或ECD4和/或CLPTM1的ECD。在特定的实施方案中，此类部分可以代表从ECD删除至少2个连续或非连续氨基酸。因此，在代表性实施方案中，根据本发明的多肽可以由如下氨基酸序列组成或可以包含如下氨基酸序列：对应于具有多于一个(即2、3、4、5、6、7或更多个)氨基酸(其可以是连续的或非连续的)删除的SED ID NO:5、SED ID NO:12或SED ID NO:14或由具有多于一个(即2、3、4、5、6、7或更多个)氨基酸(其可以是连续的或非连续的)删除的SED ID NO:5、12或14表示的氨基酸序列。换言之，删除的氨基酸可以发现于SED ID NO:5、12或14的N末端和/或C末端。
如上表明，在某些实施方案中，多肽序列不是SED ID NO:243-249中的任一个。在仍然另外的实施方案中，多肽序列不是SED ID NO:287或SED ID NO:288。
因此，在本发明的一个特定的实施方案中，提供了能够与GDF15结合并抑制其与受体-QRFPR和/或CLPTM1相互作用的多肽，其中所述多肽：
(i)包含SED ID NO:5(QRFPR的细胞外结构域3)、SED ID NO:12(QRFPR的细胞外结构域4)或SED ID NO:14(CLPTM1的细胞外结构域)所示的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在任一端或两端不以天然QRFPR或CLPTM1受体中的所述氨基酸序列侧翼的氨基酸序列为侧翼；或包含不是SED ID NO:5、SED ID NO:12或SED ID NO:14的氨基酸序列的氨基酸序列，但所述氨基酸序列与SED ID NO:5、SED ID NO:12或SED ID NO:14具有至少75％的序列同一性，其中任选地所述氨基酸序列在任一端或两端不以天然QRFPR或CLPTM1受体中的所述氨基酸序列侧翼的氨基酸序列为侧翼；或
(ii)是或包含SED ID NO:5、SED ID NO:12或SED ID NO:14的一部分，所述部分包含SED ID NO:5、SED ID NO:12或SED ID NO:14的至少6个连续氨基酸，其中(i)SED ID NO:5、SED ID NO:12或SED ID NO:14的至少2个连续或非连续氨基酸删除和/或(ii)所述部分在一端或两端不以天然QRFPR或CLPTM1受体中的所述氨基酸序列侧翼的氨基酸序列为侧翼；或
(iii)包含具有对应于SED ID NO:5、SED ID NO:12或SED ID NO:14的至少6个连续氨基酸的至少6个氨基酸的氨基酸序列，并且与SED ID NO:5、SED ID NO:12或SED IDNO:14中的等效氨基酸序列具有至少75％的序列同一性，其中(i)SED ID NO:5、SED ID NO:12或SED ID NO:14的至少2个连续或非连续氨基酸删除和/或(ii)对应于SED ID NO:5、SEDID NO:12或SED ID NO:14的氨基酸序列在任一端或两端不以天然QRFPR或CLPTM1受体中的所述氨基酸序列侧翼的氨基酸序列为侧翼。
如上表明，已经发现在体外包含源自QRFPR的细胞外结构域3和4的序列的肽与GDF15相互作用，并且在以下实施例中提供了表明此类肽不仅能够与GDF15结合，还能够阻断QRFPR和GDF15相互作用的数据。
具有或包含以上式I或式II所示序列的多肽可以分别代表源自或基于QRFPR的ECD3和ECD4的多肽。
如上表明，已经发现GDF15与QRFPR的细胞外结构域3和4两者同时结合。因此，认为QRFPR中的GDF15的结合位点包含QRFPR的细胞外结构域3和4两者的一部分。因此，根据本发明的多肽可以包含源自QRFPR的细胞外结构域3和4两者的序列，包括：SEQ ID NO:5、SEQ IDNO：6至9或SEQ ID NO：11的任一个所示的第一序列或与其具有至少75％序列同一性的序列，以及SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13所示的第二序列或与其具有至少75％序列同一性的序列。在另外的特定的实施方案中，所述第一序列和第二序列被接头分隔开。它们可以以任意顺序存在。在一个优选的实施方案中，所述多肽可以包括SEQ ID NO：178或SEQ ID NO：179所示的第一序列和SEQ ID NO：12所示的第二序列。
GDF15通过引起包含QRFPR的外泌体的脱落，或通过引起QRFPR的内化进行下调QRFPR在细胞表面的表达。然而，QRFPR具有其他配体(例如P518和RF-酰胺43)，所述其他配体具有激动效应并通过QRFPR引起信号传导。在本发明的一个优选的实施方案中，具有或包含源自QRFPR的细胞外结构域的序列的多肽将不与QRFPR激动剂结合，并将不降低QRFPR激动剂通过QRFPR激活信号传导的能力。
还已经发现包含源自CLPTM1的细胞外结构域的序列的多肽与GDF15相互作用，并且可以用于阻断GDF15和其受体之间的相互作用。在一个特定的实施方案中，此类多肽可以具有或包含SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18所示的序列。认为，与QRFPR相似，受体CLPTM1可以包含GDF15的两个结合位点，即GDF15可以在CLPTM1受体或更特别地在其ECD内具有至少两个接触点。特别是，基于我们在以下实施例中报道的研究，我们目前认为GDF15的两个结合位点或接触点可以存在于代表SEQ ID NO.14(人CLPTM1的ECD)的第108至138位氨基酸的SEQ ID NO.17。这些位点被提供为SEQ ID NO:15(YISEHEH)和SEQ ID NO:16(LFWEQH)，其代表或包含或构成这些结合位点的一部分。本发明的代表性多肽可以包含对应于或基于或源自这两个序列中的一者或二者的序列。包含两种结合位点的代表性多肽具有或包含SEQ IDNO.18或与其具有至少75％序列同一性的序列。本发明的代表性多肽还包括具有或包含代表SEQ ID NO:14的第123至138位氨基酸的SEQ ID NO:18所示的序列的多肽，所述序列包括一个假定的结合位点。
另外的实施例已经表明，GDF15可以在CLPTM1中具有其他或另外的结合位点(参见例如实施例19)。因此，一种此类另外的结合位点可以被表示为或可以包含SEQ ID NO:200(YFNDYWNLQ)。本发明的一种代表性多肽可以包含对应于或基于或源自该序列的序列。一种代表性多肽相应地具有或包含SEQ ID NO.200或与其具有至少75％序列同一性的序列，例如所述多肽可以具有或包含SEQ ID NO：201至209中的任一种或与其具有至少75％序列同一性的序列。
在一个实施方案中，获取自或源自CLPTM1的多肽不抑制内源配体与CLPTM1的结合，和/或不抑制受体被内源配体激活或刺激。然而，在其他实施方案中，结合和/或受体被内源配体激活或刺激可能是期望或有利的。
此外，本发明的多肽可以包含：获取自或源自QRFPR的氨基酸序列，包括本文描述的任何此类序列；以及获取自或源自CLPTM1的氨基酸序列，包括本文描述的任何此类序列。
将看出，本发明提供了一系列不同的多肽，其可以获取自或源自不同的受体和/或不同的ECD，并且可以具有不同的尺寸，并且其可以包含GDF15的一个或多个结合位点。因此，可以提供不同多肽的系统或组或文库或集。不同的多肽可以在它们对GDF15的亲和力方面不同，并且可以根据选择被用于例如提供对GDF15的不同结合活性。它们可以单独或组合使用。因此，不同的多肽可以允许治疗得以延长或延续，例如如果被治疗的受试者发展出对特定多肽的免疫响应，然后可以选择另一种多肽用于使用。多肽可以组合使用以提供较大的治疗效果。
如上表明，本发明的多肽包含最少6个氨基酸。然而，较长的多肽可以以较高的亲和力与GDF15有利地结合，并且因此多肽可以或包含至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19或更多个氨基酸。
例如，关于源自或获取自QRFRPR的ECD3(SEQ ID NO.5)的多肽，这些多肽可以具有或包含6至29个氨基酸，例如6至28个氨基酸，例如6、7、8、9或10中的任一个至27、26、25、24、23、22、21、20、19或18中的任一个，例如来自或对应于SEQ ID NO.5或其一部分的氨基酸。在某些实施方案中，所述多肽是或包含SEQ ID NO：5的不超过27个氨基酸。
出乎意料地，发现QRFPR的ECD3的细胞外结构域的短的部分能够在溶液中与GDF15结合(参见实施例16)。包含来自小鼠QRFPR的ECD3的15个氨基酸的多肽(SEQ ID NO：184)被提供为具有柔性接头的Fc融合蛋白，并且被发现在拉下测定中与GDF15良好地结合(参见SEQ ID NO：240)。该多肽对应于来自人QRFPR，具有SEQ ID NO：176所示序列的序列。小鼠序列与人序列高度同源，并且仅在以下方面不同：在SEQ ID NO：184(小鼠)的第二位处具有精氨酸残基，而不是在SEQ ID NO：176(人)的第二位处的谷氨酰胺残基。具有源自该序列或与该序列密切相关的序列的多肽是特别感兴趣的。因此，与该序列密切相关的包含13-18个氨基酸的多肽代表了本发明特别优选的实施方案。特别是，具有或包含SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:175-189的任一个所示的序列或与其具有至少75％同一性的序列的多肽代表了本发明的多个方面的优选多肽。
如上表明，源自ECD3的此类氨基酸序列可以与来自QRFPR的ECD4的序列组合。因此，多肽可以包含：为如以上段落中限定的前述ECD3来源的序列的第一序列，连同如SEQ IDNO:12或SEQ ID NO:13所示的第二序列，或与其具有至少75％序列同一性的序列。所述第一序列和第二序列可以以任意顺序连接，任选地经由接头或间隔序列连接，或者它们可以以组合提供为异质二聚体，例如Fc融合蛋白异质二聚体，如以下更详细地描述的。
获取自或源自QRFPR的ECD4(SEQ ID NO.12)的多肽可以具有或包含6至19个氨基酸，例如6至18个，或6、7、8或9中任一个至19、18、17、16或15中任一个，例如来自或对应于SEQ ID NO.12或其一部分的氨基酸。在某些实施方案中，所述多肽是或包含SEQ ID NO.12的不超过17个氨基酸。
获取自或源自CLPTM1的ECD(SEQ ID NO.14)的多肽可以包含6至354个氨基酸，例如6、7、8、9、10、12、14、16、18或20中任一个至354、353、350、320、300、280、260、250、240、220、200、180、160、150、140、120、100、90、80、70、60、50、40、30或20中任一个，例如来自或对应于SEQ ID NO.14或其一部分的氨基酸。例如，多肽可以具有或包含获取其或源自SEQ IDNO.14或对应于其的一部分的6、7、8或9个至50、45、40、35或30个氨基酸或更多。
发现包含CLPTM1的细胞外结构域的对应于SEQ ID NO：17所示的序列的31个氨基酸部分的多肽能够在溶液中与GDF15结合(参见实施例16)，并阻断GDF15在CD14+免疫细胞中对CLPTM1活性的效应(参见实施例17)。提供了包含以上源自CLPTM1的多肽的融合蛋白，所述多肽被用包含三个重复的GGGGS接头序列的柔性接头连接至Fc(参见SEQ ID NO：241)。因此，具有或包含SEQ ID NO:17的序列或与其具有至少75％同一性的序列的多肽，或包含为SEQ ID NO:17的部分并且包含至少6个连续氨基酸的序列的多肽是本发明的多个方面的优选多肽。
在实施例18中，在ELISA测定中测试了GDF15与很多源自CLPTM1的多肽的结合(参见图32)。发现很多多肽与GDF15结合，并因此这些多肽可以代表本发明的优选多肽。因此，具有或包含SEQ ID NO:258、SEQ ID NO:259、SEQ ID NO:261、SEQ ID NO:262、SEQ ID NO:269、SEQ ID NO:270、SEQ ID NO:297、SEQ ID NO:298、SEQ ID NO:301、SEQ ID NO:302、SEQID NO:308、SEQ ID NO:309的任一个所示的序列或与其具有至少75％同一性的序列的多肽代表了本发明的多个方面的优选多肽。
特别地，具有或包含、或基于或源自(例如包含至少6个连续氨基酸或与其具有至少75％序列同一性的序列的其一部分)SEQ ID NO:270(即序列GDYYPIIYFNDYWNLQKDYYG)或SEQ ID NO:309(即序列GDYYPIIYFNDYWNLQKDYY，即缺乏在CLPTM1的天然ECD中不存在的C末端G残基的SEQ ID NO:270)所示的氨基酸序列的多肽是优选的。例如，所述多肽可以为包含如下多肽的融合蛋白的形式：具有SEQ ID NO:270或SEQ ID NO:309的序列或为SEQ ID NO:270或SEQ ID NO:309的部分并且包含至少6个连续氨基酸的序列，或与SEQ ID NO:270或SEQ ID NO:309具有至少75％同一性的序列的多肽。在另一个实施方案中，所述多肽可以不具有融合伴侣，而是可以是裸多肽(naked polypeptide)，或所述多肽可以被缀合至另一部分，例如基于非肽的聚合物，诸如以下进一步描述的。例如所述多肽可以包含SEQ ID NO:270或309的部分并且至少包含序列DYYPII(SEQ ID NO:326)。
在本发明的其中所述多肽获取自或源自CLPTM1的细胞外结构域的某些实施方案中，所述多肽可以包含由CLPTM1基因编码的天然N末端甲硫氨酸残基，例如当在编码所述多肽的核酸序列中提供天然或内源CLPTM1起始密码子时。因此，所述多肽可以包含SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列的第1至137、138、139、140、150、160、180、200、220、240、260、280、288、290、300、320、340、350或354位氨基酸。因此，在一个另外的实施方案中，所述多肽可以具有或包含对应于SEQ ID NO:14的氨基酸序列连同N末端甲硫氨酸。这种多肽被表示为SEQID NO:315。因此，当SEQ ID NO.14在本文例如指包含SEQ ID NO：14或其一部分的多肽时，此指代可以用SEQ ID NO.315的指代替换或补充。换言之，在本文中SEQ ID NO.14的任何指代也可以被用来包括SEQ ID NO.315的指代。
事实上，本发明的多肽可以包含或具有如下范围内的长度：对应于以上包括的任何整数之间并包括以上包括的任何整数、或位于任何以上范围内。此外，如以下将更详细地描述的，本发明的多肽可以以融合形式或以其他延长或延伸的形式提供，包含附连或偶联至获取自或源自QRFPR和/或CLPTM1的肽序列的一个或更多个其他氨基酸序列。
在本发明的一个特定的实施方案中，所述多肽可以包含QRFPR和/或CLPTM1的所有或基本上所有的完整细胞外结构域。
为了使所述多肽能够阻断GDF和其受体之间的相互作用，此类多肽能够与GDF15结合是必要的。不希望被理论束缚，认为GDF15上的QRFPR和CLPTM1的结合位点是重叠的(完全地或部分地)，并且因此认为源自这些受体中的任一种的细胞外结构域、与GDF15结合的多肽，能够阻断GDF15与任一种受体的结合。换言之，获取自或源自QRFPR的细胞外结构域、与GDF15结合的多肽，将能够阻止GDF15结合至QRFPR或CLPTM1，并且获取自或源自CLPTM1的细胞外结构域、与GDF15结合的多肽，将能够阻止GDF15结合至QRFPR或CLPTM1。
这得到以下实施例20中报告的进一步工作的支持，其显示，在QRFPR的ECD3和CLPTM1的ECD之间存在序列相似的区域。与ECD4的一些序列相似性也被指出。有趣的是，这些序列是当比较两种受体时覆盖背景的仅有的相似区域，并且其在介导GDF15结合的位点或区域内。
本发明的多肽可以以可溶形式提供，例如以可溶多肽、或被提供为具有增溶基团和/或部分的肽。
所述多肽可以以单体、或二聚体或更高的多聚体形式提供，即它可以是或包含本文描述或限定的任何多肽的二聚体或更高的多聚体。以下实施例中提供的数据显示，所述多肽可以以单体形式或二聚体形式具有活性。GDF15作为二聚体存在，并且因此提供二聚体形式的多肽可能是有益的。
二聚体或更高的多聚体可以根据本领域已知的技术以任何常规方式形成。例如，二聚体可以在融合蛋白的形成期间自发地形成，或者它们可以被工程化。
提供融合蛋白或构建体或与另外部分的缀合物的形式的多肽可能是有利的或期望的。
在某些实施方案中，所述多肽可以被缀合或连接至天然或合成聚合物，包括蛋白、多肽或肽或多糖，以改善其药代动力学特性。因此，在多种实施方案中，所述多肽可以被缀合至直链或支链单甲氧基聚乙二醇(PEG；PEG化)、透明质酸、葡聚糖或糊精、同质氨基酸聚合物(a homo-amino acid polymer)(HAP；HAP化)、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸聚合物(PAS；PAS化)或弹性蛋白样肽(ELP；ELP化)，如Strohl.2015.BioDrugs 29,215-239中描述的，通过引用将其全部公开特此并入。事实上，可以使用本领域已知的用于与治疗性蛋白一起使用的任何已知融合或缀合伴侣。
本发明的任何多肽可以被提供为融合蛋白或嵌合蛋白，例如以增长多肽的血清半衰期，和/或以给予多肽另外的功能。术语“融合蛋白”指包含来自两种或更多种不同来源的多肽序列的单个多肽链。本发明的多肽可以被提供为与白蛋白、血纤蛋白原、谷胱甘肽S-转移酶、转铁蛋白、链霉亲和素或链霉亲和素样蛋白或免疫球蛋白，或其一部分，特别是与免疫球蛋白(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc部分或其一部分(例如被提供为Fc融合蛋白)组合的融合蛋白。在包含本发明的多肽的融合蛋白内，本发明的多肽可以位于融合蛋白的N末端或融合蛋白的C末端。或者，本发明的多肽可以位于融合蛋白内部，例如融合蛋白的环或其他表面特征内。
在一个优选的实施方案中，本发明的多肽可以被提供为与免疫球蛋白的Fc区域组合的融合蛋白，即可以被提供为Fc融合蛋白。Fc融合蛋白形成二聚体，并因此在该实施方案中，两个拷贝的本发明的多肽可以被提供为单个实体。在此类实施方案中，所述二聚体可以是同质二聚体，包含两个相同的本发明的多肽，或可以被提供为异质二聚体，包含两个不相同的本发明的多肽。例如，所述Fc融合蛋白可以是包含如本文描述的获取自或源自QRFPR的第三个细胞外结构域的两个相同多肽的同质二聚体，或可以是包含如本文描述的获取自或源自QRFPR的第四个细胞外结构域的两个相同多肽的同质二聚体。所述Fc融合蛋白还可以是包含如本文描述的获取自或源自QRFPR的第三个细胞外结构域的两个不同多肽的异质二聚体，或可以是包含如本文描述的获取自或源自QRFPR的第四个细胞外结构域的两个不同多肽的异质二聚体。在一个特定的实施方案中，所述Fc融合蛋白可以是包含如本文描述的获取自或源自QRFPR的第三个细胞外结构域的第一多肽，和获取自或源自QRFPR的第四个细胞外结构域的第二多肽的异质二聚体。所述Fc融合蛋白还可以是包含如本文所述的源自CLPTM1的两个相同多肽的同质二聚体，或可以是包含如本文描述的源自CLPTM1的两个不同多肽的异质二聚体。在一个特定的实施方案中，所述Fc融合蛋白可以是包含第一肽和第二肽的异质二聚体，所述第一肽包含SEQ ID NO:15的序列或与其具有至少75％序列同一性的序列，所述第二肽包含SEQ ID NO:16的序列或与其具有至少75％序列同一性的序列。
除单体和二聚体之外，更高的多聚体形式的Fc融合物，例如三聚体或更高的多聚体也是已知的，并且根据本发明被包括。
Fc融合蛋白可以包含免疫原性的Fc结构域。换言之，Fc融合蛋白可以包含已知引起免疫响应，例如固有免疫系统的细胞的响应的序列。因此，在一个实施方案中，Fc融合蛋白可以是免疫原性的。在一个特定的实施方案中，免疫原性序列可以引起抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)。免疫原性Fc标签序列的实例是本领域已知的(参见例如Lazar等2006.PNAS 103,4005–4010；Shields等2001.J.Biol.Chem.276,6591–6604；和Stewart等2011.Protein Engineering,Design andSelection 24,671–678)。尽管不限于此类应用，此类免疫原性Fc融合蛋白在过表达GDF15并在邻近其细胞表面处具有高浓度的GDF15的癌症的治疗中可能是有特殊效用的。此类Fc融合蛋白可以将受试者的免疫系统的细胞招募至癌症部位，并在简单地阻断GDF15和其受体之间的相互作用之外引起免疫响应。
然而，使Fc融合蛋白包含最小的免疫原性活性，即结合至(并因此使隔绝)GDF15而不引起免疫响应可能是期望的。因此，在一个另外的实施方案中，Fc融合蛋白不是免疫原性的。
在另一个优选的实施方案中，多肽可以被提供为与二磷酸盐的缀合物。不希望被理论束缚，认为这种构建体可以被指引在骨中富集(即积累)。这种积累可以在阻止GDF15与其受体的相互作用方面具有特别的优势，其在抑制癌症中骨的参与方面可以是特别有益的。
在本发明中构思的任何融合蛋白或缀合物中，源自QRFPR或CLPTM1的多肽可以在其N末端和/或其C末端通过接头序列或接头或间隔基团连接至缀合或融合伴侣。对于包含基于多肽/肽的融合伴侣的融合蛋白，接头将常规地是肽/多肽接头，很多所述接头在本领域是已知的并被描述。所述接头可以是柔性接头序列(其可以包括重复的柔性接头序列基序)。本领域已知的通常的接头富含小的非极性(例如甘氨酸)或极性(例如丝氨酸或苏氨酸)残基，并且通常由一段甘氨酸和丝氨酸残基(GS)组成。通常使用的接头是(GGGGS)接头(SEQ ID NO:242)，其可以在接头中被提供为重复单元(以(GGGGS)n)，其中n的拷贝数可以调整。这种接头作为三个重复(即(GGGGS)3)被用于实施例16的融合蛋白构建体。
对于具有非多肽/肽聚合物(诸如PEG或多糖等)或具有其他缀合伴侣的缀合物，可以使用任何已知的或期望的偶联化学基团或接头/偶联基团将本发明的多肽偶联或连接(缀合)至其他部分(缀合伴侣)。这些基团的很多种在本领域被描述。
在又一个另外的实施方案中，本发明的多肽可以被提供为环肽。在蛋白或基于肽的治疗剂的口服施用中，环肽是有特殊效用的，因为它们通常对蛋白水解是高度耐受的，并因此在消化道内不被蛋白水解酶降解。然而，当与结构上相关的线性肽相比时，环肽还通常表现出增长的血清半衰期。
本文描述了如下多肽，所述多肽相对于GDF15受体的细胞外结构域的野生型序列包含一个或多个氨基酸置换，然而所述多肽保留了与GDF15结合的能力。本发明的多肽将优选地与天然蛋白中发现的序列的等效部分的序列具有高度的序列同一性。本发明的多肽与天然蛋白中发现的序列的等效部分的序列具有至少75％的序列同一性，并且优选地将具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。然而，在本发明的一个特定的方面，用于通过与GDF15结合而阻断GDF15和其受体之间的相互作用的多肽可以包含与天然蛋白中发现的序列的等效部分的序列相同的序列。不希望被理论束缚，此类蛋白可以引起比相对于天然蛋白具有一个或多个置换的多肽少的免疫响应(即为较低免疫原性的)是可能的，因为具有非天然序列的多肽可以被受试者的免疫系统识别为‘外来的’。
序列同一性可以通过本领域已知且容易获得的方法和软件容易地确定。因此，序列同一性可以通过任何常规方法评价。然而，对于确定序列之间的序列同一性的程度，进行序列多重比对的计算机软件是有用的，例如Clustal W(Thompson等,(1994)Nucleic AcidsRes.,22:4673-4680)。比较并对齐序列对的程序像ALIGN(Myers等,(1988)CABIOS,4:11-17)、FASTA(Pearson等,(1988)PNAS,85:2444-2448；Pearson(1990),Methods Enzymol.,183:63-98)、BLAST和间隙BLAST(Altschul等,(1997)Nucleic Acids Res.,25:3389-3402)对于该目的也是有用的，并且可以使用缺省设定来使用。此外，位于欧洲生物信息研究所(European Bioinformatics institute)的Dali服务器提供基于结构的蛋白序列比对(Holm(1993)J.Mol.Biol.,233:123-38；Holm(1995)Trends Biochem.Sci.,20:478-480；Holm(1998)Nucleic Acid Res.,26:316-9)。多重序列比对和同一性百分比计算可以使用标准BLAST参数(使用可获得的来自所有器官的序列，矩阵Blosum 62，空位代价(gapcosts)：存在11、延伸1)来确定。或者，可以使用以下程序和参数：程序：Align Plus 4，4.10版(Sci Ed Central Clone Manager Professional Suite)。DNA比较：Global比较，标准线性评分矩阵，错配罚分＝2，开放空位罚分＝4，延伸空位罚分＝1。氨基酸比较：Global比较，BLOSUM 62评分矩阵。如本文限定的天然存在的多肽序列的变体可以例如通过使用本领域已知的标准分子生物技术，例如标准诱变技术诸如定点诱变和随机诱变(例如使用基因重排或易错PCR)来合成地生成。此类诱变技术可以被用于开发具有改进的或不同的结合和/或抑制特性的多肽。
还可以使用如本文限定的多肽的衍生物。衍生物意指包含如以上描述的多肽或其变体，其包含天然存在的氨基酸的结构类似物而不是天然存在的氨基酸。衍生或修饰(例如多肽中的氨基酸的标记、糖基化、甲基化)也可以发生，只要多肽的功能没有被不利地影响。
“结构类似物”意指非标准氨基酸。可以使用的此类非标准或结构类似物氨基酸的实例是D氨基酸、酰胺等排体(诸如N-甲基酰胺、向后-反向酰胺(retro-inverse amide)、硫代酰胺、硫酯、磷酸酯、酮亚甲基、羟基亚甲基、氟乙烯基、(E)-乙烯基、亚甲基氨基、亚甲基硫基或烷烃)、L-N甲基氨基酸、D-β甲基氨基酸或D-N-甲基氨基酸。
当多肽相对于天然蛋白的序列包含氨基酸置换时，置换可以优选地是保守置换。术语“保守氨基酸置换”指其中氨基酸被具有相似物理化学特性的氨基酸，即同一类型/组的氨基酸替换(置换)的任何氨基酸置换。例如，小的残基甘氨酸(G)、丙氨酸(A)丝氨酸(S)或苏氨酸(T)；疏水性或脂肪族残基亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)；结氨酸(V)或甲硫氨酸(M)；亲水性残基天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)；酸性残基天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；带正电荷的(碱性)残基精氨酸(R)、赖氨酸(K)或组氨酸(H)；或芳香族残基苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)可以互换地置换，而基本上不改变多肽与GDF15结合的能力。
第二类制剂包括能够与GDF15受体结合并且可以用于阻断GDF15和其受体之间的相互作用的结合剂。此类结合剂可以用于通过与受体的细胞外结构域结合并阻止GDF15与所述受体结合，或通过抑制或降低在受体处GDF15结合的效应(如上表明，这可以不必然地包括GDF15结合的阻止)，来降低GDF15和其受体之间的相互作用。
由于此类结合剂进行抑制或降低GDF15在受体处的结合或者效应或活性，它们可以被视为受体拮抗剂，至少对于配体GDF15在受体处的效应而言。此类拮抗剂包括部分拮抗剂(即结合剂可以对GDF15具有期望的拮抗效应，但还可以在受体处表现出关于受体处的其他效应/其他配体的激动活性)。
在一个实施方案中，该制剂可以与QRFPR的细胞外结构域结合，并降低QRFPR与GDF15结合的能力和/或GDF15发挥其在受体处的效应的能力。如以上讨论的，QRFPR包含四个细胞外结构域。结合剂可以通过以阻止GDF15的结合的方式与这些结构域中的任一个结合，或通过直接与GDF15结合位点结合(并从而阻断GDF15与QRFPR的结合)，或通过在足够邻近GDF15结合位点处结合以使得它在空间上阻止或阻碍GDF15与受体的结合，来阻断GDF15和QRFPR之间的相互作用。
在一个特定的实施方案中，结合剂可以与QRFPR的已经被发现与GDF15相互作用的相同区域(配体结合位点)结合，即与QRFPR的第三和第四个细胞外结构域中的一者或二者结合。因此，在一个实施方案中，该制剂可以与QRFPR的第三个细胞外结构域(即与具有SEQID NO:5所示的氨基酸序列的多肽)或QRFPR的第四个细胞外结构域(即与具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的多肽)，或与QRFPR的第三和第四个细胞外结构域两者(即与具有SEQID NO:5所示的氨基酸序列的多肽并且与具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的多肽，或更特别地与包含SEQ ID NO.5和12两者的多肽)结合。在一个另外的实施方案中，该制剂可以只与QRFPR的第三和/或第四个细胞外结构域的一部分结合。
在一个另外的实施方案中，所述结合剂可以不与GDF15结合位点结合。在该实施方案中，该制剂能够通过在空间上阻碍相互作用来阻断GDF15和QRFPR之间的相互作用。因此，所述结合剂可以通过与QRFPR的第一和/或第二个细胞外结构域结合来阻止GDF15与QRFPR的结合。在一个实施方案中，该制剂可以与QRFPR的第一个细胞外结构域(即与具有SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列的多肽)结合。在另外一个实施方案中，所述结合剂可以与QRFPR的第二个细胞外结构域(即与具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的多肽)结合。在仍然另一个实施方案中，所述结合剂可以与QRFPR的第一和第二个细胞外结构域两者(即与具有SEQID NO:3所示的氨基酸序列的多肽并且与具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的多肽，或与包含SEQ ID NO.3和4两者的多肽)结合。
在一个可选的实施方案中，该制剂可以与CLPTM1的细胞外结构域结合，并降低CLPTM1与GDF15结合的能力和/或GDF15在受体处发挥其效应的能力。因此，在第一个实施方案中，该制剂可以与具有SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的多肽结合。在一个特定的实施方案中，该制剂可以与具有或包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列的多肽结合。在一个另外的实施方案中，该制剂可以与具有或包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的多肽结合。在又一个另外的实施方案中，该制剂可以与具有或包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的多肽和/或与具有或包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的多肽结合。在另一个实施方案中，该制剂可以与具有或包含SEQ ID NO:200所示的氨基酸序列的多肽结合。
以下实施例19描述了CLPTM1的ECD(SEQ ID NO:14)中抗CLPTM1抗体的结合位点的阐释，所述抗CLPTM1抗体表现出对该受体的拮抗活性。该抗体的共同特征被指示为在SEQID NO:2的第98-100位处为PKD(SEQ ID NO:322)。因此，在仍然另外的实施方案中，该制剂可以与具有或包含序列PKD(SEQ ID NO:322)的多肽，例如具有或包含SEQ ID NO:212所示的氨基酸序列(PKDT)、或者具有或包含SEQ ID NO:213-239中任一个或SEQ ID NO:275至278中任一个的多肽结合。在实施例19中还鉴定了第二表位。因此，在仍然另外的实施方案中，该制剂可以与具有或包含SEQ ID NO:280-286的任一个所示的氨基酸序列的多肽结合。
本发明的结合剂可以是任何制剂，例如具有与QRFPR，并且特别地与QRFPR和/或CLPTM1的细胞外结构域结合的能力的任何化合物、分子或实体。特别地，所述结合剂可以与QRFPR和/或CLPTM1(或其细胞外结构域)特异性结合。特异性结合意指该制剂能够以如下方式与QRFPR和/或CLPTM1(或其细胞外结构域)结合，所述方式将其和与非靶分子的结合区分开。因此，与非靶分子的结合和与QRFPR和/或CLPTM1的结合相比可以是可忽略的或实质上减少的。因此结合剂可以是对QRFPR和/或CLPTM1具有结合亲和力的任何制剂，即针对QRFPR和/或CLPTM1或更特别地针对其细胞外结构域的亲和结合伴侣。
因此本发明的结合剂可以选自蛋白或多肽，诸如抗体或其片段或衍生物、来自噬菌体展示或核糖体展示或任何其他肽展示系统的组合地衍生的多肽、GDF15的非激动性片段(例如包含GDF15的一部分的多肽)或核酸分子(诸如适体)或其组合。
在本发明的一个优选的实施方案中，结合剂是蛋白，优选为抗体或其衍生物或片段。多种抗体样分子在本领域也是已知的并被描述，并且可以使用，例如亲和体(affibody)等。
在一个优选的实施方案中，所述结合剂是抗体。所述抗体可以是任何常规的或期望的种类、类别或亚型。此外，所述抗体可以是天然的、衍生的或合成的。因此如本文使用的术语“抗体”包括所有类型的抗体分子和抗体片段。
更特别地，根据本发明的“抗体”包括：
(a)源自任何动物(例如常规使用的动物(例如绵羊、兔、山羊或小鼠)中的任一种)或卵黄的多种类别或亚类的免疫球蛋白(例如IgG、IgA、IgM、IgD或IgE)中的任一种；
(b)单克隆或多克隆抗体；
(c)单克隆抗体或多克隆抗体的完整抗体或片段，所述片段为包含抗体的结合区域的那些片段，例如缺乏Fc部分的片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、通过完整抗体中连接重链组分的二硫键的还原性裂解获得所谓的“半分子”片段。Fv可以被限定为包含表达为两条链的轻链的可变区和重链的可变区的片段；
(d)通过重组DNA或其他合成技术产生或修饰的抗体，包括单克隆抗体、抗体的片段、人源化抗体、嵌合抗体或合成制备或改变的抗体样结构。也包括抗体的功能衍生物或“等效物”，例如单链抗体。
单链抗体可以被限定为在遗传上工程化的分子，其作为融合的单链分子包含通过合适的多肽接头连接的轻链的可变区、重链的可变区。
制备此类抗体片段以及合成的和衍生的抗体的方法是本领域熟知的。也包括包含抗体的互补决定区(CDR)或高变区的抗体片段。这些抗体片段可以被限定为包含抗体的轻链和重链上的形成三维环结构的氨基酸序列的区域，所述三维环结构有助于抗原结合位点的形成。CDR可以用于生成CDR移植的抗体。如本文使用的“CDR移植的”限定具有如下氨基酸序列的抗体：其中轻链和/或可变结构域中的一个或多个序列中的至少部分已经被来自对给定的抗原具有不同的结合特异性的抗体的CDR序列的类似部分替换。本领域技术人员可以利用本领域熟知的方法容易地制备此类CDR移植的抗体。
嵌合抗体可以通过组合一个种类的抗受体抗体的可变结构域与源自不同种类的抗体的恒定区来制备。可以使用此类技术来使抗体人源化用于治疗用途。
根据本发明，单克隆抗体及其片段和衍生物是优选的抗体。
优选地，抗体将是人源化或嵌合抗体，即已经被修饰或创造以包含以下的抗体：结合结构域(例如互补决定区(CDR))，所述结合结构域识别人GDF15受体；以及固定(例如Fc)结构域，所述固定结构域已经被修饰以增加其与人类中天然产生的抗体变体的相似度。在一个特别的方面，人源化单克隆抗体或嵌合单克隆抗体可以是IgG4亚型。修饰该类型是期望的，以提供具有最小免疫原性效应的抗体。
在另一个优选的实施方案中，抗体可以是人抗体。人抗体可以使用转基因小鼠或其他转基因动物来制备，所述转基因小鼠或其他转基因动物可以已经被修饰以表达人免疫球蛋白基因。它们还可以从噬菌体展示获得，或者事实上它们可以从人受试者，即其中抗受体抗体天然地存在或出现(即无需免疫受试者用于抗体产生)的人受试者，例如人自身免疫受试者分离。
与QRFPR或CLPTM1结合的抗体已被报道，并且是商业可得的(参见例如以下实施例)。一个此类实例是从Bioss Antibodies(USA)可得的抗CLPTM1抗体bs-8018R。此外，受体的抗体可以利用已知且常规的技术容易地制备。用于确定抗体的抗原中的抗体结合位点(它结合的部分)的方法也是常规的(也参见以下实施例)并且因此确定QRFPR或CLPTM1中的表位或抗体结合位点是很可能的。
