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CN108136047B - 提高原代细胞中基于核酸内切酶的基因编辑 - Google Patents

提高原代细胞中基于核酸内切酶的基因编辑 Download PDF

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CN108136047B CN201680039989.4A CN201680039989A CN108136047B CN 108136047 B CN108136047 B CN 108136047B CN 201680039989 A CN201680039989 A CN 201680039989A CN 108136047 B CN108136047 B CN 108136047B
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Abstract

本文公开了基于核酸酶的基因组编辑系统以及使用该系统进行基因组编辑的方法。并且，本文公开了在存在辅助蛋白的情况下使用腺相关病毒(AAV)载体表达基于CRISPR/Cas9的基因组编辑所需的向导RNA时，在原代人类细胞中以最小的毒性提高Cas9介导的基因编辑效率的方法。

Description

提高原代细胞中基于核酸内切酶的基因编辑
优先权及相关申请的交叉引用
本申请要求2015年5月13日提交的美国临时申请62/161,104的优先权，以引用的方式将其整体内容并入本文。
序列表的引用
本申请与电子格式的序列表一起提交。该序列表作为题为SCRI_094WO_SEQLIST.txt的文件而提供，大小为72,184字节，创建于2016年5月11日，最后一次修改于2016年5月11日。
技术领域
本文提供的公开方面总体上涉及基于核酸内切酶的基因编辑系统和方法。本文提供的一些公开方面涉及CRISPR/Cas9基因编辑系统。
背景技术
基于核酸内切酶的系统已经迅速成为生物医学研究中重要的基因编辑工具，在各种培养细胞和模式生物系统中证明了它们在基因破坏(gene disruption)和/或基因靶向方面的应用。
用于基因编辑的基于核酸内切酶的系统允许科学家们以前所未有的精确度、效率和灵活性来编辑基因组。用于基因编辑的基于核酸内切酶的手段的实例包括含有(但不限于)锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应子核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶(如MegaTAL)和CRISPR/Cas9的系统。
发明内容
本公开提供了在原代细胞中应用CRISPR/Cas9的几种方法，其中，用mRNA来表达Cas9，同时用mRNA来瞬时表达两种腺病毒蛋白(E4ORF6和E1B55K的突变形式H373A或H354)。野生型E4ORF6蛋白和E1B55K蛋白解除来自AAV载体的进入后表达缺陷，然而，如果使用野生型E1B55K蛋白或E4ORF6蛋白，则它们会使参与DNA修复的重要蛋白质复合物(称为MRN复合物)失效，导致由于缺乏DNA断裂的修复而产生细胞周期停滞和高毒性。利用不使MRN复合物失效的E1B55K突变体来替代野生型蛋白质的使用。Cas9与E4ORF6/E1B55K突变体的共表达导致在保持完整DNA修复的同时，充分解除对AAV表达的进入后限制。这允许当使用AAV载体来表达Cas9靶向所必需的向导RNA(guide RNA)时，以最小的毒性大幅地提高Cas9介导的基因编辑的效率。
本文提供的系统的一些可选方式包含核酸内切酶，如此以提供在基因破坏中有用的额外工具。例如，几种可选方式涉及同时使用核酸内切酶的利用CRISPR/Cas9系统和方法来提高靶基因的失活效率的系统。更多可选方式涉及利用本文所述一个或多个系统的用于治疗、农业和/或其它商业上有用的目的的靶基因失活。进一步更多的可选方式涉及具有失活靶基因的自体原代细胞和/或非自体原代细胞的制备以及这些细胞在治疗和/或其它商业应用方面的用途。
在一些可选方式中，提供了用于编辑细胞中至少一个靶基因的系统，所述系统包含：编码CRISPR向导RNA的第一核酸序列，其中所述CRISPR向导RNA与细胞中至少一个靶基因互补，并且，其中所述第一核酸序列存在于载体中；编码Cas9蛋白、其衍生物或其片段的第二核酸序列；编码第一腺病毒蛋白的第三核酸序列；以及编码第二腺病毒蛋白的第四核酸序列。在所述系统的一些可选方式中，所述细胞是真核细胞。在所述系统的一些可选方式中，所述细胞是哺乳动物细胞。在所述系统的一些可选方式中，所述细胞是人类细胞。在所述系统的一些可选方式中，所述细胞是原代细胞。在所述系统的一些可选方式中，所述细胞不是转化细胞(transformed cell)。在所述系统的一些可选方式中，所述细胞是原代淋巴细胞、CD34+干细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、神经胶质细胞、肌肉细胞或肠细胞。
在所述系统的一些可选方式中，所述载体是病毒载体。在所述系统的一些可选方式中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。在所述系统的一些可选方式中，编码Cas9蛋白、其衍生物或其片段的所述第二核酸是mRNA。在所述系统的一些可选方式中，编码Cas9蛋白的所述第二核酸序列经密码子优化以在真核细胞(例如人类细胞)中表达。在所述系统的一些可选方式中，所述Cas9蛋白、其衍生物或其片段来自于酿脓链球菌(S.pyogenes)。在所述系统的一些可选方式中，编码第一腺病毒蛋白的所述第三核酸是mRNA。在所述系统的一些可选方式中，所述mRNA经密码子优化以在真核细胞(例如人类细胞)中表达。在所述系统的一些可选方式中，所述第一腺病毒蛋白是E4ORF6。在所述系统的一些可选方式中，编码第二腺病毒蛋白的所述第四核酸是mRNA。在所述系统的一些可选方式中，编码第二腺病毒蛋白的所述第四核酸经密码子优化以在真核细胞(例如人类细胞)中表达。在所述系统的一些可选方式中，所述第二腺病毒蛋白是E1B55K突变体。在所述系统的一些可选方式中，所述第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列和第四核酸序列连接至在真核细胞(例如人类细胞)中可操作的调控元件。在所述系统的一些可选方式中，将编码CRISPR向导RNA的所述第一核酸序列可操作地连接至调控元件。在所述系统的一些可选方式中，将编码CRISPR向导RNA的所述核酸序列可操作地连接至启动子(例如U6启动子)。在所述系统的一些可选方式中，编码CRISPR向导RNA的所述第一核酸序列是组成型表达的。
在一些可选方式中，提供了编辑细胞中至少一个靶基因的方法，所述方法包括：将包含编码CRISPR向导RNA的第一核酸序列的第一载体导入细胞中，其中所述CRISPR向导RNA与所述细胞中至少一个靶基因互补；将编码Cas9蛋白、其衍生物或其片段的第二核酸序列导入所述细胞中；将编码第一腺病毒蛋白的第三核酸序列导入所述细胞中；以及将编码第二腺病毒蛋白的第四核酸序列导入所述细胞中。在所述方法的一些可选方式中，所述细胞是真核细胞。在所述方法的一些可选方式中，所述细胞是哺乳动物细胞。在所述方法的一些可选方式中，所述细胞是人类细胞。在所述方法的一些可选方式中，所述细胞是原代细胞。在所述方法的一些可选方式中，所述细胞不是转化细胞。在所述方法的一些可选方式中，所述细胞是原代淋巴细胞、CD34+干细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、神经胶质细胞、肌肉细胞或肠细胞。
在所述方法的一些可选方式中，包含编码CRISPR向导RNA的第一核酸序列的所述第一载体是病毒载体。在所述方法的一些可选方式中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。在所述方法的一些可选方式中，所述第二核酸序列、第三核酸序列和第四核酸序列是mRNA。在所述方法的一些可选方式中，所述mRNA经密码子优化以在真核细胞(例如人类细胞)中表达。在所述方法的一些可选方式中，所述Cas9蛋白、其衍生物或其片段来自于酿脓链球菌。在所述方法的一些可选方式中，所述第一腺病毒蛋白是E4ORF6。在所述方法的一些可选方式中，所述第二腺病毒蛋白是E1B55K突变体。在所述方法的一些可选方式中，所述CRISPR向导RNA与目的靶基因互补。在所述方法的一些可选方式中，所述CRISPR向导RNA与目的靶基因互补。在所述方法的一些可选方式中，将所述第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列和第四核酸序列瞬时导入细胞中。在所述方法的一些可选方式中，所述第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列和第四核酸序列不是永久性地被导入细胞中。在所述方法的一些可选方式中，将所述第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列和第四核酸序列导入细胞不会转化细胞。在所述方法的一些可选方式中，所述靶基因是经选择或经鉴定的目的基因。在所述方法和/或所述系统的一些可选方式中，在载体上提供所述第二核酸序列、第三核酸序列或第四核酸序列。在一些可选方式中，通过将本文所述系统的任何可选方式导入细胞中来实行编辑细胞中至少一个靶基因的方法。
在一些可选方式中，通过向患有疾病和/或病症(condition)的受试者提供本文所述系统的任何可选方式来实行治疗、改善(ameliorating)或抑制受试者中的疾病和/或病症的方法。
附图说明
图1A示出了用于TCR基因座靶向的mRNA和AAV载体构建体的示意图。
图1B示出了在TCRα基因座处的编辑诱导的插入-缺失(insertions-deletions，indels)的T7测定。
图1C示出了Cas9-T2A-mCherry mRNA剂量在转染24小时后对表达的作用。
图1D示出了增加AAV剂量对TCRα敲除的作用。
图1E示出了涉及在T细胞中利用用于向导表达的单链(single stranded，ss)AAV与自身互补(self-complementary，sc)AAV进行TCRα敲除的比较的流式细胞数据。
图2A示出了涉及解除对AAV介导的基因表达的进入后限制的数据。
图2B示出了涉及E4ORF6/E1B55K蛋白对自身互补AAV6和单链AAV6介导的基因表达的作用的比较的数据。
图2C示出了涉及MRN失活及其解除进入后限制对AAV介导的表达的作用的数据。
图3A示出了E4ORF6/E1B55K突变体对AAV驱动的GFP表达的作用。
图3B示出了E4ORF6/E1B55K-H373表达对AAV转导的作用。
图3C示出了E1B55K突变体、E4ORF6突变体对AAV转导的作用的比较。
图3D示出了E1B55K突变体、E4ORF6突变体对AAV驱动的GFP表达的作用的比较。
图4A-图4C示出了涉及通过使用腺病毒E4ORF6/E1B55K蛋白在原代人类T细胞中进行CRISPR介导的基因敲除的数据。
图5A-图5C示出了涉及E4ORF6/E1B55K MRN突变体对indel谱(indel spectra)的作用的数据。
图6示出了E4ORF6/E1B55K蛋白对非同源AAV插入的作用。
图7A-图7B示出了涉及用mRNA/AAV递送实施CRISPR/Cas9以在多个基因组位点实现敲除的数据。
图8A-图8D示出了涉及实施Cas9 mRNA/AAV向导递送以在具有E4ORF6/E1B55KH373A表达的原代人类T细胞中产生CRISPR介导的双敲除的数据。
图9示出了涉及实施Cas9 mRNA/AAV向导递送以在具有E4ORF6/E1B55K H373A表达的原代人类T细胞中产生CRISPR介导的多于两种基因的敲除的数据。
图10A-图10C示出了涉及使用E1B55K突变体(E4ORF6/E1B55K)提高靶向CRISPR敲入的效果的数据。
图11示出了涉及当使用较短同源臂用于CRISPR-Cas9在CCR5基因座处的基因敲入时，添加E4ORF6/E1B55K H373A或E4ORF6/E1B55K H354对同源介导的修复(homologydirected repair，HDR)的作用的数据。
图12A-图12C示出了涉及当使用较短同源臂用于CRISPR-Cas9在TCR基因座处的基因敲入时，添加E4ORF6/E1B55K H354对HDR的作用的数据。
图13A-图13B示出了涉及具有E4ORF6/E1B55K H373A的经编辑的原代T细胞中的表面标志物表型和Ca2+信号的数据。
图14A-图14B示出了涉及多重CRISPR编辑之后的细胞核型(cell karyotype)的数据。
图15A-图15C示出了涉及用E4ORF6/E1B55K H373A或E4ORF6/E1B55K H354进行CRISPR-Cas9断裂后的HDR事件的分子确认的数据。
图16A示出了用于使用CRISPR/Cas9系统来产生TCR敲除的向导RNA的多核苷酸序列的可选方式：向导1(SEQ ID NO：15)、向导2(SEQ ID NO：16)、向导3(SEQ ID NO：17)以及向导4(SEQ ID NO：5)。
图16B示出了当使用向导1-向导4的向导RNA时，对来自供体1的原代T细胞中的mRNA的Cas9-mCherry的表达效率进行比较的流式细胞数据。
图16C示出了当使用向导1-向导4的向导RNA时，对来自供体1的原代T细胞中的TCR敲除的产生效率进行比较的流式细胞数据。
图16D示出了当使用不同体积的Cas9/向导样品时，对来自供体1的原代T细胞中的Cas9-mCherry表达水平进行比较的流式细胞数据。
图16E示出了当使用不同体积的含有向导4的向导RNA的样品时，对来自供体1的原代T细胞中的TCR敲除的产生效率进行比较的流式细胞数据。
图16F示出了当使用不同体积的含有向导4的向导RNA的Cas9/向导样品时，对来自供体2的原代T细胞中的Cas9-mCherry表达水平进行比较的流式细胞数据。
图16G示出了当使用不同体积的含有向导4的向导RNA的样品时，对来自供体2的原代T细胞中的TCR敲除的产生效率进行比较的流式细胞数据。
图16H示出了当使用向导1-向导4的向导RNA时，对来自Jurkat T细胞中的mRNA的Cas9-mCherry的表达效率进行比较的流式细胞数据。
图16I示出了当使用向导1-向导4的向导RNA时，对Jurkat T细胞中的TCR敲除的生成效率进行比较的流式细胞数据。
图17示出了野生型腺病毒蛋白E1B55K的可选方式的蛋白质序列(SEQ ID NO：1)。
图18示出了具有H373A多态性(polymorphism)的突变腺病毒蛋白E1B55K的可选方式的蛋白质序列(SEQ ID NO：2)。突变用粗体和下划线表示。
图19示出了野生型腺病毒蛋白E4ORF6的可选方式的蛋白质序列(SEQ ID NO：3)。
图20示出了具有H354的突变腺病毒蛋白E1B55K的可选方式的蛋白质序列(SEQ IDNO：4)。突变/插入用粗体和下划线表示。
图21示出了用向导1(G1)、向导2(G2)、向导3(G3)和向导4(G4)的CRISPR向导RNA产生TCRα敲除的流式细胞数据。
图22示出了酿脓链球菌的Cas9蛋白的可选dCas9变异体(variant)的蛋白质序列(SEQ ID NO：6)。
图23示出了来自酿脓链球菌的可选Cas9-SP变异体的核苷酸序列(SEQ ID NO：7)。
图24示出了来自酿脓链球菌的可选Cas9-SPm4变异体的核苷酸序列(SEQ ID NO：8)。
图25示出了来自嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的可选Cas9-ST1变异体的核苷酸序列(SEQ ID NO：9)。
图26示出了来自嗜热链球菌的可选Cas9-STlm4变异体的核苷酸序列(SEQ ID NO：10)。
图27示出了来自脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)的可选Cas9-NM变异体的核苷酸序列(SEQ ID NO：11)。
图28示出了来自脑膜炎奈瑟氏菌的可选Cas9-NMm4变异体的核苷酸序列(SEQ IDNO：12)。
图29示出了来自齿垢密螺旋体(Treponema denticola)的可选Cas9-TD变异体的核苷酸序列(SEQ ID NO：13)。
图30示出了来自齿垢密螺旋体的可选Cas9-TDm4变异体的核苷酸序列(SEQ IDNO：14)。
图31示出了PD1向导RNA的多核苷酸序列的可选方式(SEQ ID NO：18)、TIGIT向导RNA的多核苷酸序列的可选方式(SEQ ID NO：19)、Lag3向导RNA的多核苷酸序列的可选方式(SEQ ID NO：20)以及Tim3向导RNA的多核苷酸序列的可选方式(SEQ ID NO：21)。
图32A示出了就CCR5基因座而言TALEN对HDR的作用。
图32B示出了就CD40L基因座而言TALEN对HDR的作用。
图33示出了腺病毒蛋白E1B55K的R240A突变体的可选方式的核苷酸序列(SEQ IDNO：22)。
图34示出了腺病毒蛋白E4ORF6的AXA突变体的可选方式的核苷酸序列(SEQ IDNO：23)。
具体实施方式