如上表明，本发明的多肽和结合剂可以以组合物，并且特别是可以被用于或可以被提供用于治疗或预防与升高的GDF15有关的症状的药物组合物的形式提供。此类组合物可以包含或含有本发明的一种或多种多肽和/或一种或多种结合剂。所述多肽和结合剂可以在单个组合物中一起提供，或在用于一起或联合使用的分开的组合物中提供(即作为联合疗法)。所述多肽和结合剂可以顺序地或同时地或基本上同时施用或使用。因此，不同的多肽和结合剂组分可以一起或分开施用或使用；基本上同时施用或使用；或分开施用或使用，各自在不同的时间或时间间隔分开施用或使用。
此类组合物或组合(例如如以上描述的试剂盒或组合产品)可以包含获取自或衍生自QRFRP的细胞外结构域的多肽以及与QRFPR的细胞外结构域结合的结合剂。在一个另外的实施方案中，组合物或组合可以包含获取自或衍生自QRFPR的细胞外结构域的多肽以及与CLPTM1的细胞外结构域结合的结合剂。在另一个实施方案中，组合物或组合可以包含获取自或源自CLPTM1的细胞外结构域的多肽以及与QRFPR的细胞外结构域结合的结合剂。在又一个另外的实施方案中，组合物或组合可以包含获取自或源自CLPTM1的细胞外结构域的多肽以及与CLPTM1的细胞外结构域结合的结合剂。
将明显的是，本发明的组合物、试剂盒或组合产品可以包含获取自或衍生自GDF15受体的多肽以及与相同受体结合的结合剂。在该情况中，通常期望的是，所述结合剂不与衍生自相同受体的多肽结合，因为所述结合剂和多肽将彼此结合并且从而不能阻断GDF15与其受体的相互作用。这可以以多种方式实现。在一个实施方案中，所述结合剂可以与GDF15的不直接参与GDF15结合的部分结合(并从而可以如以上讨论的通过空间阻碍间接地阻断GDF结合)，并且所述多肽可以源自GDF15受体的与GDF15结合的部分。在一个另外的实施方案中，所述结合剂可以与GDF15受体的参与结合GDF15的部分结合，并且所述多肽可以源自GDF15受体的不同部分。作为实例，所述结合剂可以与QRFPR的第四个细胞外结构域结合，并且所述多肽可以源自QRFPR的第三个细胞外结构域。在又一个另外的实施方案中，所述多肽可以包含序列修饰，例如保守置换，所述保守置换不损害其与GDF15结合的能力，但所述保守置换阻止其与结合剂结合。然而，技术人员将领会到，确定特定的结合剂是否可与与特定的多肽结合将是简单的，并且此类组合可以被避免。
因此，作为实例，可以使用相对于受体中的GDF15结合位点表现出表位移动的抗体，允许在同一受试者中使用此类受体连同获取自或源自相同受体的多肽，而不彼此干扰。
不与本发明的多肽结合或至少不与和它联合使用的多肽结合的结合剂的优势是，两种组分可以一起使用，并且可以有利地使用获得互补效应，与GDF15(例如在循环中游离的GDF15或位于肿瘤邻近部位的GDF15)以及GDF15可以与其结合以发挥有害或不希望的效应的受体两者均结合。
如前表明，若干种疾病、紊乱和症状与增加的GDF15水平相关。此类增加的GDF15水平可以在循环中或在身体的组织或器官中可检测到。GDF15还可以在肿瘤部位或邻近处局部增加，例如它可以在肿瘤的间质或细胞外基质中或周围积累。
与升高的GDF15水平相关的症状可以是其中GDF15水平增加的任何症状、疾病或紊乱，包括在循环中和/或局部地，例如在癌症(例如肿瘤)或其他损伤或紊乱的部位或邻近处(例如在炎症部位)。例如，当GDF15在癌症(例如肿瘤)部位处局部增加时，该增加可能不对GDF15的循环水平具有明显影响，但GDF15的局部浓度或量可能增加(例如在肿瘤的微环境中)。因此GDF15的水平可以相对于无研究的症状的受试者(例如健康受试者)，或相对于现在或曾经不存在症状的受试者的身体的部位或位置增加。
与升高的GDF15水平有关的症状因此可以包括其中GDF15水平异常的任何症状，不管是在循环中还是在身体的任何部位局部地。根据本发明还包括其中GDF15水平是不希望(例如导致对受试者的有毒或有害影响)的任何症状。还包括其中GDF15的活性增加或是不希望的任何症状。
此类症状可以包括以上提到的已知与增加的或升高的GDF15水平有关的症状中的任一种。因此，所述症状可以特别地包括恶病质，包括与任何原因有关或起因于任何原因的恶病质。恶病质可以起因于任何慢性或长期症状，包括炎性症状，诸如充血性心脏衰竭、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性阻塞性肺高血压、慢性肾病、囊性纤维化、多发性硬化、运动神经元病、帕金森病、痴呆、HIV/AIDS、类风湿性关节炎或任何其他炎性或自身免疫症状，包括例如狼疮、多发性硬化或强直性脊柱炎。
在一个特定的实施方案中，恶病质是癌症引起的。
更通常地，所述症状可以是不希望的或过度的重量减轻、或与食欲抑制和/或重量减轻有关或起因于食欲抑制和/或重量减轻的任何症状。重量减轻可以是对患者有害的，即临床上显著的重量减轻。实例包括厌食症。恶病质、重量减轻或食欲抑制可能与升高的GDF15的循环水平有关。关于恶病质、重量减轻或食欲抑制，结合剂可以特别地是针对受体QRFPR的结合剂。多肽可以是本发明的任何多肽，但可以特别地是源自或获取自QRFPR的多肽。
另外的症状包括癌症、骨病、心血管疾病、肺部紊乱(包括例如慢性肺部紊乱，如慢性阻塞性肺病(COPD)、肺动脉高血压)和肾部紊乱或疾病。
很多血液和铁过载紊乱也已经与升高的GDF15相关，并因此此类症状还可以包括镰状细胞疾病、遗传性球形红细胞症、I型和II型先天性红细胞生成异常性贫血、地中海贫血、难治性贫血伴环形铁粒幼红细胞(RARS)和丙酮酸激酶缺乏症。
癌症代表了根据本发明特别感兴趣的症状。已知不管循环的还是在癌症部位处局部地升高的GDF15水平指示大范围的不同癌症的差的预后，并且已知很多癌症过表达并分泌GDF15。例如，前列腺癌(Karan等Cancer Res 2009；69(1):2–5)、多发性骨髓瘤(Tanno等Blood.2014年1月30日；123(5):725-33)、黑色素瘤(Boyle等J Invest Dermatol.2009年2月；129(2):383-91)、结肠直肠癌(Barderas等Mol Cell Proteomics.2013年6月；12(6):1602-20)、胃癌(Baek等Clin Chim Acta.2009年3月；401(1-2):128-33)、乳腺癌(Kim等Carcinogenesis.2008年4月；29(4):704-12)、卵巢癌(等Onco TargetsTher.2015年2月23日；8:471-85)、子宫内膜癌(Alonso-Alconada等Mol Cancer.2014；13:223)、口腔鳞癌(Urakawa等Lab Invest.2015年5月；95(5):491-503)、胰腺癌(Wang等BMCCancer.2014年8月8日；14:578)、肺癌(Kadara等Cancer Biol Ther.2006年5月；5(5):518-22)、口腔癌(Schiegnitz等J Oral Pathol Med.2015年4月16日)、食管癌(Fisher等Br JCancer.2015年4月14日；112(8):1384-91)、睾丸癌(Altena等PLoS One.2015年1月15日；10(1):e0115372)和肝癌(Si等PLoS One.2011；6(5):e19967)与升高的GDF15水平有关。因此，能够降低GDF15与其受体的结合的活性的制剂将代表肿瘤学领域中有吸引力的可能疗法。
认为特别是GDF15和CLPTM1之间的相互作用在很多不同癌症的病理中可以是特别重要的，特别是对于与升高的GDF15水平相关的免疫功能的调节。然而，在某些癌症中，特别是在骨癌或其他癌症向骨的转移中，GDF15和QRFPR之间的相互作用可能是重要的。
术语“癌症”在本文被广泛使用以包括任何恶性、非恶性或癌前肿瘤，包括实体肿瘤和非实体肿瘤两者，例如造血癌。构思了任何已知的癌症，包括身体的任何组织或细胞的癌症以及不同的癌症类型，包括但不限于以上列出的那些。然而，在某些实施方案中，癌症不是直肠癌、结肠癌或前列腺癌(或不是前列腺癌或直肠癌)。在另一个实施方案中，它不是乳腺癌、宫颈癌或子宫内膜癌中的任一种或多种，或者它不是胶质瘤、除尤文肉瘤(EwingSarcoma)之外的肉瘤、间皮瘤或血细胞癌。在其他实施方案中，包括此类癌症。我们的数据似乎显示，尤文肉瘤与高水平的GDF15相关(参见图25)。可以使用本发明的任何多肽和/或结合剂，包括以上讨论的任何组合。因此，多肽可以源自或获取自QRFPR和/或CLPTM1，并且任何此类多肽可以与任何结合剂(即针对QRFPR和/或CLPTM1的结合剂)联合使用。然而，在某些优选的实施方案中，结合剂能够与CLPTM1结合。
在一个特定的实施方案中，多肽可以获取自或源自QRFPR，并且可以与针对CLPTM1的结合剂联合使用。或者，获取自或源自CLPTM1的多肽可以与针对CLPTM1的结合剂联合使用。
癌症可以是原发性或继发性癌症(即已经转移至身体中的继发部位的癌症，包括微转移)。
癌症可以是前列腺癌、膀胱癌、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、结肠直肠癌(包括结肠癌和直肠癌)、肾癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、口腔鳞癌、胰腺癌、肺癌、口腔癌、食管癌、睾丸癌或肝癌。
如上表明，我们已经特别地示出，QRFPR可以在多种骨癌或涉及骨的癌症中表达，包括原发性癌和转移两者，特别是前列腺癌向骨的转移。因此，癌症可以特别地是骨癌或涉及骨的癌症，例如尤文肉瘤、骨肉瘤或多发性骨髓瘤或继发性前列腺癌或其他癌症向骨的转移。
GDF15能够下调由很多不同的免疫细胞(例如自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和/或树突状细胞)提供的免疫响应。如上表明，已经显示，CLPTM1由多种免疫细胞(包含CD4和CD8阳性T淋巴细胞、CD14阳性单核细胞/巨噬细胞、CD11c阳性树突状细胞和/或NK细胞)表达。因此，在为本发明的基础的工作中，我们已经示出T细胞和/或其他淋巴细胞亚组可以表达CLPTM1。
有趣的是，大部分CD14阳性细胞(单核细胞/巨噬细胞)对于CLPTM1是显著阳性的。先前已经报道GDF15抑制巨噬细胞激活，并且也被称为巨噬细胞抑制细胞因子1(MIC1)。CLPTM1被GDF15刺激导致增加的GSK3B的磷酸化并降低免疫功能。在得到本发明的工作中还已经发现CLPTM1的GDF15刺激降低NKG2D的水平，并发现使用CLPTM1结合剂(一种抗体)阻断GDF15对CLPTM1的可接近性降低了NKG2D的水平被降低的程度。NKG2D在NK细胞和T细胞两者中表达。NKG2D是细胞溶解功能(诸如穿孔素和颗粒酶B释放)的关键效应器蛋白。由于已经显示GDF15降低细胞毒性细胞中的NKG2D水平(从而破坏细胞溶解功能诸如穿孔素和颗粒酶)，我们预料CLPTM1结合剂在免疫肿瘤学应用中是有特别功效的，在免疫肿瘤学应用中肿瘤来源的GDF15降低免疫效应器细胞诸如NKG2D阳性NK细胞和T细胞介导细胞溶解活动的能力。另外，我们预见抑制GDF15引起的CLPTM1与TGFb受体复合体(TGFB1(ALK5)/TGFBRII)的邻近可能是有益的，以阻断通过该复合体的下游信号传导，所述复合体对免疫细胞是抑制性的。
认为肿瘤间质中或转移部位(包括微转移)处升高的GDF15水平提供了癌症细胞逃避免疫系统的重要机制。因此，本发明的结合剂和/或多肽在阻止或降低GDF15的免疫抑制效应中可以具有效用。
因此，更通常地，本发明的治疗剂可以被用于抑制由GDF15引起或导致的免疫抑制或与升高的GDF15水平有关的免疫抑制。
此类免疫抑制可以特别地是细胞介导的细胞毒性免疫响应的抑制。因此，免疫抑制可以是由一种或多种免疫细胞(例如巨噬细胞、NK细胞、树突状细胞、中性粒细胞和/或T细胞)的降低的活性导致的免疫抑制。
更特别地，免疫抑制可以是在癌症的背景中，即与癌症有关的免疫抑制。免疫抑制可以由于增加的GDF15循环水平，或在某些优选的实施方案中，由于在癌症(例如肿瘤)的部位处升高的GDF15局部浓度。
特别地，本发明的结合剂和多肽在抑制癌症细胞的免疫逃避或抑制由癌细胞引起的免疫耐受中可能是有用的。本发明的阻断GDF15和QRFPR或CLPTM1、特别是CLPTM1之间的相互作用的治疗剂在抑制癌细胞的免疫逃避中可能是有用的。因此，获取自或源自CLPTM1和/或QRFPR的肽，以及能够与CLPTM1和/或QRFPR、特别是CLPTM1结合的结合剂在这点上可以是有特别效用的。如讨论的，本文讨论的治疗剂的任何组合可以被使用。
通过抑制免疫逃避，本发明的治疗剂可以帮助受试者的身体攻击癌症。因此，本发明可以通过促进(或有利于或增加或以任何方式使能够或帮助)身体中针对癌症的免疫响应，而帮助降低或废除受试者的身体中的癌症。
在一个特定方面，所述治疗剂可以被用于抑制癌症的扩散或转移。这可以包括抑制微转移的发展或抑制微转移的生长或扩散。转移可以是任何癌症向身体的任何部分。在特定实施方案中，它可以是前列腺癌、乳腺癌或肺癌的转移，包括例如向骨的转移。
在癌症的治疗中，本发明的治疗剂可以与其他抗癌疗法(例如与其他抗癌剂，包括其他免疫治疗剂或免疫肿瘤剂或化学治疗剂)组合或联合使用。因此，例如，本发明的制剂可以与基于细胞的癌症疗法(例如过继细胞转移疗法)联合使用和/或与基于抗体的疗法联合使用。
在一个特定的实施方案中，本发明的制剂可以与过继细胞转移疗法，特别地在一些实施方案中可以被修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)的NK细胞或T细胞、或者表达或被修饰为表达(即包含天然或异源)对癌症细胞表面上存在的抗原具有特异性的T细胞受体的T细胞联合使用。
本发明还提供了细胞毒性免疫细胞，所述细胞毒性免疫细胞例如通过基因敲除、基因敲低或基因删除被修饰为与不被修饰的细胞相比具有降低的CLPTM1水平和/或活性。
因此，基因(即编码CLPTM1蛋白的细胞中的序列)可以被修饰为降低CLPTM1蛋白的表达量，例如细胞表面的CLPTM1受体的量和/或受体蛋白的活性。因此，受体蛋白可以是失活的。这可以包括例如通过插入或替换/置换(例如天然CLPTM1基因的核苷酸序列的)天然核苷酸序列来修饰基因序列。这可以通过如本领域已知的标准诱变技术和/或同源置换来实现。
在特定实施方案中，细胞可以是表达或被修饰为表达T细胞受体的T细胞、或被修饰为表达CAR的T细胞。在一个另外的实施方案中，细胞可以是任选地被修饰为表达CAR的NK细胞。所述修饰的细胞在癌症的治疗中可以是有特别功效的，并且因此在一个实施方案中，细胞将包含对癌细胞表面上的抗原具有特异性的TCR或CAR。还提供了所述细胞在疗法(特别是在癌症疗法)中的用途，以及包含用于在治疗癌症中分开、顺序或同时使用的所述细胞和为本发明的多肽和/或结合剂的治疗剂的组合产品或制品(例如试剂盒)。因此，本发明的治疗癌症的方法或用途可以包括向受试者(特别是需要其的受试者)施用本发明的多肽和/或结合剂以及(即一起或组合或联合施用)所述修饰的细胞毒性免疫细胞。细胞和治疗剂(多肽和/或结合剂)可以(例如在分开的制剂)中分开、顺序或同时施用，如以上讨论的。因此，本发明的试剂盒可以包含多肽和/或结合剂以及修饰的细胞，如前文描述的。
本发明的制剂还可以与在癌症治疗中靶向免疫检查点的免疫治疗剂(即免疫检查点抑制剂)联合使用。检查点蛋白通过向免疫系统表明哪些细胞是健康的以及哪些细胞应被破坏，使免疫系统保持受控制。检查点蛋白通过阻止T细胞活化充当免疫系统上的“闸”。如果细胞在其表面上不具有足够的检查点蛋白，它可以被免疫系统破坏。在癌细胞的情况中，尽管可能存在发送该细胞是癌性的信号的分子，如果在细胞表面上不存在足够的检查点蛋白，则该细胞可以逃避免疫系统，并且已推测检查点蛋白促成在一些癌症免疫疗法中不成功。
检查点蛋白的最佳已知实例是PD-L1(程序性死亡配体1)。PD-L1的受体是PD-1。PD-L1阻止T细胞攻击健康细胞。癌细胞可以上调PD-L1作为保护性机制。当PD-L1激活T细胞表面上的PD-1受体时，T细胞被告知破坏其自身。如果T细胞被程序化为选择性地攻击癌细胞，则T细胞的该设定将被破坏并且癌症占了上风。
另一种检查点蛋白是细胞毒性T淋巴细胞抗原4或CTLA4。一旦细胞毒性T细胞变成有活性的之后，它在其表面上表达CTLA4，所述CTLA4然后与共刺激分子CD28竞争在抗原呈递细胞上的它们相互共用的配体，B7-1和B7-2。该平衡使细胞毒性活性保持受控制，同时允许T细胞功能以自我限制的方式进行。
其他检查点蛋白包括：CD-137(4-1BB)，所述CD-137为共刺激检查点蛋白；淋巴细胞激活基因3(LAG-3、CD223)，一种在耐受性T细胞上与PD-1共表达的CD-4相关抑制性受体；B7超家族蛋白B7-H3和B7-H4；T细胞蛋白TIM3；和磷脂酰丝氨酸(PS)，所述磷脂酰丝氨酸在正常细胞中为磷脂，所述磷脂在凋亡期间转位至外膜表面，抑制过度的免疫活化，所述过度的免疫活化否则将在腐化细胞物质的进程和清除期间发生。PS的外部化间接地刺激巨噬细胞，导致树突状细胞抗原展示的抑制。像PD-L1，外部化的PS被一些肿瘤细胞和肿瘤来源的微泡异常表达。因此，PS被认为被肿瘤用来阻止适应性肿瘤免疫。
可以靶向或抑制这些检查点蛋白中的任一种的免疫治疗剂被称为“检查点抑制剂”。
检查点抑制剂(也称为免疫检查点调节剂或CPM)被设计成降低检查点蛋白的有效性。理想地，CPM应将癌症暴露给免疫系统，而不引起同一系统攻击健康组织。
若干种检查点抑制剂是已知的，并且在癌症的治疗中可以与本发明的制剂联合使用，例如Creelan(2014)Cancer Control 21:80-89中描述的那些抑制剂，通过引用将其特此并入。
检查点抑制剂的实例包括：Tremelimumab(CP-675,206)，一种对CTLA-4具有高亲和力的人IgG2单克隆抗体；易普利单抗(Ipilimumab)(MDX-010)，一种针对CTLA-4的人IgG1单克隆抗体；纳武单抗(Nivolumab)(BMS-936558)，一种基本上缺乏可检测的抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)的人单克隆抗PD1IgG4抗体；MK-3475(以前的lambrolizumab)，一种在C228P处包含被设计为阻止Fc介导的ADCC的突变的人源化IgG4抗PD-1抗体；Urelumab(BMS-663513)，一种完全的人IgG4单克隆抗CD137抗体；抗LAG-3单克隆抗体(BMS-986016)；和巴维昔单抗(Bavituximab)(嵌合3G4)，一种抗PS的嵌合IgG3抗体。所有这些检查点抑制剂可以用于本发明。
一种可选的策略是抑制肿瘤细胞表面上的PD-L1(PD-1的配体)，并且因此还可以将PD-L1的抑制剂与本发明的制剂联合使用，例如MPDL3280A(RG7446)，一种人IgG1-κ抗PD-L1单克隆抗体。MEDI4736是另一种IgG1-κPD-L1抑制剂。
另一种可选的方法是使用B7-DC-Fc融合蛋白竞争性地阻断PD-1受体，并且因此此类融合蛋白也可以用于本发明。
在另外的一个可选的方法中，杀伤细胞免疫球蛋白样受体的抗体可以用作免疫治疗剂。杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)是NK细胞上下调NK细胞毒性活性的受体。HLA I类等位基因特异性KIR受体在细胞毒性(CD56dimCD16+)NK细胞中表达，而CD56brightCD16-NK亚组缺乏这些KIR。根据这些线索，抑制性KIR似乎在癌周NK细胞浸润物中选择性表达，并因此似乎为肿瘤增补的检查点途径，与PD-L1类似。因此，使用抗体抑制特异性KIR应该引起NK细胞的持续体内激活。例如，lirilumab(IPH2102)是KIR的完全人单克隆抗体并且根据本发明可被使用。
识别并结合癌症抗原的任何合适的抗体也可以与本发明的制剂联合使用。癌症抗原的实例或治疗性抗体的靶标包括：很多“CD”蛋白，诸如CD52、CD47、CD30、CD33、CD20、CD152和CD279；生长因子，诸如血管内皮生长因子(VEGF)；生长因子受体，诸如表皮生长因子受体(EGFR)或人表皮生长因子受体2(HER2)。
与此类抗原或靶标结合的若干种抗体是已知的并且已经被批准用于癌症的治疗，并且这些抗体中的任一种可以与本发明的制剂联合使用。优选的抗体是在治疗实体肿瘤，并且特别是具有改变的ECM的那些(诸如乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌)中具有效用的那些抗体。
已知并批准的抗体包括：阿仑单抗(Alemtuzumab)、贝伐单抗(Bevacizumab)、本妥昔单抗(Brentuximab vedotin)、西妥昔单抗(Cetuximab)、吉妥珠单抗奥唑米星(Gemtuzumab ozogamicin)、赫赛汀(Herceptin)、替伊莫单抗(Ibritumomab tiuxetan)、易普利单抗、奥法木单抗(Ofatumumab)、帕尼单抗(Panitumumab)、利妥昔单抗(Rituximab)、托西莫单抗(Tositumomab)和曲妥单抗(Trastuzumab)。
阿仑单抗是抗CD52人源化IgG1单克隆抗体，被指示用于治疗氟达拉滨-难治性慢性淋巴细胞白血病(CLL)、皮肤T细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤和T细胞幼淋巴细胞白血病。
贝伐单抗(阿瓦斯汀)是人源化IgG1单克隆抗体，其与血管内皮生长因子-A(VEGF-A)(通常被称为VEGF而没有后缀)结合。贝伐单抗结合并在物理上阻断VEGF，阻止受体激活，所述受体激活具有肿瘤血管形成的后果。贝伐单抗被批准用于结肠癌、肾癌、肺癌、卵巢癌、胶质母细胞瘤和乳腺癌。
本妥昔单抗用于治疗霍奇金淋巴瘤和间变大细胞淋巴瘤(ALCL)的第二代嵌合IgG1抗体药物缀合物。它是缀合至单甲基阿里他汀E(monomethyl auristatin E)(一种通过破坏微管阻止细胞分裂的药物)的抗体。该抗体与CD30结合，常被发现在霍奇金淋巴瘤和ALCL细胞的表面上高表达，并且然后被内化，在此处该药物从抗体分离并发挥其细胞效应。通过阻止细胞分裂，它通过引起程序性细胞死亡杀死癌细胞。
西妥昔单抗(爱必妥)是嵌合IgG1单克隆抗体，其靶向表皮生长因子受体(EGFR)的细胞外结构域(受体的细胞外部分)。它用于治疗结肠直肠癌和头颈癌。一旦配体与细胞表面上的EGFR结合，细胞内与恶性特性有关的信号传导途径被激活。这些包括引起癌症细胞增殖、侵袭、分化和癌症干细胞再生的PI3K/AKT和KRAS/BRAF/MEK/ERK途径。西妥昔单抗通过竞争性抑制配体结合，从而阻止EGFR激活和随后的细胞信号传导来发挥功能。
吉妥珠单抗奥唑米星是与细胞毒性卡奇霉素衍生物化学连接的IgG4抗CD33抗体的“免疫缀合物”，并且可以用于治疗急性髓性白血病(AML)。
替伊莫单抗(泽娃灵)是化学连接至结合放射性同位素钇-90(90Y)的螯合剂的鼠抗CD20抗体。它用于治疗特定类型的非霍奇金淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，其是B细胞的肿瘤。
易普利单抗(Yervoy)是结合表面蛋白CTLA4的人IgG1抗体，所述表面蛋白CTLA4在负调控T细胞的激活中具有作用。以下在检查点抑制剂的上下文中讨论了CTLA4。
尼妥珠单抗是嵌合人-小鼠抗EGFR单克隆抗体并且已批准用于头部和颈部的鳞状细胞癌(SCCHN)。
奥法木单抗是与CD20结合的第二代人IgG1抗体。它被用于治疗慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，因为CLL的癌性细胞通常是表达CD20的B细胞。不像与CD20蛋白的大环结合的利妥昔单抗，奥法木单抗与不同的小环结合。
帕尼单抗(维克替比)是与EGF受体结合的人IgG2抗体。像西妥昔单抗，它通过阻断受体和其配体之间的相互作用阻止通过受体的细胞信号传导。它被用于治疗结肠直肠癌。
利妥昔单抗是对CD20特异的嵌合单克隆IgG1抗体，开发自其母源抗体替伊莫单抗。正如替伊莫单抗，利妥昔单抗靶向B细胞上存在的CD20。由于这一原因，它在治疗某些类型的从癌性B细胞形成的恶性肿瘤中是有效的。这些包括：侵袭且无痛性淋巴瘤，诸如弥漫性大B细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤；以及白血病，诸如B细胞慢性淋巴细胞白血病。
托西莫单抗是共价键合至放射性碘131的鼠IgG2a抗CD20抗体，被称为“百克沙(Bexxar)”，其被批准用于治疗非霍奇金淋巴细胞瘤，但被自愿地退出市场。
曲妥单抗(赫赛汀)是对表皮生长因子受体2蛋白(HER2)特异的单克隆IgG1人源化抗体。它在1998年收到FDA批准，并且在临床上用于治疗乳腺癌。HER-2是跨膜酪氨酸激酶的表皮生长因子受体(EGFR)家族的成员。在本发明的一个优选实施方案中，免疫治疗剂并且因此抗癌剂是曲妥单抗，优选地用于卵巢癌的治疗。
在一个可选的实施方案中，抗体是抗CD47抗体，即阻断CD47信号传导的抗体。已经显示，此类抗体在针对细胞和小鼠的实验室测试中消除或抑制很大范围的癌症和肿瘤的生长。CD47存在于很多种癌细胞上，并且存在于很多健康细胞上。
在另外的一个可选的实施方案中，所述抗体是在癌细胞的表面上发现的碳水化合物分子的抗体。作为实例，此类抗体可以是抗GD2抗体。GD2是在很多种类型的癌细胞(包括神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、黑色素瘤、小细胞肺癌、脑瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、尤文肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、平滑肌肉瘤和其他软组织肉瘤)的表面上发现的神经节苷脂。它在正常组织的表面通常不表达，使其是用于免疫疗法的良好靶标，以允许针对肿瘤的特异性行动并降低毒性。在另外的实施方案中，治疗剂可以用于治疗或预防骨病。此类疾病可以包括任何骨病或涉及骨的任何疾病，包括如以上讨论的肿瘤疾病(即骨癌或涉及骨的癌症)和非肿瘤疾病两者。如以上讨论的，已经显示受体QRFPR在成骨细胞上表达，并且QRFPR的敲除与破骨细胞的数目的减少有关。与来自尤文和骨肉瘤的临床材料中的QRFPR表达的观察结果一致，在本申请中已经检测并定量了骨肉瘤U2OS细胞中的QRFPR水平，并且发现受到用GDF15刺激的调节。
因此，在一个优选的实施方案中，所述结合剂能够与QRFPR结合。所述多肽可以获取自或源自任一种受体，并且在一个实施方案中获取自或源自QRFPR。
特别地，骨病可以是与骨吸收(例如增加的、过量的或不希望的骨吸收)有关的疾病。在一个实施方案中，所述骨病可以是骨质疏松症，特别地年龄相关骨质疏松症。在另一个实施方案中，所述骨病可以是骨质减少。受试者可以是任何人或非人动物(优选哺乳动物受试者)。在一个特定的实施方案中，所述受试者是人，但在其他实施方案中它可以是家禽、家畜、农场、动物园、野生、实验室或运动(例如竞赛)动物，例如灵长类、狗、猫、鼠、猪、牛、马等。
如以上描述的，GDF15独立地与QRFPR和CLPTM1结合。已经发现GDF15经由外泌体脱落和靶向蛋白酶体的内体引起QRFPR从细胞表面的损失，并且已经发现GDF15经由TGF-β受体复合物增加GSKB的磷酸化。因此，通过测量QRFPR从细胞表面的损失，或通过测量GSKB被磷酸化的程度，确定GDF15对这些受体中的每一种的‘活性’(即当GDF15暴露至细胞时，它能够影响其生物功能的程度)是可能的。因此，本发明的结合剂或多肽降低GDF15的活性(即阻止GDF15产生或发挥其生物功能)的能力可以通过测量特定的结合剂或肽是否能够降低GDF15的活性来确定。因此，本发明的结合剂或多肽将优选地能够与GDF受体或与GDF15结合，并且在实质上抑制或废除GDF15的活性，即将GDF15的活性降低至与在结合剂或多肽不存在时的GDF15的活性水平相比小于50％、40％、30％、20％或10％。更优选地，所述结合剂或多肽将使GDF15的活性降低至小于9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小，即所述结合剂或多肽可以优选地有效消除GDF15的活性。
除了结合剂以及蛋白或肽之外，治疗组合物可以包含任何药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。如本文引用的“药学上可接受的”指与组合物的其他组分相容并且对于接受者在生理上可接受的组分。组合物以及载体或赋形剂材料的性质、剂量等可以根据选择以及期望的施用途径、pH、温度等以常规方式选择。
治疗剂的剂量还可以根据标准临床实践以常规方式来确定。0.1-10mg/kg的剂量，诸如0.1-0.5mg/kg、0.1-1mg/kg、0.1-2mg/kg、0.1-5mg/kg、0.5-1mg/kg、0.5-2mg/kg、0.5-5mg/kg、0.5-10mg/kg、1-2mg/kg、1-5mg/kg、1-10mg/kg、2-5mg/kg、2-10mg/kg或5-10mg/kg的剂量可以每日，每周，或每10天、2周、3周或每月施用，直到观察到疾病进展或直到观察到可接受的细胞毒性。
同样地，所述治疗剂可以以任何方便或期望的方式施用，例如胃肠外或非胃肠外地，例如通过肠内施用，例如口服(取决于制剂的性质和/或配制)或通过静脉内、皮下、肌肉内、腹腔内注射或输注。取决于例如待治疗的症状、制剂的性质和/或配制等，施用可以是全身的或局部的。因此，例如可以将制剂例如通过输注或直接注射局部地递送到例如癌症的部位或位置。
GDF15以及受体QRFPR和/或CLPTM1之间的相互作用或者GDF15与受体中的一者或二者的结合的效应可以检测，并且此类检测方法可以被用作本文公开的治疗或预防方法的伴随诊断的基础。
因此，相互作用和/或其效应的检测可以被用于检测或确定受试者可能或是否可能需要根据本发明的治疗或预防(阻止)，或者可以或是否可以从其受益，或者可能或是否可能需要例如在治疗的进程期间或结束时监测或评价治疗或预防。因此，GDF15与受体QRFPR和/或CLPTM1的相互作用的存在，或GDF15在受体QRFPR和/或CLPTM1处的可检测的效应的存在可以被用作生物标志物，例如用于施用根据本发明的治疗或预防的预测性生物标志物，或被用于监测或评价治疗或预防的效果。另外，通过检测相互作用和/或其效应，可以确定或检测受试者是否具有与升高的GDF15水平有关的症状，例如癌症，特别是骨癌，包括原发性骨癌或向骨的转移。特别地，它可以用于检测向骨的转移。
因此，本发明的一个另外的方面提供了一种检测需要治疗或预防的受试者的方法，特别是通过施用根据本发明的治疗剂(即能够抑制GDF15与受体QRFPR和/或CLPTM1的相互作用的多肽和/或结合剂，例如如本文限定的制剂)，所述方法包括检测受试者中的GDGF15以及受体QRFPR和/或CLPTM1之间的相互作用和/或如此相互作用的效应。
在另一方面，本发明提供了通过向受试者施用根据本发明的治疗剂(即能够抑制GDF15与受体QRFPR和/或CLPTM1的相互作用的多肽和/或结合剂，例如如本文限定的制剂)来评价或监测治疗或预防方法的方法，所述方法包括检测和/或监测受试者中的这种相互作用的效应。
又一个另外的方面提供了检测受试者具有与升高的GDF15水平相关的状况或有发展该症状的风险的方法，所述方法包括检测所述受试者中的GDF15与受体QRFPR和/或CLPTM1的相互作用或所述相互作用的效应。
相互作用或其效应可以在体内(即在受试者中)或在体外检测。即，相互作用或其效应可以在受试者的身体中、或者优选地在来自所述受试者的样品中检测。样品可以是任何合适的临床样品。更特别地，样品可以是包含表达受体QRFPR和/或CLPTM1的细胞的样品。因此，样品可以是来自受试者的任何包含细胞的临床样品。它可以是组织或体液样品，例如组织活检样品、血液或血液来源的样品(例如血浆、血清或其级分)、尿、CSF、唾液、粪便或拭子、洗涤物或冲洗物等。
相互作用可以通过本领域已知的用于检测两种或更多种结合伴侣之间的结合或相互作用的任何手段来检测。因此，所述方法可以是基于检测GDF15和受体之间的结合的任何方法。它可以是例如基于邻近测定的方法，并且特别是基于使用GDF15和受体的基于抗体的结合伴侣的邻近测定。邻近测定是本领域所熟知的并且在文献中被广泛地描述。Uppsala,瑞典的Olink AB已经开发并商业化了基于成对(或更多)的邻近探针的邻近测定，每个探针包含：结合伴侣(其能够直接或间接地与分析物结合(例如经由媒介分析物结合抗体或分析物的其他结合伴侣)以及核酸结构域(当探针已经邻近地键合时(例如当相互作用对的伴侣已经相互作用或键合在一起时)，所述核酸结构域与一种或多种其他邻近探针的核酸结构域相互作用以产生可检测信号)。邻近探针的核酸结构域之间的相互作用可以包含核酸连接和/或延伸反应，并且可以通过连接和/或延伸产物来检测。核酸结构域自身可以相互作用(例如可以连接在一起)或者它们可以作为从一种或多种添加的寡核苷酸形成连接和/或延伸产物的模板。可以特别提到的是邻位连接测定(PLA)，其可以被用于原位检测细胞或组织样品中的相互作用。这种测定已经由Olink AB开发并以的商标名销售。在US6878515、US 7306904、WO 2007/107743、WO/EP2012/051474和WO2012/152942中描述了邻近测定。
用于检测GDF15和受体之间的结合的另外的方法可以包括免疫测定，诸如酶联免疫测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或免疫PCR。
以上描述了与QRFPR或CLPTM1结合的GDF的多种效应，并且这些效应中的任一种可以被检测。在一个特别优选的实施方案中，可以检测QRFPR阳性外泌体的生成。例如，可以例如通过蛋白质印迹在获取自细胞的条件培养基中检测QRFPR阳性外泌体。或者，QRFPR阳性外泌体可以通过显微术，例如荧光或电子显微术来检测。GDF15与QRFPR阳性外泌体的相互作用还可以例如通过以上提到的任何基于邻近的检测测定来检测。特别地，可以使用原位PLA。在一个另外的优选实施方案中，可以检测通过CLPTM1被GDF15的激活生成的磷酸化的GSK3b。在一个实施方案中，这可以利用基于邻近的检测测定，例如通过使用能够与GSK3b结合的第一探针和能够与磷酸基团结合的第二探针来完成。在一个实施方案中，检测可以通过PLA，特别地通过原位PLA来进行。
通过以下实施例和图可以更好地理解本发明，其中：
附图说明
图1显示了包含QRFPR的外泌体被暴露至GDF15的细胞释放。A)获取自条件培养基的外泌体的电子显微图，所述条件培养基获取自暴露至GDF15的MCF-7乳腺癌细胞。B)从来自MCF-7细胞的条件培养基获取的外泌体的蛋白质印迹-QRFPR被检测为在49kDa处的单个条带。暴露至GDF15的细胞显示出在条件培养基中比未暴露至GDF15的细胞更高的QRFPR水平。
图2表明了细胞表面上的GFD15-QRFPR复合体。A-B)MCF-7细胞表面的GDF15-QRFPR复合体的原位PLA检测。A)暴露至舒林酸(Sulindac)硫化物后的细胞。用siRNA对照(缠绕的RNA)处理的细胞。B)暴露至舒林酸硫化物并用QRFPR siRNA处理以降低细胞中存在的QRFPR水平后的细胞。
图3显示了GDF15刺激降低细胞表面的ACTRIIB-QRFPR复合体的水平，以及早期内体抗原1(EEA1)被GDF15招募至QRFPR。A-B)MCF-7细胞表面上的ACTRIIB-QRFPR复合体的原位PLA检测。在37℃用GDF15刺激细胞20分钟使复合体的表面水平降低。C-D)MCF-7细胞表面上的QRFPR-EEA1复合体的原位PLA检测。在37℃用GDF15刺激细胞5分钟导致将EEA1招募至QRFPR。
图4显示了GDF15刺激导致CD9-QRFPR复合体在细胞表面的形成。A-D)MCF-7细胞表面上的CD9-QRFPR复合体的原位PLA检测。A)和C)不具有添加的GDF15的阴性对照细胞。B)和D)在37℃暴露至GDF1530分钟后的细胞。在用GDF15刺激30分钟的细胞中，CD9-QRFPR复合体被检测为在较高水平。
图5显示了GDF15刺激导致Rab11-QRFPR双阳性内体的形成。A-D)MCF-7细胞中的Rab11-QRFPR复合体的原位PLA检测。A)和C)不具有添加的GDF15的阴性对照细胞。B)和D)暴露至GDF15后的细胞。在用GDF15刺激的细胞中，Rab11-QRFPR复合体被检测为在较高水平。
图6显示了GDF15刺激降低细胞中的QRFPR水平并靶向QRFPR用于蛋白酶体降解。A-D)细胞表面的QRFPR的检测。A)不具有添加的GDF15的对照细胞。B)暴露至GDF15过夜后的细胞。C)用蛋白酶体抑制剂MG132过夜处理的对照细胞。D)在蛋白酶体抑制剂MG132的存在下，过夜暴露至GDF15后的细胞。在MG132不存在下暴露至GDF15后，QRFPR的水平降低(B)，然而，在MG132的存在下，QRFPR的水平不受GDF15的影响，表明由GDF15引起的QRFPR的降解被阻断。
图7显示了GDF15刺激导致Rab4-QRFPR双阳性内体的形成。A)细胞暴露至GDF15后，Rab4-QRFPR复合体的原位PLA检测。B)细胞暴露至GDF15后，Rab4-QRFPR复合体的原位PLA检测，其中细胞用与QRFPR的细胞外结构域结合的抗体预孵育。在用阻断抗体预孵育的细胞中检测到的Rab4-QRFPR复合体的水平降低。
图8显示了源自QRFPR和CLPTM1的肽能够与GDF15相互作用。A)来自QRFPR和CLPTM1的细胞外结构域的生物素标记的肽被固定在链霉亲和素-琼脂糖珠上并被发现在大量洗涤后与GDF15相互作用。B)包含源自QRFPR和CLPTM1的细胞外结构域的肽的GST融合蛋白与GDF15一起孵育。发现包含这些肽的融合蛋白与GDF15相互作用。
图9显示了来自QRFPR的细胞外环的肽足以阻断GDF15介导的QRFPR的内体积累。A-D)在MCF7细胞暴露至GDF15后，Rab11-QRFPR复合体的原位PLA检测。A)+对照肽。B)+QRFPR细胞外N末端肽。C-D)+QRFPR细胞外环3(结构域4)肽。Rab11-QRFPR复合体的水平被来自QRFPR的细胞外环3的肽降低。E)U2OS骨肉瘤细胞中的QRFPR的原位PLA检测。柱状图表明，来自QRFPR的细胞外环3的肽能够将在细胞表面检测的QRFPR水平恢复至与未曾暴露至GDF15的对照细胞相同的水平。
图10显示了来自QRFPR的细胞外环的肽可以降低GDF15对细胞表面的QRFPR水平的影响，同时不影响QRFPR被其内源激动剂P518的激活。A-C)在细胞表面的QRFPR的原位检测。A)不具有添加的GDF15的阴性对照细胞。B)暴露至GDF15后的细胞。C)暴露至源自QRFPR的细胞外结构域4的GDF15+合成肽GEKEYDDVTIK的细胞。该肽逆转了QRFPR从细胞表面的移除。D-F)在细胞表面的ACTRIIB原位PLA检测。D)不具有添加的P518的对照细胞。E)暴露至P518后的细胞。F)暴露至125摩尔过量的源自QRFPR的细胞外结构域4的P518+合成肽GEKEYDDVTIK后的细胞。P518增加细胞表面的ACTRIIB水平的能力不受该肽的影响。
图11显示了靶向QRFPR的细胞外结构域的抗体能够阻止GDF15引起的内吞作用。A-C)Rab4-QRFPR复合体的原位PLA检测。A)不具有添加的GDF15的阴性对照细胞。B)暴露至GDF15后的细胞。C)与靶向QRFPR的细胞外结构域的抗体一起预孵育后，暴露至GDF15后的细胞。
图12显示了测量在肽阵列上的结合，鉴定QRFPR的第三个细胞外结构域内与GDF15结合所需的残基的肽筛选的组合结果。A)GDF15与固定化肽的结合的结果。B)在肽阵列中测试的肽的比对。加下划线的残基表明当被置换成丙氨酸或双重置换(AA)时结合降低。显示了用于筛选的肽的SEQ ID号。
图13显示了通过测量抗体与一系列肽的结合鉴定靶向QRFPR的细胞外结构域的多克隆抗体的表位。A)pAb与固定化肽的结合的结果。B)结合结果的归纳，表明了相对于配体结合位点的位置，pAb的表位。抗体中的一种的表位与配体结合位点良好地重叠。在实施例8中示出了用于筛选的氨基酸的序列。
图14显示了表达CLPTM1的NK细胞的GDF15处理增加了CLPTM1-TGFBRI复合体的水平。A-B)CLPTM1-TGFBRI复合体的原位PLA检测。A)不具有添加的GDF15的阴性对照细胞。B)暴露至GDF15后的细胞。CLPTM1-TGFBR1复合体的水平响应于GDF15增加。
图15显示了表达CLPTM1的NK细胞的GDF15处理增加了CLPTM1-TGFBRII复合体的水平。A-B)CLPTM1-TGFBRII复合体的原位PLA检测。A)不具有添加的GDF15的阴性对照细胞。B)暴露至GDF15后的细胞。CLPTM1-TGFBRII复合体的水平响应于GDF15增加。
图16显示了靶向CLPTM1的单克隆抗体能够阻断NK细胞中的GDF15和CLPTM1之间的相互作用。A-C)使用一对邻近探针的磷酸化GSK3b(GSK3b-p(9/21)的原位PLA检测。A)不具有添加的GDF15的阴性对照细胞。B)暴露至GDF15和对照抗体后的细胞。C)在与靶向CLPTM1的细胞外结构域的单克隆抗体一起预孵育后，暴露至GDF15后的细胞。D)蛋白质印迹，表明了磷酸化GSKb(p-GSKb)的水平。泳道1-无GDF15。泳道2-GDF15刺激+对照抗体。泳道3GDF15刺激+mAb小鼠(用于原位PLA实验的抗体)。小鼠mAb抗体能够降低暴露至GDF15的细胞中的p-GSKb水平。
图17显示了测量肽阵列上的结合，鉴定CLPTM1的细胞外结构域内与GDF15结合所需的残基的肽筛选的组合结果。显示了GDF15与固定化肽的结合的结果。
图18显示了通过测量抗体与一系列肽的结合来鉴定靶向QRFPR的细胞外结构域的单克隆抗体的表位。A)mAb与固定化肽的结合的结果。B)结合结果的归纳，表明了相对于配体结合位点的位置mAb的表位。抗体之一的表位与配体结合位点良好地重叠。
图19显示了免疫系统的细胞表达CLPTM1。A)通过流式细胞术在SSC-A和Alexa-488通道中检测的CD4+T淋巴细胞。左-同型对照。中-0.3μg抗CLPTM1-Alexa。右-3μg抗CLPTM1-Alexa。B)通过流式细胞术在SSC-A和Alexa-488通道中检测的CD8+T淋巴细胞。左-同型对照。中-0.3μg抗CLPTM1-Alexa。右-3μg抗CLPTM1-Alexa。C)通过流式细胞术在SSC-A和Alexa-488通道中检测的CD45+/CD3+(非T淋巴细胞)。左-同型对照。右-抗CLPTM1-Alexa。在CD4+和CD8+T淋巴细胞两者中以及在CD45+/CD3+非T细胞中检测到CLPTM1表达。
图20显示了免疫系统的细胞表达CLPTM1。A)通过流式细胞术在SSC-A和Alexa-488通道中检测的CD14+单核细胞/巨噬细胞。左-同型对照。中-0.3μg抗CLPTM1-Alexa。右-3μg抗CLPTM1-Alexa。B)通过流式细胞术在SSC-A和Alexa-488通道中检测的CD11c+树突状细胞。左-同型对照。中-0.3μg抗CLPTM1-Alexa。右-3μg抗CLPTM1-Alexa。
图21显示了靶向CLPTM1的单克隆抗体能够阻断NK细胞中的GDF15和CLPTM1之间的相互作用，并抑制NKG2D被GDF15下调。A-B NK细胞中的NKG2D的检测。A)暴露至GDF15后的细胞。B)在与靶向CLPTM1的细胞外结构域的抗体一起预孵育后，暴露至GDF15后的细胞。
图22显示在肺鳞状细胞癌转移中发现了CLPTM1-GDF15复合体。CLPTM1和GDF15之间的相互作用由箭头指示。发现该相互作用与免疫系统的CD3+细胞共定位，表明CLPTM1在调节免疫功能方面可能是重要的。
图23显示在前列腺癌向骨的微转移中发现了升高的GDF15-QRFPR复合体水平。在前列腺向骨的微转移中GDF15-QRFPR复合体的原位PLA检测表明，在浸润骨的前列腺癌微转移的边界中发现了独特的特征。
图24显示在骨肉瘤和前列腺骨转移中发现了升高的GDF15-QRFPR复合体水平。A-B)在前列腺向骨的微转移中，GDF15-QRFPR复合体的原位PLA检测表明，在浸润骨的前列腺微转移的边界中发现了升高的GDF15-QRFPR复合体水平。C)在原发性前列腺癌中，GDF15-QRFPR复合体的原位PLA检测。原发性前列腺癌中GDF15-QRFPR复合体的水平被降低。D)在原发性骨肉瘤中GDF15-QRFPR复合体的原位PLA检测表明，在原发性骨癌中可以发现升高的GDF15-QRFPR复合体水平。
图25显示在尤文肉瘤中发现了升高的GDF15-QRFPR复合体水平。A)在原发性骨癌中GDF15-QRFPR复合体的原位PLA检测表明，在原发性骨癌中可以发现升高的GDF15-QRFPR复合体水平。B)在邻近尤文肉瘤的组织中(针对QRFPR分析的(A)部分的切片)GDF15-CLPTM1复合体的原位检测。未发现检测到复合体，表明CLPTM1不存在。
图26显示在恶性黑色素瘤中发现升高的GDF15-QRFPR复合体水平。A)在黑色素瘤中GDF15-QRFPR复合体的原位PLA检测表明，在黑色素瘤中可以发现升高的GDF15-QRFPR复合体水平。B)在邻近黑色素瘤的组织(针对QRFPR分析的(A)部分的切片)中GDF15-CLPTM1复合体的原位检测。未发现检测到复合体，表明CLPTM1不存在。
图27显示在具有严格洗涤条件的拉下测定中，包含源自QRFPR和CLPTM1的多肽的Fc融合蛋白与GDF15相互作用。AP5–QRFPR多肽，AP2–CLPTM1多肽，AP1–对照多肽，AP0–阴性对照。
图28显示了在LPS刺激的CD14+免疫细胞中，抗CLPTM1抗体对细胞因子的分泌的影响。在LPS的存在下，细胞因子分泌并且在与GDF15接触的细胞中分泌减少。抗CLPTM1抗体恢复了分泌IL12(图28A)和TNF(图28B)的能力。
图29显示了在LPS刺激的CD14+免疫细胞中，包含CLPTM1多肽的Fc融合蛋白对细胞因子的分泌的影响。在LPS的存在下，细胞因子分泌并且在与GDF15接触的细胞中分泌减少。包含CLPTM1多肽的Fc融合蛋白恢复了分泌IL12(图29A)和TNF(图29B)的能力。
图30显示了在LPS刺激的CD14+免疫细胞中，包含CLPTM1多肽的Fc融合蛋白对IFNγ的分泌的影响。在LPS的存在或不存在下，未检测到分泌，但是在与包含CLPTM1多肽的Fc融合蛋白接触的细胞中，检测到IFNγ，恢复了分泌IL12的能力。
图31显示了GDF15与CLPTM1来源的肽的结合。具有SEQ ID NO:250-273所示的氨基酸的多肽被固定在链霉亲和素包被的孔中，并测量了GDF15与每种肽的结合。
图32显示了多克隆兔抗CLPTM1抗体(Bioss)的表位在CLPTM1上的映射。鉴定到两种不同的表位。在图33A中显示了表位1鉴定，并且在图33B中显示了表位2鉴定。
具体实施方式
实施例
实施例1-串联亲和纯化-质谱法
我们使用具有相同亲和力标签的一组不同蛋白设计了蛋白-蛋白相互作用捕获测定，并包括GDF15以筛选相互作用的蛋白。由于在人病理(包括多种癌症)中的重要作用，以及关于相互作用的蛋白和受体的科学文献的空缺，GDF15被选择包括在组内。
多重诱饵蛋白的设计和构建
进行生物信息学(SSPRO、RASMOL)分析以排除诱饵中疏水性氨基酸的存在并避免已知二级结构元件的破坏。将诱饵插入物从质粒DNA PCR扩增并插入到允许庆大霉素选择的真核表达载体。
使用表达载体转染细胞，并针对一组诱饵蛋白(包括GDF15)平行地制备过表达稳定细胞系。
在克隆选择并且细胞扩增至足以允许足够的材料用于随后的质谱分析的量(108个细胞)的范围之后，使条件培养基经历针对载体中的框中编码(并且从而表达为与诱饵蛋白包括GDF15的融合物)的标签的亲和纯化。因此，诱饵蛋白在真核宿主中表达，增加了正确折叠的可能性。另外，由此构建的“人工”自分泌/旁分泌环允许宿主细胞的诱饵配体刺激以多种方式响应于诱饵，诸如包含受体的外泌体的释放，所述受体随后通过与加标签的诱饵共纯化而被捕获。
简而言之，来自不同培养物的加标签的蛋白诸如GDF15利用亲和基质来捕获、用包含清洁剂和逐渐增加的盐浓度的缓冲液大量地洗涤，然后从亲和基质洗脱并随后进行质谱分析。将与GDF15键合的蛋白消化并进行MS分析。在MS数据的基础上鉴定蛋白。
用多种诱饵进行多重运行。使用相同的标签，仅改变具体的诱饵允许与具体的诱饵独特地共纯化的蛋白的鉴定。编写软件脚本来使个体诱饵的独特击中的鉴定容易些。
从这些多重运行，我们鉴定到QRFPR和CLPTM1与GDF15诱饵独特地共纯化。
稳定细胞系的制备
建立稳定的细胞系并在收获前扩增。将细胞用无血清培养基洗涤，然后允许在无血清培养基中生长20小时。
蛋白在滤器上的胰蛋白酶消化
将500μL的等份样品基本上根据Wisniewski等(Wisniewski等,2009)的方案使用3kDa滤器(Pall Life Sciences,Ann Arbor,密歇根州,美国)在滤器上消化。胰蛋白酶消化在37℃在黑暗中过夜进行。然后将样品离心以收集滤液中的胰蛋白酶肽，同时保留滞留物中的未消化的蛋白和胰蛋白酶。添加另外体积为100μl的50％ACN、1％HAc，并将滤器旋转持续10min合并第一胰蛋白酶肽滤液混合。最后，将收集的滤液使用Speedvac系统ISS110(Thermo Scientific,Waltham,马萨诸塞州,美国)冷冻干燥，并在纳米LC-MS/MS鉴定前重新溶解到10μl 0.1％TFA中。
纳米LC-MS/MS用于蛋白鉴定
使用安装有纳米级电喷雾离子化(ESI)离子源的7T杂交LTQ FT质谱仪(ThermoFisher Scientific,不莱梅,德国)进行蛋白鉴定实验。使用Agilent 1100纳米流系统(Agilent Technologies,瓦尔德布隆,德国)进行在线纳米LC分离。在内部装配的15-cm熔融二氧化硅发射器(75-μm内径、375-μm外径)上进行肽分离。发射器利用在50-60巴操作的加压包装装置，装有反相的甲醇浆料、完全末端封闭的Reprosil-Pur C18-AQ 3μm树脂(Dr.Maisch GmbH,Ammerbuch-Entringen,德国)。用流动相A(具有0.5％乙酸的水)和B(89.5％乙腈、10％水、和0.5％乙酸)在200nL/min的流动下进行分离。利用从2％B到50％B的100-min梯度，然后用98％B的洗涤步骤持续5min。
诱饵蛋白产生自相同的载体构建体，共有亲和力标签和接头。我们使用这些诱饵来筛选从由G418选择的稳定细胞制备的条件培养基中的相互作用蛋白，并经由质谱法(MS)鉴定相互作用蛋白。为了选出对每种诱饵特异的命中，我们开发了内部软件：DataDrudger。从该分析，只有当GDF15被用作诱饵时，我们鉴定到来自QRFPR的胰蛋白酶肽。在我们的初始TAP-MS筛选中，还发现了第二种蛋白与GDF15诱饵共纯化。该蛋白被鉴定为唇腭裂跨膜蛋白1(CLPTM1)。
实施例2-从条件培养基纯化包含QRFPR的外泌体。
外泌体分离
在3,000x g依次离心条件细胞培养物5min，以使细胞成团，然后在10,000x g持续10min以进一步移除细胞和细胞碎片。然后使上清液过滤通过0.45μm滤器，并最终在4℃在100,000x g持续2h使成团。将成团的外泌体重悬在PBS中并添加蛋白酶抑制剂(completemini,Roche)。然后制备样品用于如其他处描述的进一步的分析。
通过电子显微术的外泌体鉴定
使成团的外泌体在20目聚醋酸甲基乙烯脂/碳包被的铜网格(polysciences,Inc.)上沉淀，然后通过在Technai G2(FEI)中通过80kV的透射电子显微术(TEM)进行分析(图1A)。
QRFPR阳性外泌体的蛋白质印迹鉴定
将来自超速离心的团块的材料在150v下在12.5％SDS-PAGE凝胶(Biorad)上分离80min，湿转移到Immobilon K膜，用5％BSA封闭1h(室温)，并与相应的QRFPR抗体在+4一起过夜孵育，伴随温和搅拌。用TBST洗涤膜，并应用与辣根过氧化物酶缀合的相应的第二抗体1小时(室温)，将膜用TBST洗涤并使用ECL检测试剂显影(图1B)。
实施例3-检测细胞表面的GDF15-QRFPR
为了研究GDF15和QRFPR之间的复合体在细胞表面上的存在，我们利用原位PLA分析了用舒林酸硫化物(一种NSAID，以增加低的内源GDF15的量)处理的MCF-7细胞，以检测GDF15和QRFPR之间的相互作用。我们比较用针对QRFPR的siRNA(图2B)或用序列缠绕的对照siRNA(图2A)处理的MCF-7细胞中的GDF15和QRFPR之间的邻近事件的水平。我们在QRFPRsiRNA处理的细胞中检测到降低的GDF15-QRFPR水平，从而证实了抗体的特异性以及受体在该细胞系中存在。在GDF15处理之前，细胞是血清饥饿的。
实施例4-GDF15刺激降低细胞表面的QRFPR水平
ACTRIIB-QRFPR邻近的检测
TGF-β超家族(GDF15属于其)的成员通过由两个I型和两个II型受体组成的异四聚体受体复合体传导信号。II型受体结合配体并将它们呈递至I型受体。我们寻求鉴定针对GDF15的相应的II型受体。
对于TGFb超家族只存在5种已知的II型受体，并且最初猜测ACTRIIB将满足此类相应的II型受体的一些标准。ACTRIIB是GDF8(TGFb超家族的在系统发生上接近GDF15的成员)的2型受体。另外，已经表明ACTRIIB参与脂肪新陈代谢。已经描述了QRFPR在脂肪细胞中表达。
用GDF15(来自分离的哺乳动物来源的GDF15或源自从Abcam和Biovision购买的大肠杆菌的重组体)刺激MCF7细胞。进行测定用于监测GDF15的活性或研究受体的动力学，诸如QRFPR被配体的调节。
用GDF15处理血清饥饿的MCF7细胞，并使用来自两种不同物种的抗体(因此允许使用Duolink第二检测试剂)进行原位PLA检测测定来检测ACTRIIB和QRFPR之间的相互作用。在GDF15不存在下检测QRFPR-ACTRIIB复合体的存在(参见图3A，由箭头指示)。然而，我们最初出乎意料的是，获得的信号被GDF15的短暂刺激(20分钟)的处理降低，表明被GDF15动态调节(参见图3B)。有趣地是，在使用MCF7细胞的实验中(其中细胞经历过夜血清饥饿以避免来自血清的任何混淆效应)，发现血清饥饿的细胞具有增加的QRFPR表达。
从文献可知，GDF15和QRFPR对两种下游靶标NPY和POMC具有相反的效应。因此，这表明GDF15可能干扰QRFPR的细胞表面水平。如果QRFPR从细胞表面移除，其亲水性激动性肽配体(26RF酰胺和QRFP)调节NPY和POMC的效应也将被抑制。GDF15调节对于哺乳动物新陈代谢是主要的关键靶标诸如NPY和POMC的能力，以及报告的其在恶病质中的作用，可以通过QRFPR的GDF15抑制来解释。
EEA1-QRFPR邻近的检测
为了研究GDF15对QRFPR内化的作用，设计了能够监测内体形成的一系列原位PLA测定。
早期内体标志物1(EEA1)是快速内体形成的标志物，并设计测定以检测EEA1和QRFPR的邻近。在GDF15不存在下，未获得信号(图3C)。然而，发现短暂的GDF15暴露(5min)足以增加由EEA1和QRFPR之间的邻近产生的RCA产物的数目，如通过使用EEA和QRFPR的抗体然后是Duolink第二探针的原位PLA测定测量(参见图3D，由箭头指示)。
我们还观察到GDF15引起QRFPR阳性分泌体的释放，从而表明途径的分叉，GDF15藉以可以降低QRFPR的细胞表面水平的两种方式。因此我们寻求设计掺入已知在内体和外泌体运输两者中具有双重作用的标志物的测定。
CD9-QRFPR邻近的检测
四次跨膜蛋白CD9在内体运输以及在外泌体分泌两者中具有双重作用(Mazurov等)。设计了原位PLA测定以使用针对CD9和QRFPR的抗体来检测CD9和QRFPR的邻近。在GDF15不存在下，仅观察到低的信号水平(图4A和4C)。用GDF15刺激30分钟导致较高的CD9-QRFPR复合体的信号水平，表明内体和外泌体的形成(图4B和4D)。
RAB11-QRFPR邻近的检测
RAB11蛋白是回收内体返回至细胞表面的标志物，并且RAB11途径还参与外泌体组装(Savina等,2005；Savina等,2002)。因此认为RAB11是参与由GDF15引起的细胞表面上的QRFPR减少的可能候选者。
设计原位PLA测定来检测RAB11和QRFPR的邻近。在GDF15不存在下，仅观察到低的信号(图5A和5C)。用GDF15刺激导致细胞质中的RAB11-QRFPR双重阳性内体的快速检测(图5B和5D)。
蛋白酶体降解的抑制
为了研究QRFPR的内体运输是否导致外泌体的组装和随后的脱落，或者QRFPR是否被靶向蛋白酶体降解，设计了如下测定：其中将细胞用GDF15刺激持续延长的时间段。
在之前的实验中已经观察到GDF15刺激导致细胞表面的QRFPR水平降低。然而，一旦蛋白酶体被蛋白酶体抑制剂MG132(终浓度10μM)抑制，QRFPR的水平与在MG132不存在下用等量的GDF15处理的细胞相比增加。图6A显示了GDF15不存在下的细胞，而图6B显示了已经用GDF15过夜刺激的细胞，并且其在细胞表面具有不可检测的QRFPR水平。图6C显示了已经暴露至蛋白酶体抑制剂MG132的对照细胞，并且图6D显示了已经暴露至蛋白酶体抑制剂MG132并用GDF15过夜刺激的细胞。
实验表明GDF15引起蛋白酶体介导的QRFPR的降解。在MG132不存在下，GDF15处理18小时显著降低了QRFPR的水平(图6B)。在用MG132处理的细胞中未观察到该效应(图6D)。
RAB4-QRFPR邻近的检测
已经报道RAB11阳性内体也包含RAB4，因此存在RAB4-RAB11双重阳性内体。设计测定以使用针对RAB4和QRFPR的抗体检测RAB4-QRFPR的邻近。在GDF15不存在下，未观察到RAB4-QRFPR的信号(参见图7A)。在GDF15刺激后检测RAB4-QRFPR双重阳性内体的形成(参见图7B)。
RAB4-RAB11双重阳性内体是已知的内体形式，并且我们因此通过两种独立的RAB标志物(4和11)表明，在细胞的GDF15暴露后，形成了QRFPR阳性内体。
QRFPR阳性内体的形成可以用于测定，以测量例如实施例6中的多种GDF15阻断剂的效应。
实施例5-体外相互作用测定
为了进一步表征与GDF15相互作用的肽，制备了一系列GST融合蛋白和生物素化的肽。GDF15获取自Biovision和/或Abcam。
使用源自QRFPR和CLPTM1的肽的GDF15的生物素拉下
设计来自QRFPR和CLPTM1蛋白的一系列肽。为了使肽用于免疫沉淀实验和增加的基于细胞培养物的测定两者，将N末端生物素添加至每种肽，并且反离子变成氯化物。
使用一系列生物素化的肽(图8A)。泳道1：非生物素化的对照；泳道2：生物素-GEIKYDFLYEKEHICCLEEWTS(SEQ ID NO:10；来自QRFPR的细胞外结构域3)；泳道3-生物素-GIEYSNFEKEYDDVTIK(SEQ ID NO:174；来自QRFPR的细胞外结构域4)；泳道4-生物素-GALFWEQHDLVYGDWTS(SEQ ID NO:19；来自CLPTM1的细胞外结构域的肽)；泳道5-生物素-来自不相关蛋白的肽(对照)。在沉淀GDF15方面，两种肽比其他的肽更成功(图8A泳道2和4)。
还使用了肽的组合。将肽以1:1的比例混合，具有与泳道1-5中相同的总量，得到与泳道1-5相比50％的每种肽。泳道6：来自QRFPR的EC结构域3和EC结构域4；泳道7：来自QRFPR的EC结构域4和来自CLPTM1的EC结构域的肽；泳道8：来自QRFPR的EC结构域3和来自CLPTM1的EC结构域的肽；泳道9：Mw标志物；泳道10：GDF15(阳性对照)。
我们先前用RAB11-QRFPR内体的实验以及拉下表明，细胞外环4也可以参与与GDF15的相互作用。因此，QRFPR的细胞外环3和环4两者均接触GDF15是可能的。
GST-融合QRFPR和CLPTM1片段的产生
我们之前已经用生物素化的来自QRFPR和CLPTM1的肽观察到用源自CLPTM1的基序的更多的GDF15滞留。
然后我们使用对应于来自细胞外结构域3、4(QRFPR)或CLPTM1的基序的合成的杂合寡核苷酸来组装来自QRFPR和CLPTM1的GDF15结合基序。将寡核苷酸插入到pGEX4T1骨架中，在BL21DE3pLys细菌中表达并纯化。通过Sanger测序来证实正确的序列。
然后我们将纯化的GST融合蛋白与等量的GDF15一起孵育，并使分析物经历大量洗涤，包括高盐缓冲液。
与之前的使用生物素化的肽结果一致，我们观察到在GDF15和CLPTM1来源的基序之间的更强的亲和力。
简而言之，从合成的寡聚物(ultramers，IDT技术)构建受体的选择的片段，通过限制性酶消化侧翼末端，并插入到pGEX 4T-1载体(Pharmacia Biotech)。在DH5a实验室高效细菌(Invitrogen)中克隆构建体。正确的克隆通过在2％琼脂糖凝胶上运行的分析性限制性消化来鉴定，并在Uppsala测序中心通过Sanger测序来验证。
验证的克隆被用于转化BL21pLYs细菌。使单克隆在补充有100μg/ml的氨苄青霉素的20ml LB培养基中过夜生长，并且在次日扩大至100ml，然后用0.1mM IPTG诱导3小时。将细菌细胞通过离心成团，通过超声处理和具有Triton x-100(1％)的PBS裂解。通过离心清除裂解物，并将上清液与谷胱甘肽珠(Pharmacia)一起过夜孵育。
GDF15的GST拉下
将等量的GST-融合蛋白与等量的GDF15在4℃在500μl的PBST中以翻滚式(end-over-end)旋转孵育4小时，并用谷胱甘肽琼脂糖4B珠(GE healthcare)捕获，然后用三种不同的洗涤溶液(PBST、具有添加的200mM NaCl的PBST和细胞裂解缓冲液(0.5％脱氧胆酸盐、NP-40))大量洗涤。在洗涤期间，将珠转移至新的Eppendorf管以避免与管壁的非特异性结合的残留，然后在SDS中煮沸。
在PBS中的最终洗涤
通过在用DDT补充的SDS加载颜料中煮沸5min使材料变性，然后在12％丙烯酰胺凝胶上运行(120V 70min)，并通过ECL和CCD照相机(Biorad)分析。
泳道3：GST-EIKYDFLYEKEHICCLEEWTS(与SEQ ID NO:7的GST融合物；QRFPR的EC结构域3)；泳道4：GST-ALFWEQHDLVYGDWTS(SEQ ID NO:18；来自CLPTM1的EC结构域的肽)。泳道7：GST对照(无融合物)。对于相应于QRFPR的细胞外结构域3和CLPTM1的细胞外结构域的一部分的肽，观察到增加的结合(图8B，泳道3和4)。
实施例6-阻断GDF15-QRFPR相互作用
在MCF7和U2OS细胞中使用肽阻断内化
我们选择使用本测定作为研究GDF15的活性是否可以被多种试剂抑制的方法。来自QRFPR的细胞外环3的受体片段实质性地降低GDF15引起RAB11-QRFPR双重阳性内体的能力(参见图9)。相反，来自不相关蛋白的对照片段不影响增加的RAB11-QRFPR双重阳性内体的抑制。GDF15引起的RAB11/QRFPR内体的形成被QRFPR肽抑制(图9A-D)。将等量的GDF15混合液等分并在PBS中与多种受体片段一起预孵育，然后添加至细胞。将细胞依次用PBS、GDF15或GDF15/QRFPR来源的肽混合物处理。在U2OS细胞中，细胞表面的QRFPR水平被GDF15降低，但被QRFPR肽恢复至正常水平(图9E)。
使用肽阻断内化而不影响P518
图10A-10C证实，GDF15降低细胞表面的QRFPR水平，并且该降低可以被源自QRFPR的细胞外环3(细胞外结构域4)的肽逆转。
测量了QRFPR激动剂p518的效应。简而言之，p518/QRFP-26购自PhoenixPeptides,加利福尼亚州，并且根据制造商的说明进行。在P518过夜刺激之前，细胞是血清饥饿的。
将P518与PBS或溶解于PBS的QRFPR受体片段混合，然后刺激细胞。
我们证明，仅p518足以增加ACTRIIB的水平，并且有趣地，QRFPR片段的存在并不降低P518引起的ACTRIIB水平的水平。相反，当用P518和QRFPR受体片段两者处理细胞时，我们注意到与用P518单独处理相比，ACTRIIB的轻微增加(参见图10D-F)。
因此，我们观察到QRFPR受体片段并不抑制QRFPR的激动剂P518，然而，它具有降低在针对QRFPR水平的不同测定中(图10A-C)表明的GDF15对QRFPR水平的效应的能力。
因此，通过使用这两种测定，检测并开发抑制GDF15而容留激动剂(p518)的选择性抑制剂(诸如本文使用的QRFPR片段或针对不干扰p518的表位的QRFPR抗体)是可能的。
阻止rab4内体的抗体
简而言之，使细胞过夜血清饥饿，然后与针对QRFPR的细胞外部分的阻断抗体一起预孵育2小时，然后是GDF处理(1μg/ml)30分钟。使用Duolink PLA系统，通过形成的RCA产物的可视化测量形成的RAB4-QRFPR复合体的水平(参见图11)。发现阻断抗体抑制RAB4-QRFPR内体的形成。在Pep-star阵列上证明使用的阻断抗体与QRFPR上的GDF15结合位点重叠。
对于证明针对QRFPR的抗体能够抑制GDF15介导的内体形成，该测定是有用的。
最初选择ACTRIIB，以研究它是否可能是GDF15的可能的II型受体的可能性。这基于以下事实：GDF15与GDF8密切相关，GDF8与ACTRIIB相互作用。发现GDF15通过至少以下两种机制降低QRFPR和ACTRIIB相互作用的程度(如通过邻近事件的数目的降低鉴定的)：内体介导的内化(例如经由RAB4和11内体)以及通过QRFPR的外泌体脱落。
出乎意料地，发现QRFPR的两种已知激动剂(p518/26RFa(26-mer)和QRFP(43-mer)以彼此相对的方式调节ACTRIIB的水平。鉴定到，这可以提供对于使得能够开发针对QRFPR的GDF15结合位点同时容留激动性配体的结合的选择性抑制剂有用的新型测定。
优选地，此类结合剂(例如抗体)可以通过直接结合与GDF15结合位点重叠的表位阻断GDF15与QRFPR的接近，或通过与邻近表位结合并通过例如空间障碍阻断结合从而抑制GDF15与QRFPR的接近来间接地阻断GDF15与QRFPR的接近。
优选地，此类结合剂不干扰受体的通过与内源性配体结合介导的激动性功能。因此本文提供的该ACTRIIB测定允许确定此类结合物是否干扰配体的激动性结合。
我们能够使用该测定来确定被用于抑制GDF15的肽不干扰QRFP。因此，可以通过使用ACTRIIB测定和RAB11-QRFPR内体测定两者来检测调节QRFPR激动剂和拮抗剂的功能的选择性工具。
实施例7-肽筛选
为了确定QRFPR的第三个细胞外结构域(细胞外环2)中存在的关键氨基酸和最小表位，我们设计了Pepstar肽阵列，所述Pepstar肽阵列购自JPT peptides。简而言之，阵列包括分成150-mer的QRFPR的细胞外环2的完全覆盖。该长度(15-mer)的肽基于制造商的推荐长度进行选择，基于诸如FMOC化学的合成效率、纯度和产率的因素。15-mer根据氨基酸步移、单或双丙氨酸扫描而变化。每组一式三份进行分析。将GDF15稀释到PBS-T(0.05％吐温-20)中并在+4℃在轨道式振荡器上在温和搅拌下过夜孵育。在Sky line轨道式振荡器DOS-10L,ELMI上在搅拌下进行洗涤。
将针对GDF15的一级抗体添加到预先GDF15孵育的孔和其中已经省略GDF15的邻近对照孔(仅PBS-T)，并在轨道式振荡器上在搅拌下孵育1小时(室温)。在重复洗涤之后，添加缀合荧光团的二级抗体，并在最终洗涤之后，在G2502微阵列扫描仪,AgilentTechnologies上分析阵列。将来自技术对照和对照孔(无GDF15)的荧光值减去，并在Excel和Prism中分析得到的一式三份的值。
我们能够从实验确定对于GDF15和QRFPR之间的相互作用是重要的最少的一组关键氨基酸。氨基酸步移和丙氨酸扫描显示，片段FLYEKEHIC(SEQ ID NO:11)对于GDF15结合是必要的。(图12)另外的片段也能够留滞GDF15，如本申请已列举的。
有趣地，GPR诸如QRFPR在细胞外环2(ECL2)中具有保守的半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基与细胞外环1中的半胱氨酸形成二硫桥。
激动剂和拮抗剂配体的结合在ECL2中在保守的二硫键周围引起不同的盖(lid)构象。已经暗示这些产生受体的不同功能状态。在我们的实验中我们证明了GDF15具有在该位点处精确相互作用，形成巧妙的调节机制的能力。通过在此处的准确相互作用，GDF15拮抗QRFPR的原基因(orixogenic)功能，从而调节关键新陈代谢调节激素诸如NPY和POMC的水平。我们表明，对于理解恶病质以及由很多癌症形式中的升高的GDF15水平引起的骨新陈代谢的失调以及其他人类紊乱，这是极其重要的关键机制(并且FLYEKEHICC(SEQ ID NO：78)是核心结合位点)。因此，我们表明，制剂(诸如与QRFPR的ECL2(ECD3)结合、或邻近QRFPR的ECL2(ECD3)并且通过空间障碍阻断GDF15结合QRFPR的能力的抗体)具有成为用于其中GDF15升高的紊乱的治疗剂的潜力。
实施例8-表位映射
为了确定用于细胞培养实验的抗体的表位，我们用多种受体结合抗体处理平行孔。实验和分析如图14中针对GDF15的分析，除了抗体在室温下孵育1小时。由此我们能够鉴定出与GDF15使用的表位具有重叠的抗体(图13)。氨基酸步移表明，QQLEIK(SEQ ID NO：335)，特别是K，对于N-15山羊抗体结合是必要的。N-15抗体还需要FLYEK(SEQ ID NO：210)，如通过丙氨酸扫描显示的(以红色标记)。因此，抗体与由配体占据的位点部分重叠。
表2-筛选肽序列的阵列
多肽序列 SEQ ID NO：
QQLEIKYDFLYEKEH 176
QLEIKYDFLYEKEHI 39
LEIKYDFLYEKEHIC 40
EIKYDFLYEKEHICC 41
IKYDFLYEKEHICCL 42
KYDFLYEKEHICCLE 43
YDFLYEKEHICCLEE 44
DFLYEKEHICCLEEW 45
FLYEKEHICCLEEWT 73
LYEKEHICCLEEWTS 324
YEKEHICCLEEWTSP 325
EKEHICCLEEWTSPV 326
KEHICCLEEWTSPVH 327
EHICCLEEWTSPVHQ 328
HICCLEEWTSPVHQK 329
实施例9-GDF15-CLPTM1
文献中已经报道GDF15介导下游信号传导，像通过ALK5(TGFBRI)激酶结构域介导的典型(SMAD)途径和非典型的TGFβ受体信号传导(诸如GSK3b的磷酸化)两者。为了研究CLPTM1是否参与其中，我们设计了一组原位PLA测定来确定CLPTM1和TGFβ受体之间的动力学以及TGFβ受体下游的组分。用GDF15处理NK-92细胞49min以检测细胞核中的磷酸化的SMAD蛋白诸如SMAD2。在GDF15刺激后，我们未在NK-92细胞中检测到c-末端磷酸化的SMAD2。从之前的用TGFB1刺激的实验，我们知晓测定(pSMAD2)是起作用的。
出乎意料地，在用GDF15刺激后，我们检测到引起的CLPTM1和TGFBRI(ALK5)之间的邻近，如图14中表明的。
未知的是，在GDF15刺激后，TGFBRI是否独立于相应的II型受体TGFBRII与CLPTM1定位，或者TGFBRI-TGFBRII异质复合体是否与CLPTM1缔合。为了确定该问题，使用来自另一物种的与CLPTM1抗体一致的针对TGFBRII的抗体设计了第二原位PLA测定。然后我们发现，GDF15处理也引起CLPTM1与TGFBRII的邻近(图15)。
在关于异四聚体TGFBRI-TGFBRII复合体的化学计量学和动力学的文献中，目前的假定表明了在细胞表面上的两种可选形式：1)配体刺激(例如(TGFB1))后，两个TGFBRI和两个TGFBRII受体的缔合，或2)预先存在的异四聚体复合体(即配体结合前)。
文献中的目前的假定表明了不同的优选的下游信号传导途径，其中前者(引起异四聚体的配体)更支持典型(SMAD)途径，并且后者(其中配体被呈递并结合预先存在的异四聚体)支持非典型途径，诸如非SMAD底物的磷酸化。
基于SMAD2磷酸化的不存在，和关于由GDF15引发的非典型下游信号传导的文献中的报道，以及我们发现的在GDF15刺激后两种受体均与CLPTM1缔合，我们推测CLPTM1参与将GDF15呈递至预先存在的TGFBRI-TGFBRII异四聚体复合体。
为了测试该理论，设计了测定来使用CLPTM1结合剂测试GDF15与CLPTM1的结合的效应(参见实施例10)。
实施例10-阻断GDF15-CLPTM1
通过在原位PLA测定中检测磷酸化的GSK3b-pGSK3b(9/21)，评价了结合CLPTM1的抗体对抑制GDF15引起的通过TGFB异四聚体复合体的下游信号传导的影响。已知GSK3b的磷酸化引起免疫抑制效应，即抑制免疫细胞功能。
为了验证CLPTM1参与GDF15并第一次证明阻断剂诸如抗体可以降低GDF15引起的下游信号传导，我们在对照抗体或CLPTM1抗体的存在下用GDF15处理NK-92细胞(参见图16)。我们证明，在对照抗体的存在下，GDF15引起GSK3b的9/21磷酸化(与文献一致)。然而，CLPTM1结合抗体降低了GDF15引起的GSK3b的磷酸化。不希望受理论束缚，这将表明，与CLPTM1结合的抗体可能能够抑制GDF15通过GSK3b磷酸化的免疫抑制作用。
实施例11-肽筛选
使用源自CLPTM1的细胞外结构域的肽，如实施例7中针对QRFPR描述的，我们研究了GDF15与CLPTM1的结合。从两种受体之间的BLAST同源性，我们鉴定到CLPTM1的细胞外结构域中的具有QRFPR的细胞外环2中的相应氨基酸序列的两个潜在位点(YISEHEH(SEQ IDNO:15)和LFWEQH(SEQ ID NO:16))。
CLPTM1的表位可以潜在地包含比用于阵列的15-mer肽更长的一段，并且具有较长的肽段和增加的亲合力(四聚体和二聚体)的生物素-肽和GST-融合物实验两者(参见实施例5)均提供了比线性的15-mer更好的GDF15结合。
从阵列实验(图17)，来自CLPTM1的若干种肽结合GDF15并在本申请中列出。
表3-CLPTM1筛选肽
多肽 SEQ ID NO：
ISEHEHFTDFNATSA 330
SEHEHFTDFNATSAL 320