在一些可选方式中，提供了基于核酸酶的基因编辑系统和方法。用于基因编辑的基于核酸酶的手段的实例包括包含例如但不限于如下核酸酶的系统：ZFN、TALEN、大范围核酸酶(例如MegaTAL)和CRISPR/Cas9。
本文提供的基因编辑系统和方法可应用于任何基于核酸酶的基因编辑手段，包括但不限于基因破坏和/或基因靶向。例如，本公开的方面涉及基于CRISPR/Cas9的基因编辑。在一些可选方式中，提供了Cas9核酸酶介导的增强的基因编辑。
将CRISPR/Cas9用于基因编辑的重要方面在于需要在各种各样的细胞类型中有效表达向导RNA的系统。表达向导RNA的重要系统基于腺相关病毒载体(AAV)的使用。AAV载体能够转导范围广泛的原代细胞。
然而，在许多细胞类型中，存在对AAV载体的进入后限制，使得AAV介导的转基因(包括向导RNA)的表达效率非常低，因此大大削弱了将AAV载体用于此目的的效用。因此，在考虑之列的是大幅地改进和扩展CRISPR/Cas9系统在原代细胞中的潜在应用的手段。
在一些可选方式中，当使用腺相关病毒载体(AAV)来表达Cas9靶向所需的向导RNA时，基于Cas9的手段以最小的毒性增强了基因编辑效率。
CRISPR/Cas9和相关的可编程核酸内切酶系统已经迅速地成为生物医学研究实验室的重要基因编辑工具，在多种培养细胞和模式生物系统中证实了它们在基因破坏和/或基因靶向方面的应用。尽管Cas9核酸酶所具有的可通过重编程来靶向新位点的灵活性是在研究背景下用于基因组工程化的主要优势，但是几种实际障碍限制了将基于研究的基因编辑方法直接扩展到为治疗目的而进行的原代人类细胞的编辑。
这些实际障碍的一些实例包括：识别和富集已经经受所需编辑事件的细胞的机会有限；由于与长期和/或体内核酸酶表达相关的安全性和免疫原性问题，需要瞬时(例如几天)核酸酶递送；以及由原代细胞能够强有力地(robust)检测细胞质DNA的存在和随后产生的抗病毒信号或促凋亡信号所造成的用于核酸酶或重组模板递送的载体系统的局限性。
在本文所述的实际障碍的驱动下，利用锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应子核酸酶(TALEN)和大范围核酸酶进行的治疗性基因编辑策略已经趋向于确保瞬时表达核酸酶、最显著地转染mRNA以及使用病毒载体递送重组模板的递送手段。出于这些相同的原因，基于mRNA的CRISPR组分表达最近已经扩展到人类原代细胞中，通过使用电穿孔来递送Cas9mRNA或蛋白质连同天然或抗降解的向导RNA，以用于基因破坏的目的。
尽管基于RNA或基于蛋白质/RNA的核酸酶递送是破坏个别基因的简单直接的方法，但是涉及基因靶向的基于CRISPR的基因编辑的应用需要有效递送Cas9、向导RNA和重组模板这三种组分。
在一些可选方式中，提供了用于CRISPR/Cas9基因编辑的电穿孔/转导共递送方法，所述方法利用mRNA电穿孔介导Cas9连同两种腺病毒血清型5蛋白(E4ORF6和E1B55K)的变异体的表达，瞬时增强了原代细胞的AAV转导能力和基因编辑效率。
在一些可选方式中，使用与临床转译相容的细胞培养/制造方案，提供了该方法在原代人类T细胞中进行高效的基因破坏和同源介导的基因靶向方面的应用。
定义
在以下描述中广泛地使用了大量术语。为便于理解本发明的可选方式，提供了以下定义。
如本文使用的，“一”或“一个/种”可意味着一个/种或多于一个/种。
如本文使用的，术语“约/大约”表示包括为确定数值所采用的方法的固有误差或者实验之间存在的误差的数值。
如本文使用的，“核酸”或“核酸分子”是指多核苷酸(例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA))；寡核苷酸；由聚合酶链式反应(PCR)产生的片段；以及由连接、断裂、核酸内切酶作用和核酸外切酶作用中的任何方式产生的片段。核酸分子可由天然存在的核苷酸(例如DNA和RNA)或天然存在的核苷酸的类似物(例如天然存在的核苷酸的对映体形式)的单体或两者的组合组成。修饰的核苷酸可在糖部分和/或在嘧啶碱基或嘌呤碱基部分具有改变。糖修饰包括例如用卤素、烷基、胺基和叠氮基取代一个或多个羟基，或者可将糖官能化为醚或酯。此外，整个糖部分可被空间上和电子上相似的结构(如氮杂糖和碳环糖类似物)替代。碱基部分中的修饰的实例包括烷基化嘌呤和嘧啶、酰化嘌呤或嘧啶、或其它众所周知的杂环替代物。核酸单体可通过磷酸二酯键或这种键的类似物进行连接。磷酸二酯键的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯(phosphoranilidate)、氨基磷酸酯等。术语“核酸分子”还包括所谓的“肽核酸”，其包含连接至聚酰胺骨架的天然存在的核酸碱基或修饰的核酸碱基。核酸可为单链的或者双链的。CRISPR/Cas9系统的基本组分包括靶基因；向导RNA；以及Cas9核酸内切酶、其衍生物或其片段。应用CRISPR/Cas9进行基因编辑的重要方面在于需要有效地将向导RNA递送至各种各样的细胞类型的系统。例如，这可涉及以核酸的方式来递送体外产生的向导RNA(通过体外转录或化学合成产生的向导RNA)。在一些可选方式中，编码向导RNA的核酸通过掺入修饰的碱基(例如2'O-甲基碱基)而被赋予核酸酶抗性。在一些可选方式中，例如，本文所述的CRISPR/Cas9系统设置有包含一个或多个修饰的碱基(例如任何一个或多个本文所述的修饰的碱基)的向导RNA，所述系统中编码Cas9核酸酶或其衍生物或其功能片段的多核苷酸(例如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14)设置有所需长度的poly(T)尾或poly(A)尾并且根据本文所述的教导来制备。
可用于本文所述的可选方式的示例性向导RNA(可含有一个或多个本文所示的修饰的碱基)提供于SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21中。此外，由于腺相关病毒(AAV)载体能够转导范围广泛的原代细胞，在这种情况下，用于表达向导RNA的重要系统基于AAV载体的使用。AAV载体不会引起感染，也不会整合到基因组中。因此，使用AAV载体具有既安全又有效的益处。
术语“与……互补”意味着互补序列与参考多核苷酸序列的全部或者一个或多个部分同源。为了说明，核苷酸序列“CATTAG”对应于参考序列“CATTAG”并且与参考序列“GTAATC”互补。
“启动子”是指导结构基因转录的核苷酸序列。在一些可选方式中，启动子位于基因的5'非编码区中，临近结构基因的转录起始位点。在转录起始中发挥功能的启动子中的序列元件通常特征在于共有核苷酸序列。这些启动子元件包括：RNA聚合酶结合位点、TATA序列、CAAT序列、分化特异性元件(DSE；McGehee等，Mol.Endocrinol.7:551(1993)；以引用的方式将其整体并入本文)、环AMP应答元件(CRE)、血清应答元件(SRE；Treisman，Seminarsin Cancer Biol.1:47(1990)；以引用的方式将其整体并入本文)、糖皮质激素应答元件(GRE)以及其它转录因子的结合位点，所述转录因子例如为：CRE/ATF(O'Reilly等，J.Biol.Chem.267:19938(1992))、AP2(Ye等，J.Biol.Chem.269:25728(1994))、SP1、cAMP应答元件结合蛋白(CREB；Loeken,Gene Expr.3：253(1993))以及八聚体因子(octamerfactors)(总体上参见：Watson等编，Molecular Biology of the Gene，第4版(TheBenjamin/Cummings Publishing Company,Inc.，1987)以及Lemaigre和Rousseau，Biochem.J.303:1(1994)；所有参考文献以引用的方式将它们整体并入本文)。如本文使用的，启动子可为组成型激活的、可阻遏的或可诱导的。如果启动子是诱导型启动子，则转录速率应答于诱导剂而增加。反之，如果启动子是组成型启动子，则转录速率不受诱导剂调控。阻遏型启动子也是公知的。在一些可选方式中，调控元件可为非翻译区。在一些可选方式中，非翻译区是5'非翻译区。在一些可选方式中，非翻译区是3'非翻译区。在一些可选方式中，使用5'非翻译区或3'非翻译区。在一些可选方式中，使用5'非翻译区和3'非翻译区。本领域技术人员将理解本文的可选方式中使用的非翻译区的含义。
“调控元件”是调节核心启动子活性的核苷酸序列。例如，调控元件可含有与细胞因子结合的核苷酸序列，所述细胞因子能够使得转录专一地或优先地在特定的细胞、组织或细胞器中进行。这些类型的调控元件通常与以“细胞特异性”、“组织特异性”或“细胞器特异性”的方式表达的基因相关联。在一些可选方式中，提供了用于编辑细胞中至少一个靶基因的系统，其中所述系统包含编码CRISPR向导RNA的第一核酸序列，其中所述CRISPR向导RNA与细胞中至少一个靶基因互补，并且，其中所述第一核酸序列存在于载体中；所述系统还包含编码Cas9蛋白的第二核酸序列、编码第一腺病毒蛋白的第三核酸序列以及编码第二腺病毒蛋白的第四核酸序列。在一些可选方式中，所述第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列和第四核酸序列连接至在真核细胞(例如人类细胞)中可操作的调控元件。
“多肽”是由肽键连接的氨基酸残基的聚合物，无论是天然产生的还是合成产生的。少于约10个氨基酸残基的多肽通常被称为“肽”。多肽可被认为是蛋白质。
“蛋白质”是包含一个或多个多肽链的大分子。蛋白质还可包含非肽组分，如糖类(carbohydrate)基团。糖类和其它非肽取代基可由其中产生蛋白质的细胞添加到该蛋白质中，并且将随着细胞类型而变化。蛋白质在本文中根据其氨基酸骨架的结构来定义；取代基(例如糖类基团)通常不进行详细说明，尽管如此，其仍可以存在。在一些实施方式中，提供了用于编辑细胞中至少一个靶基因的系统，其中所述系统包含编码CRISPR向导RNA的第一核酸序列，其中所述CRISPR向导RNA与细胞中至少一个靶基因互补，并且，其中所述第一核酸序列存在于载体中；所述系统还包含编码Cas9蛋白的第二核酸序列、编码第一腺病毒蛋白的第三核酸序列以及编码第二腺病毒蛋白的第四核酸序列。
如本文使用的，“瞬时转染”是指由通常不会引起外源核酸整合至瞬时转染的宿主细胞的基因组中的方法将该外源核酸导入宿主细胞中。在一些可选方式中，所述核酸是RNA。在一些可选方式中，所述核酸是DNA。在一些可选方式中，当所述核酸是RNA时，所述核酸通常不会整合至瞬时转染的细胞的基因组中。在一些可选方式中，当所述核酸是DNA时，所述核酸可整合至瞬时转染的细胞的基因组中。
术语“宿主细胞”意味着根据本发明的可选方式导入了Cas9-mRNA/AAV-向导RNA的细胞以及与本文的系统一起提供的细胞。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。原核宿主细胞的实例包括但不限于：大肠杆菌(E.coli)、固氮菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、白色葡萄球菌(Staphylococcus albus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、破伤风梭菌(Clostridiumtetani)、肉毒梭状芽胞杆菌(Clostridium botulinum)、变异链球菌(Streptococcusmutans)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、支原体(mycoplasmas)和蓝细菌(cyanobacteria)。真核宿主细胞的实例包括但不限于：原生动物细胞、真菌细胞、藻类细胞、植物细胞、昆虫细胞、两栖动物细胞、禽类细胞和哺乳动物细胞。在一些可选方式中，提供了用于编辑细胞中至少一个靶基因的系统，其中所述细胞是真核细胞。在一些可选方式中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些可选方式中，所述细胞是人类细胞。在一些可选方式中，所述细胞是原代细胞。在一些可选方式中，所述细胞不是转化细胞。在一些可选方式中，所述细胞是原代淋巴细胞。在一些可选方式中，所述细胞是原代淋巴细胞、CD34+干细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、神经胶质细胞、肌肉细胞或肠细胞。
术语“基因表达”是指基因产物的生物合成。例如，在结构基因的情况中，基因表达涉及将结构基因转录成mRNA以及将mRNA翻译成一种或多种多肽。
术语“核酸内切酶”是指切割多核苷酸链内的磷酸二酯键的酶。所述多核苷酸可为双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、RNA、DNA和RNA的双链杂合体、以及合成的DNA(例如含有除A、C、G和T以外的碱基)。核酸内切酶可对称地切割多核苷酸，留下“平”末端，或者在不直接相对的位置产生可被称为“粘性末端”的垂悬端(overhang)。本文所述的方法和组合物可应用于由核酸内切酶产生的切割位点。在所述系统的一些可选方式中，所述系统可进一步提供编码核酸内切酶(例如Cas9、TALEN或MegaTAL)的核酸、或包含核酸内切酶(例如Cas9、TALEN或MegaTAL或它们的一个或多个部分)的结构域的融合蛋白。这些实例并不意味着是限制性的，其它核酸内切酶和包含其它核酸内切酶的系统和方法的可选方式以及这些示例性可选方式的变型和修饰是可能的，并不需要过多实验。所有这些变型和修饰都在当前教导的范围内。
术语“TAL效应子核酸酶”(TALEN)是指包含与核酸酶结构域融合的TAL效应子结构域的核酸酶。从植物病原体黄单胞菌属(Xanthomonas)中分离的TAL效应子DNA结合结构域已有描述(参见Boch等，(2009)Science 29Oct.2009(10.1126/science.1117881)；及Moscou和Bogdanove，(2009)Science 29October 2009(10.1126/science.1178817)；以引用的方式将这两篇参考文献整体并入本文)。可对这些DNA结合结构域进行工程化以结合至期望靶标并融合至核酸酶结构域(例如Fok1核酸酶结构域)，从而得到TAL效应子结构域-核酸酶融合蛋白。本文所述的方法和系统可应用于由TAL效应子核酸酶产生的切割位点。在本文提供的系统的一些可选方式中，所述系统可进一步包含TALEN核酸酶或编码TALEN核酸酶的载体或核酸。在本文提供的方法的一些可选方式中，所述方法可进一步包括提供核酸酶(例如TALEN核酸酶)。
MegaTAL源自于两种不同类别的DNA靶向酶的组合。大范围核酸酶(也称为归巢核酸内切酶)是指在同一结构域中同时具有DNA识别和核酸酶功能的优势的单肽链。在本文提供的系统的一些可选方式中，所述系统可进一步包含MegaTAL核酸酶或编码MegaTAL核酸酶的载体或核酸。在本文提供的方法的一些可选方式中，所述方法可进一步包括提供MegaTAL核酸酶或编码MegaTAL核酸酶的载体或核酸。
Cas9(CRISPR相关蛋白9)是一种RNA引导的DNA核酸内切酶，在其它细菌中，其与酿脓链球菌的CRISPR(Clustered Regularly Interspersed Palindromic Repeats，成簇规律间隔短回文重复)获得性免疫系统相关。酿脓链球菌利用Cas9来记忆并随后识别和切割外源DNA(例如侵入的噬菌体DNA或质粒DNA)。Cas9通过将外源DNA解链然后检查它是否与向导RNA的20个碱基对的间隔子(spacer)区域互补来进行该识别。如果DNA底物与向导RNA互补，则Cas9切割侵入的DNA。
CRISPR(成簇规律间隔短回文重复)是含有短碱基序列重复的原核DNA片段。每个重复之后是来自以前暴露于细菌病毒或质粒的“间隔子DNA”的短片段。CRISPR/Cas系统已被用于在整个生命树中在物种内进行基因编辑(添加、破坏或改变特定基因的序列)和基因调控。通过将Cas9蛋白、其衍生物或其片段以及适当的向导RNA递送到细胞中，可在任何所期望的位置切割生物体的基因组。使用CRISPR来建立能够改变整个群体的基因组的RNA引导的基因驱动成为可能。在一些可选方式中，提供了用于编辑细胞中至少一个靶基因的系统，其中所述系统包含：编码CRISPR向导RNA的第一核酸序列，其中所述CRISPR向导RNA与细胞中至少一个靶基因互补，并且，其中所述第一核酸序列存在于载体中；编码Cas9蛋白、其衍生物或其片段的第二核酸序列；编码第一腺病毒蛋白的第三核酸序列；以及编码第二腺病毒蛋白的第四核酸序列。用于本文所述可选方式的示例性向导RNA(可含有一个或多个修饰的碱基)提供于SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和/或SEQ ID NO：21中。
在一些可选方式中，使用化学修饰的向导RNA在考虑之列。化学修饰的向导RNA已用于人类原代细胞中的CRISPR-Cas基因组编辑(Hendel,A.等，Nat Biotechnol.2015Sep；33(9):985-9)。向导RNA的化学修饰可包括赋予核酸酶抗性的修饰。核酸酶可为核酸内切酶或核酸核酸外切酶、或两者皆可。一些化学修饰不受限制地包括：2'-氟代、2'O-甲基、硫代磷酸酯二硫醇3'-3'端连接、2-氨基-dA、5-甲基-dC、C-5丙炔基-C、C-5丙炔基-U、吗啉代等。这些实例并不意味着是限制性的，其它化学修饰以及这些示例性可选方式的变型和修饰也在考虑之列。