EHEHFTDFNATSALF 331
HEHFTDFNATSALFW 332
EHFTDFNATSALFWE 333
HFTDFNATSALFWEQ 334
FTDFNATSALFWEQH 149
TDFNATSALFWEQHD 135
DFNATSALFWEQHDL 171
FNATSALFWEQHDLV 170
NATSALFWEQHDLVY 169
ATSALFWEQHDLVYG 168
TSALFWEQHDLVYGD 167
SALFWEQHDLVYGDW 166
ALFWEQHDLVYGDWT 142
相对短的肽并且特别是本文鉴定的结合基序的鉴定提供了可以用于阻断GDF15和其受体之间的相互作用的治疗产品的起点。然而不希望被特定的实施方案限制，潜在的GDF15诱饵肽可以被提供为用于治疗用途的环肽或Fc融合物。
实施例12-表位映射
我们确定，在本研究中使用的针对CLPTM1的抗体识别与GDF15结合位点重叠的表位，如实施例8中描述的(参见图18)。
表4-CLPTM1抗体表位映射
多肽 SEQ ID NO：
YISEHEHFTDFNATS 102
ISEHEHFTDFNATSA 330
SEHEHFTDFNATSAL 320
EHEHFTDFNATSALF 331
HEHFTDFNATSALFW 332
EHFTDFNATSALFWE 333
HFTDFNATSALFWEQ 334
FTDFNATSALFWEQH 149
TDFNATSALFWEQHD 135
DFNATSALFWEQHDL 171
FNATSALFWEQHDLV 170
NATSALFWEQHDLVY 169
ATSALFWEQHDLVYG 168
TSALFWEQHDLVYGD 167
SALFWEQHDLVYGDW 166
ALFWEQHDLVYGDWT 142
LFWEQHDLVYGDWTS 125
我们提出，在CLPTM1上的GDF15结合位点之外结合的抗体也可以通过空间障碍抑制GDF15与CLPTM1的结合，并因此在诸如免疫肿瘤学的应用中也可以是有用的，在免疫肿瘤学中，抑制与CLPTM1结合有关的GDF15介导的与TGFb受体复合体的交叉对话是期望的。GDF15的免疫抑制作用可能因此而阻断。
实施例13-CLPTM1在免疫细胞上的表达
为了研究CLPTM1在人免疫细胞上表达的程度，我们FACS分选了来自健康供体PBMC的多种免疫细胞类型，并检测了CD4+和CD8+ T淋巴细胞和CD45+CD3+非T淋巴细胞(图19)中的CLPTM1表达以及CD11c+细胞(树突状)和CD14+细胞(单核细胞/巨噬细胞)(图20)中的CLPTM1表达。
在CD4和CD8T淋巴细胞中，我们检测到表达高水平的CLPTM1的细胞亚组。在CD4阳性细胞中，我们检测到整体的高CLPTM1量。(图20)。
通过临床免疫学单位，KS，斯德哥尔摩并遵循建立的方案，进行健康供体PBMC的获得以及用于选择免疫细胞类型的FACS上的门控策略。
CLPTM1在免疫系统的细胞上的表达程度表明，它在免疫系统的调节中可以具有广泛的作用，并且可能能够在广泛范围的不同免疫响途径中调节免疫响应。
实施例14-NKG2D被GDF15下调的抑制
已经报道，TGFb超家族的成员诸如TGFb1和GDF15抑制表达NKG2D的免疫细胞诸如NK细胞和T细胞的细胞溶解功能。
NKG2D是关键效应器蛋白诸如穿孔素和颗粒酶的上游，并且已经报道TGFb1和GDF15抑制此类细胞溶解蛋白的水平。
基于文献、CLPTM1在免疫细胞诸如CD8+ T淋巴细胞和NK-92细胞中的表达以及GDF15引起的CLPTM1与TGFBRI-TGFBRII(TGFB1通过其传导信号)的邻近，我们研究了CLPTM1被抗体的阻断是否可以影响已经经历GDF15的长时间刺激的NK-92细胞中的免疫效应器NKG2D的水平。图21A显示，用GDF15过夜刺激导致NK-92细胞中的低的可检测NKG2D的水平。在GDF15刺激之前已经用能够与CLPTM1结合的结合剂(一种抗体)预处理的NK-92细胞中，NKG2D的减少被逆转(图21B)。因此，CLPTM1抗体可以增加NK-92细胞中NKG2D的水平。我们提出，这可以增加它们的细胞毒性。
实施例15-癌症适应症
检测肿瘤微环境中的免疫细胞中的CLPTM1-GDF15
我们利用购自US Biomax的商业可得的组织微阵列研究了两种受体在多种人类癌症中的存在。
对于CLPTM1-GDF15PLA相互作用阳性的浸润性细胞在一组人类癌症中的存在在图22中示例，图22显示了从鳞状肺细胞癌的转移。通过用FITC标记的CD3对比染色，我们能够检测到双重阳性的细胞。然而，我们还检测到CD3+CLPTM1-GDF15阴性细胞，可能代表如在我们的FACS数据中观察到的对于CLPTM1阴性的浸润细胞的群体。
另外，我们还检测到显示出CLPTM1-GDF15复合体的CD3-细胞，其可能代表其他免疫细胞诸如CD14+细胞(例如单核细胞)。组织诸如具有不同的浸润性免疫细胞类型的肿瘤转移的复杂性使得必要用其他标志物诸如CD14进行另外的研究。
还在GDF15富集的肿瘤微环境中表现出可检测的与GDF15结合的CLPTM1的肿瘤浸润性CD3+细胞的存在表明了抑制GDF15接近CLPTM1的CLPTM1结合剂(诸如抗体)的可能性。此类产品在降低GDF15引起的免疫抑制中可能是有用的。
骨癌中的QRFPR-GDF15的检测
对于QRFPR，我们在骨中的前列腺癌微转移的边界中检测到QRFPR-GDF15(参见图23、24A和24B)。与在前列腺癌向骨的微转移中可检测的高的信号水平相比，在原发性前列腺癌中可检测到低的信号水平(参见图24C)。
这是特别感兴趣的，因为GDF15被用作从前列腺的骨转移的生物标志物。另外，已知QRFPR在成骨细胞中表达，并且参与骨的新陈代谢。因此，在降低前列腺癌中GDF15引起的成骨细胞新陈代谢的失调方面，能够阻断GDF15接近QRFPR的QRFPR结合剂(诸如抗体)或多肽可以是有用的。
此类抗体在此类紊乱中将是特别有临床价值的，特别是如果被用于与目前的治疗方案诸如对破骨细胞起作用的二磷酸盐分开地治疗骨新陈代谢的失调的方面。
在以下原发性骨癌中也发现了QRFPR的表达：尤文肉瘤(图25)和骨肉瘤(图24D)。后者的表达与我们在U2OS骨肉瘤细胞中的QRFPR染色以及在U2OS细胞中的GDF15对QRFPR的调节的观察结果一致。因此，阻断GDF15和QRFPR之间的相互作用的QRFPR结合剂或多肽在此类紊乱中可以是有临床价值的，特别是如果被用于与目前的治疗方案诸如对破骨细胞起作用的二磷酸盐分开地治疗骨新陈代谢的失调的方面。
最后，在骨髓瘤中检测到QRFPR-GDF15复合体(图26)，代表了此类治疗剂的可能的另外的适应症。
实施例16-QRFPR和CLPTM1肽与GDF15的相互作用的拉下
在+4℃在PBST+1％BSA中将20μg Fc融合蛋白构建体与0.5μg GDF15和蛋白G珠一起混合孵育6小时。洗涤6次：3次PBST，更换管，2次PBST+220mM NaCl洗涤。最终PBS洗涤。在洗涤之间，使用设定在500g 5分钟的台式离心机收集珠。检测：将材料装载到4-12％梯度凝胶上，在100伏运行，使用Turbo Tank印迹系统转移到PVDF膜，用具有3％BSA的PBS封闭1小时(室温)，并与RD系统单克隆抗GDF15抗体一起过夜孵育。二级抗体：使用小鼠HRP 1：2000用于检测。通过与在毗邻泳道中运行的seeblue2蛋白梯度标志物比较估计带的大小。
设计掺入来自小鼠的序列的Fc融合蛋白：
将(GGGGS)x3用作柔性接头(SEQ ID NO：242)。
AP5(QRFPR肽)
Fc小鼠IgG1-GGGGSGGGGSGGGGSQRLEIKYDFLYEKEH(SEQ ID NO：240)
AP1(对照蛋白)
AAAQEADGARSAVVAAGGGSSGQVTSNGSIGRDPPAETQPQNPPAQPAPNAGGGGSGGGGSGGGGS-Fc小鼠IgG1(SEQ ID NO：323)
AP2(CLPTM1肽)
Fc小鼠IgG1-
GGGGSGGGGSGGGGSYISEHEHFTDFNATSALFWEQHDLVYGDWTS(SEQ ID NO：241
AP0
阴性对照
基于前面的结果(包括表明与GDF15的直接相互作用的阵列数据)，选择来自受体的片段。在阵列中，相互作用是肽单体和配体之间的。进行具有严格洗涤条件的拉下实验，并检测GDF15，如图27中所示。
讨论：在大量洗涤之后，我们注意到包含来自QRFPR的肽的AP5构建体和包含来自CLPTM1的肽的AP2构建体能够拉下GDF15。
结论：我们已经示出，GDF15对两种受体均具有亲和力，并且两种构建体均可以被考虑在其中升高的GDF15具有病理作用的紊乱中作为配体陷阱用于治疗用途。数据与阵列结果一致，其中例如AP1中的多肽不与GDF15相互作用，但AP2序列与GDF15相互作用。
不希望被理论所束缚，全长CLPTM1受体可以具有赋予较高亲和力的潜能。
实施例17-阻断GDF15的抗体和肽
确立了GDF15对免疫细胞的效应，并且发现该效应可以被靶向CLPTM1的抗体以及包含CLPTM1的细胞外结构域的一部分的Fc融合构建体阻断。
将CD14+细胞分离并在LPS刺激的培养物中在GDF15的存在或不存在下培养。GDF15证明了免疫抑制效应，因为在与GDF15一起孵育的细胞中，TNF和IL12的LPS响应分泌降低。多克隆兔抗体(由Bioss Antibodies提供的bs-8018R)降低了该免疫抑制效应，如由图28中两种细胞因子的分泌的增加所示。
源自CLPTM1的细胞外结构域的多肽(SEQ ID NO:17)也证明了GDF15的免疫抑制效应的相似逆转。该多肽被提供为包含N末端接头序列的Fc融合物，并被证明对TNF和IL12的相似作用，如由图29中两种细胞因子的分泌的增加所示。包含其接头序列的肽的序列由SEQID NO:241所示。
在包含CLPTM1多肽的Fc融合蛋白的存在下孵育用LPS刺激的CD14+细胞也被证明促炎蛋白IFNγ的分泌，如图30中所示。
材料和方法
外周血单核细胞(PBMC)的分离
用无菌、室温PBS稀释白膜层细胞(buffy coat cell)悬浮液或肝素化血液样品。1:1稀释外周血样品，而将白膜层稀释至120ml的最终体积(在标准白膜层中，这将导致比1:1略大的稀释)。将稀释的细胞悬浮液分层至Ficoll Paque PLUS上。对于一个白膜，使用4x15ml等份(30ml稀释的细胞悬浮液/管)。将细胞在室温在400xg离心30min，并转移至新的50ml管。将细胞洗涤一次并重悬在20ml PBS中。
CD14+细胞级分的磁力分选
通过离心使单核细胞悬浮物成团。将细胞以108个细胞/ml的浓度重悬在Stemcell缓冲液中并转移至圆底14ml管。以100μl/ml细胞添加EasySep阳性选择混合物，通过温和的移液混合，并在室温孵育15min。每1ml细胞添加50μl EasySep磁力纳米颗粒并混合，并在室温孵育10min。添加Stemcell推荐的培养基以使细胞悬浮液达到5ml的总体积，并通过温和地移液混合。将管(无帽)放入磁体并搁置5min。5分钟后，弃去上清液。CD14+标记的细胞将保留在管内。将管从磁体移出，并添加5ml Stemcell推荐的培养基并通过温和地移液混合。将管(无帽)放入磁体并搁置5min。重复该步骤，然后将细胞重悬在5ml完全RPMI培养基中。在台盼蓝溶液中稀释以及放置在Fast Read 102计数玻片后，移出50μl的CD14+细胞悬浮液并计数，以确定总细胞数。
培养物建立和刺激
第0天
将CD14+细胞悬浮液体积调整至在完全RPMI培养基中的0.833x106个细胞/ml的浓度。将300μl的细胞悬浮液添加到48孔板中的孔中(0.25x106个细胞/孔)并允许在37℃在孵育箱中粘附90min。通过将培养基温和地移液之后移除上清液，来移除未粘附的细胞。用300μl预温的完全RPMI培养基将细胞洗涤一次，并吸掉培养基。将300μl预温的完全RPMI培养基添加至每个孔，并在37℃在细胞孵育箱中过夜(20-24h)孵育细胞。
第1天
在完全RPMI中稀释期望的GDF15调节物质的17x储备溶液。(20μl物质/孔进行测定)。将20μl调节物质或培养基/载体(阴性对照)添加到每个孔并通过温和地移液混合。将细胞在37℃在细胞孵育箱中孵育30min。通过将100μg/ml储备溶液在完全RPMI中稀释至8.5μg/ml的浓度(在培养物中的终浓度0.5μg/ml)，制备17X GDF15溶液。每孔添加20μl稀释的GDF15，并在37℃在细胞孵育箱中过夜(18-20h)孵育。
第2天
通过将LPS储备溶液在完全RPMI中稀释至18ng/ml的浓度(在培养物中的终浓度为1ng/ml)，制备18X LPS溶液。将20μl LPS或培养基(阴性对照)添加至每个孔并通过温和地移液混合。将细胞在37℃在细胞孵育箱中孵育4h。将来自每个孔的200μl上清液转移至V底96孔板。对样品离心以移除任何细胞或碎片。将上清液转移至塑料96孔PCR板。立即进行TNF-α分析，或用粘性塑料盖盖住孔并在-80℃贮存直到进一步分析。
Proseek测定
利用Olink Proteomics AB(乌普萨拉瑞典)的多路复用邻近延伸测定Proseek(Assarsson E等PlosOne 2014)定量从细胞培养物分泌的蛋白。数据呈现为标准化蛋白表达(NPX log2)。运行Oncology v292-plex面板。呈现来自重要的促炎标志物IL12、TNF和IFNg的数据。
实施例18-GDF15与CLPTM1来源的肽的结合
材料和方法
在+4℃在链霉素亲和96孔板(#15500Pierce)中以在PBS中1μM过夜固定生物素化的来自CLPTM1的合成肽片段(JPT peptides，德国)。将板在具有0.05％吐温-20的300μlPBS(洗涤缓冲液)中洗涤4次。将板在室温用PBS 1％BSA和0.05％吐温-20(封闭缓冲液)封闭持续1.5小时，然后在洗涤缓冲液中洗涤4次。将GDF15配体(Abcam)以100ng/ml添加到封闭缓冲液中并在室温孵育2小时。然后将板在具有2X NaCl的300μl洗涤缓冲液中洗涤8次。在封闭缓冲液中以1ug/ml添加GDF15抗体(RnD系统山羊多克隆)并在室温孵育1小时，然后用4x300μl洗涤缓冲液洗涤。在封闭缓冲液中添加HAF017抗山羊HRP抗体并孵育1小时，然后洗涤。添加TMB底物并在15分钟后用H2SO4终止。在ELISA读取仪中测量OD 450-620。
评价具有SEQ ID NO：250-273所示序列的多肽与GDF15的结合(相应于图31中从左到右指示的多肽)。这些蛋白被合成，在相应的来自CLPTM1的序列中不存在C末端甘氨酸残基。在图31中示出了针对每种多肽测量的信号。将ELISA读数中近似地大于或等于0.1OD的截断鉴定为指示GDF15与固定化多肽的结合(即包括与具有SEQ ID NO：258所示序列的多肽结合的GDF15的0.098OD值)。以下肽显示出与GDF15的结合(相对于SEQ ID NO：2的残基号)：
GSIYIHVYFTKSGFHPDPRQG(162-181)(SEQ ID NO：258)
KALYRRLATVHMSRMINKYKG(182-201)(SEQ ID NO：259)
ITINIVDDHTPWVKGSVPPPG(242-260)(SEQ ID NO：262)
LDQYVKFDAVSGDYYPIIYFG(262-280)(SEQ ID NO：263)
YPINESLASLPLRVSFCPLSG(292-311)(SEQ ID NO：269)
GDYYPIIYFNDYWNLQKDYYG(273-292)SEQ ID NO：270)
缺乏C末端甘氨酸残基的SEQ ID NO：258、259、262、263、269和270的相应多肽分别是297、298、301、302、308和309。此类多肽或其部分或包含这些序列或其部分的多肽或密切相关的序列，代表了根据本发明的一组优选的多肽。
实施例19-‘Bioss’pAb在CLPTM1上的表位映射
材料和方法
肽阵列
将CLPTM1的N末端aa 1-354 aa以完全覆盖分成具有11个aa重叠的86个独特的15-mer，由JPT peptide Technologies GmbH制备。将Bioss 8018R多克隆多肽以1μg/ml在+4℃孵育过夜，在PBST中大量洗涤，随后与1:60000稀释的Alexa flour 647(Thermoscientific)兔IgG(H+L)多克隆二级抗体(目录#:A-21244)室温孵育1小时，并在重复PBST洗涤后利用G2502微阵列扫描仪(Agilent Technologies)扫描。使用的多肽及其SEQ ID参考号示于图32。
在阵列上，Bioss BS8018R的表位1具有最高的中值荧光强度(MFI)(信号强度)，表明该位点的最高结合亲和力。抗体与阵列中的多种肽(SEQ ID NO:274-279)的结合示于图32A。
最小共同特征：PKD(SEQ ID NO:322)
最可能的侧翼氨基酸也参与在以下区域内：
GGAPRVASRNLFPKDTLMNLHVYISEH(SEQ ID NO：313)。
表位2呈现出略低的MFI，仍表明对于该抗体的具有亲和力的第二位点。抗体与阵列中的多种肽(SEQ ID NO:280-286)的结合示于图32B。我们注意到，该位点部分第与MIC1的结合位点重叠。因此，具有该结合模式的Bioss抗体可以是MIC的拮抗剂，通过在表位2处直接竞争MIC1结合或通过通过与表位1结合的空间障碍。表位2的区域在LDQYVKFDAVSGDYYPIIYFNDYWNLQKDYYPINE(SEQ ID NO：314）内。
因此，来自24种不同的CLPTM1来源的一组肽的对Mic1具有最高亲和力的来自CLPTM1的多肽(SEQ ID NO:270)似乎与Bioss抗体的该表位重叠。
实施例20-CLPTM1和QRFPR之间的推定保守序列
当进行BLAST比对时发现，在实施例7中进行的阵列测定(参见图2)中以及在拉下测定中发现对GDF15具有亲和力的源自QRFPR的细胞外结构域的序列与CLPTM1的细胞外结构域的部分具有一定程度的序列同一性。
评分 预期 方法 同一性 阳性 空位 框
16.5命中(31)1.5()成分矩阵调整.5/15(33％)9/15(60％)0/15(0％)
特征：
13.1命中(22)1.6()基于组成的统计4/25(16％)12/25(48％)0/25(0％)
特征：
具有或包含如下序列的多肽代表了根据本发明的另外的示例性多肽：SEQ ID NO:324所示序列或与其具有至少75％序列同一性的序列，或为SEQ ID NO:324的包含至少6个连续氨基酸的部分的序列。
序列表
<110> 基阿贡治疗公司
<120> 用于治疗与升高的GDF15有关的症状的治疗剂
<130> FP1V172707ZX
<150> GB1512733.5
<151> 2015-07-20
<160> 357
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 431
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
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Asp His Asn Leu Thr Arg Glu Gln Phe Ile Ala Leu Tyr Arg Leu Arg
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Val Leu Thr Gly Val Leu Ile Phe Ala Leu Ala Leu Phe Gly Asn Ala
50 55 60
Leu Val Phe Tyr Val Val Thr Arg Ser Lys Ala Met Arg Thr Val Thr
65 70 75 80
Asn Ile Phe Ile Cys Ser Leu Ala Leu Ser Asp Leu Leu Ile Thr Phe
85 90 95
Phe Cys Ile Pro Val Thr Met Leu Gln Asn Ile Ser Asp Asn Trp Leu
100 105 110
Gly Gly Ala Phe Ile Cys Lys Met Val Pro Phe Val Gln Ser Thr Ala
115 120 125
Val Val Thr Glu Ile Leu Thr Met Thr Cys Ile Ala Val Glu Arg His
130 135 140
Gln Gly Leu Val His Pro Phe Lys Met Lys Trp Gln Tyr Thr Asn Arg
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Arg Ala Phe Thr Met Leu Gly Val Val Trp Leu Val Ala Val Ile Val
165 170 175
Gly Ser Pro Met Trp His Val Gln Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe
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Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr Ser Pro
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Val His Gln Lys Ile Tyr Thr Thr Phe Ile Leu Val Ile Leu Phe Leu
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Leu Pro Leu Met Val Met Leu Ile Leu Tyr Ser Lys Ile Gly Tyr Glu
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Leu Trp Ile Lys Lys Arg Val Gly Asp Gly Ser Val Leu Arg Thr Ile
245 250 255
His Gly Lys Glu Met Ser Lys Ile Ala Arg Lys Lys Lys Arg Ala Val
260 265 270
Ile Met Met Val Thr Val Val Ala Leu Phe Ala Val Cys Trp Ala Pro
275 280 285
Phe His Val Val His Met Met Ile Glu Tyr Ser Asn Phe Glu Lys Glu
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Tyr Asp Asp Val Thr Ile Lys Met Ile Phe Ala Ile Val Gln Ile Ile
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Gly Phe Ser Asn Ser Ile Cys Asn Pro Ile Val Tyr Ala Phe Met Asn
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Glu Asn Phe Lys Lys Asn Val Leu Ser Ala Val Cys Tyr Cys Ile Val
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Asn Lys Thr Phe Ser Pro Ala Gln Arg His Gly Asn Ser Gly Ile Thr
355 360 365
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Pro Lys Asp Thr Leu Met Asn Leu His Val Tyr Ile Ser Glu His Glu
100 105 110
His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His
115 120 125
Asp Leu Val Tyr Gly Asp Trp Thr Ser Gly Glu Asn Ser Asp Gly Cys
130 135 140
Tyr Glu His Phe Ala Glu Leu Asp Ile Pro Gln Ser Val Gln Gln Asn
145 150 155 160
Gly Ser Ile Tyr Ile His Val Tyr Phe Thr Lys Ser Gly Phe His Pro
165 170 175
Asp Pro Arg Gln Lys Ala Leu Tyr Arg Arg Leu Ala Thr Val His Met
180 185 190
Ser Arg Met Ile Asn Lys Tyr Lys Arg Arg Arg Phe Gln Lys Thr Lys
195 200 205
Asn Leu Leu Thr Gly Glu Thr Glu Ala Asp Pro Glu Met Ile Lys Arg
210 215 220
Ala Glu Asp Tyr Gly Pro Val Glu Val Ile Ser His Trp His Pro Asn
225 230 235 240
Ile Thr Ile Asn Ile Val Asp Asp His Thr Pro Trp Val Lys Gly Ser
245 250 255
Val Pro Pro Pro Leu Asp Gln Tyr Val Lys Phe Asp Ala Val Ser Gly
260 265 270
Asp Tyr Tyr Pro Ile Ile Tyr Phe Asn Asp Tyr Trp Asn Leu Gln Lys
275 280 285
Asp Tyr Tyr Pro Ile Asn Glu Ser Leu Ala Ser Leu Pro Leu Arg Val
290 295 300
Ser Phe Cys Pro Leu Ser Leu Trp Arg Trp Gln Leu Tyr Ala Ala Gln
305 310 315 320
Ser Thr Lys Ser Pro Trp Asn Phe Leu Gly Asp Glu Leu Tyr Glu Gln
325 330 335
Ser Asp Glu Glu Gln Asp Ser Val Lys Val Ala Leu Leu Glu Thr Asn
340 345 350
Pro
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 15
Tyr Ile Ser Glu His Glu His
1 5
<210> 16
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 16
Leu Phe Trp Glu Gln His
1 5
<210> 17
<211> 31
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 17
Tyr Ile Ser Glu His Glu His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala
1 5 10 15
Leu Phe Trp Glu Gln His Asp Leu Val Tyr Gly Asp Trp Thr Ser
20 25 30
<210> 18
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 18
Ala Leu Phe Trp Glu Gln His Asp Leu Val Tyr Gly Asp Trp Thr Ser
1 5 10 15
<210> 19
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 19
Gly Ala Leu Phe Trp Glu Gln His Asp Leu Val Tyr Gly Asp Trp Thr
1 5 10 15
Ser
<210> 20
<211> 28
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 20
Gln Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile
1 5 10 15
Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr Ser Pro Val His Gln
20 25
<210> 21
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 21
Gln Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile
1 5 10 15
Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr Ser Pro Val His
20 25
<210> 22
<211> 26
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 22
Gln Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile
1 5 10 15
Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr Ser Pro Val
20 25
<210> 23
<211> 25
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 23
Gln Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile
1 5 10 15
Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr Ser Pro
20 25
<210> 24
<211> 24
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 24
Gln Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile
1 5 10 15
Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr Ser
20
<210> 25
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 25
Gln Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile
1 5 10 15
Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr
20
<210> 26
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 26
Gln Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile
1 5 10 15
Cys Cys Leu Glu Glu Trp
20
<210> 27
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 27
Gln Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile
1 5 10 15
Cys Cys Leu Glu Glu
20
<210> 28
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 28
Gln Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile
1 5 10 15
Cys Cys Leu Glu
20
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<211> 19
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 29
Gln Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile
1 5 10 15
Cys Cys Leu
<210> 30
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 30
Gln Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile
1 5 10 15
Cys Cys
<210> 31
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 31
Gln Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile
1 5 10 15
Cys
<210> 32
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 32
Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys
1 5 10 15
Cys
<210> 33
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 33
Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys
1 5 10 15
Leu
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 34
Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu
1 5 10 15
Glu
<210> 35
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 35
Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu
1 5 10 15
Glu
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<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 36
Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu
1 5 10 15
Trp
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<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 37
Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu Trp
1 5 10 15
Thr
<210> 38
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 38
Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr
1 5 10 15
Ser
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<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 39
Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile
1 5 10 15
<210> 40
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 40
Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys
1 5 10 15
<210> 41
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 41
Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 42
Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 43
Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 44
Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu
1 5 10 15
<210> 45
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 45
Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu Trp
1 5 10 15
<210> 46
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 46
Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys
1 5 10 15
<210> 47
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 47
Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys
1 5 10 15
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<211> 14
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 48
Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys
1 5 10
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<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 49
Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys
1 5 10
<210> 50
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 50
Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 51
Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys
1 5 10
<210> 52
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 52
Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys
1 5 10
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<211> 28
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 53
Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys
1 5 10 15
Cys Leu Glu Glu Trp Thr Ser Pro Val His Gln Lys
20 25
<210> 54
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 54
Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys
1 5 10 15
Leu Glu Glu Trp Thr Ser Pro Val His Gln Lys
20 25
<210> 55
<211> 26
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 55
Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu
1 5 10 15
Glu Glu Trp Thr Ser Pro Val His Gln Lys
20 25
<210> 56
<211> 25
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 56
Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu
1 5 10 15
Glu Trp Thr Ser Pro Val His Gln Lys
20 25
<210> 57
<211> 24
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 57
Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu
1 5 10 15
Trp Thr Ser Pro Val His Gln Lys
20
<210> 58
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 58
Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu Trp
1 5 10 15
Thr Ser Pro Val His Gln Lys
20
<210> 59
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 59
Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr
1 5 10 15
Ser Pro Val His Gln Lys
20
<210> 60
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 60
Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr Ser
1 5 10 15
Pro Val His Gln Lys
20
<210> 61
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 61
Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr
1 5 10 15
Ser Pro Val His Gln
20
<210> 62
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 62
Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu Trp
1 5 10 15
Thr Ser Pro Val His
20
<210> 63
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 63
Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu
1 5 10 15
Trp Thr Ser Pro Val
20
<210> 64
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 64
Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu
1 5 10 15
Glu Trp Thr Ser Pro
20
<210> 65
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 65
Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu
1 5 10 15
Glu Glu Trp Thr Ser
20
<210> 66
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 66
Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys
1 5 10 15
Leu Glu Glu Trp Thr
20
<210> 67
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 67
Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys
1 5 10 15
Cys Leu Glu Glu Trp
20
<210> 68
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 68
Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr Ser
1 5 10 15
Pro Val His Gln
20
<210> 69
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 69
Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr Ser
1 5 10 15
Pro Val His
<210> 70
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 70
Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr Ser
1 5 10 15
Pro Val
<210> 71
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 71
Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr Ser
1 5 10 15
Pro
<210> 72
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 72
Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr Ser
1 5 10 15
<210> 73
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 73
Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr
1 5 10 15
<210> 74
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 74
Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu Trp
1 5 10
<210> 75
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 75
Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu
1 5 10
<210> 76
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 76
Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 77
Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu
1 5 10
<210> 78
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 78
Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys
1 5 10
<210> 79
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 79
Met Met Ile Glu Tyr Ser Asn Phe Glu Lys Glu Tyr Asp Asp Val Thr
1 5 10 15
Ile Lys
<210> 80
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 80
Met Ile Glu Tyr Ser Asn Phe Glu Lys Glu Tyr Asp Asp Val Thr Ile
1 5 10 15
Lys
<210> 81
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 81
Ile Glu Tyr Ser Asn Phe Glu Lys Glu Tyr Asp Asp Val Thr Ile Lys
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<210> 82
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 82
Glu Tyr Ser Asn Phe Glu Lys Glu Tyr Asp Asp Val Thr Ile Lys
1 5 10 15
<210> 83
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 83
Tyr Ser Asn Phe Glu Lys Glu Tyr Asp Asp Val Thr Ile Lys
1 5 10
<210> 84
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 84
Ser Asn Phe Glu Lys Glu Tyr Asp Asp Val Thr Ile Lys
1 5 10
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<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 85
Asn Phe Glu Lys Glu Tyr Asp Asp Val Thr Ile Lys
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 86
Phe Glu Lys Glu Tyr Asp Asp Val Thr Ile Lys
1 5 10
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<211> 30
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 87
Tyr Ile Ser Glu His Glu His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala
1 5 10 15
Leu Phe Trp Glu Gln His Asp Leu Val Tyr Gly Asp Trp Thr
20 25 30
<210> 88
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 88
Tyr Ile Ser Glu His Glu His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala
1 5 10 15
Leu Phe Trp Glu Gln His Asp Leu Val Tyr Gly Asp Trp
20 25
<210> 89
<211> 28
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 89
Tyr Ile Ser Glu His Glu His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala
1 5 10 15
Leu Phe Trp Glu Gln His Asp Leu Val Tyr Gly Asp
20 25
<210> 90
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 90
Tyr Ile Ser Glu His Glu His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala
1 5 10 15
Leu Phe Trp Glu Gln His Asp Leu Val Tyr Gly
20 25
<210> 91
<211> 26
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 91
Tyr Ile Ser Glu His Glu His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala
1 5 10 15
Leu Phe Trp Glu Gln His Asp Leu Val Tyr
20 25
<210> 92
<211> 25
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 92
Tyr Ile Ser Glu His Glu His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala
1 5 10 15
Leu Phe Trp Glu Gln His Asp Leu Val
20 25
<210> 93
<211> 24
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 93
Tyr Ile Ser Glu His Glu His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala
1 5 10 15
Leu Phe Trp Glu Gln His Asp Leu
20
<210> 94
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 94
Tyr Ile Ser Glu His Glu His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala
1 5 10 15
Leu Phe Trp Glu Gln His Asp
20
<210> 95
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 95
Tyr Ile Ser Glu His Glu His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala
1 5 10 15
Leu Phe Trp Glu Gln His
20
<210> 96
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 96
Tyr Ile Ser Glu His Glu His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala
1 5 10 15
Leu Phe Trp Glu Gln
20
<210> 97
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 97
Tyr Ile Ser Glu His Glu His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala
1 5 10 15
Leu Phe Trp Glu
20
<210> 98
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 98
Tyr Ile Ser Glu His Glu His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala
1 5 10 15
Leu Phe Trp
<210> 99
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 99
Tyr Ile Ser Glu His Glu His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala
1 5 10 15
Leu Phe
<210> 100
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 100
Tyr Ile Ser Glu His Glu His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala
1 5 10 15
Leu
<210> 101
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 101
Tyr Ile Ser Glu His Glu His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala
1 5 10 15
<210> 102
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 102
Tyr Ile Ser Glu His Glu His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser
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<210> 103
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 103
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1 5 10
<210> 104
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 104
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1 5 10
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 105
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1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 106
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 107
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<400> 108
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<400> 109
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1 5
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 110
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 111
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 113
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Gln His Asp Leu Val Tyr Gly Asp Trp Thr Ser
20 25
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 114
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His Asp Leu Val Tyr Gly Asp Trp Thr Ser
20 25
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<211> 25
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 115
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1 5 10 15
Asp Leu Val Tyr Gly Asp Trp Thr Ser
20 25
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<211> 24
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 116
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Leu Val Tyr Gly Asp Trp Thr Ser
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His Asp Leu
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Val Tyr Gly Asp Trp Thr Ser
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<213> 智人(Homo sapiens)
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20
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Asp Trp Thr Ser
20
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20
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1 5 10 15
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 122
Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His Asp Leu Val Tyr Gly Asp Trp
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Thr Ser
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Ser
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 124
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<400> 131
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<400> 132
Leu Phe Trp Glu Gln His Asp Leu
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<400> 133
Leu Phe Trp Glu Gln His Asp
1 5
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Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 137
Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His Asp Leu Val
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 138
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Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His Asp Leu Val Tyr Gly Asp
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<212> PRT
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 142
Ala Leu Phe Trp Glu Gln His Asp Leu Val Tyr Gly Asp Trp Thr
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 143
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1 5 10 15
Phe Trp Glu Gln His
20
<210> 144
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 144
Ser Glu His Glu His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe
1 5 10 15
Trp Glu Gln His
20
<210> 145
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 145
Glu His Glu His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp
1 5 10 15
Glu Gln His
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 146
His Glu His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu
1 5 10 15
Gln His
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 147
Glu His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln
1 5 10 15
His
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<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 148
His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 149
Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His
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<210> 150
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His
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<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 151
Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His
1 5 10
<210> 152
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 152
Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His
1 5 10
<210> 153
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 153
Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His
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<210> 154
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 154
Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His
1 5 10
<210> 155
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 155
Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His
1 5
<210> 156
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 156
Ala Leu Phe Trp Glu Gln His
1 5
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<211> 22
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 157
Ile Ser Glu His Glu His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu
1 5 10 15
Phe Trp Glu Gln His Asp
20
<210> 158
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 158
Ser Glu His Glu His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe
1 5 10 15
Trp Glu Gln His Asp Leu
20
<210> 159
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 159
Glu His Glu His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp
1 5 10 15
Glu Gln His Asp Leu Val
20
<210> 160
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 160
His Glu His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu
1 5 10 15
Gln His Asp Leu Val Tyr
20
<210> 161
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 161
Glu His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln
1 5 10 15
His Asp Leu Val Tyr Gly
20
<210> 162
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 162
His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His
1 5 10 15
Asp Leu Val Tyr Gly Asp
20
<210> 163
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 163
Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His Asp
1 5 10 15
Leu Val Tyr Gly Asp Trp
20
<210> 164
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 164
Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His Asp Leu
1 5 10 15
Val Tyr Gly Asp Trp Thr
20
<210> 165
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 165
Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His Asp Leu Val
1 5 10 15
Tyr Gly Asp Trp Thr Ser
20
<210> 166