术语“核酸外切酶”是指通过水解反应(在3'端或5'端使磷酸二酯键断裂)在多核苷酸链的末端切割磷酸二酯键的酶。所述多核苷酸可为双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、RNA、DNA和RNA的双链杂合体以及合成的DNA(例如含有除A、C、G和T以外的碱基)。术语“5'核酸外切酶”是指在5'端切割磷酸二酯键的核酸外切酶。术语“3'核酸外切酶”是指在3'端切割磷酸二酯键的核酸外切酶。核酸外切酶可在核酸内切酶切割位点处或在通过其它化学或机械方式(如剪切(例如通过穿过细规格的针头、加热、超声处理、微珠滚动(tumbling)和雾化)、电离辐射、紫外线辐射、氧自由基、化学水解和化疗剂)产生的末端处切割多核苷酸链末端处的磷酸二酯键。核酸外切酶可在平末端或粘性末端处切割磷酸二酯键。大肠杆菌核酸外切酶I和核酸外切酶III是两种常用的具有3'核苷酸外切单链降解活性的3'核酸外切酶。3'-核酸外切酶的其它实例包括二磷酸核苷激酶(Nucleoside diphosphate kinases，NDK)NDK1(NM23-H1)、NDK5、NDK7和NDK8(Yoon J-H等，Characterization of the 3′to 5′exonuclease activity found in human nucleoside diphosphate kinase 1(NDK1)andseveral of its homologues.(Biochemistry 2005:44(48):15774-15786.))、WRN(Ahn,B.等，Regulation of WRN helicase activity in human base excisionrepair.J.Biol.Chem.2004,279:53465-53474)和3′修复核酸外切酶2(Three primerepair exonuclease，Trex2)(Mazur,D.J.,Perrino,F.W.,Excision of 3′termini bythe Trex1and TREX2 3′→5′exonucleases；Characterization of the recombinantproteins.J.Biol.Chem.2001,276:17022-17029；以引用的方式将两篇参考文献整体并入本文)。大肠杆菌核酸外切酶VII和T7-核酸外切酶基因6是两种常用的具有5％核苷酸外切单链降解活性的5'-3'核酸外切酶。核酸外切酶可来源于原核生物(如大肠杆菌核酸外切酶)或真核生物(如酵母核酸外切酶、蠕虫核酸外切酶、鼠科动物核酸外切酶或人核酸外切酶)。在本文提供的系统的一些可选方式中，所述系统可进一步包含含有核酸外切酶或编码核酸外切酶的载体或核酸。在一些可选方式中，所述核酸外切酶是Trex2。在本文提供的方法的一些可选方式中，所述方法可进一步包含提供核酸外切酶或编码核酸外切酶(例如Trex2)的载体或核酸。
术语“切割”是指多核苷酸的共价骨架的断裂。切割可通过多种方法(包括但不限于磷酸二酯键的酶促水解或化学水解)起始。单链切割和双链切割都是可能的，并且由于两个不同的单链切割事件可导致双链切割的发生。双链DNA、RNA或DNA/RNA杂合体的切割可导致平末端或交错末端(staggered end)的产生。
“原核”细胞缺乏真正的核酸酶。原核细胞的实例是细菌(例如蓝细菌、嗜酸乳杆菌、固氮菌、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、金黄色葡萄球菌、炭疽芽孢杆菌、破伤风梭菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和大肠杆菌)和古细菌(例如泉古菌门(Crenarchaeota)、广古菌门(Euryarchaeota)和初古菌门(Korarchaeota))。本文所述的Cas9蛋白是来自于原核细胞的蛋白质。
“真核”细胞包括但不限于：藻类细胞、真菌细胞(如酵母)、植物细胞、动物细胞、哺乳动物细胞和人类细胞(例如T细胞)。
如本文使用的术语“受试者”包括动物界的所有成员(包括非人灵长类动物和人类)。在一些可选方式中，提供了用于编辑细胞中至少一个靶基因的系统，其中所述系统包含：编码CRISPR向导RNA的第一核酸序列，其中所述CRISPR向导RNA与细胞中至少一个靶基因互补，并且，其中所述第一核酸序列存在于载体中；编码Cas9蛋白、其衍生物或其片段的第二核酸序列；编码第一腺病毒蛋白的第三核酸序列；以及编码第二腺病毒蛋白的第四核酸序列。在一些可选方式中，将包含经编辑的基因的细胞递送给有需要的受试者。
归巢核酸内切酶(也称为大范围核酸酶)是序列特异性的核酸内切酶，由于其切割位点大(例如>14bp)而在基因组DNA中以高特异性产生双链断裂。尽管归巢核酸内切酶对其靶位点的特异性允许精确靶向所诱导的DNA断裂，但是归巢核酸内切酶的切割位点很罕见，在靶向基因中发现天然存在的切割位点的概率很低。在本文提供的系统的一些可选方式中，所述系统可进一步包含大范围核酸酶或编码大范围核酸酶的载体或核酸。在本文提供的方法的一些可选方式中，所述方法可进一步包括提供大范围核酸酶或编码大范围核酸酶的载体或核酸。
另一类人工核酸内切酶是工程化大范围核酸酶。通过修饰现有的归巢核酸内切酶的特异性来产生工程化归巢核酸内切酶。在一种手段中，将变异导入天然存在的归巢核酸内切酶的氨基酸序列中，然后筛选所获得的工程化归巢核酸内切酶以选择切割靶向结合位点的功能性蛋白质。在另一种手段中，通过如下方式使嵌合归巢核酸内切酶工程化：组合两种不同归巢核酸内切酶的识别位点以产生由各归巢核酸内切酶的半位点组成的新识别位点。在本文提供的系统的一些可选方式中，所述系统可进一步包含工程化大范围核酸酶或编码工程化大范围核酸酶的载体或核酸。
通过采用非同源末端连接(non-homologous end joining)DNA修复途径，可将由罕见切割核酸内切酶导入的靶向DNA双链断裂用于不同细胞类型中的基因破坏应用。然而，核酸内切酶产生的化学上整齐的断裂经常受到精确的修复，从而限制了靶向基因破坏的效率。本文所述的几种可选方式涉及提高由核酸内切酶诱导的位点特异性DNA双链断裂的不精确修复导致的靶向基因破坏率的方法。在一些可选方式中，系统可进一步包含与末端加工酶偶联(coupled)以提高靶向基因破坏率的位点特异性核酸内切酶。偶联可为例如物理上的、空间上的和/或时间上的。
不受任何特定理论所束缚，因为非同源末端连接(NHEJ)过程可引起断裂位点处的插入和缺失，通过“易出错”的NHEJ来消除(resolution)双链DNA断裂可被用来产生靶向破坏和基因敲除。NHEJ由几条各自具有不同突变结果的子途径(sub-pathway)介导。经典NHEJ途径(cNHEJ)需要KU/DNA-PKcs/Lig4/XRCC4复合物，并且以最小的加工将末端连接回一起。由于由设计的核酸内切酶平台(锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应子核酸酶(TALEN)和归巢核酸内切酶(HE))产生的DNA断裂都留下在连接前不需要进行处理的化学上整齐的、相容的垂悬断裂，它们是通过cNHEJ途径进行精确修复的优异底物。在缺失经典NHEJ途径来消除断裂或其消除断裂失败时，另一种NHEJ途径(altNHEJ)可替代；然而，这些途径具有相当高的致突变性。
不受任何特定理论所束缚，由末端加工酶进行的DNA双链断裂的修饰可使修复偏向于altNHEJ途径。此外，末端加工酶的不同子集可通过不同机制增强破坏。例如，特异性水解暴露于3'垂悬端的磷酸二酯键的核酸外切酶Trex2使断裂位点处的修复偏向于致突变的缺失。相比之下，预期作为非模板型聚合酶的末端脱氧核苷酸转移酶(terminaldeoxynucleotidyl transferase，TdT)通过促进在连接之前加入核苷酸碱基以改变DNA末端从而使断裂位点处的修复偏向于致突变的插入。因此，本领域技术人员可使用具有不同活性的末端加工酶与本文提供的任何系统或方法一起来提供所期望的工程化结果。进一步，本领域技术人员可借助不同末端加工酶之间的协同作用，以此来实现最大的或独特类型的效果。
本文所述的几种可选方式将由核酸内切酶产生的DNA断裂与末端加工酶偶联，这可提高各种细胞类型和物种中的靶向破坏率，而不会对宿主产生相关毒性。这是重大的进步，至少是由于以下原因：1)双链断裂(DSB)触发细胞周期检查点(cell cyclecheckpoints)以使分裂停滞，直到断裂被消除；在“持续性断裂”(重复循环切割和精确修复)的情况下，细胞可无限期地停滞，导致细胞凋亡。2)工程化应用通常利用核酸内切酶的瞬时递送，仅提供酶浓度足以实现断裂的短窗口。3)持续性断裂可是易位的来源。将核酸内切酶偶联至末端加工酶避免持续性断裂的建立，并减少总体染色体重排的发生率，从而提高核酸内切酶诱导的靶向破坏的安全性。4)在单轮突变形成中可实现多重变化(例如用于多等位基因敲除和倍增(multiplexing))，正如本文所述的数据提供证据证明了将核酸内切酶偶联至末端加工酶在它们各自的靶标处将两种给定核酸内切酶的突变率提高了5倍，在同时破坏两种靶标时可实现25倍的提高。
所述系统可进一步包含用于递送至宿主细胞的核酸内切酶、末端加工酶和/或具有核酸内切酶和末端加工活性的融合蛋白。在本文所述系统的一些可选方式中，所述系统可进一步包含可直接提供给细胞的蛋白质(例如具有核酸内切酶和/或末端加工活性的一种或多种多肽)。在一些可选方式中，核酸内切酶、末端加工酶和/或具有核酸内切酶和末端加工活性的融合蛋白在宿主细胞中的表达可由将编码一种或多种核酸内切酶、末端加工酶和/或具有核酸内切酶和末端加工活性的融合蛋白的一种或多种多核苷酸递送至宿主细胞中来产生。在一些可选方式中，一种或多种多核苷酸是DNA表达载体。在一些可选方式中，一种或多种多核苷酸是RNA表达载体。在一些可选方式中，反式剪切、多肽切割和/或多肽连接可参与到细胞中一种或多种蛋白质的表达中。
本文所述的系统和方法可用于产生基因编码序列的靶向破坏以及在一些可选方式中产生基因敲除。由本文所述组合物和方法进行的靶向切割也可用于改变非编码序列(例如，诸如启动子、增强子、起始子、终止子、剪接位点的调控序列)，以改变基因产物的表达水平。这些方法例如可用于生物学研究、用于生物技术应用(如作物修饰(cropmodification))、用于治疗目的、功能基因组学和/或靶标确证研究。
所述系统的一些可选方式与一种或多种位点特异性核酸内切酶和一种或多种末端加工酶的活性偶联。在一些可选方式中，所述核酸内切酶和末端加工酶作为单独的蛋白质与系统一起提供。在一些可选方式中，所述核酸内切酶和末端加工酶在细胞中共表达。如果单独的核酸内切酶和末端加工酶的表达是通过多核苷酸递送进行，那么核酸内切酶和末端加工酶可各自由单独的多核苷酸来编码、或由单个多核苷酸来编码。在一些可选方式中，所述核酸内切酶和末端加工酶由单个多核苷酸来编码并且由单个启动子来表达。在一些可选方式中，核酸内切酶和末端加工酶通过T2A序列进行连接，这允许从一次翻译中产生两种不同的蛋白质。在一些可选方式中，可使用不同的接头序列。在其它可选方式中，单个多核苷酸编码的核酸内切酶和末端加工酶由内部核糖体进入序列(Internal Ribosome EntrySequence，IRES)分隔。
所述系统的几种可选方式包括将所述系统与核酸内切酶和一种或多种DNA末端加工酶进行偶联，所述核酸内切酶选自于由以下核酸内切酶所组成的组：I-Anil、I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-PanII、I-PanMI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-LtrI、I-GpiI、I-GZeI、I-OnuI、I-HjeMI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII；所述DNA末端加工酶选自于由以下DNA末端加工酶所组成的组：Trex2、Trex1、没有跨膜结构域的Trex1、Apollo、Artemis、DNA2、Exol、ExoT、ExoIII、Fen1、Fan1、MreII、Rad2、Rad9、TdT(末端脱氧核苷酸转移酶)、PNKP、RecE、RecJ、RecQ、λ核酸外切酶、Sox、牛痘DNA聚合酶、核酸外切酶I、核酸外切酶III、核酸外切酶VII、NDK1、NDK5、NDK7、NDK8、WRN、T7-核酸外切酶基因6、禽成髓细胞瘤病毒整合蛋白(avian myeloblastosis virus integration protein，IN)、Bloom、Antartic磷酸酶、碱性磷酸酶、多核苷酸激酶(PNK)、ApeI、绿豆核酸酶、Hexl、TTRAP(TDP2)、Sgsl、Sae2、CtIP、Polμ、Polλ、MUS81、EME1、EME2、SLX1、SLX4和UL-12。在一些可选方式中，将归巢核酸内切酶和DNA末端加工酶作为融合蛋白进行提供。在一些可选方式中，将核酸内切酶和DNA末端加工酶作为单独的蛋白质进行提供。在一些可选方式中，所述核酸内切酶和DNA末端加工酶在宿主细胞中共表达。
几种可选方式涉及将本文所述的系统与DNA末端加工酶进行偶联，所述DNA末端加工酶选自于由以下DNA末端加工酶所组成的组：Trex2、Trex1、没有跨膜结构域的Trex1、Apollo、Artemis、DNA2、Exol、ExoT、ExoIII、Fen1、Fan1、MreII、Rad2、Rad9、TdT(末端脱氧核苷酸转移酶)、PNKP、RecE、RecJ、RecQ、λ核酸外切酶、Sox、牛痘DNA聚合酶、核酸外切酶I、核酸外切酶III、核酸外切酶VII、NDK1、NDK5、NDK7、NDK8、WRN、T7-核酸外切酶基因6、禽成髓细胞瘤病毒整合蛋白(IN)、Bloom、Antartic磷酸酶、碱性磷酸酶、多核苷酸激酶(PNK)、ApeI、绿豆核酸酶、Hexl、TTRAP(TDP2)、Sgsl、Sae2、CtIP、Polμ、Polλ、MUS81、EME1、EME2、SLX1、SLX4和UL-12。在所述系统的一些可选方式中，所述末端加工酶作为单独的蛋白质进行提供。在所述系统的一些可选方式中，所述末端加工酶在宿主细胞中共表达。
在一些可选方式中，将一种或多种位点特异性归巢核酸内切酶的活性与一种或多种DNA末端连接酶的活性进行偶联，所述归巢核酸内切酶选自于由以下归巢核酸内切酶所组成的组：I-Anil、I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-PanII、I-PanMI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-LtrI、I-GpiI、I-GZeI、I-OnuI、I-HjeMI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII；所述DNA末端连接酶选自于由以下DNA末端连接酶所组成的组：Artemis、Trex1、Flap核酸内切酶、末端脱氧核苷酸转移酶、Trex2、牛痘DNA聚合酶、Mrell、核酸外切酶I、核酸外切酶III、NDK1、NDK5、NDK7、NDK8和WRN。在一些可选方式中，将所述归巢核酸内切酶和DNA末端加工酶作为融合蛋白进行提供。在一些可选方式中，将所述核酸内切酶和DNA末端加工酶作为单独的蛋白质进行提供。在一些可选方式中，所述核酸内切酶和DNA末端加工酶在宿主细胞中共表达。
所述系统的几个可选方式进一步包含异源融合蛋白，所述融合蛋白包含核酸内切酶结构域和末端加工结构域或者它们的一个或多个部分。几种可选方式涉及编码具有核酸内切酶和末端加工活性的融合蛋白的异源融合构建体。本发明的可选方式还涉及进一步包含异源融合构建体的系统和方法；以及用于制备具有核酸内切酶和末端加工活性的融合蛋白的方法及其组合物。在一个可选方式中，通过重组手段将核酸内切酶结构域偶联至末端加工结构域(例如，通过翻译核酸产生融合蛋白，在所述核酸中，编码核酸内切酶的全部或者一个或多个部分的多核苷酸与编码末端加工酶的全部或者一个或多个部分的多核苷酸框内连接(joined in-frame))。在其它可选方式中，融合蛋白的核酸内切酶结构域和末端加工结构域以化学方式连接。这种化学连接可通过例如使用双功能接头分子(如BS3(二[磺基琥珀酰亚胺]辛二酸酯))进行。
所述系统的一些可选方式进一步包含含有核酸内切酶结构域和核酸外切酶结构域的蛋白质，其中将所述蛋白质作为蛋白质(包含核酸内切酶结构域和核酸外切酶结构域作为融合蛋白)或编码该蛋白质的载体或核酸进行提供。在一些可选方式中，所述融合蛋白包含归巢核酸内切酶的至少一个片段或变异体和核酸外切酶(例如3'核酸外切酶)的至少一个片段或变异体，它们通过遗传接合或化学接合彼此连接。在几种可选方式中，所述3'核酸外切酶是Trex2的单体、二聚体或其变异体。在其它可选方式中，所述融合蛋白包含锌指核酸内切酶的至少一个片段或变异体和5'核酸外切酶的至少一个片段或变异体，它们通过遗传融合或化学接合彼此连接。一旦成为融合蛋白的一部分，所述核酸内切酶和核酸外切酶可称为所述核酸内切酶/核酸外切酶融合蛋白的“一部分(portion)”、“区域”、“结构域”或“部分(moiety)”。在一些可选方式中，所述核酸外切酶结构域包含Trex或其一个或多个部分。
核酸内切酶/末端加工酶融合蛋白可任选地在核酸内切酶结构域和末端加工酶结构域之间包含接头肽，以在部分与部分之间提供更大的物理分隔，从而使核酸内切酶部分的可及性(例如用于结合至其靶序列)最大化。所述接头肽可由根据相关功能进行选择以使其更加地柔性或更加地刚性的氨基酸组成。所述接头序列可被蛋白酶切割或化学切割以获得单独的核酸内切酶部分和末端加工酶部分。接头中的酶切位点的实例包括蛋白水解酶(如肠激酶、因子Xa、胰蛋白酶、胶原酶和凝血酶)的切割位点。在一些可选方式中，所述蛋白酶是一种由宿主天然产生的或者外源导入的蛋白酶。或者，接头中的切割位点可为当暴露于选定化学条件(例如溴化氰、羟胺或低pH)时能够被切割的位点。任选的接头序列可用于除提供切割位点以外的目的。所述接头序列应当允许核酸内切酶部分相对于末端加工酶部分有效定位，从而使得核酸内切酶结构域可识别并切割其靶序列，并且末端加工结构域可修饰暴露在切割位点处的DNA末端。所述接头也可为简单的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有足够的长度来避免核酸内切酶结构域和末端加工结构域之间的任何空间位阻。另外，所述接头序列可提供用于翻译后修饰，包括但不限于：例如磷酸化位点、生物素化位点、硫酸化位点、γ-羧基化位点等。在一些可选方式中，所述系统可进一步包含与核酸内切酶/末端加工蛋白融合。
在一些可选方式中，所述接头序列包含4个氨基酸至30个氨基酸、更优选8个氨基酸至22个氨基酸。换言之，所述接头序列可为从4到30的任何数目的氨基酸，例如为至少或等于4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个氨基酸或者在由上述任何两个长度所限定的范围内的长度。在一些可选方式中，所述接头序列是柔性的，从而不会将生物活性肽约束在一个不受期望的构象中。所述接头可主要由具有小侧链的氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸)组成，以提供柔性。在一些可选方式中，约80％或90％或更多的接头序列包含甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基，尤其是甘氨酸和丝氨酸残基。在几种可选方式中，G4S接头肽将融合蛋白的末端加工结构域和核酸内切酶结构域分隔。在其它可选方式中，T2A接头序列允许从一次翻译中产生两种不同的蛋白质。可凭经验容易地鉴定出合适的接头序列。另外，也可通过常规计算机建模技术来确定接头序列的合适大小和序列。
融合蛋白在细胞中的表达可由将融合蛋白递送至细胞或通过将编码融合蛋白的多核苷酸递送至细胞而产生，其中所述多核苷酸进行转录，然后转录物进行翻译以产生融合蛋白。反式剪切、多肽切割和多肽连接也可参与细胞中的蛋白质表达。用于将多核苷酸和多肽递送至细胞的方法在本领域中是公知的。
可构建编码本文所述的核酸内切酶、末端加工酶和融合蛋白的各种DNA分子来将选定的蛋白质或肽提供至细胞。正如本领域已知的，编码核酸内切酶、末端加工酶和融合蛋白的DNA分子可经过修饰而含有不同的密码子，从而优化在选定的宿主细胞中的表达。
可构建编码本文所述的核酸内切酶、末端加工酶和融合蛋白的各种RNA分子来将选定的蛋白质或肽提供至细胞。正如本领域已知的，编码核酸内切酶、末端加工酶和融合蛋白的RNA分子可经过修饰而含有不同的密码子，从而优化在选定的宿主细胞中的表达。在一些可选方式中，所述RNA可包含poly(A)尾，所述poly(A)尾具有50个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个共价连接的腺苷残基，或者具有由上述任何两个值所限定的范围内的残基量。
所述系统的几种可选方式进一步包含用于同时表达位点特异性核酸内切酶和末端加工酶的载体或核酸，从而将靶向基因破坏的效率提高多达约70倍，基本上在少于72小时的时间内在100％的含有靶位点的细胞群中将突变结果固定。
在所述系统的一些可选方式中，提供了额外的载体或核酸，用于通过直接使细胞与蛋白质接触或通过来自表达构建体的瞬时表达来将有效量的核酸内切酶和末端加工酶或有效量的融合蛋白递送至细胞。在所述系统的这些可选方式中，其中所述系统被递送至细胞，在几次细胞分裂中，细胞分裂将核酸酶的浓度降低到低于活性的水平(sub-activelevels)。
本文提供的系统和方法的几种可选方式进一步提供了融合蛋白，所述融合蛋白通过将末端加工酶结构域物理连接至位点特异性DNA结合结构域而赋予DNA末端加工酶位点特异性。在一些可选方式中，所述末端加工酶结构域通过接头肽连接到DNA结合结构域。所述接头肽的组成和结构没有特别的限制，在一些可选方式中，所述接头是可化学切割的或酶切割的。所述接头肽可为柔性的或刚性的并且可包含约4个氨基酸至30个氨基酸。在其它可选方式中，所述末端加工酶结构域化学融合至DNA结合结构域。不希望受特定理论所束缚，与未连接的末端加工酶相比，通过将末端加工酶连接到位点特异性DNA结合结构域而赋予末端加工酶位点特异性降低了与无差别的(indiscriminate)末端加工活性(例如核酸外切酶活性)相关的毒性，并且减少了有效修饰由核酸内切酶活性引起的暴露的双链DNA断裂所需要的末端加工酶的有效量。在一些可选方式中，所述末端加工酶连接至归巢核酸内切酶。在其它可选方式中，所述末端加工酶连接至锌指核酸内切酶。在一些可选方式中，末端加工酶结构域连接至与临近归巢核酸内切酶或锌指核酸内切酶的切割位点的DNA序列结合的锌指DNA结合结构域。
为了在与本文提供的系统进行偶联时有效地促进基因敲除，所述系统和方法的几种可选方式涉及将CRISPR/Cas9系统的活性与一种或多种位点特异性核酸内切酶和Trex2进行偶联。Trex2可作为单体或二聚体进行提供。Trex2酶特异性地水解暴露在3'垂悬端处的磷酸二酯键。归巢核酸内切酶可产生易受Trex2核酸外切酶的活性影响的3'垂悬端，而利用Fok1切割结构域的锌指核酸酶产生具有5'垂悬端的双链DNA断裂。归巢核酸内切酶和锌指核酸酶以基线率(baseline rate)在其切割位点处产生突变。Trex2与归巢核酸内切酶的共表达将突变率增加了约70倍。观察到Trex2与锌指核酸内切酶的共表达也影响突变率。所述方法的一些可选方式涉及提供本文所述的系统，带有核酸外切酶Trex2的共表达。
如本文使用的，Ad5腺病毒蛋白和Ad5病毒蛋白或Ad5蛋白是指由腺病毒血清型5编码的蛋白质。非限制性实例包括E4ORF6和E1B55K。野生型E1B55K蛋白的可选方式的蛋白质序列示于图17(SEQ ID NO：1)中。野生型E4ORF6蛋白的可选方式的蛋白质序列示于图19(SEQ ID NO：3)中。在一些可选方式中，使用Ad5蛋白的突变形式。非限制性实例包括E1B55K的H373A突变体和E1B55K的H354突变体。在一些可选方式中，Ad5是指两种以上Ad5病毒蛋白的组合。在一些可选方式中，Ad5是指两种以上野生型Ad5病毒蛋白的组合。在一些可选方式中，Ad5是指其中至少一种为野生型形式的两种以上Ad5病毒蛋白的组合。在一些可选方式中，Ad5是指其中至少一种为突变形式的两种以上Ad5病毒蛋白的组合。在一些可选方式中，Ad5wt是指一种或多种野生型Ad5病毒蛋白。在一些可选方式中，Ad5MRN-是指一种或多种不使MRN复合物失效的突变Ad5病毒蛋白。在一些可选方式中，至少一种Ad5病毒蛋白与核酸酶联合使用，或者不与核酸酶联合使用。在一些可选方式中，所述核酸酶是核酸内切酶。在一些可选方式中，所述核酸内切酶是Cas9、其衍生物或其片段。在一些可选方式中，所述核酸酶是核酸外切酶。在一些可选方式中，所述核酸外切酶是Trex2。在一些可选方式中，至少一种Ad5病毒蛋白与多于一种核酸酶联合使用。在一些可选方式中，至少一种Ad5病毒蛋白与Cas9、其衍生物或其片段和Trex2联合使用。
表达载体
表达构建体可使用本领域已知的方法容易地设计。核酸表达载体的实例包括但不限于：重组病毒、慢病毒、腺病毒、质粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、人类人工染色体、微环DNA、游离基因(episomes)、cDNA、RNA以及PCR产物。在一些可选方式中，核酸表达载体编码单个肽(例如核酸内切酶、末端加工酶或具有核酸内切酶和末端加工活性的融合蛋白)。在一些可选方式中，核酸表达载体在单个多顺反子表达盒中编码一种或多种核酸内切酶和一种或多种末端加工酶。在所述系统的一些可选方式中，提供了一种或多种核酸内切酶和一种或多种末端加工酶，其中它们通过2A肽序列或“自动切割(autocleavage)”序列或自切割序列彼此连接。在一些可选方式中，所述核酸表达载体是DNA表达载体。在一些可选方式中，所述核酸表达载体是RNA表达载体。在一些可选方式中，所述表达载体是病毒载体。在本文提供的系统的一些可选方式中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。
在一些可选方式中，核酸表达载体进一步包含一个或多个选择标记，所述选择标记有助于鉴定或选择已接受并表达核酸内切酶、末端加工酶和/或具有核酸内切酶和末端加工活性的融合蛋白以及该选择标记的宿主细胞。选择标记的实例包括但不限于：编码荧光蛋白(例如EGFP、DS-Red、YFP和CFP)的基因、编码赋予对选择剂的抗性的蛋白质的基因(例如PuroR基因、ZeoR基因、HygroR基因、neoR基因和杀稻瘟菌素(blasticidin)抗性基因)。在一些情况下，所述选择标记包含荧光报告子和选择标记。
在一些可选方式中，DNA表达载体包含启动子，所述启动子能够驱动一种或多种核酸内切酶、末端加工酶和/或具有核酸内切酶和末端加工活性的融合蛋白的表达。启动子的实例包括但不限于：逆转录病毒LTR元件；组成型启动子，如CMV、HSV1-TK、SV40、EF-1α、β-肌动蛋白；诱导型启动子，如那些含有Tet-操纵子元件的启动子；以及组织特异型启动子。合适的细菌和真核生物启动子是本领域公知的并且公开于例如Sambrook等，MolecularCloning,A Laboratory Manual(第2版2001)；Kriegler，Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(1990)；以及Current Protocols in Molecular Biology(2010)中，以引用的方式将所述参考文献整体并入本文。植物启动子的非限制性实例包括来源于拟南芥(A.thaliana)泛素3(ubiquitin-3，ubi-3)的启动子序列。
在一些可选方式中，将编码一种或多种核酸内切酶、末端加工酶和/或具有核酸内切酶和末端加工活性或核酸外切酶活性的融合蛋白的核酸克隆到载体中，用于与本文提供的系统的载体和核酸一起转化到真核细胞中。在一些可选方式中，将编码不同核酸内切酶和末端加工酶的核酸克隆到同一载体中。在这些情况下，编码不同核酸内切酶和末端加工酶的核酸可任选地被T2A、自切割序列、蛋白酶切割位点或IRES序列分隔。载体可为原核载体(例如质粒、或穿梭载体)、昆虫载体或真核载体(包括本文所述的植物载体)。核酸酶和融合蛋白的表达可在组成型启动子或诱导型启动子的控制下进行。在一些可选方式中，所述载体包含编码Cas9、其衍生物或其片段的核酸序列。在一些可选方式中，所述载体包含编码Trex的核酸序列。在一些可选方式中，载体中的基因和/或核酸经密码子优化以在哺乳动物细胞(例如人类细胞)中表达。在一些可选方式中，所述载体是mRNA。在一些可选方式中，所述载体是编码Cas9蛋白、其衍生物或其片段的mRNA。在一些可选方式中，编码Cas9蛋白、其衍生物或其片段的所述核酸经密码子优化以在真核细胞(例如人类细胞)中表达。在一些可选方式中，所述Cas9蛋白、其衍生物或其片段来自于酿脓链球菌或是由来自其它生物体的其它Cas9蛋白制成的共有序列。
可使用本文所述的或本领域技术人员已知的用于递送核酸或蛋白质的任何合适的方法将具有核酸内切酶和/或末端加工活性的多肽和/或编码具有核酸内切酶和/或末端加工活性的多肽的多核苷酸导入宿主细胞中。本文所述的多肽和多核苷酸可体外递送至培养细胞以及原位递送至组织和整个生物体内。将本发明可选方式的多肽和多核苷酸导入宿主细胞可通过化学方法、生物学方法或机械方法实现。这可包括但不限于：电穿孔、声致穿孔、使用基因枪、脂质体转染、磷酸钙转染、使用树枝状聚合物(dendrimer)、显微注射、聚凝胺、原生质体融合、使用病毒载体(包括腺病毒载体、AAV载体和逆转录病毒载体)以及II型核酶。
针对AAV载体的免疫应答
腺相关病毒(AAV)载体被广泛用于基于基因疗法的遗传疾病治疗中。然而，针对AAV载体的免疫应答的产生会危害载体的治疗功效。类似地，针对在基于CRISPR/Cas9(或基于一种或多种其它核酸酶)的基因组编辑中使用的AAV载体的免疫应答的产生会危害基因靶向的功效。
在一些可选方式中，在考虑之列的是在基于CRISPR/Cas9(和/或基于一种或多种其它核酸酶)的基因组编辑中使用的AAV载体将具有降低的免疫原性。在一些可选方式中，在考虑之列的是在基于CRISPR/Cas9(和/或基于一种或多种其它核酸酶)的基因组编辑中使用的AAV载体将不具有免疫原性。在一些可选方式中，由于免疫原性降低，对AAV载体产生抗性的可能性将是最小的。在一些可选方式中，由于缺乏免疫原性，对AAV载体产生抗性的可能性将不存在。
生物体
本文所述的可选方式适用于任何期望进行基因编辑的真核生物。真核生物的实例包括但不限于：藻类、植物、动物(例如哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、灵长类动物、猪、牛、羊、兔、狗、猫或马等)、鱼类和昆虫。在一些可选方式中，来自生物体的分离的细胞进行如本文所述的遗传修饰。在一些可选方式中，修饰的细胞发育成繁殖成熟的生物体。可使用真核(例如，藻类、酵母、植物、真菌、鱼类、禽类和哺乳动物细胞)细胞。也可使用来自含有一种或多种其它遗传修饰的生物体的细胞。
哺乳动物细胞的实例包括目标生物体的任何细胞或细胞系，例如：卵母细胞、体细胞、K562细胞、CHO(中国仓鼠卵巢)细胞、HEP-G2细胞、BaF-3细胞、Schneider细胞、COS细胞(表达SV40T-抗原的猴肾细胞)、CV-1细胞、HuTu80细胞、NTERA2细胞、NB4细胞、HL-60细胞和HeLa细胞、293细胞和骨髓瘤细胞(如SP2或NS0)。也可使用外周血单核细胞(PBMC)或T细胞，同样还可使用胚胎干细胞和成体干细胞。例如，可使用的干细胞包括：胚胎干细胞(ES)、诱导多能干细胞(iPSC)、间充质干细胞、造血干细胞、肌肉干细胞、皮肤干细胞、脂肪来源干细胞和神经元干细胞。在一些可选方式中，提供了用于编辑细胞中至少一个靶基因的系统，其中所述系统包含编码CRISPR向导RNA的第一核酸序列，其中所述CRISPR向导RNA与细胞中至少一个靶基因互补，并且其中所述第一核酸序列存在于载体中，其中所述系统还包含编码Cas9蛋白、其衍生物或其片段的第二核酸序列；编码第一腺病毒蛋白的第三核酸序列；以及编码第二腺病毒蛋白的第四核酸序列。在一些可选方式中，所述细胞是真核细胞。在一些可选方式中，所述细胞是哺乳动物细胞(例如人类细胞)。在一些可选方式中，所述细胞是原代细胞。在一些可选方式中，所述细胞不是转化细胞。在一些可选方式中，所述细胞是原代淋巴细胞、CD34+干细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、神经胶质细胞、肌肉细胞或肠细胞。
靶标植物和植物细胞的实例包括但不限于：单子叶植物和双子叶植物，例如农作物(包括粮食作物(例如小麦、玉米、大米、小米、大麦)、水果作物(例如番茄、苹果、梨、草莓、桔子)、饲料作物(例如苜蓿)、根菜作物(例如胡萝卜、马铃薯、甜菜、山药)、叶菜作物(例如生菜、菠菜))；开花植物(例如矮牵牛、玫瑰、菊花)、针叶树(conifers)和松树(例如松杉(pine fir)、云杉)；植物修复中使用的植物(例如重金属累积植物)；油料作物(例如向日葵、油菜籽)；和用于实验目的的植物(例如拟南芥)。因此，所公开的方法和组合物可用于大范围的植物中，包括但不限于来自以下属的物种：芦笋属、燕麦属、芸苔属、柑橘属、西瓜属、辣椒属、南瓜属、胡萝卜属、飞蓬属(Erigeron)、大豆属(Glycine)、棉花属(Gossypium)、大麦属、莴苣属、黑麦草属(Lolium)、番茄属、苹果属、木薯属、烟草属、诸葛菜属、稻属、鳄梨属、菜豆属、豌豆属、梨属、李属、萝卜属、黑麦属、茄属、高粱属、小麦属、葡萄属、豇豆属以及玉蜀黍属(Zea)。术语植物细胞包括分离的植物细胞以及整个植物或整个植物的一个或多个部分(例如种子、愈伤组织、叶、根等)。本公开还涵盖了本文所述的植物的种子。本公开进一步涵盖了所述植物的后代、克隆、细胞系或细胞。
产生纯合(Homozygously)修饰的生物体
使细胞表达并测定位点特异性切割，所述细胞中的系统设置有编码与一种或多种融合蛋白(包含核酸内切酶和末端加工活性)共表达的核酸内切酶的一个或多个载体或核酸。可使用本领域技术人员已知的任何合适的方法来鉴定这类修饰的细胞，包括测序、PCR分析、Southern印迹等。在一些可选方式中，通过PCR产生跨核酸内切酶靶位点的扩增子。药物组合物和给予