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 166
Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His Asp Leu Val Tyr Gly Asp Trp
1 5 10 15
<210> 167
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 167
Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His Asp Leu Val Tyr Gly Asp
1 5 10 15
<210> 168
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 168
Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His Asp Leu Val Tyr Gly
1 5 10 15
<210> 169
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 169
Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His Asp Leu Val Tyr
1 5 10 15
<210> 170
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 170
Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His Asp Leu Val
1 5 10 15
<210> 171
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 171
Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His Asp Leu
1 5 10 15
<210> 172
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 172
Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His Asp
1 5 10 15
<210> 173
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 173
Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His
1 5 10 15
<210> 174
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 174
Gly Ile Glu Tyr Ser Asn Phe Glu Lys Glu Tyr Asp Asp Val Thr Ile
1 5 10 15
Lys
<210> 175
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 175
Gln Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile
1 5 10 15
<210> 176
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 176
Gln Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His
1 5 10 15
<210> 177
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 177
Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His
1 5 10
<210> 178
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 178
Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys
1 5 10 15
<210> 179
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 179
Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile
1 5 10
<210> 180
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 180
Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His
1 5 10
<210> 181
<211> 18
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 181
Gln Arg Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile
1 5 10 15
Cys Cys
<210> 182
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 182
Gln Arg Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile
1 5 10 15
Cys
<210> 183
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 183
Gln Arg Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile
1 5 10 15
<210> 184
<211> 15
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 184
Gln Arg Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His
1 5 10 15
<210> 185
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 185
Arg Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys
1 5 10 15
Cys
<210> 186
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 186
Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys
1 5 10 15
<210> 187
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 187
Arg Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys
1 5 10 15
<210> 188
<211> 15
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 188
Arg Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile
1 5 10 15
<210> 189
<211> 14
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 189
Arg Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His
1 5 10
<210> 190
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 190
Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His Asp Leu Val Tyr Gly Asp Trp Thr
1 5 10 15
<210> 191
<211> 24
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 191
Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His Asp Leu Val Tyr
1 5 10 15
Gly Asp Trp Thr Ser Gly Glu Asn
20
<210> 192
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 192
Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His Asp Leu Val Tyr
1 5 10 15
Gly Asp Trp Thr Ser Gly Glu
20
<210> 193
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 193
Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His Asp Leu Val Tyr
1 5 10 15
Gly Asp Trp Thr Ser Gly
20
<210> 194
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 194
Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His Asp Leu Val Tyr
1 5 10 15
Gly Asp Trp Thr Ser
20
<210> 195
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 195
Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His Asp Leu Val Tyr
1 5 10 15
Gly Asp Trp Thr
20
<210> 196
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 196
Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His Asp Leu Val Tyr Gly
1 5 10 15
Asp Trp Thr Ser Gly Glu Asn
20
<210> 197
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 197
Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His Asp Leu Val Tyr Gly Asp
1 5 10 15
Trp Thr Ser Gly Glu Asn
20
<210> 198
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 198
Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His Asp Leu Val Tyr Gly Asp Trp
1 5 10 15
Thr Ser Gly Glu Asn
20
<210> 199
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 199
Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His Asp Leu Val Tyr Gly Asp Trp Thr
1 5 10 15
Ser Gly Glu Asn
20
<210> 200
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 200
Tyr Phe Asn Asp Tyr Trp Asn Leu Gln
1 5
<210> 201
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 201
Tyr Pro Ile Ile Tyr Phe Asn Asp Tyr Trp Asn Leu Gln Lys Asp Tyr
1 5 10 15
Tyr
<210> 202
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 202
Tyr Pro Ile Ile Tyr Phe Asn Asp Tyr Trp Asn Leu Gln Lys Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 203
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 203
Tyr Pro Ile Ile Tyr Phe Asn Asp Tyr Trp Asn Leu Gln Lys Asp
1 5 10 15
<210> 204
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 204
Tyr Pro Ile Ile Tyr Phe Asn Asp Tyr Trp Asn Leu Gln Lys
1 5 10
<210> 205
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 205
Tyr Pro Ile Ile Tyr Phe Asn Asp Tyr Trp Asn Leu Gln
1 5 10
<210> 206
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 206
Pro Ile Ile Tyr Phe Asn Asp Tyr Trp Asn Leu Gln Lys Asp Tyr Tyr
1 5 10 15
<210> 207
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 207
Ile Ile Tyr Phe Asn Asp Tyr Trp Asn Leu Gln Lys Asp Tyr Tyr
1 5 10 15
<210> 208
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 208
Ile Tyr Phe Asn Asp Tyr Trp Asn Leu Gln Lys Asp Tyr Tyr
1 5 10
<210> 209
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 209
Tyr Phe Asn Asp Tyr Trp Asn Leu Gln Lys Asp Tyr Tyr
1 5 10
<210> 210
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 210
Phe Leu Tyr Glu Lys
1 5
<210> 211
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 211
Trp Thr Ser
1
<210> 212
<211> 4
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 212
Pro Lys Asp Thr
1
<210> 213
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 213
Ala Pro Arg Val Ala Ser Arg Asn Leu Phe Pro Lys Asp Thr
1 5 10
<210> 214
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 214
Pro Arg Val Ala Ser Arg Asn Leu Phe Pro Lys Asp Thr
1 5 10
<210> 215
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 215
Arg Val Ala Ser Arg Asn Leu Phe Pro Lys Asp Thr
1 5 10
<210> 216
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 216
Val Ala Ser Arg Asn Leu Phe Pro Lys Asp Thr
1 5 10
<210> 217
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 217
Ala Ser Arg Asn Leu Phe Pro Lys Asp Thr
1 5 10
<210> 218
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 218
Ser Arg Asn Leu Phe Pro Lys Asp Thr
1 5
<210> 219
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 219
Arg Asn Leu Phe Pro Lys Asp Thr
1 5
<210> 220
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 220
Asn Leu Phe Pro Lys Asp Thr
1 5
<210> 221
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 221
Leu Phe Pro Lys Asp Thr
1 5
<210> 222
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 222
Phe Pro Lys Asp Thr
1 5
<210> 223
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 223
Pro Arg Val Ala Ser Arg Asn Leu Phe Pro Lys Asp Thr Leu
1 5 10
<210> 224
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 224
Val Ala Ser Arg Asn Leu Phe Pro Lys Asp Thr Leu Met
1 5 10
<210> 225
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 225
Ala Ser Arg Asn Leu Phe Pro Lys Asp Thr Leu Met Asn
1 5 10
<210> 226
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 226
Ser Arg Asn Leu Phe Pro Lys Asp Thr Leu Met Asn Leu
1 5 10
<210> 227
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 227
Arg Asn Leu Phe Pro Lys Asp Thr Leu Met Asn Leu His
1 5 10
<210> 228
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 228
Asn Leu Phe Pro Lys Asp Thr Leu Met Asn Leu His Val
1 5 10
<210> 229
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 229
Leu Phe Pro Lys Asp Thr Leu Met Asn Leu His Val Tyr
1 5 10
<210> 230
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 230
Phe Pro Lys Asp Thr Leu Met Asn Leu His Val Tyr Ile
1 5 10
<210> 231
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 231
Pro Lys Asp Thr Leu Met Asn Leu His Val Tyr Ile Ser
1 5 10
<210> 232
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 232
Pro Lys Asp Thr Leu Met Asn Leu His Val Tyr Ile
1 5 10
<210> 233
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 233
Pro Lys Asp Thr Leu Met Asn Leu His Val Tyr
1 5 10
<210> 234
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 234
Pro Lys Asp Thr Leu Met Asn Leu His Val
1 5 10
<210> 235
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 235
Pro Lys Asp Thr Leu Met Asn Leu His
1 5
<210> 236
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 236
Pro Lys Asp Thr Leu Met Asn Leu
1 5
<210> 237
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 237
Pro Lys Asp Thr Leu Met Asn
1 5
<210> 238
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 238
Pro Lys Asp Thr Leu Met
1 5
<210> 239
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 239
Pro Lys Asp Thr Leu
1 5
<210> 240
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> AP5
<400> 240
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
1 5 10 15
Arg Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His
20 25 30
<210> 241
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> AP2
<400> 241
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr
1 5 10 15
Ile Ser Glu His Glu His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu
20 25 30
Phe Trp Glu Gln His Asp Leu Val Tyr Gly Asp Trp Thr Ser
35 40 45
<210> 242
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> GS接头
<400> 242
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 243
<211> 69
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 243
Arg Arg Ala Phe Thr Met Leu Gly Val Val Trp Leu Val Ala Val Ile
1 5 10 15
Val Gly Ser Pro Met Trp His Val Gln Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp
20 25 30
Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr Ser
35 40 45
Pro Val His Gln Lys Ile Tyr Thr Thr Phe Ile Leu Val Ile Leu Phe
50 55 60
Leu Leu Pro Leu Met
65
<210> 244
<211> 134
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> UNSURE
<222> (3)..(3)
<220>
<221> UNSURE
<222> (53)..(53)
<220>
<221> UNSURE
<222> (68)..(68)
<220>
<221> UNSURE
<222> (82)..(82)
<400> 244
Phe Thr Xaa Ser Leu Glu Leu Ser Ser Cys Asn Ala Ile Ser Pro Leu
1 5 10 15
Leu Tyr Ala Gly His Gln Ala Thr His Val Asn Leu Asp Ser Leu Ser
20 25 30
Glu Asp Ser Ser Gln Arg Leu Phe Leu Phe Arg Tyr Gln Met Pro Leu
35 40 45
Pro Lys Arg Ser Xaa Glu Leu Phe Thr Pro Ser Asp Thr Cys Thr Ser
50 55 60
Leu Ser Leu Xaa Gln Val Thr Asn Arg Ser Phe Ile Leu Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Lys Xaa Thr Tyr Ile Leu Lys Tyr Tyr Phe Ile Ser Gly Asn Phe Glu
85 90 95
Lys Glu Tyr Asp Asp Val Thr Ile Lys Met Ile Phe Ala Ile Val Gln
100 105 110
Ile Ile Gly Phe Ser Asn Ser Ile Cys Asn Pro Ile Val Tyr Ala Phe
115 120 125
Met Asn Glu Asn Phe Lys
130
<210> 245
<211> 74
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 245
Lys Lys Lys Arg Ala Val Ile Met Met Val Thr Val Val Ala Leu Phe
1 5 10 15
Ala Val Cys Trp Ala Pro Phe His Val Val His Met Met Ile Glu Tyr
20 25 30
Ser Asn Phe Glu Lys Glu Tyr Asp Asp Val Thr Ile Lys Met Ile Phe
35 40 45
Ala Ile Val Gln Ile Ile Gly Phe Ser Asn Ser Ile Cys Asn Pro Ile
50 55 60
Val Tyr Ala Phe Met Asn Glu Asn Phe Lys
65 70
<210> 246
<211> 48
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 246
Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys
1 5 10 15
Cys Leu Glu Glu Trp Thr Ser Pro Val His Gln Lys Ile Tyr Thr Thr
20 25 30
Phe Ile Leu Ser Ser Ser Ser Ser Cys Leu Leu Trp Lys Lys Lys Arg
35 40 45
<210> 247
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 247
Met Met Ile Glu Tyr Ser Asn Phe Glu Lys Glu Tyr Asp Asp Val Thr
1 5 10 15
Ile Lys Met
<210> 248
<211> 28
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 248
Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys
1 5 10 15
Cys Leu Glu Glu Trp Thr Ser Pro Val His Gln Lys
20 25
<210> 249
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 249
His Met Met Ile Glu Tyr Ser Asn Phe Glu Lys Glu Tyr Asp Asp Val
1 5 10 15
Thr Ile Lys
<210> 250
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 250
Ala Ala Ala Gln Glu Ala Asp Gly Ala Arg Ser Ala Val Val Ala Ala
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly
20
<210> 251
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 251
Ser Gly Gln Val Thr Ser Asn Gly Ser Ile Gly Arg Asp Pro Pro Ala
1 5 10 15
Glu Thr Gln Pro Gly
20
<210> 252
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 252
Gln Asn Pro Pro Ala Gln Pro Ala Pro Asn Ala Trp Gln Val Ile Lys
1 5 10 15
Gly Val Leu Phe Gly
20
<210> 253
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 253
Arg Ile Phe Ile Ile Trp Ala Ile Ser Ser Trp Phe Arg Arg Gly Pro
1 5 10 15
Ala Pro Gln Asp Gly
20
<210> 254
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 254
Gln Ala Gly Pro Gly Gly Ala Pro Arg Val Ala Ser Arg Asn Leu Phe
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Gly
20
<210> 255
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 255
Leu Met Asn Leu His Val Tyr Ile Ser Glu His Glu His Phe Thr Asp
1 5 10 15
Phe Asn Ala Thr Gly
20
<210> 256
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 256
Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His Asp Leu Val Tyr Gly Asp Trp Thr
1 5 10 15
Ser Gly Glu Asn Gly
20
<210> 257
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 257
Ser Asp Gly Cys Tyr Glu His Phe Ala Glu Leu Asp Ile Pro Gln Ser
1 5 10 15
Val Gln Gln Asn Gly
20
<210> 258
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 258
Gly Ser Ile Tyr Ile His Val Tyr Phe Thr Lys Ser Gly Phe His Pro
1 5 10 15
Asp Pro Arg Gln Gly
20
<210> 259
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 259
Lys Ala Leu Tyr Arg Arg Leu Ala Thr Val His Met Ser Arg Met Ile
1 5 10 15
Asn Lys Tyr Lys Gly
20
<210> 260
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 260
Arg Arg Arg Phe Gln Lys Thr Lys Asn Leu Leu Thr Gly Glu Thr Glu
1 5 10 15
Ala Asp Pro Glu Gly
20
<210> 261
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 261
Met Ile Lys Arg Ala Glu Asp Tyr Gly Pro Val Glu Val Ile Ser His
1 5 10 15
Trp His Pro Asn Gly
20
<210> 262
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 262
Ile Thr Ile Asn Ile Val Asp Asp His Thr Pro Trp Val Lys Gly Ser
1 5 10 15
Val Pro Pro Pro Gly
20
<210> 263
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 263
Leu Asp Gln Tyr Val Lys Phe Asp Ala Val Ser Gly Asp Tyr Tyr Pro
1 5 10 15
Ile Ile Tyr Phe Gly
20
<210> 264
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 264
Asn Asp Tyr Trp Asn Leu Gln Lys Asp Tyr Tyr Pro Ile Asn Glu Ser
1 5 10 15
Leu Ala Ser Leu Gly
20
<210> 265
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 265
Pro Leu Arg Val Ser Phe Cys Pro Leu Ser Leu Trp Arg Trp Gln Leu
1 5 10 15
Tyr Ala Ala Gln Gly
20
<210> 266
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 266
Ser Thr Lys Ser Pro Trp Asn Phe Leu Gly Asp Glu Leu Tyr Glu Gln
1 5 10 15
Ser Asp Glu Glu Gly
20
<210> 267
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 267
Tyr Glu Gln Ser Asp Glu Glu Gln Asp Ser Val Lys Val Ala Leu Leu