由本文提供的系统或方法制造的细胞可直接给予患者，用于靶向切割DNA序列以及用于治疗性或预防性应用，例如用于治疗、抑制或改善癌症、局部缺血、糖尿病视网膜病变、黄斑变性、类风湿性关节炎、银屑病、HIV感染、镰状细胞性贫血、Alzheimer病、肌营养不良、神经退行性疾病、血管疾病、囊性纤维化、中风、高IGE综合征或血友病。在一些可选方式中，通过本文提供的系统制造细胞。在一些可选方式中，提供了编辑细胞中至少一个靶基因的方法，其中所述方法包括：将包含编码CRISPR向导RNA的第一核酸序列的第一载体导入细胞中，其中所述CRISPR向导RNA与所述细胞中至少一个靶基因互补；将编码Cas9蛋白、其衍生物或其片段的第二核酸序列导入所述细胞中；将编码第一腺病毒蛋白的第三核酸序列导入所述细胞中；以及将编码第二腺病毒蛋白的第四核酸序列导入所述细胞中。在一些可选方式中，提供了细胞，其中所述细胞通过所述方法制造。在一些可选方式中，提供了组合物，其中所述组合物包含所述细胞。在一些可选方式中，本文所述的组合物可用于治疗、预防、改善或抑制疾病(例如癌症、局部缺血、糖尿病视网膜病变、黄斑变性、类风湿性关节炎、银屑病、HIV感染、镰状细胞性贫血、Alzheimer病、肌营养不良、神经退行性疾病、血管疾病、囊性纤维化、中风、高IGE综合征、血友病)或改善与疾病(例如癌症、局部缺血、糖尿病视网膜病变、黄斑变性、类风湿性关节炎、银屑病、HIV感染、镰状细胞性贫血、Alzheimer病、肌营养不良、神经退行性疾病、血管疾病、囊性纤维化、中风、高IGE综合征、或血友病)相关的疾病状况或症状的方法中。在一些可选方式中，给予所述细胞或组合物以治疗、预防、改善或抑制常染色体显性疾病(例如软骨发育不全、假性软骨发育不全、多发性骨骺发育不良、软骨发育不良、成骨不全症、Marfan综合征、多指畸形、遗传性运动感觉神经病I和II(Charcot-Marie-Tooth病)、肌强直性营养不良、以及神经纤维瘤病)或改善与常染色体显性疾病(例如软骨发育不全、假性软骨发育不全、多发性骨骺发育不良、软骨发育不良、成骨不全症、Marfan综合征、多指畸形、遗传性运动感觉神经病I和II(Charcot-Marie-Tooth病)、肌强直性营养不良、和/或神经纤维瘤病)相关的疾病状况或症状。在一些可选方式中，给予本文提供的细胞或组合物以治疗、预防、改善或抑制由基因失调引起的疾病。在一些可选方式中，给予本文提供的细胞或组合物以治疗、预防、改善或抑制癌症(例如BCL-2、Bcl-XI和FLIP)或改善与癌症(例如BCL-2、Bcl-XI和FLIP)相关的疾病状况或症状。
包含所述细胞的组合物以任何合适的方式进行给予，在一些可选方式中，与药学上可接受的载体一起给予。给予此类蛋白质或多核苷酸的合适方法是可获得的并且是本领域技术人员所熟知的，而且，尽管可使用超过一种的途径来给予特定组合物，但是特定途径通常可比另一种途径提供更直接且更有效的反应。
药学上可接受的载体由给予的特定组合物以及用于给予组合物的特定方法来部分地确定。因此，可获得各种各样的药物组合物的合适制剂(参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences)。
适合肠胃外给予(例如，诸如通过静脉内途径、肌肉内途径、真皮内途径和皮下途径)的制剂包括水性的和非水性的等渗无菌注射溶液(可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预定接受者的血液等渗的溶质)以及水性的和非水性的无菌混悬剂(可包含助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂)。所公开的组合物可例如通过静脉内输注、口服、局部、腹膜内、膀胱内或鞘内进行给予。可将化合物的制剂提供在单位剂量或多剂量的密封容器(如安瓿和小瓶)中。注射溶液和混悬剂可由前述种类的无菌粉剂、颗粒剂和片剂来制备。
在一些可选方式中，在考虑之列的是以下给予途径中的一种或多种：肠胃外给予途径、皮下给予途径、关节内给予途径、支气管内给予途径、腹腔内给予途径、囊内给予途径、软骨内给予途径、腔内给予途径、体腔内给予途径、小脑内给予途径、脑室内给予途径、结肠内(intracolic)给予途径、宫颈内给予途径、胃内给予途径、肝内给予途径、心肌内给予途径、骨内给予途径、骨盆内给予途径、心包内给予途径、腹膜内给予途径、胸膜内给予途径、前列腺内给予途径、肺内给予途径、直肠内给予途径、肾内给予途径、视网膜内给予途径、椎管内(intraspinal)给予途径、滑膜内给予途径、胸内给予途径、宫内给予途径、膀胱内给予途径、病灶内给予途径、推注(bolus)、阴道给予途径、直肠给予途径、口腔给予途径、舌下给予途径、鼻内给予途径或经皮给予途径。在一些实施方式中，待给予的组合物可被配制成由一种或多种上述途径进行递送。其它可选方式
RNA引导的核酸内切酶(RNA-guided endonuclease，RGEN)技术对实现靶基因组基因座的有效编辑而言具有很大希望。在一些可选方式中，对将酿脓链球菌Cas9用于在原代人类细胞(例如原代人类T细胞)中进行基因编辑的应用进行了评估，该应用使用mRNA介导第一代spCas9的递送并使用腺相关病毒(AAV)驱动向导RNA的表达。在一些可选方式中，spCas9介导的编辑在TCRα基因座处实现了高达30％的靶向基因破坏率，该编辑使用mRNA介导第一代spCas9的递送并使用腺相关病毒(AAV)驱动向导RNA的表达。在一些可选方式中，在不同Cas9 mRNA剂量下在一定范围的AAV MOI下对编辑效率的剂量应答的评估提供证据证明了编辑效率主要受AAV驱动的向导RNA表达的限制。在一些可选方式中，对旨在获得更高编辑效率的几种手段进行的评估导致开发出在选定细胞群中在降低的AAV MOI下实现了高达90％的TCRα破坏的手段。在一些可选方式中，所述结果提供证据证明了Cas9-mRNA/AAV-向导手段可应用于在原代人类T细胞中有效地破坏多个不同基因，并且产生了使得CRISPR/Cas9技术的效率提高的创新方法。
CRISPR/Cas9系统的基本组分包括靶基因、原型间隔区邻近基序(protospaceradjacent motif，PAM)、向导RNA、Cas9核酸内切酶。应用CRISPR/Cas9进行基因编辑的重要方面在于需要有效地将向导RNA递送至各种各样的细胞类型中的系统。这可能例如涉及作为核酸来递送体外产生的向导RNA(由体外转录或化学合成产生的向导RNA)。在一些可选方式中，可通过掺入修饰的碱基而向核酸赋予核酸酶抗性。由于腺相关病毒(AAV)载体能够转导范围广泛的原代细胞，因此用于表达向导RNA的重要系统基于AAV载体的使用。AAV载体不会引起感染，也不会整合到基因组中。因此，使用AAV载体具有既安全又有效的益处。
在一些可选方式中，将AAV载体用于递送CRISPR/Cas9系统的一种或多种组分以进行基因编辑。在一些可选方式中，将AAV载体用于递送CRISPR/Cas9系统的一种或多种组分以在原代细胞中进行基因编辑。在一些可选方式中，将AAV载体用于递送CRISPR向导RNA以进行基因编辑。在一些可选方式中，将AAV载体用于递送CRISPR向导RNA以在原代细胞中进行基因编辑。在一些可选方式中，原代细胞是直接来源于宿主供体的细胞，其不会发生转化或癌变，而且其不能在宿主外无限繁殖。
在许多细胞类型中存在对AAV载体的进入后限制或递送后限制。这使得AAV介导的转基因(包括向导RNA)的表达效率非常低，因此大大地损害了AAV载体用于此目的的效用。某些腺病毒蛋白促进AAV和AAV载体的表达和复制。具体而言，在一些可选方式中，将E4ORF6和E1B55K作为辅助蛋白用于AAV载体的制备中和/或作为辅助蛋白用于编码向导RNA的AAV载体的复制中。
前期工作表明，野生型E1B55K蛋白或野生型E4ORF6蛋白可使参与DNA修复的重要蛋白质复合物(称为MRN复合物)失效。由于缺乏DNA断裂的修复，这会导致细胞周期停滞和高毒性。另一方面，已经认识到E1B55K的H373A突变体和E1B55K的H354突变体都不会使MRN复合物失效。当使用ad蛋白的突变体形式用于细胞中的AAV复制时，这使得DNA修复机器保持完整，并且提供提高的安全性和功效。因此，在一些可选方式中，野生型E1B55K与E1B55K蛋白的H373A突变体联合使用。在一些可选方式中，野生型E4ORF6与E1B55K蛋白的H354突变体联合使用。在一些可选方式中，联合使用野生型E4ORF6与E1B55K蛋白的H373A突变体不会使MRN复合物失效。在一些可选方式中，联合使用野生型E4ORF6与E1B55K蛋白的H354突变体不会使MRN复合物失效。在一些可选方式中，联合使用野生型E4ORF6与E1B55K蛋白的H373A突变体不会导致细胞周期停滞。在一些可选方式中，联合使用野生型E4ORF6与E1B55K蛋白的H354突变体不会导致细胞周期停滞。在一些可选方式中，联合使用野生型E4ORF6与E1B55K蛋白的H373A突变体不会导致由于缺乏DNA断裂的修复而产生毒性。在一些可选方式中，联合使用野生型E4ORF6与E1B55K蛋白的H354突变体不会导致由于缺乏DNA断裂的修复而产生毒性。
在一些可选方式中，与野生型腺病毒蛋白相比，使用突变型腺病毒蛋白进行AAV转导使得原代细胞的转导效率较低。然而，使用突变型腺病毒蛋白使得基于CRISPR/Cas9的基因编辑显著增强。在一些可选方式中，这可能是由于来自AAV载体的gRNA的表达增加。在一些可选方式中，这可能是由于调节细胞的DNA修复环境来促进由CRISPR产生的双链断裂的致突变修复。在一些可选方式中，这可能是由于来自AAV载体的gRNA的表达增加以及调节细胞的DNA修复环境来促进由CRISPR产生的双链断裂的致突变修复这两方面原因。
在一些可选方式中，E4ORF6和突变型E1B55K-H373A的表达导致在充分解除对AAV表达的进入后限制的同时保持完整的DNA修复。在一些可选方式中，E4ORF6和突变型E1B55K-H354的表达导致在充分解除对AAV表达的进入后限制的同时保持完整的DNA修复。在一些可选方式中，E4ORF6和E1B55K-H373A的表达使得基因编辑效率大幅提高。在一些可选方式中，E4ORF6和E1B55K-H354的表达使得基因编辑效率大幅提高。在一些可选方式中，E4ORF6和E1B55K-H373A的表达使得CRISPR/Cas9介导的基因编辑效率大幅提高。在一些可选方式中，E4ORF6和E1B55K-H354的表达使得CRISPR/Cas9介导的基因编辑效率大幅提高。在一些可选方式中，E4ORF6和E1B55K-H373A的表达使得原代细胞中的基因编辑效率大幅提高。在一些可选方式中，E4ORF6和E1B55K-H354的表达使得原代细胞中的基因编辑效率大幅提高。在一些可选方式中，E4ORF6和E1B55K-H373A的表达使得原代细胞中CRISPR/Cas9介导的基因编辑效率大幅提高。在一些可选方式中，E4ORF6和E1B55K-H354的表达使得原代细胞中CRISPR/Cas9介导的基因编辑效率大幅提高。
在一些可选方式中，提供了使用AAV-mRNA分离系统(split system)手段将CRISPR/Cas9导入原代细胞中的系统。在所述分离系统的一些可选方式中，Cas9、其衍生物或其片段和腺病毒蛋白由mRNA表达并且是瞬时表达，而且gRNA不断地表达并且是由AAV表达。在一些可选方式中，所述分离系统增加了原代人类细胞中的基因编辑效率。
一些可选方式涉及使用AAV载体将CRISPR向导RNA导入原代细胞中的方法。更多可选方式涉及将由mRNA编码的Cas9、其衍生物或其片段导入原代细胞中的方法。在一些可选方式中，提供了将由mRNA编码为融合蛋白的Cas9、其衍生物或其片段导入原代细胞中的方法。在一些可选方式中，Cas9在C末端与荧光团融合。在一些可选方式中，Cas9、其衍生物或其片段在N末端与荧光团融合。在一些可选方式中，Cas9、其衍生物或其片段与荧光团融合，并且Cas9、其衍生物或其片段和荧光团由自切割序列(例如T2A序列)分隔。在一些可选方式中，将Cas9、其衍生物或其片段融合至NLS。在一些可选方式中，NLS融合在Cas9、其衍生物或其片段的N末端。在一些可选方式中，NLS融合在Cas9、其衍生物或其片段的C末端。在一些可选方式中，NLS融合在Cas9、其衍生物或其片段的N末端和C末端这两端。在一些可选方式中，Cas9、其衍生物或其片段用mCherry荧光团进行标记。
在一些可选方式中，所述mRNA包含poly A尾。在一些可选方式中，所述poly A尾赋予mRNA稳定性。在一些可选方式中，poly A尾的长度大于或等于100个、125个、150个、175个、200个、225个、250个、275个、300个、325个、350个、375个、400个、425个、450个、475个或500个碱基对，或者是由上述任何两个长度限定的范围内的长度。在一些可选方式中，所述mRNA由载体进行编码。在一些可选方式中，所述mRNA由载体通过体外转录进行表达。在一些可选方式中，所述mRNA编码核酸酶、解旋酶和/或腺病毒蛋白。在一些可选方式中，所述mRNA编码Cas9、其衍生物或其片段。在一些可选方式中，所述mRNA编码MegaTAL或TALEN。在一些可选方式中，所述mRNA编码E4ORF6。在一些可选方式中，所述mRNA编码E1B55K。在一些可选方式中，所述mRNA编码H373A E1B55K。在一些可选方式中，所述mRNA编码H354E1B55K。在一些可选方式中，所述mRNA编码Trex2。
在一些可选方式中，期望Cas9蛋白伴随腺病毒蛋白的表达。具有长度大于或等于100个、125个、150个、175个、200个、225个、250个、275个、300个、325个、350个、375个、400个、425个、450个、475个或500个碱基对或者是由上述任何两个长度限定的范围内的长度的poly A尾的mRNA(其中所述mRNA编码Cas9、其衍生物或其片段；TALEN；或MegaTAL)可在原代人类细胞中有效地进行共表达。在一些可选方式中，将所述mRNA用于表达Cas9、其衍生物或其片段。在一些可选方式中，将所述mRNA用于表达野生型腺病毒蛋白。在一些可选方式中，将所述mRNA用于表达突变型腺病毒蛋白。在一些可选方式中，将AAV用于表达向导RNA。一些可选方式涉及将由mRNA编码的腺病毒蛋白导入原代细胞中的方法。在一些可选方式中，使用mRNA来导入野生型腺病毒蛋白E4ORF6。在一些可选方式中，使用mRNA来导入突变型腺病毒蛋白H373A E1B55K。在一些可选方式中，使用mRNA来导入突变型腺病毒蛋白H354E1B55K。在一些可选方式中，使用不同的mRNA来导入野生型E4ORF6和突变型H373A E1B55K这两者。在一些可选方式中，使用不同的mRNA来导入野生型E4ORF6和突变型H354E1B55K这两者。在一些可选方式中，所述mRNA在载体上。在一些可选方式中，将具有向导RNA的AVV和编码Cas9、其衍生物或其片段以及E4ORF6和突变体H373A E1B55K的mRNA或者具有向导RNA的AAV和编码Cas9、E4ORF6和突变体H354E1B55K的mRNA同时导入。在一些可选方式中，将具有向导RNA的AVV和编码Cas9、其衍生物或其片段以及E4ORF6和突变体H373A E1B55K的mRNA或者具有向导RNA的AAV和编码Cas9、E4ORF6和突变体H354E1B55K的mRNA依次导入。在一些可选方式中，具有向导RNA的AVV和编码Cas9、其衍生物或其片段以及E4ORF6和突变体H373AE1B55K的mRNA或者具有向导RNA的AAV和编码Cas9、E4ORF6和H354E1B55K的mRNA同时存在于细胞中。在一些可选方式中，使用mRNA来瞬时表达野生型腺病毒蛋白。在一些可选方式中，使用mRNA来瞬时表达突变型腺病毒蛋白。在一些可选方式中，使用mRNA来同时但瞬时表达Cas9、其衍生物或其片段；野生型腺病毒蛋白；和突变型腺病毒蛋白。在一些可选方式中，向导RNA易于降解。在一些可选方式中，因此使用AAV来不断表达向导RNA。在一些可选方式中，具有向导RNA的AVV和编码Cas9、其衍生物或其片段以及E4ORF6和突变体H373A E1B55K的mRNA或者具有向导RNA的AAV和编码Cas9以及E4ORF6和H354E1B55K的mRNA是瞬时存在的。在一些可选方式中，具有向导RNA的AVV和编码Cas9、其衍生物或其片段、E4ORF6和突变体H373A E1B55K的mRNA或者具有向导RNA的AAV和编码Cas9、E4ORF6和H354E1B55K的mRNA不是永久性存在的。
在一些可选方式中，使Cas9、其衍生物或其片段与E4ORF6/E1B55K-H373A共表达导致在充分解除对AAV表达的进入后限制的同时维持完整的DNA修复。当同时使用AAV载体来表达Cas9靶向所必需的向导RNA时，这允许以最小的毒性大幅提高Cas9介导的基因编辑效率，因此获得了与使用AAV载体可能预期的结果相反的(counterintuitive)结果，并且大幅提高和扩展了CRISPR/Cas9系统在原代细胞中的潜在应用。
在一些可选方式中，提供了腺病毒蛋白在原代细胞中增强CRISPR介导的基因敲除的用途。在一些可选方式中，提供了腺病毒蛋白在原代T细胞中增强CRISPR介导的基因敲除的用途。在一些可选方式中，提供了腺病毒蛋白在Jurkat T细胞中增强CRISPR介导的基因敲除的用途。在一些可选方式中，提供了使用联合的mRNA/AAV手段实现腺病毒蛋白在原代细胞中增强CRISPR介导的基因敲除的用途。在一些可选方式中，提供了使用联合的mRNA/AAV手段实现腺病毒蛋白在原代T细胞中增强CRISPR介导的基因敲除的用途。在一些可选方式中，提供了使用联合的mRNA/AAV手段实现腺病毒蛋白在Jurkat T细胞中增强CRISPR介导的基因敲除的用途。在一些可选方式中，提供了突变型腺病毒蛋白增强CRISPR介导的基因敲除的用途。在一些可选方式中，提供了突变型腺病毒蛋白在原代细胞中增强CRISPR介导的基因敲除的用途。在一些可选方式中，提供了突变型腺病毒蛋白在原代T细胞中增强CRISPR介导的基因敲除的用途。在一些可选方式中，提供了突变型腺病毒蛋白在Jurkat T细胞中增强CRISPR介导的基因敲除的用途。
在一些可选方式中，描述了腺病毒蛋白在原代T细胞中增强CRISPR介导的基因敲除以及增强同源重组的用途。在一些可选方式中，描述了使用联合的mRNA/AAV手段实现腺病毒蛋白在原代T细胞中增强CRISPR介导的基因敲除以及增强同源重组的用途。在一些可选方式中，提供了突变型腺病毒蛋白增强CRISPR介导的基因敲除以及增强同源重组的用途。在一些可选方式中，突变型腺病毒蛋白在原代T细胞中增强CRISPR介导的基因敲除以及增强同源重组。
这项技术的应用并不限于原代人类细胞。在一些可选方式中，提供了用于靶向非人类序列(例如病原生物体)的系统。在一些可选方式中，提供了用于靶向非人类序列(例如病原生物体)的方法。在一些可选方式中，提供了用于靶向疾病的系统。在一些可选方式中，提供了用于靶向疾病的方法。在一些可选方式中，所述疾病可为由病原生物体引起的传染病。在一些可选方式中，所述疾病可为非传染性疾病。
通过NHEJ途径进行的双链DNA断裂修复通常是不致突变的。大多数由NHEJ途径修复的核酸内切酶诱导的断裂包括精确的重新连接，导致原始DNA序列的恢复。与NHEJ相反，HDR需要修复模板，并且通过该途径进行的不精确修复可引起断裂位点处的突变(例如DNA碱基的缺失和插入以及易位和端粒融合)。
在一些可选方式中，使用Cas9-mRNA/AAV-向导系统导致NHEJ率增加。因此，在Cas9-mRNA/AAV-向导系统的一些可选方式中，将修复模板导入细胞中。在一些可选方式中，所述修复模板是RNA。在一些可选方式中，所述修复模板是DNA。在一些可选方式中，驱使Cas9-mRNA/AAV-向导系统倾向于HDR以实现更高突变率。在一些可选方式中，不提供修复模板而用另一种核酸酶实施mRNA-AAV系统。在一些可选方式中，不提供修复模板而用另一种核酸酶实施的mRNA-AAV系统允许NHEJ的进行。在一些可选方式中，所述系统进一步包含核酸酶，其中所述核酸酶是MegaTAL。
其它优选的可选方式
在一些可选方式中，提供了用于编辑细胞中至少一个靶基因的系统，所述系统包含编码CRISPR向导RNA的第一核酸序列，其中所述CRISPR向导RNA与细胞中至少一个靶基因互补，并且其中所述第一核酸序列存在于载体中，其中所述系统还包含：编码Cas9蛋白、其衍生物或其片段的第二核酸序列；编码第一腺病毒蛋白的第三核酸序列；以及编码第二腺病毒蛋白的第四核酸序列。在所述系统的一些可选方式中，所述细胞是真核细胞。在所述系统的一些可选方式中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些可选方式中，所述细胞是人类细胞。在所述系统的一些可选方式中，所述细胞是原代细胞。在一些可选方式中，所述细胞不是转化细胞。在所述系统的一些可选方式中，所述细胞是原代淋巴细胞、CD34+干细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、神经胶质细胞、肌肉细胞或肠细胞。在所述系统的一些可选方式中，所述载体是病毒载体。在所述系统的一些可选方式中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。在所述系统的一些可选方式中，编码Cas9蛋白、其衍生物或其片段的第二核酸是mRNA。在所述系统的一些可选方式中，编码Cas9蛋白、其衍生物或其片段的第二核酸序列经密码子优化以在真核细胞(例如人类细胞)中表达。在所述系统的一些可选方式中，所述Cas9蛋白、其衍生物或其片段来自酿脓链球菌。在所述系统的一些可选方式中，编码第一腺病毒蛋白的第三核酸是mRNA。在所述系统的一些可选方式中，所述mRNA经密码子优化以在真核细胞(例如人类细胞)中表达。在所述系统的一些可选方式中，所述第一腺病毒蛋白是E4ORF6。在所述系统的一些可选方式中，编码第二腺病毒蛋白的第四核酸是mRNA。在所述系统的一些可选方式中，编码第二腺病毒蛋白的第四核酸经密码子优化以在真核细胞(例如人类细胞)中表达。在所述系统的一些可选方式中，所述第二腺病毒蛋白是E1B55K突变体。在所述系统的一些可选方式中，所述第二腺病毒蛋白包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列。在所述系统的一些可选方式中，所述第二腺病毒蛋白包含SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列。在所述系统的一些可选方式中，第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列和第四核酸序列连接至在真核细胞(例如人类细胞)中可操作的调控元件。在所述系统的一些可选方式中，将编码CRISPR向导RNA的第一核酸序列可操作地连接至调控元件。在所述系统的一些可选方式中，将编码CRISPR向导RNA的核酸序列可操作地连接至U6启动子。在所述系统的一些可选方式中，编码CRISPR向导RNA的核酸序列是组成型表达的。
在一些可选方式中，提供了编辑细胞中至少一个靶基因的方法，所述方法包括：将包含编码CRISPR向导RNA的第一核酸序列的第一载体导入细胞中，其中所述CRISPR向导RNA与所述细胞中至少一个靶基因互补；将编码Cas9蛋白、其衍生物或其片段的第二核酸序列导入所述细胞中；将编码第一腺病毒蛋白的第三核酸序列导入所述细胞中；以及将编码第二腺病毒蛋白的第四核酸序列导入所述细胞中。
在所述方法的一些可选方式中，所述细胞是真核细胞。在所述方法的一些可选方式中，所述细胞是哺乳动物细胞。在所述方法的一些可选方式中，所述细胞是人类细胞。在所述方法的一些可选方式中，所述细胞是原代细胞。在所述方法的一些可选方式中，所述细胞不是转化细胞。在所述方法的一些可选方式中，所述细胞是原代淋巴细胞、CD34+干细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、神经胶质细胞、肌肉细胞或肠细胞。在所述方法的一些可选方式中，包含编码CRISPR向导RNA的第一核酸序列的第一载体是病毒载体。在所述方法的一些可选方式中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。在所述方法的一些可选方式中，所述第二核酸序列、第三核酸序列和第四核酸序列是mRNA。在所述方法的一些可选方式中，所述mRNA经密码子优化以在真核细胞(例如人类细胞)中表达。在所述方法的一些可选方式中，所述Cas9蛋白、其衍生物或其片段来自酿脓链球菌。在所述方法的一些可选方式中，所述第一腺病毒蛋白是E4ORF6。在所述方法的一些可选方式中，所述第二腺病毒蛋白是E1B55K突变体。在所述方法的一些可选方式中，所述第二腺病毒蛋白包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列。在所述方法的一些可选方式中，所述第二腺病毒蛋白包含SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列。
在所述系统的一些可选方式中，所述CRISPR向导RNA是与目的基因互补的任何向导RNA和所有向导RNA。在所述系统的一些可选方式中，所述CRISPR向导RNA与目标靶基因互补。目标靶基因的一些非限制性实例包括TCRα、TCRβ、PD-1、Tim3、Lag3、TIGIT或HBB。
在所述系统的一些可选方式中，靶向TCR的CRISPR向导RNA序列包含SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：5中所示的序列。这些序列描述于图16A中。在所述系统的一些可选方式中，PD1向导靶标的多核苷酸序列的可选方式包含SEQ ID NO：18中所示的序列、TIGIT向导靶标的多核苷酸序列的可选方式包含SEQ ID NO：19中所示的序列、Lag3向导靶标的多核苷酸序列的可选方式包含SEQ ID NO：20中所示的序列以及Tim3向导靶标的多核苷酸序列的可选方式包含SEQ ID NO：21中所示的序列。这些序列提供在图31中。
在所述方法的一些可选方式中，所述第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列和第四核酸序列不是永久性地被导入细胞中。在所述方法的一些可选方式中，将所述第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列和第四核酸序列导入细胞不会转化细胞。在所述方法和/或系统的一些可选方式中，所述第二核酸序列、第三核酸序列或第四核酸序列提供于载体上。在一些可选方式中，提供了编辑细胞中至少一个靶基因的方法，所述方法包括将本文所述系统的任何可选方式导入细胞中。
在一些可选方式中，提供了治疗、改善或抑制受试者中的疾病和/或病症的方法，所述方法包括将本文所述系统的任何可选方式提供给患有疾病和/或病症并且有需要的受试者。疾病和/或病症的一些非限制性实例可为镰状细胞疾病、高胆固醇血症、癌症、自身免疫疾病、遗传性代谢紊乱、免疫缺陷或遗传疾病(例如由于细胞基因组中相对于参考人类基因组而言发生改变而引起的基因产物功能缺陷所导致的任何疾病)。
更多可选方式
在更多可选方式中，提供了用于编辑细胞中至少一个靶基因的系统，所述系统包含：编码Cas9蛋白的核酸；至少编码(单独或与其它蛋白质一起)在细胞中修饰至少一种泛素连接酶或泛素连接酶复合物的底物特异性的蛋白的至少一种核酸；以及包含至少一种编码CRISPR向导RNA的核酸序列的载体，其中，一种或多种CRISPR向导RNA与细胞中至少一个靶基因互补，并且在所述系统的一些可选方式中，包含用于同源基因靶向的核酸模板的载体。
在所述系统的一些可选方式中，所述Cas9蛋白、其衍生物或其片段与泛素连接酶底物特异性修饰蛋白在同一核酸上编码。在所述系统的一些可选方式中，所述Cas9蛋白、其衍生物或其片段与泛素连接酶底物特异性修饰蛋白在两种以上核酸上编码。在所述系统的一些可选方式中，所述细胞是真核细胞。在所述系统的一些可选方式中，所述细胞是哺乳动物细胞。在所述系统的一些可选方式中，所述细胞是人类细胞。在所述系统的一些可选方式中，所述细胞是原代细胞。在所述系统的一些可选方式中，所述细胞不是转化细胞。在所述系统的一些可选方式中，所述细胞是原代淋巴细胞、CD34+干细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、神经胶质细胞、肌肉细胞或肠细胞。在所述系统的一些可选方式中，编码所述向导RNA的载体是病毒载体。在所述系统的一些可选方式中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。在一些可选方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。
在所述系统的一些可选方式中，编码Cas9蛋白、其衍生物或其片段的核酸是mRNA；编码Cas9蛋白、其衍生物或其片段的第二核酸是mRNA。在所述系统的一些可选方式中，编码Cas9蛋白的核酸序列经密码子优化以在真核细胞(例如人类细胞)中表达。在所述系统的一些可选方式中，所述Cas9蛋白、其衍生物或其片段来自于酿脓链球菌。
在所述系统的一些可选方式中，编码任何泛素连接酶/泛素连接酶复合物底物特异性修饰蛋白的核酸是mRNA。在所述系统的一些可选方式中，编码泛素连接酶/泛素连接酶复合物底物特异性修饰蛋白的一种或多种mRNA经密码子优化以在真核细胞(例如人类细胞)中表达。在所述系统的一些可选方式中，所述泛素连接酶/泛素连接酶复合物底物特异性修饰蛋白中的一种是任何腺病毒血清型的腺病毒蛋白E4ORF6。在所述系统的一些可选方式中，所述泛素连接酶/泛素连接酶复合物底物特异性修饰蛋白中的一种是任何腺病毒血清型的E1B55K。
在所述系统的一些可选方式中，所述泛素连接酶/泛素连接酶复合物底物特异性修饰蛋白中的一种是E1B55K突变体，相对于野生型E1B55K蛋白而言，所述突变体具有一个或多个氨基酸改变或增加，这导致相对于野生型E1B55K蛋白而言，所述突变蛋白修饰细胞泛素连接酶底物特异性的能力有所改变。
在所述系统的一些可选方式中，所述泛素连接酶/泛素连接酶复合物底物特异性修饰蛋白中的一种包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列。
在所述系统的一些可选方式中，所述泛素连接酶/泛素连接酶复合物底物特异性修饰蛋白中的一种包含SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列。
在所述系统的一些可选方式中，将所述核酸序列连接至在真核细胞(例如人类细胞)中可操作的调控元件。在所述系统的一些可选方式中，将编码CRISPR向导RNA的核酸序列可操作地连接至调控元件。在所述系统的一些可选方式中，将编码CRISPR向导RNA的核酸序列可操作地连接至U6启动子。在所述系统的一些可选方式中，编码CRISPR向导RNA的核酸序列是组成型表达的。在一些可选方式中，编码CRISPR向导RNA的核酸序列可操作地连接至U6启动子并且是组成型表达的。
在一些可选方式中，提供了编辑细胞中至少一个靶基因的方法，所述方法包括：将编码Cas9蛋白、其衍生物或其片段的核酸序列导入细胞中；将至少一种编码泛素连接酶/泛素连接酶复合物底物特异性修饰蛋白的核酸序列导入所述细胞中；将包含至少一种编码CRISPR向导RNA的核酸序列的载体导入所述细胞中，其中所述CRISPR向导RNA与所述细胞中至少一个靶基因互补；以及在所述方法的一些可选方式中，将包含用于同源基因靶向的核酸模板的载体导入所述细胞中。
在所述方法的一些可选方式中，所述细胞是真核细胞。在所述方法的一些可选方式中，所述细胞是哺乳动物细胞。在所述方法的一些可选方式中，所述细胞是人类细胞。在所述方法的一些可选方式中，所述细胞是原代细胞。在所述方法的一些可选方式中，所述细胞不是转化细胞。在所述方法的一些可选方式中，所述细胞是原代淋巴细胞、CD34+干细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、神经胶质细胞、肌肉细胞或肠细胞。在所述方法的一些可选方式中，包含编码核酸内切酶的第一核酸序列的载体是病毒载体。在一些可选方式中，在病毒载体上编码Cas9。在一些可选方式中，在病毒载体上编码向导RNA。在一些可选方式中，Cas9和向导RNA一起在病毒载体上编码。在一些可选方式中，一起在病毒载体上编码的Cas9和向导RNA与一种或多种由mRNA编码的Ad5蛋白联合使用。
在所述方法的一些可选方式中，包含编码一种或多种CRISPR向导RNA的核酸序列的载体是病毒载体。在所述方法的一些可选方式中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。在所述方法的一些可选方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在所述方法的一些可选方式中，编码Cas9、其衍生物或其片段和/或泛素连接酶底物特异性修饰蛋白的核酸是mRNA。在所述方法的一些可选方式中，所述mRNA经密码子优化以在真核细胞(例如人类细胞)中表达。
在所述方法的一些可选方式中，所述Cas9蛋白、其衍生物或其片段来自于酿脓链球菌。在所述方法的一些可选方式中，所述泛素连接酶底物特异性修饰蛋白是任何腺病毒血清型的E4ORF6。在所述方法的一些可选方式中，所述泛素连接酶底物特异性修饰蛋白是任何腺病毒血清型的E1B55K。在所述方法的一些可选方式中，所述第二腺病毒蛋白包含SEQID NO：2中所示的氨基酸序列。在所述方法的一些可选方式中，所述第二腺病毒蛋白包含SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列。
在所述系统的一些可选方式中，所述CRISPR向导RNA是与目的基因互补的任何向导RNA和所有向导RNA。在所述系统的一些可选方式中，所述CRISPR向导RNA与目标靶基因互补。目标靶基因的一些非限制性实例包括TCRα、TCRβ、PD-1、Tim3、Lag3、TIGIT或HBB。
在所述系统的一些可选方式中，靶向TCR的CRISPR向导RNA序列的可选方式包含SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：5中所示的序列。这些序列示于图16A中。在所述系统的一些可选方式中，多核苷酸序列包含PD1向导靶标的可选方式(SEQID NO：18)、TIGIT向导靶标的可选方式(SEQ ID NO：19)、Lag3向导靶标的可选方式(SEQ IDNO：20)或Tim3向导靶标的可选方式(SEQ ID NO：21)。这些序列提供在图31中。
在所述方法的一些可选方式中，将核酸序列瞬时导入细胞中。在所述方法的一些可选方式中，所述核酸序列不是永久性地导入细胞中。在所述方法的一些可选方式中，将核酸序列导入细胞不会永久性地转化细胞。
在本文所述系统或方法的任何可选方式中，所述第二核酸序列、第三核酸序列或第四核酸序列提供在载体上。