1 5 10 15
Glu Thr Asn Pro Gly
20
<210> 268
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 268
Leu Trp Arg Trp Gln Leu Tyr Ala Ala Gln Ser Thr Lys Ser Pro Trp
1 5 10 15
Asn Phe Leu Gly Gly
20
<210> 269
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 269
Tyr Pro Ile Asn Glu Ser Leu Ala Ser Leu Pro Leu Arg Val Ser Phe
1 5 10 15
Cys Pro Leu Ser Gly
20
<210> 270
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 270
Gly Asp Tyr Tyr Pro Ile Ile Tyr Phe Asn Asp Tyr Trp Asn Leu Gln
1 5 10 15
Lys Asp Tyr Tyr Gly
20
<210> 271
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 271
Trp Gln Val Ile Lys Gly Val Leu Phe Arg Ile Phe Ile Ile Trp Ala
1 5 10 15
Ile Ser Ser Trp Gly
20
<210> 272
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 272
Arg Asn Leu Phe Pro Lys Asp Thr Leu Met Asn Leu His Val Tyr Ile
1 5 10 15
Ser Glu His Glu Gly
20
<210> 273
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 273
Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His Asp
1 5 10 15
Leu Val Tyr Gly Gly
20
<210> 274
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 274
Gln Ala Gly Pro Gly Gly Ala Pro Arg Val Ala Ser Arg Asn Leu
1 5 10 15
<210> 275
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 275
Gly Gly Ala Pro Arg Val Ala Ser Arg Asn Leu Phe Pro Lys Asp
1 5 10 15
<210> 276
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 276
Arg Val Ala Ser Arg Asn Leu Phe Pro Lys Asp Thr Leu Met Asn
1 5 10 15
<210> 277
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 277
Arg Asn Leu Phe Pro Lys Asp Thr Leu Met Asn Leu His Val Tyr
1 5 10 15
<210> 278
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 278
Pro Lys Asp Thr Leu Met Asn Leu His Val Tyr Ile Ser Glu His
1 5 10 15
<210> 279
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 279
Leu Met Asn Leu His Val Tyr Ile Ser Glu His Glu His Phe Thr
1 5 10 15
<210> 280
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 280
Leu Asp Gln Tyr Val Lys Phe Asp Ala Val Ser Gly Asp Tyr Tyr
1 5 10 15
<210> 281
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 281
Val Lys Phe Asp Ala Val Ser Gly Asp Tyr Tyr Pro Ile Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 282
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 282
Ala Val Ser Gly Asp Tyr Tyr Pro Ile Ile Tyr Phe Asn Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 283
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 283
Asp Tyr Tyr Pro Ile Ile Tyr Phe Asn Asp Tyr Trp Asn Leu Gln
1 5 10 15
<210> 284
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 284
Ile Ile Tyr Phe Asn Asp Tyr Trp Asn Leu Gln Lys Asp Tyr Tyr
1 5 10 15
<210> 285
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 285
Asn Asp Tyr Trp Asn Leu Gln Lys Asp Tyr Tyr Pro Ile Asn Glu
1 5 10 15
<210> 286
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 286
Asn Leu Gln Lys Asp Tyr Tyr Pro Ile Asn Glu Ser Leu Ala Ser
1 5 10 15
<210> 287
<211> 438
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 287
Met Ile Cys Cys Ser Ala Leu Ser Pro Arg Ile His Leu Ser Phe His
1 5 10 15
Arg Ser Leu Thr Gly Ile Val Leu Ala Asn Ser Ser Leu Asp Ile Val
20 25 30
Leu His Asp Thr Tyr Tyr Trp Ala His Cys Gly Gly Asn Val Arg Arg
35 40 45
His Cys Gly Gly Pro Ala Ser Arg Glu Arg Thr Ala Met Gln Ala Leu
50 55 60
Asn Ile Thr Pro Glu Gln Phe Ser Arg Leu Leu Arg Asp His Asn Leu
65 70 75 80
Thr Arg Glu Gln Phe Ile Ala Leu Tyr Arg Leu Arg Pro Leu Val Tyr
85 90 95
Thr Pro Glu Leu Pro Gly Arg Ala Lys Leu Ala Leu Val Leu Thr Gly
100 105 110
Val Leu Ile Phe Ala Leu Ala Leu Phe Gly Asn Ala Leu Val Phe Tyr
115 120 125
Trp Thr Arg Ser Lys Ala Met Arg Thr Val Thr Asn Ile Phe Ile Cys
130 135 140
Ser Leu Ala Ser Asp Leu Leu Ile Thr Phe Phe Cys Ile Pro Val Thr
145 150 155 160
Met Leu Gln Asn Ile Ser Asp Asn Leu Gly Gly Ala Phe Ile Cys Glu
165 170 175
Met Val Pro Phe Val Gln Ser Thr Ala Val Val Thr Glu Ile Leu Thr
180 185 190
Met Thr Cys Ile Ala Val Glu Arg His Gln Gly Leu Val His Pro Phe
195 200 205
Lys Lys Trp Gln Tyr Thr Asn Arg Arg Ala Phe Thr Met Leu Gly Val
210 215 220
Val Leu Val Ala Val Ile Val Gly Ser Pro Met His Val Gln Gln Glu
225 230 235 240
Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Glu Glu
245 250 255
Thr Ser Pro Val His Gln Lys Ile Tyr Thr Thr Phe Ile Leu Ser Ser
260 265 270
Ser Ser Ser Cys Leu Leu Trp Lys Lys Lys Arg Ala Val Ile Met Met
275 280 285
Val Thr Trp Ala Leu Phe Ala Val Cys Trp Ala Pro Phe His Val Val
290 295 300
His Met Met Ile Glu Tyr Ser Asn Phe Glu Lys Glu Tyr Asp Asp Val
305 310 315 320
Thr Ile Lys Ile Phe Ala Ile Val Gln Ile Ile Gly Phe Ser Asn Ser
325 330 335
Ile Cys Asn Pro Ile Val Tyr Ala Phe Met Asn Glu Asn Phe Lys Lys
340 345 350
Asn Val Leu Ser Ala Val Cys Tyr Cys Ile Val Asn Lys Thr Phe Ser
355 360 365
Pro Ala Gln Arg His Gly Asn Ser Gly Ile Thr Met Arg Lys Lys Ala
370 375 380
Lys Phe Ser Leu Arg Glu Asn Pro Val Glu Glu Thr Lys Gly Glu Ala
385 390 395 400
Phe Ser Asp Gly Asn Ile Glu Val Lys Cys Glu Gln Thr Glu Glu Lys
405 410 415
Lys Lys Lys Arg His Leu Ala Leu Phe Arg Ser Glu Leu Ala Glu Asn
420 425 430
Ser Pro Asp Ser Gly His
435
<210> 288
<211> 419
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 288
Met Gln Ala Leu Asn Ile Thr Pro Glu Gln Phe Ser Arg Leu Leu Arg
1 5 10 15
Asp His Asn Leu Thr Arg Glu Gln Phe Ile Ala Val His Arg Leu Arg
20 25 30
Pro Leu Val Tyr Thr Pro Glu Leu Pro Gly Arg Ala Lys Leu Ala Leu
35 40 45
Val Leu Thr Gly Val Leu Ile Phe Ala Leu Ala Leu Phe Gly Asn Ala
50 55 60
Leu Val Phe Tyr Trp Thr Arg Ser Lys Ala Met Arg Thr Val Thr Asn
65 70 75 80
Ile Phe Ile Cys Ser Leu Ala Ser Asp Leu Leu Ile Thr Phe Phe Cys
85 90 95
Ile Pro Val Thr Met Gln Asn Ile Ser Asp Asn Leu Gly Gly Ala Phe
100 105 110
Ile Cys Lys Met Val Pro Phe Val Gln Ser Thr Ala Val Val Thr Glu
115 120 125
Ile Leu Thr Met Thr Cys Ile Ala Val Glu Arg His Gln Gly Val His
130 135 140
Pro Phe Lys Met Lys Gln Tyr Thr Asn Arg Arg Ala Phe Thr Leu Gly
145 150 155 160
Val Val Leu Val Ala Val Ile Val Gly Ser Pro Met Trp His Val Gln
165 170 175
Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys
180 185 190
Cys Leu Glu Glu Thr Ser Pro Val His Gln Lys Ile Tyr Thr Thr Phe
195 200 205
Ile Leu Val Ile Leu Phe Leu Pro Leu Met Val Met Leu Ile Leu Tyr
210 215 220
Ser Lys Ile Gly Tyr Glu Leu Trp Ile Lys Lys Arg Val Gly Asp Gly
225 230 235 240
Ser Val Leu Arg Thr Ile His Gly Lys Glu Met Ser Lys Ile Ala Arg
245 250 255
Lys Lys Ile Arg Ala Val Ile Met Met Val Thr Val Val Ala Leu Phe
260 265 270
Ala Val Cys Ala Pro Phe His Val Val His Met Met Ile Glu Tyr Ser
275 280 285
Asn Phe Glu Lys Glu Tyr Asp Asp Val Thr Ile Lys Met Ile Phe Ala
290 295 300
Ile Val Gln Ile Ile Gly Phe Ser Asn Ser Ile Cys Asn Pro Ile Val
305 310 315 320
Tyr Ala Phe Asn Glu Asn Phe Lys Lys Asn Val Leu Ser Ala Val Cys
325 330 335
Tyr Cys Ile Val Asn Lys Thr Phe Ser Pro Ala Gln Arg His Gly Asn
340 345 350
Ser Gly Ile Thr Met Met Arg Lys Lys Ala Lys Phe Ser Leu Arg Glu
355 360 365
Asn Pro Val Glu Glu Thr Lys Gly Glu Ala Phe Ser Asp Gly Asn Ile
370 375 380
Glu Val Lys Leu Cys Glu Gln Thr Glu Glu Lys Lys Lys Leu Lys Arg
385 390 395 400
His Leu Ala Leu Phe Arg Ser Glu Leu Ala Glu Asn Ser Pro Leu Asp
405 410 415
Ser Gly His
<210> 289
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 289
Ala Ala Ala Gln Glu Ala Asp Gly Ala Arg Ser Ala Val Val Ala Ala
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 290
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 290
Ser Gly Gln Val Thr Ser Asn Gly Ser Ile Gly Arg Asp Pro Pro Ala
1 5 10 15
Glu Thr Gln Pro
20
<210> 291
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 291
Gln Asn Pro Pro Ala Gln Pro Ala Pro Asn Ala Trp Gln Val Ile Lys
1 5 10 15
Gly Val Leu Phe
20
<210> 292
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 292
Arg Ile Phe Ile Ile Trp Ala Ile Ser Ser Trp Phe Arg Arg Gly Pro
1 5 10 15
Ala Pro Gln Asp
20
<210> 293
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 293
Gln Ala Gly Pro Gly Gly Ala Pro Arg Val Ala Ser Arg Asn Leu Phe
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr
20
<210> 294
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 294
Leu Met Asn Leu His Val Tyr Ile Ser Glu His Glu His Phe Thr Asp
1 5 10 15
Phe Asn Ala Thr
20
<210> 295
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 295
Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His Asp Leu Val Tyr Gly Asp Trp Thr
1 5 10 15
Ser Gly Glu Asn
20
<210> 296
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 296
Ser Asp Gly Cys Tyr Glu His Phe Ala Glu Leu Asp Ile Pro Gln Ser
1 5 10 15
Val Gln Gln Asn
20
<210> 297
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 297
Gly Ser Ile Tyr Ile His Val Tyr Phe Thr Lys Ser Gly Phe His Pro
1 5 10 15
Asp Pro Arg Gln
20
<210> 298
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 298
Lys Ala Leu Tyr Arg Arg Leu Ala Thr Val His Met Ser Arg Met Ile
1 5 10 15
Asn Lys Tyr Lys
20
<210> 299
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 299
Arg Arg Arg Phe Gln Lys Thr Lys Asn Leu Leu Thr Gly Glu Thr Glu
1 5 10 15
Ala Asp Pro Glu
20
<210> 300
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 300
Met Ile Lys Arg Ala Glu Asp Tyr Gly Pro Val Glu Val Ile Ser His
1 5 10 15
Trp His Pro Asn
20
<210> 301
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 301
Ile Thr Ile Asn Ile Val Asp Asp His Thr Pro Trp Val Lys Gly Ser
1 5 10 15
Val Pro Pro Pro
20
<210> 302
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 302
Leu Asp Gln Tyr Val Lys Phe Asp Ala Val Ser Gly Asp Tyr Tyr Pro
1 5 10 15
Ile Ile Tyr Phe
20
<210> 303
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 303
Asn Asp Tyr Trp Asn Leu Gln Lys Asp Tyr Tyr Pro Ile Asn Glu Ser
1 5 10 15
Leu Ala Ser Leu
20
<210> 304
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 304
Pro Leu Arg Val Ser Phe Cys Pro Leu Ser Leu Trp Arg Trp Gln Leu
1 5 10 15
Tyr Ala Ala Gln
20
<210> 305
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 305
Ser Thr Lys Ser Pro Trp Asn Phe Leu Gly Asp Glu Leu Tyr Glu Gln
1 5 10 15
Ser Asp Glu Glu
20
<210> 306
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 306
Tyr Glu Gln Ser Asp Glu Glu Gln Asp Ser Val Lys Val Ala Leu Leu
1 5 10 15
Glu Thr Asn Pro
20
<210> 307
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 307
Leu Trp Arg Trp Gln Leu Tyr Ala Ala Gln Ser Thr Lys Ser Pro Trp
1 5 10 15
Asn Phe Leu Gly
20
<210> 308
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 308
Tyr Pro Ile Asn Glu Ser Leu Ala Ser Leu Pro Leu Arg Val Ser Phe
1 5 10 15
Cys Pro Leu Ser
20
<210> 309
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 309
Gly Asp Tyr Tyr Pro Ile Ile Tyr Phe Asn Asp Tyr Trp Asn Leu Gln
1 5 10 15
Lys Asp Tyr Tyr
20
<210> 310
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 310
Trp Gln Val Ile Lys Gly Val Leu Phe Arg Ile Phe Ile Ile Trp Ala
1 5 10 15
Ile Ser Ser Trp
20
<210> 311
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 311
Arg Asn Leu Phe Pro Lys Asp Thr Leu Met Asn Leu His Val Tyr Ile
1 5 10 15
Ser Glu His Glu
20
<210> 312
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 312
Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His Asp
1 5 10 15
Leu Val Tyr Gly
20
<210> 313
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 313
Gly Gly Ala Pro Arg Val Ala Ser Arg Asn Leu Phe Pro Lys Asp Thr
1 5 10 15
Leu Met Asn Leu His Val Tyr Ile Ser Glu His
20 25
<210> 314
<211> 35
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 314
Leu Asp Gln Tyr Val Lys Phe Asp Ala Val Ser Gly Asp Tyr Tyr Pro
1 5 10 15
Ile Ile Tyr Phe Asn Asp Tyr Trp Asn Leu Gln Lys Asp Tyr Tyr Pro
20 25 30
Ile Asn Glu
35
<210> 315
<211> 354
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 315
Met Ala Ala Ala Gln Glu Ala Asp Gly Ala Arg Ser Ala Val Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gln Val Thr Ser Asn Gly Ser Ile Gly
20 25 30
Arg Asp Pro Pro Ala Glu Thr Gln Pro Gln Asn Pro Pro Ala Gln Pro
35 40 45
Ala Pro Asn Ala Trp Gln Val Ile Lys Gly Val Leu Phe Arg Ile Phe
50 55 60
Ile Ile Trp Ala Ile Ser Ser Trp Phe Arg Arg Gly Pro Ala Pro Gln
65 70 75 80
Asp Gln Ala Gly Pro Gly Gly Ala Pro Arg Val Ala Ser Arg Asn Leu
85 90 95
Phe Pro Lys Asp Thr Leu Met Asn Leu His Val Tyr Ile Ser Glu His
100 105 110
Glu His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln
115 120 125
His Asp Leu Val Tyr Gly Asp Trp Thr Ser Gly Glu Asn Ser Asp Gly
130 135 140
Cys Tyr Glu His Phe Ala Glu Leu Asp Ile Pro Gln Ser Val Gln Gln
145 150 155 160
Asn Gly Ser Ile Tyr Ile His Val Tyr Phe Thr Lys Ser Gly Phe His
165 170 175
Pro Asp Pro Arg Gln Lys Ala Leu Tyr Arg Arg Leu Ala Thr Val His
180 185 190
Met Ser Arg Met Ile Asn Lys Tyr Lys Arg Arg Arg Phe Gln Lys Thr
195 200 205
Lys Asn Leu Leu Thr Gly Glu Thr Glu Ala Asp Pro Glu Met Ile Lys
210 215 220
Arg Ala Glu Asp Tyr Gly Pro Val Glu Val Ile Ser His Trp His Pro
225 230 235 240
Asn Ile Thr Ile Asn Ile Val Asp Asp His Thr Pro Trp Val Lys Gly
245 250 255
Ser Val Pro Pro Pro Leu Asp Gln Tyr Val Lys Phe Asp Ala Val Ser
260 265 270
Gly Asp Tyr Tyr Pro Ile Ile Tyr Phe Asn Asp Tyr Trp Asn Leu Gln
275 280 285
Lys Asp Tyr Tyr Pro Ile Asn Glu Ser Leu Ala Ser Leu Pro Leu Arg
290 295 300
Val Ser Phe Cys Pro Leu Ser Leu Trp Arg Trp Gln Leu Tyr Ala Ala
305 310 315 320
Gln Ser Thr Lys Ser Pro Trp Asn Phe Leu Gly Asp Glu Leu Tyr Glu
325 330 335
Gln Ser Asp Glu Glu Gln Asp Ser Val Lys Val Ala Leu Leu Glu Thr
340 345 350
Asn Pro
<210> 316
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 316
Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys
1 5 10 15
Cys Leu Glu Glu
20
<210> 317
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 317
Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys
1 5 10 15
Cys Leu Glu
<210> 318
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 318
Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys
1 5 10 15
Cys Leu
<210> 319
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 319
His Val Tyr Ile Ser Glu His Glu His Phe Thr Asp Phe Asn Ala
1 5 10 15
<210> 320
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 320
Ser Glu His Glu His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu
1 5 10 15
<210> 321
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 321
Val Pro Pro Pro Leu Asp Gln Tyr Val Lys Phe Asp Ala Val Ser
1 5 10 15
<210> 322
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 322
Pro Lys Asp
1
<210> 323
<211> 66
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> AP1
<400> 323
Ala Ala Ala Gln Glu Ala Asp Gly Ala Arg Ser Ala Val Val Ala Ala
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gln Val Thr Ser Asn Gly Ser Ile Gly Arg
20 25 30
Asp Pro Pro Ala Glu Thr Gln Pro Gln Asn Pro Pro Ala Gln Pro Ala
35 40 45
Pro Asn Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Ser
65
<210> 324
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 324
Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr Ser
1 5 10 15
<210> 325
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 325
Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr Ser Pro
1 5 10 15
<210> 326
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 326
Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr Ser Pro Val
1 5 10 15
<210> 327
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 327
Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr Ser Pro Val His
1 5 10 15
<210> 328
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 328
Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr Ser Pro Val His Gln
1 5 10 15
<210> 329
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 329
His Ile Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr Ser Pro Val His Gln Lys
1 5 10 15
<210> 330
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 330
Ile Ser Glu His Glu His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala
1 5 10 15
<210> 331
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 331
Glu His Glu His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu
1 5 10
<210> 332
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 332
His Glu His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp
1 5 10 15
<210> 333
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 333
Glu His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu
1 5 10 15
<210> 334
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 334