在一些可选方式中，提供了编辑细胞中至少一个靶基因的方法，所述方法包括将本文所述系统的任何可选方式导入所述细胞中。
在一些可选方式中，提供了治疗、改善或抑制受试者中的疾病和/或病症的方法，所述方法包括将本文所述系统的任何可选方式提供给患有疾病和/或病症并且有需要的受试者。疾病和/或病症的一些非限制性实例可为镰状细胞疾病、高胆固醇血症、癌症、自身免疫疾病、遗传性代谢紊乱、免疫缺陷或遗传疾病(例如由于细胞基因组中相对于参考人类基因组而言发生改变而引起的基因产物功能缺陷所导致的任何疾病)。
在一些可选方式中，提供了用于编辑细胞中至少一个靶基因的系统，所述系统包含：编码靶向细胞中至少一个序列的核酸内切酶蛋白的核酸；编码至少一种(单独或与其它蛋白质一起)在细胞中修饰至少一种泛素连接酶或泛素连接酶复合物的底物特异性的蛋白的至少一种核酸；以及任选的包含用于同源基因靶向的核酸模板的载体。在所述系统的一些可选方式中，所述核酸酶蛋白与泛素连接酶底物特异性修饰蛋白在同一核酸上编码。在所述系统的一些可选方式中，所述核酸酶蛋白与泛素连接酶底物特异性修饰蛋白在两种以上核酸上编码。在所述系统的一些可选方式中，所述用于同源基因靶向的核酸模板是DNA。在所述系统的一些可选方式中，所述用于同源基因靶向的核酸模板是RNA。在所述系统的一些可选方式中，所述细胞是真核细胞。在所述系统的一些可选方式中，所述细胞是哺乳动物细胞。在所述系统的一些可选方式中，所述细胞是人类细胞。在所述系统的一些可选方式中，所述细胞是原代细胞。在所述系统的一些可选方式中，所述细胞不是转化细胞。在所述系统的一些可选方式中，所述细胞是原代淋巴细胞、CD34+干细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、神经胶质细胞、肌肉细胞或肠细胞。在所述系统的一些可选方式中，所述载体是病毒载体。在所述系统的一些可选方式中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。在所述系统的一些可选方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。
在所述系统的一些可选方式中，编码Cas9核酸酶、其衍生物或其片段的核酸是mRNA。在所述系统的一些可选方式中，编码核酸酶的核酸序列经密码子优化以在真核细胞(例如人类细胞)中表达。在所述系统的一些可选方式中，编码任何泛素连接酶/泛素连接酶复合物底物特异性修饰蛋白的核酸是mRNA。在所述系统的一些可选方式中，编码泛素连接酶/泛素连接酶复合物底物特异性修饰蛋白的一种或多种mRNA经密码子优化以在真核细胞(例如人类细胞)中表达。
在所述系统的一些可选方式中，所述泛素连接酶/泛素连接酶复合物底物特异性修饰蛋白是任何腺病毒血清型的腺病毒蛋白E4ORF6。在所述系统的一些可选方式中，所述泛素连接酶/泛素连接酶复合物底物特异性修饰蛋白是任何腺病毒血清型的E1B55K。在所述系统的一些可选方式中，所述泛素连接酶/泛素连接酶复合物底物特异性修饰蛋白是E1B55K突变体，相对于野生型E1B55K蛋白而言，所述突变体具有一个或多个氨基酸改变，这导致相对于野生型E1B55K蛋白而言，所述突变蛋白修饰细胞泛素连接酶底物特异性的能力有所改变。在所述系统的一些可选方式中，所述泛素连接酶/泛素连接酶复合物底物特异性修饰蛋白包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列。在所述系统的一些可选方式中，所述泛素连接酶/泛素连接酶复合物底物特异性修饰蛋白包含SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列。在所述系统的一些可选方式中，所述泛素连接酶底物特异性修饰蛋白是一种或多种病毒蛋白。
在所述系统的一些可选方式中，将编码核酸内切酶RNA的核酸序列可操作地连接至调控元件。在所述系统的一些可选方式中，将编码核酸内切酶RNA的核酸序列可操作地连接至U6启动子。在所述系统的一些可选方式中，编码核酸内切酶RNA的核酸序列是组成型表达的。在一些可选方式中，编码核酸内切酶RNA的核酸序列可操作地连接至U6启动子并且是组成型表达的。
在一些可选方式中，提供了编辑细胞中至少一个靶基因的方法，所述方法包括：将编码核酸内切酶的核酸序列导入细胞中；将至少一种编码泛素连接酶/泛素连接酶复合物底物特异性修饰蛋白的核酸序列导入所述细胞中；以及任选地将包含能够在细胞中对至少一种基因组序列进行同源基因靶向的核酸模板的载体导入所述细胞中。在所述方法的一些可选方式中，所述进行同源基因靶向的核酸模板是DNA。在所述方法的一些可选方式中，所述进行同源基因靶向的核酸模板是RNA。
在所述方法的一些可选方式中，所述细胞是真核细胞。在所述方法的一些可选方式中，所述细胞是哺乳动物细胞。在所述方法的一些可选方式中，所述细胞是人类细胞。在所述方法的一些可选方式中，所述细胞是原代细胞。在所述方法的一些可选方式中，所述细胞不是转化细胞。在所述方法的一些可选方式中，所述细胞是原代淋巴细胞、CD34+干细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、神经胶质细胞、肌肉细胞或肠细胞。在所述方法的一些可选方式中，包含编码核酸内切酶的第一核酸序列的载体是病毒载体。在一些可选方式中，在病毒载体上编码Cas9、其衍生物或其片段。在一些可选方式中，在病毒载体上编码向导RNA。在一些可选方式中，Cas9、其衍生物或其片段和向导RNA一起在病毒载体上编码。在一些可选方式中，一起在病毒载体上编码的Cas9、其衍生物或其片段和向导RNA与一种或多种由mRNA编码的Ad5蛋白联合使用。在所述方法的一些可选方式中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。在所述方法的一些可选方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在所述方法的一些可选方式中，编码核酸酶和/或泛素连接酶底物特异性修饰蛋白的核酸是mRNA。在所述方法的一些可选方式中，所述mRNA经密码子优化以在真核细胞(例如人类细胞)中表达。在所述方法的一些可选方式中，所述核酸内切酶蛋白是大范围核酸酶、TALEN、锌指核酸酶或MegaTAL。在所述方法的一些可选方式中，所述泛素连接酶底物特异性修饰蛋白中的一种是任何腺病毒血清型的E4ORF6。在所述方法的一些可选方式中，所述泛素连接酶底物特异性修饰蛋白中的一种是任何腺病毒血清型的E1B55K。在所述方法的一些可选方式中，所述泛素连接酶底物特异性修饰蛋白中的一种包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列。在所述方法的一些可选方式中，所述泛素连接酶底物特异性修饰蛋白中的一种包含SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列。在所述系统的一些可选方式中，所述核酸酶靶向目的基因。目标靶基因的一些非限制性实例包括TCRα、TCRβ、PD-1、Tim3、Lag3、TIGIT或HBB。
在所述方法的一些可选方式中，将核酸序列瞬时导入细胞中。在所述方法的一些可选方式中，所述核酸序列不是永久性地导入细胞中。在所述方法的一些可选方式中，将核酸序列导入细胞不会转化所述细胞。在所述系统的一些可选方式中，旨在用于同源基因靶向的靶基因是目的基因。目标靶基因的一些非限制性实例包括TCRα、TCRβ、PD-1、Tim3、Lag3、TIGIT或HBB。在本文所述任何系统或任何方法的一些可选方式中，所述核酸序列提供在载体上。在一些可选方式中，提供了编辑细胞中至少一个靶基因的方法，所述方法包括将本文所述系统的任何可选方式导入细胞中。
在一些可选方式中，提供了治疗、改善或抑制受试者中的疾病和/或病症的方法，所述方法包括将本文所述系统的任何可选方式提供给患有疾病和/或病症并且有需要的受试者。疾病和/或病症的一些非限制性实例可为镰状细胞疾病、高胆固醇血症、癌症、自身免疫疾病、遗传性代谢紊乱、免疫缺陷或遗传疾病(例如由于细胞基因组中相对于参考人类基因组而言发生改变而引起的基因产物功能缺陷所导致的任何疾病)。
尽管前面的书面描述能够使本领域技术人员制造和使用目前被认为最佳的本发明的实施方式，但是本领域技术人员将理解和意识到本文的具体实施方式、方法和实施例的变型、组合和等同方式的存在。因此，本发明的可选方式不应受到本文所述的实施方式、方法和实施例的限制，而是由本发明可选方式的范围和精神内的所有可选方式和方法来限制。下面的实施例是为了说明目的而提出，而不应当被解释为是限制性的。
另外的可选方式
本文所述Cas9的可选方式可用于本文所述系统和/或方法的任何和全部可选方式中。Cas9的一些可选方式公开于以下参考文献中(通过引用的方式将它们整体并入本文)(Gilbert等，Cell,Jul 18,154(2):442-451,2013；Hilton等，Nat Biotechnol.Apr 6.doi:10.1038/nbt.3199,2015；Qi等，Cell,Feb 28；152(5):1173-1183,2013；Esvelt等，NatureMethods 10,1116-1121,2013；Zetsche等，Nature Biotechnology,33,139-142,2015；以引用的方式将所有参考文献整体并入本文)。Cas9能够将RNA、DNA和蛋白质共定位至基因组靶区域的能力使得使用Cas9系统对细胞组织构建、调控和行为提供了前所未有的控制(Mali等)。
酿脓链球菌Cas9的与CRISPR相关的没有催化活性的变异体(dCas9或核酸酶无效(nuclease null)Cas9)可用于RNA引导的DNA靶向(Gilbert等；以引用的方式将其整体并入本文)。将dCas9融合至调节蛋白的效应子结构域(例如转录激活子(下文称为激活子结构域)或转录抑制子(下文称为抑制子结构域))使得能够在人类细胞和酵母细胞中稳定且有效地进行转录调节(Gilbert等；以引用的方式将其整体并入本文)。dCas9的位点特异性递送完全由向导RNA确定(Gilbert等)。CRISPR干扰(CRISPRi)介导的转录阻遏(需要将dCas9偶联至转录抑制子结构域)可在真核细胞(Gilbert等；以引用的方式将其整体并入本文)和大肠杆菌(Qi等；以引用的方式将其整体并入本文)中强有力地且特异性地沉默基因表达。
因此，在一些可选方式中，使用不引起双链DNA断裂的没有催化活性的Cas9(dCas9)。在一些可选方式中，dCas9融合至激活子结构域。在一些可选方式中，dCas9融合至抑制子结构域。在一些可选方式中，dCas9-激活子结构域由mRNA编码。在一些可选方式中，dCas9-抑制子结构域由mRNA编码。在一些可选方式中，将编码dCas9-激活子结构域的mRNA与编码向导RNA的AAV载体联合使用。在一些可选方式中，将编码dCas9-抑制子结构域的mRNA与编码向导RNA的AAV载体联合使用。在一些可选方式中，将编码dCas9-激活子结构域的mRNA与编码Ad5蛋白的mRNA以及编码向导RNA的AAV载体联合使用。在一些可选方式中，将编码dCas9-抑制子结构域的mRNA与编码Ad5蛋白的mRNA以及编码向导RNA的AAV载体联合使用。在一些可选方式中，dCas9-激活子结构域激活转录。在一些可选方式中，dCas9-抑制子结构域抑制转录。在一些可选方式中，一种或多种Ad5蛋白通过dCas9-激活子结构域的融合进一步增加对转录的激活。在一些可选方式中，一种或多种Ad5蛋白通过dCas9-抑制子结构域的融合进一步增加对转录的抑制。
制造dCas9与人乙酰转移酶催化核心的融合导致组蛋白H3乙酰化，从而导致来自启动子以及近端和远端增强子的靶基因的强有力的转录激活(Hilton等；以引用的方式将其整体并入本文)。因此，在一些可选方式中，dCas9融合至组蛋白修饰酶的功能性催化结构域。在一些可选方式中，dCas9融合至功能性催化结构域(例如组蛋白乙酰转移酶的催化核心)。在一些可选方式中，dCas9融合至组蛋白脱乙酰酶的功能性催化结构域。在一些可选方式中，dCas9融合至组蛋白甲基转移酶的功能性催化结构域。在一些可选方式中，dCas9融合至组蛋白修饰酶的功能性催化结构域可激活转录。在一些可选方式中，dCas9融合至组蛋白修饰酶的功能性催化结构域可抑制转录。
一组完全正交的(fully orthogonal)Cas9蛋白同时且独立地介导细菌和人类细胞中的靶向基因调控和编辑(Esvelt等)。在一些可选方式中，Cas9变异体识别PAM的不同变异体(Kleinstiver等)。PAM是紧接着Cas9靶向的DNA序列之后的DNA序列。因此，在一些可选方式中，Cas9来自于酿脓链球菌。在一些可选方式中，酿脓链球菌Cas9变异体可识别NGG原型间隔区PAM。在一些可选方式中，酿脓链球菌Cas9变异体可识别非NGG的PAM。在一些可选方式中，Cas9变异体可来自于金黄色葡萄球菌。在一些可选方式中，Cas9变异体可来自于嗜热链球菌。在一些可选方式中，Cas9变异体可来自于脑膜炎奈瑟氏菌。在一些可选方式中，Cas9变异体可来自于齿垢密螺旋体。在一些可选方式中，Cas9的序列可为来源于本文提供的两种以上生物体(例如金黄色葡萄球菌和嗜热链球菌)的Cas9共有序列。在一些可选方式中，Cas9的序列可来自于本文提供的任何生物体并且经密码子优化以在本文提供的任何其它生物体中表达。
Cas9的理想可选方式的实例包括来自于酿脓链球菌的Cas9及其变异体。在一些可选方式中，Cas9可来自于酿脓链球菌。在一些可选方式中，Cas9可为来自于酿脓链球菌的Cas9的变异体。在一些可选方式中，Cas9可为来自于酿脓链球菌的Cas9的直系同源物(ortholog)。在一些可选方式中，Cas9可为来自于酿脓链球菌的Cas9的直系同源物的变异体。在一些可选方式中，Cas9是没有催化活性的。在一些可选方式中，由于突变，dCas9是没有活性的。在一些可选方式中，由于蛋白质序列中的D10A突变和H841A突变，dCas9是没有活性的。
已经报道了用于诱导型基因组编辑和转录调节的模块化Cas9构建体，其中Cas9被分割成各自具有催化活性并融合至二聚化结构域的N末端片段和C末端片段。通过小分子(例如药物)将两个Cas9片段中的每一个的两个二聚化结构域聚集在一起以生成能够产生双链断裂的功能性Cas9(Zetsche等；以引用的方式将其整体并入本文)。因此，在一些可选方式中，使用Cas9的N末端片段。在一些可选方式中，使用Cas9的C末端片段。在一些可选方式中，联合使用Cas9的N末端片段和Cas9的C末端片段。在一些可选方式中，将Cas9的N末端片段融合至二聚化结构域。在一些可选方式中，将Cas9的C末端片段融合至二聚化结构域。在一些可选方式中，二聚化结构域进行二聚化。在一些可选方式中，二聚化结构域不进行二聚化。在一些可选方式中，在小分子(例如药物)的存在下，二聚化结构域进行二聚化。在一些可选方式中，在小分子(例如药物)的存在下，二聚化结构域不进行二聚化。在一些可选方式中，在不存在小分子(例如药物)的情况下，二聚化结构域进行二聚化。在一些可选方式中，在不存在小分子(例如药物)的情况下，二聚化结构域不进行二聚化。在一些可选方式中，二聚化结构域的二聚化使Cas9的N末端片段和C末端片段非常接近。在一些可选方式中，当使两个Cas9片段非常接近时，在靶基因组基因座处产生双链DNA断裂。Cas9的N末端片段的理想可选方式的实例可为以下氨基酸延伸的Cas9片段：氨基酸1-203、氨基酸1-256、氨基酸1-311、氨基酸1-535、氨基酸1-573、氨基酸1-714、氨基酸1-1004、氨基酸1-1055、氨基酸1-1115、氨基酸1-1153或氨基酸1-1246。Cas9的C末端片段的理想可选方式的实例可为以下氨基酸延伸的Cas9片段：氨基酸204-1368、氨基酸257-1368、氨基酸312-1368、氨基酸536-1368、氨基酸574-1368、氨基酸715-1368、氨基酸1005-1368、氨基酸1056-1368、氨基酸1116-1368、氨基酸1154-1368或氨基酸1247-1368。原代人类T细胞中基于核酸内切酶的基因编辑
RNA引导的核酸内切酶的许多未来的治疗应用可能需要将它们用于促进基因靶向，因此需要开发提供将三种组分(核酸内切酶、向导RNA和重组模板)递送至原代细胞的方法，使其能够出色地进行同源介导的修复以实现基因破坏和/或基因靶向而用于重组。
例如，CRISPR/Cas9和相关的RNA引导的核酸内切酶的许多未来的治疗应用可能需要将它们用于促进基因靶向，因此需要开发提供将三种组分(Cas9、向导RNA和重组模板)递送至原代细胞的方法，使其能够出色地进行同源介导的修复。因此，在一些可选方式中，在考虑之列的是使用mRNA/AAV共递送进行原代人类T细胞中的CRISPR基因编辑。
在一些可选方式中，提供了使用突变型腺病毒E4ORF6/E1B55K“辅助”蛋白在原代人类T细胞中高效进行的CRISPR/Cas9介导的基因编辑。
在一些可选方式中，提供了利用mRNA来表达Cas9连同突变型腺病毒E4ORF6和E1B55K辅助蛋白一起进行的电穿孔/转导共递送方法。在一些可选方式中，突变型腺病毒E4ORF6和E1B55K辅助蛋白有助于瞬时增强靶细胞对AAV转导的受纳性(permissiveness)及其基因编辑效率。