His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln
1 5 10 15
<210> 335
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 335
Gln Gln Leu Glu Ile Lys
1 5
<210> 336
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 336
Asp Tyr Tyr Pro Ile Ile
1 5
<210> 337
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X可以是任何芳香族氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X可以是任何脂肪族氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(4)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X可以是任何碱性氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(9)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 337
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 338
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X可以是F、W或Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X可以是L、V、I、A或M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(4)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X可以是K、R或H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(9)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 338
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 339
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X可以是任何芳香族氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X可以是任何脂肪族氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X可以是任何芳香族氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X可以是任何酸性氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X可以是任何碱性氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(9)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 339
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 340
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X可以是F、W或Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X可以是L、V、I、A或M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X可以是任何芳香族氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X可以是任何酸性氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X可以是K、R或H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(9)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 340
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 341
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
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<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X可以是任何脂肪族氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 396
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 397
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X可以是任何芳香族氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X可以是任何脂肪族氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X可以是任何芳香族氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X可以是任何碱性氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X可以是任何酸性氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X可以是任何脂肪族氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 397
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 398
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X可以是任何芳香族氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X可以是任何脂肪族氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X可以是任何芳香族氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X可以是任何酸性氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X可以是任何碱性氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X可以是任何酸性氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X可以是任何脂肪族氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 398
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 399
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X可以是F、W或Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X可以是L、V、I、A或M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X可以是任何芳香族氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X可以是K、R或H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X可以是任何酸性氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X可以是任何脂肪族氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 399
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 400
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X可以是F、W或Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X可以是L、V、I、A或M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X可以是任何酸性氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X可以是K、R或H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X可以是任何酸性氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X可以是任何脂肪族氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 400
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 401
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X可以是F、W或Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X可以是L、V、I、A或M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X可以是任何芳香族氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X可以是任何酸性氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X可以是K、R或H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X可以是任何酸性氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X可以是任何脂肪族氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 401
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 402
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X可以是F、W或Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X可以是L、V、I、A或M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X可以是任何芳香族氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X可以是任何酸性氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X可以是K、R或H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X可以是任何酸性氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X可以是任何碱性氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X可以是任何脂肪族氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 402
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 403
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X可以是F、W或Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X可以是L、V或I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X可以是F、W或Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X可以是D或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X可以是K、R或H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X可以是D或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X可以是K、R或H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X可以是L、V或I
<400> 403
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys
1 5
<210> 404
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X可以是D或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X可以是K、R或H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X可以是D或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X可以是F、W或Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X可以是D或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X可以是D或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X可以是L、V、I、A或M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X可以是A、S或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> X可以是L、V、I、A或M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> X可以是R、K或H
<400> 404
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10
<210> 405
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X可以是D或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X可以是K、R或H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X可以是D或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X可以是F、W或Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X可以是D或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X可以是D或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X可以是L、V或I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X可以是A、S或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> X可以是L、V或I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> X可以是R、K或H
<400> 405
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10

Claims (62)

1.一种用于治疗的结合剂，其能够与受体CLPTM1和/或QRFPR结合，其中所述结合剂能够抑制GDF15和所述受体之间的相互作用。
2.如权利要求1所述的用于使用的结合剂，其中所述结合剂是抗体。
3.如权利要求2所述的用于使用的结合剂，其中所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。
4.如权利要求2至4中任一项所述的用于使用的结合剂，其中所述抗体为嵌合抗体或人源化抗体或人抗体。
5.如权利要求1至4中任一项的使用的结合剂，其中所述结合剂与具有或包含SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:212、SEQID NO:213-239、SEQ ID NO:275-278、SEQ ID NO:280-286或SEQ ID NO:322的任一个或多个所示的氨基酸序列的多肽结合。
6.如权利要求1至5中任一项所述的用于使用的结合剂，其中所述结合剂不与如权利要求7至34的任一项中限定的多肽结合。
7.一种用于治疗的多肽，其中所述多肽能够与GDF15结合并抑制其与受体QRFPR和/或CLPTM1相互作用，并且：
(i)具有或包含SEQ ID NO:5(QRFPR的细胞外结构域3)、SEQ ID NO:12(QRFPR的细胞外结构域4)或SEQ ID NO:14(CLPTM1的细胞外结构域)所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14具有至少75％序列同一性的氨基酸序列；或
(ii)为或包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14的部分，所述部分包含SEQID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14的至少6个连续氨基酸；或
(iii)包含相应于SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14的至少6个连续氨基酸的至少6个氨基酸，并与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14中的等效氨基酸序列具有至少75％的序列同一性；
其中所述多肽不包含全长天然QRFPR或CLPTM1受体的氨基酸序列或不由全长天然QRFPR或CLPTM1受体的氨基酸序列组成，并且其中所述多肽不由SEQ ID NO:243-245的任一个所示的氨基酸序列组成。
8.一种多肽，所述多肽能够与GDF15结合并抑制其与受体QRFPR和/或CLPTM1相互作用，其中所述多肽：
(i)具有或包含SEQ ID NO:5(QRFPR的细胞外结构域3)、SEQ ID NO:12(QRFPR的细胞外结构域4)或SEQ ID NO:14(CLPTM1的细胞外结构域)所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14具有至少75％序列同一性的氨基酸序列；或
(ii)为或包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14的部分，所述部分包含SEQID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:9的至少6个连续氨基酸；或
(iii)包含相应于SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14的至少6个连续氨基酸的至少6个氨基酸，并与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14中的等效氨基酸序列具有至少75％的序列同一性；
其中所述多肽不包含全长天然QRFPR或CLPTM1受体的氨基酸序列或不由全长天然QRFPR或CLPTM1受体的氨基酸序列组成，并且其中所述多肽不由SEQ ID NO:243-249、SEQID NO:287或SEQ ID NO:288的任一个所示的氨基酸序列组成。
9.如权利要求8所述的多肽，用于在治疗中使用。
10.如权利要求7或9所述的用于使用的多肽或如权利要求8所述的多肽，其中所述多肽不由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:315的任一个所示的氨基酸序列组成。
11.如权利要求7、9或10所述的用于使用的多肽或如权利要求8或10所述的多肽，其中所述多肽：
(i)包含SEQ ID NO:5(QRFPR的细胞外结构域3)、SEQ ID NO:12(QRFPR的细胞外结构域4)或SEQ ID NO:14(CLPTM1的细胞外结构域)或SEQ ID NO:315(具有N末端甲硫氨酸的CLPTM1的细胞外结构域)所示的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在任一端或两端不以天然QRFPR或CLPTM1受体中的所述氨基酸序列侧翼的氨基酸序列为侧翼；或包含不是SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:315的氨基酸序列但与SEQ ID NO:5、SEQID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:315具有至少75％的序列同一性的氨基酸序列，其中任选地所述氨基酸序列在任一端或两端不以天然QRFPR或CLPTM1受体中的所述氨基酸序列侧翼的氨基酸序列为侧翼；或
(ii)为或包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:315的一部分，所述部分包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:315的至少6个连续氨基酸，其中(i)SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:315的至少2个连续或非连续氨基酸被删除和/或(ii)所述部分在任一端或两端不以天然QRFPR或CLPTM1受体中的所述氨基酸序列侧翼的氨基酸序列为侧翼；或
(iii)包含具有相应于SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:315的至少6个连续氨基酸的至少6个氨基酸的氨基酸序列，并与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQID NO:14或SEQ ID NO:315中的等效氨基酸序列具有至少75％的序列同一性，其中(i)SEQID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:315的至少2个连续或非连续氨基酸被删除和/或(ii)对应于SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:315的氨基酸序列在任一端或两端不以天然QRFPR或CLPTM1受体中的所述氨基酸序列侧翼的氨基酸序列为侧翼。
12.如权利要求7或9所述的用于使用的多肽或如权利要求8所述的多肽或如权利要求10或11所述的用于使用的多肽或多肽，其中所述多肽包含对应于SEQ ID NO:5的残基8至13的序列FLYEK(SEQ ID NO.210)。
13.如权利要求12所述的用于使用的多肽或多肽，其中所述多肽包含对应于SEQ IDNO:5的残基3至15的序列LEIKYDFLYEKEH(SEQ ID NO:180)。
14.如权利要求12或13所述的用于使用的多肽，其中所述多肽还包含对应于SEQ IDNO.5的残基22至24的序列WTS(SEQ ID NO.211)。
15.如权利要求12至14中任一项所述的用于使用的多肽或多肽，其中所述多肽具有或包含SEQ ID NO:11(FLYEKEHIC)所示的序列或与其具有至少75％序列同一性的序列。
16.如权利要求12至15中任一项所述的用于使用的多肽或多肽，其中所述多肽具有或包含选自由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9组成的组的序列，或与其具有至少75％序列同一性的序列。
17.如权利要求7或9所述的用于使用的多肽或如权利要求8所述的多肽或如权利要求10或11所述的用于使用的多肽或多肽，其中所述多肽包含序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9；其中：
X1是芳香族氨基酸；
X2是脂肪族氨基酸；
X5是碱性氨基酸；并且
X3、X4、X6、X7、X8和X9可以独立地是任何氨基酸(SEQ ID NO:337)。
18.如权利要求17所述的用于使用的多肽或多肽，其中
X1是F、W或Y；
X2是L、V、I、A或M，优选L、V或I；
X5是K、R或H，优选K或R(SEQ ID NO:338)。
19.如权利要求17或权利要求18所述的用于使用的多肽或多肽，其中：
X3是芳香族氨基酸，优选F、W或Y；和/或
X4是酸性氨基酸，优选E或D(SEQ ID NO:339-344)。
20.如权利要求17至19中任一项所述用于使用的多肽或多肽，其中：
X6是酸性氨基酸，优选E或D；和/或
X7是碱性氨基酸，优选K、R或H，更优选K或R(SEQ ID NO:345-369)。
21.如权利要求17至20中任一项所述的用于使用的多肽或多肽，其中
X8是脂肪族氨基酸，优选L、V、I、A或M，更优选L、V或I；和/或
X9是任意氨基酸，优选C(SEQ ID NO:370-402)。
22.如权利要求17至21中任一项所述的用于使用的多肽或多肽，其中所述多肽包含序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9；其中：
X1是F、W或Y；
X2是L、V或I；
X3是F、W或Y；
X4是D或E；
X5是K、R或H；
X6是D或E；
X7是K、R或H；
X8是L、V或I；并且
X9是C(SEQ ID NO:403)。
23.如权利要求17至22中任一项所述的用于使用的多肽或多肽，其中所述序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9在一端或两端以1至10个氨基酸为侧翼，优选地其中所述侧翼氨基酸序列包含能够形成α螺旋或β片层的氨基酸。
24.如权利要求23所述的用于使用的多肽或多肽，其中残基X1以包含能够形成α螺旋的氨基酸的氨基酸序列为侧翼和/或残基X9以包含能够形成β片层的氨基酸的氨基酸序列为侧翼，优选地其中X9以C为侧翼。
25.如权利要求7或9所述的用于使用的多肽或如权利要求8所述的多肽或如权利要求10或11所述的用于使用的多肽或多肽，其中所述多肽具有或包含SEQ ID NO:13(EKEYDDVTIK)所示的序列或与其具有至少75％序列同一性的序列。
26.如权利要求7或9所述的用于使用的多肽或如权利要求8所述的多肽或如权利要求10、11或26中任一项所述的用于使用的多肽或多肽，其中所述多肽包含序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10，其中X1是D或E；X2是K、R或H；X3是D或E；X4是F、W或Y；X5是D或E；X6是D或E；X7是L、V或I；X8是A、S或T；X9是L、V或I；并且X10是R、K或H(SEQ ID NO:405)。
27.如权利要求7或9所述的用于使用的多肽或如权利要求8所述的多肽或如权利要求10或11所述的用于使用的多肽或多肽，其中所述多肽具有或包含SEQ ID NO:15(YISEHEH)所示的序列或与其具有至少75％序列同一性的序列，和/或其中所述多肽具有或包含SEQID NO:16(LFWEQH)所示的序列或与其具有至少75％序列同一性的序列。
28.如权利要求7或9所述的用于使用的多肽或如权利要求8所述的多肽或如权利要求10、11或27中任一项所述的用于使用的多肽或多肽，其中所述多肽具有或包含SEQ ID NO:17所示的序列或与其具有至少75％序列同一性的序列，或为SEQ ID NO.17的一部分的序列，所述部分包含至少6个连续氨基酸。
29.如权利要求7或9所述的用于使用的多肽或如权利要求8所述的多肽或如权利要求10、11、27或28中任一项所述的用于使用的多肽或多肽，其中所述多肽具有或包含SEQ IDNO:18的序列或与其具有至少75％序列同一性的序列。
30.如权利要求7或9所述的用于使用的多肽或如权利要求8所述的多肽或如权利要求10或11所述的用于使用的多肽或多肽，其中所述用于使用的多肽或多肽具有或包含SEQ IDNO:258、SEQ ID NO:259、SEQ ID NO:262、SEQ ID NO:263、SEQ ID NO:269、SEQ ID NO:270、SEQ ID NO:297、SEQ ID NO:298、SEQ ID NO:301、SEQ ID NO:302、SEQ ID NO:308或SEQ IDNO:309的任一个所示的序列或与其具有至少75％序列同一性的序列，或为任一前述序列的一部分的序列，所述部分包含至少6个连续氨基酸。
31.如权利要求7或9所述的用于使用的多肽或如权利要求8所述的多肽或如权利要求10或11所述的用于使用的多肽或多肽，其中所述用于使用的多肽或多肽具有或包含SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47或SEQID NO:175-189的任一个所示的序列或与其具有至少75％序列同一性的序列。
32.如权利要求7或9所述的用于使用的多肽或如权利要求8所述的多肽或如权利要求10至31中任一项所述的用于使用的多肽或多肽，其中所述多肽为二聚体的形式或更高的多聚体形式。
33.如权利要求7或9所述的用于使用的多肽或如权利要求8所述的多肽或如权利要求10至32中任一项所述的用于使用的多肽或多肽，其中所述用于使用的多肽或多肽被提供为融合蛋白。
34.如权利要求33所述的用于使用的多肽或多肽，其中所述融合蛋白中的融合伴侣为白蛋白、转铁蛋白、Fc、纤维蛋白原、同质氨基酸聚合物、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸聚合物、或弹性蛋白样肽，其中所述融合伴侣任选地通过接头序列连接。
35.如权利要求7或9所述的用于使用的多肽或如权利要求8所述的多肽或如权利要求10至32中任一项所述的用于使用的多肽或多肽，其中所述多肽为环状多肽。
36.如权利要求1至6的任一项中限定的结合剂和/或如权利要求7、8或10至35的任一项中限定的多肽用于制备用于治疗或预防与升高的或不希望的GDF15水平相关的症状的药物的用途。
37.一种药物组合物，其包含如权利要求1至6的任一项中限定的结合剂和/或如权利要求7、8或10至35的任一项中限定的多肽，连同至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。
38.一种产品，其包含作为组合制品的如权利要求1至6的任一项中限定的结合剂和如权利要求7、8或10至35的任一项中限定的多肽，用于在治疗或预防与升高的或不希望的GDF15水平相关的症状中分开、顺序或同时使用。
39.一种治疗或预防与升高的或不希望的GDF15水平相关的症状的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用有效量的如权利要求1至6的任一项中限定的结合剂和/或如权利要求7、8或10至35的任一项中限定的多肽。
40.如权利要求1至6中任一项所述的用于使用的结合剂和/或如权利要求7或9至35中任一项所述的用于使用的多肽或如权利要求37所述的药物组合物，用于在治疗或预防与升高的或不希望的GDF15水平相关的症状中使用。
41.如权利要求39所述的用于使用的结合剂和/或如权利要求40所述的用于使用的多肽，其中所述症状选自以下中的一种或多种：癌症、恶病质、骨病、心血管疾病、慢性肺紊乱、肺动脉高血压、肾紊乱、镰状细胞疾病、遗传性球形红细胞症或铁过载紊乱。
42.如权利要求40或权利要求41所述的用于使用的结合剂和/或用于使用的多肽，用于在降低GDF15的免疫抑制效应中使用。
43.如权利要求40至42中任一项所述的用于使用的结合剂和/或用于使用的多肽，用于在抑制癌细胞的免疫逃避中使用，包括用于抑制转移，特别是用于抑制癌症中的骨的参与。
44.如权利要求41所述的用于使用的结合剂和/或用于使用的多肽，其中所述恶病质为癌症引起的。
45.如权利要求1至6的任一项中限定的结合剂和/或如权利要求7、8或10至35的任一项中限定的多肽用于抑制GDF15与受体QRFPR和/或CLPTM1的体外相互作用的用途。
46.一种通过治疗剂检测需要治疗或预防的受试者的方法，所述治疗剂为如权利要求1至8或10至35的任一项中限定的多肽和/或结合剂，所述方法包括检测GDF15和受体QRFPR和/或CLPTM1之间的相互作用和/或所述相互作用的效应。
47.一种通过向受试者施用治疗剂评价或监测治疗或预防方法的方法，所述治疗剂为如权利要求1至8或10至35的任一项中限定的结合剂和/或多肽，所述方法包括检测GDF15和受体QRFPR和/或CLPTM1之间的相互作用和/或所述相互作用的效应。
48.一种检测具有与升高的GDF15水平相关的症状或有发展与升高的GDF15水平相关的症状的风险的受试者的方法，所述方法包括检测所述受试者中的GDF15和受体QRFPR和/或CLPTM1之间的相互作用和/或所述相互作用的效应。
49.如权利要求46至48中任一项所述的方法，其中GDF15和受体QRFPR和/或CLPTM1之间的所述相互作用通过原位邻近连接测定来检测。
50.如权利要求46至48中任一项所述的方法，其中所述相互作用为在GDF15和QRFPR之间的，并且所述相互作用的所述效应为升高的包含QRFPR的外泌体的水平。
51.如权利要求46至48中任一项所述的方法，其中所述相互作用为在GDF15和CLPTM1之间的，并且所述相互作用的所述效应为升高的磷酸化的GSK3b水平。
52.一种细胞毒性免疫细胞，其中所述细胞被修饰为与尚未被修饰的细胞相比具有降低地CLPTM1水平和/或活性。
53.如权利要求52所述的细胞，其中所述细胞为细胞毒性T细胞，所述细胞毒性T细胞表达或被修饰为表达对癌细胞的表面上的抗原具有特异性的T细胞受体。
54.如权利要求52所述的细胞，其中所述细胞为细胞毒性T细胞，所述细胞毒性T细胞被修饰为表达对癌细胞的表面上的抗原具有特异性的嵌合抗原受体。
55.如权利要求52所述的细胞，其中所述细胞为自然杀伤细胞(NK细胞)，所述自然杀伤细胞任选地被修饰为表达对癌细胞的表面上的抗原具有特异性的嵌合抗原受体。
56.如权利要求52至55中任一项所述的细胞，其中所述修饰为编码CLPTM1的基因的敲除、敲减或删除。
57.如权利要求52至56中任一项所述的细胞，用于在治疗中使用。
58.如权利要求57所述的用于使用的细胞，用于在癌症治疗中使用。
59.如权利要求52至56的任一项中限定的细胞在制备用于癌症治疗的药物中的用途。
60.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求52至56的任一项中限定的细胞，连同至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。
61.一种治疗方法，所述方法包括向需要其的受试者施用有效量的如权利要求52至56的任一项中限定的细胞。
62.一种产品，其包含作为组合制品的如权利要求1至6的任一项中限定的结合剂和/或如权利要求7、8或10至35的任一项中限定的多肽，以及如权利要求52至56的任一项中限定的细胞，用于在治疗癌症中分开、顺序或同时使用。
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