在一些可选方式中，在考虑之列的是通常可将本文提供的系统和/或方法应用于在细胞中的一个或多个基因座处和/或同时在多个基因座处进行有效的基因破坏。在一些可选方式中，在考虑之列的是通常可将本文提供的系统和/或方法应用于在细胞中的一个或多个基因座处和/或同时在多个基因座处进行有效的同源基因靶向。在一些可选方式中，在考虑之列的是通常可将本文提供的系统和/或方法应用于在细胞中的一个或多个基因座处和/或同时在多个基因座处进行有效的基因破坏和同源基因靶向。
在一些可选方式中，在考虑之列的是可将本文提供的系统和/或方法应用于在原代细胞中的一个或多个基因座处和/或同时在多个基因座处进行有效的基因破坏。在一些可选方式中，在考虑之列的是可将本文提供的系统和/或方法应用于在原代细胞中的一个或多个基因座处和/或同时在多个基因座处进行有效的同源基因靶向。在一些可选方式中，在考虑之列的是可将本文提供的系统和/或方法应用于在原代细胞中的一个或多个基因座处和/或同时在多个基因座处进行有效的基因破坏和同源基因靶向。
在一些可选方式中，在考虑之列的是可将本文提供的系统和/或方法应用于在原代T细胞中的一个或多个基因座处和/或同时在多个基因座处进行有效的基因破坏。在一些可选方式中，在考虑之列的是可将本文提供的系统和/或方法应用于在原代T细胞中的一个或多个基因座处和/或同时在多个基因座处进行有效的同源基因靶向。在一些可选方式中，在考虑之列的是可将本文提供的系统和/或方法应用于在原代T细胞中的一个或多个基因座处和/或同时在多个基因座处进行有效的基因破坏和同源基因靶向。
在一些可选方式中，通常可将本文提供的系统和/或方法应用于在人类细胞中的一个或多个基因座处和/或同时在多个基因座处进行有效的基因破坏和/或同源基因靶向，说明了其在翻译基因编辑中的广泛应用潜力。例如，在一些可选方式中，该方法可应用于在原代人类T细胞中的多个基因座处进行有效的基因破坏和/或同源基因靶向，说明了其在翻译基因编辑中的广泛应用潜力。
优选的可选方式
在一些可选方式中，提供了用于编辑细胞中至少一个靶基因的系统，所述系统包含：编码一种或多种CRISPR向导RNA的第一核酸序列或核酸序列组，其中所述一种或多种CRISPR向导RNA与细胞中至少一个靶基因互补，并且，其中所述第一核酸序列或核酸序列组可包含在一个或多个载体中，但不是必需包含在一个或多个载体中；Cas9蛋白或者编码Cas9蛋白的第二核酸序列；编码第一腺病毒蛋白的第三核酸序列；以及编码第二腺病毒蛋白的第四核酸序列。
在所述系统的一些可选方式中，所述细胞是真核细胞。在所述系统的一些可选方式中，所述细胞是哺乳动物细胞。在所述系统的一些可选方式中，所述细胞是人类细胞。在所述系统的一些可选方式中，所述细胞是原代细胞。在所述系统的一些可选方式中，所述细胞不是转化细胞。在所述系统的一些可选方式中，所述细胞是原代淋巴细胞、CD34+干细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、神经胶质细胞、肌肉细胞或肠细胞。
在所述系统的一些可选方式中，所述载体是病毒载体。在所述系统的一些可选方式中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。在所述系统的一些可选方式中，所述AAV载体是自身互补载体。在所述系统的一些可选方式中，所述AAV载体是单链载体。在所述系统的一些可选方式中，所述AAV载体是自身互补载体和单链载体的组合。
在所述系统的一些可选方式中，编码Cas9蛋白的第二核酸序列是mRNA。在所述系统的一些可选方式中，编码Cas9蛋白的第二核酸序列经密码子优化以在真核细胞(例如人类细胞)中表达。
在所述系统的一些可选方式中，所述Cas9蛋白来自于酿脓链球菌。
在所述系统的一些可选方式中，编码第一腺病毒蛋白的第三核酸是mRNA。在所述系统的一些可选方式中，编码第一腺病毒蛋白的第三核酸经密码子优化以在真核细胞(例如人类细胞)中表达。在所述系统的一些可选方式中，所述第一腺病毒蛋白来自血清型5的AAV。
在所述系统的一些可选方式中，所述第一腺病毒蛋白是野生型E4ORF6。在所述系统的一些可选方式中，所述野生型E4ORF6的序列示于SEQ ID NO：3中。在所述系统的一些可选方式中，所述第一腺病毒蛋白是突变型E4ORF6。在所述系统的一些可选方式中，所述突变型E4ORF6蛋白是AXA突变体。在所述系统的一些可选方式中，所述AXA突变体示于SEQ IDNO：23中。
在所述系统的一些可选方式中，编码第二腺病毒蛋白的第四核酸是mRNA。在所述系统的一些可选方式中，编码第二腺病毒蛋白的第四核酸经密码子优化以在真核细胞(例如人类细胞)中表达。在所述系统的一些可选方式中，所述第二腺病毒蛋白来自血清型5的AAV。
在所述系统的一些可选方式中，所述第二腺病毒蛋白是野生型E1B55K。在所述系统的一些可选方式中，所述野生型E1B55K的序列示于SEQ ID NO：1中。在所述系统的一些可选方式中，所述第二腺病毒蛋白是突变型E1B55K。在所述系统的一些可选方式中，所述突变型E1B55K是H373A突变体。在所述系统的一些可选方式中，所述H373A突变体的序列示于SEQID NO：2中。在所述系统的一些可选方式中，所述突变型E1B55K是H354突变体。在所述系统的一些可选方式中，所述H354突变体的序列示于SEQ ID NO：4中。在所述系统的一些可选方式中，所述突变型E1B55K是R240A突变体。在所述系统的一些可选方式中，R240A突变体的序列示于SEQ ID NO：22中。
在所述系统的一些可选方式中，将所述第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列和第四核酸序列可操作地连接至在真核细胞(例如人类细胞)中可操作的调控元件。
在所述系统的一些可选方式中，将编码一种或多种CRISPR向导RNA的第一核酸序列可操作地连接至调控元件。在所述系统的一些可选方式中，将编码一种或多种CRISPR向导RNA的第一核酸序列可操作地连接至U6启动子。在所述系统的一些可选方式中，当所述第一核酸序列编码超过一种CRISPR向导RNA时，各向导RNA可操作地连接至各自的调控元件。
在所述系统的一些可选方式中，编码CRISPR向导RNA的第一核酸序列是组成型表达的。在所述系统的一些可选方式中，编码CRISPR向导RNA的第一核酸序列是瞬时表达的。
在所述系统的一些可选方式中，针对TCRα基因的CRISPR向导RNA序列示于SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和/或SEQ ID NO：17中。
在所述系统的一些可选方式中，针对PD1基因的CRISPR向导RNA序列示于SEQ IDNO：18中；针对TIGIT基因的CRISPR向导RNA序列示于SEQ ID NO：19中；针对Lag3基因的CRISPR向导RNA序列示于SEQ ID NO：20中；以及针对Tim3基因的CRISPR向导RNA序列示于SEQ ID NO：21中。
在所述系统的一些可选方式中，所述系统可用于基因敲除、基因敲入或两者皆可。
在所述系统的一些可选方式中，所述第一核酸序列或核酸序列组以及所述Cas9蛋白或编码Cas9蛋白的第二核酸序列被第五核酸序列和第六核酸序列集体(collectively)替代，其中所述第五核酸序列和第六核酸序列分别包含编码TALEN核酸酶的左侧元件(leftcomponent)和右侧元件(right component)的mRNA。
在一些可选方式中，提供了用于编辑细胞中至少一个靶基因的方法，所述方法包括：将编码一种或多种CRISPR向导RNA的第一核酸序列或核酸序列组导入细胞中，其中所述一种或多种CRISPR向导RNA与所述细胞中至少一个靶基因互补；将Cas9蛋白或编码Cas9蛋白的第二核酸序列导入细胞中；将编码第一腺病毒蛋白的第三核酸序列导入细胞中；以及将编码第二腺病毒蛋白的第四核酸序列导入细胞中。
在所述方法的一些可选方式中，所述细胞是真核细胞。在所述方法的一些可选方式中，所述细胞是哺乳动物细胞。在所述方法的一些可选方式中，所述细胞是人类细胞。在所述方法的一些可选方式中，所述细胞是原代细胞。在所述方法的一些可选方式中，所述细胞不是转化细胞。在所述方法的一些可选方式中，所述细胞是原代淋巴细胞、CD34+干细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、神经胶质细胞、肌肉细胞或肠细胞。
在所述方法的一些可选方式中，包含编码一种或多种CRISPR向导RNA的第一核酸序列或核酸序列组的载体可包含于一个或多个载体中，但不是必需包含于一个或多个载体中。在所述方法的一些可选方式中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。在所述方法的一些可选方式中，所述AAV载体是自身互补载体。在所述方法的一些可选方式中，所述AAV载体是单链载体。在所述方法的一些可选方式中，所述AAV载体是自身互补载体和单链载体的组合。
在所述方法的一些可选方式中，所述第二核酸序列、第三核酸序列和第四核酸序列是mRNA。在所述方法的一些可选方式中，所述mRNA经密码子优化以在真核细胞(例如人类细胞)中表达。
在所述方法的一些可选方式中，所述Cas9蛋白来自于酿脓链球菌。
在所述方法的一些可选方式中，所述第一腺病毒蛋白来自血清型5的AAV。在所述方法的一些可选方式中，所述第一腺病毒蛋白是野生型E4ORF6。在所述方法的一些可选方式中，所述野生型E4ORF6的序列示于SEQ ID NO：3中。
在所述方法的一些可选方式中，所述第一腺病毒蛋白是突变型E4ORF6。在所述方法的一些可选方式中，所述突变型E4ORF6蛋白是AXA突变体。在所述方法的一些可选方式中，所述AXA突变体的序列示于SEQ ID NO：23中。
在所述方法的一些可选方式中，所述第二腺病毒蛋白来自于血清型5的AAV。在所述方法的一些可选方式中，所述第二腺病毒蛋白是野生型E1B55K。在所述方法的一些可选方式中，所述野生型E1B55K的序列示于SEQ ID NO：1中。在所述方法的一些可选方式中，所述第二腺病毒蛋白是突变型E1B55K。在所述方法的一些可选方式中，所述突变型E1B55K是H373A突变体。在所述方法的一些可选方式中，H373A突变体的序列示于SEQ ID NO：2中。在所述方法的一些可选方式中，所述突变型E1B55K是H354突变体。在所述方法的一些可选方式中，H354突变体的序列示于SEQ ID NO：4中。在所述方法的一些可选方式中，所述突变型E1B55K是R240A突变体。在所述方法的一些可选方式中，R240A突变体的序列示于SEQ IDNO：22中。在所述方法的一些可选方式中，其中E4ORF6变异体中的任一种可与E1B55K变异体中的任一种联合使用。
在所述方法的一些可选方式中，同时敲除的基因数目是2个-10个。在所述方法的一些可选方式中，同时敲除的基因数目是2个-5个。在所述方法的一些可选方式中，mRNA的剂量是0.01μg-1μg。在所述方法的一些可选方式中，突变率增加了1.5倍-9倍。
在所述方法的一些可选方式中，针对TCRα基因的CRISPR向导RNA序列示于SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和/或SEQ ID NO：17中。
在所述方法的一些可选方式中，针对PD1基因的CRISPR向导RNA序列示于SEQ IDNO：18中；针对TIGIT基因的CRISPR向导RNA序列示于SEQ ID NO：19中；针对Lag3基因的CRISPR向导RNA序列示于SEQ ID NO：20中；以及针对Tim3基因的CRISPR向导RNA序列示于SEQ ID NO：21中。
在所述方法的一些可选方式中，将所述第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列和第四核酸序列瞬时导入细胞中。在所述方法的一些可选方式中，所述第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列和第四核酸序列不是永久性地导入细胞中。在所述方法的一些可选方式中，将第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列和第四核酸序列导入细胞中不会转化细胞。
在所述系统的一些可选方式中，所述靶基因是目的基因。在所述方法的一些可选方式中，所述靶基因是目的基因。
在本文提供的系统和/或方法的一些可选方式中，所述第三核酸序列和所述第四核酸序列包含在AAV载体中。
在所述方法的一些可选方式中，先将所述第二核酸序列导入细胞中，随后将包含所述第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸序列的AAV载体导入细胞中。
在所述方法的一些可选方式中，先将包含所述第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸序列的AAV载体导入细胞中，随后将所述第二核酸序列导入细胞中。
在所述方法的一些可选方式中，所述第二核酸序列以及包含所述第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸序列的AAV载体是共递送的并且同时被导入细胞中。
在所述方法的一些可选方式中，所述系统可用于基因敲除、基因敲入或两者皆可。
在所述方法的一些可选方式中，所述第一核酸序列或核酸序列组以及所述Cas9蛋白或编码Cas9蛋白的第二核酸序列被第五核酸序列和第六核酸序列集体替代，其中所述第五核酸序列和第六核酸序列分别包含编码TALEN核酸酶的左侧元件和右侧元件的mRNA。
在一些可选方式中，提供了用于编辑细胞中至少一个靶基因的方法，所述方法包括将本文提供的系统的任何可选方式导入细胞中。
在一些可选方式中，提供了用于治疗、改善和/或抑制受试者中的疾病和/或病症的方法，所述方法包括向患有疾病和/或病症的受试者提供本文提供的系统的任何可选方式。
在一些可选方式中，在考虑之列的是用于编辑细胞中至少一个靶基因的系统以及使用该系统进行基因组编辑的方法。在一些可选方式中，所述靶基因是可通过基因破坏进行编辑的目的基因。在一些可选方式中，所述细胞是原代T细胞。
在一些可选方式中，所述系统包含编码一种或多种向导RNA的第一核酸序列和编码核酸内切酶蛋白的第二核酸序列。在一些可选方式中，所述核酸内切酶可为本文公开的任何核酸内切酶和/或其在当前公开范围内的可选变型和修饰。在一些可选方式中，所述第二核酸是mRNA并且编码任何核酸内切酶蛋白。在一些可选方式中，编码核酸内切酶蛋白的第二核酸序列经密码子优化以在真核细胞中表达。在一些可选方式中，所述一种或多种向导RNA与细胞中至少一个靶基因互补。在一些可选方式中，所述一种或多种向导RNA在载体中提供。在一些可选方式中，所述载体可为病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。在一些可选方式中，所述AAV载体可为自身互补载体、或单链载体、或者自身互补载体和单链载体的组合。
由于许多细胞类型具有对AAV载体的进入后限制，使得AAV介导的转基因(包括向导RNA)的表达效率非常低，所以在额外的核酸序列上提供了抑制对AAV载体的进入后限制的蛋白。因此，在一些可选方式中，所述系统包含编码第一腺病毒蛋白的第三核酸序列和编码第二腺病毒蛋白的第四核酸序列。在一些可选方式中，所述第三核酸和第四核酸是经密码子优化以在真核细胞中表达的mRNA。在一些可选方式中，所述核酸序列可以以任何顺序依次地导入细胞中，或可以同时导入细胞中。
在一些可选方式中，所述第一腺病毒蛋白和第二腺病毒蛋白来自血清型5的AAV。在一些可选方式中，所述第一腺病毒蛋白是野生型E4ORF6或E4ORF6的AXA突变体。在一些可选方式中，所述第二腺病毒蛋白是野生型E1B55K、或E1B55K的H373A突变体、或E1B55K的H354突变体、或E1B55K的R240A突变体。尽管突变型蛋白在抑制对AAV载体的进入后限制方面不如野生型蛋白有效，但是它们在提高基因靶向方面相对地更有效。
在一些可选方式中，将所述第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列和第四核酸序列可操作地连接至在真核细胞中可操作的调控元件。在一些可选方式中，所述第一核酸序列可编码一种或多种向导RNA，并且每个向导RNA可操作地连接至各自的调控元件。在一些可选方式中，编码向导RNA的第一核酸序列在细胞中瞬时表达。在一些可选方式中，所述一种或多种向导RNA序列与以下基因互补：TCRα基因、PD1基因、TIGIT基因、Lag3基因和/或Tim3基因。在一些可选方式中，所述系统还包含与目的基因具有同源性的核酸序列区域。
在一些可选方式中，将包含上述组分的系统导入原代T细胞中。与目的基因具有同源性的这些核酸序列区域指导基于核酸内切酶的系统靶向特定基因。靶向特定基因可导致基因敲除、基因敲入或两者皆有。
根据基因靶向手段的性质(敲除或敲入)，可通过流式细胞术或测序或这两者来确定结果。例如，如果所述系统用于敲除编码细胞表面表达的蛋白质的目的基因，可使用流式细胞术来检查该蛋白质的细胞表面表达的抑制和/或缺乏。或者，如果所述系统用于敲除编码细胞内表达的蛋白质的目的基因，可使用流式细胞术来检查该蛋白质的细胞内表达的抑制和/或缺乏。或者，如果所述系统用于敲入(例如将抗原的优势表位敲入编码细胞表面表达的蛋白质的目的基因)，可使用流式细胞术来检查该优势表位的细胞表面表达。或者，如果将所述系统用于敲入(例如将抗原的优势表位敲入编码细胞内表达的蛋白质的目的基因)，可使用流式细胞术来检查该优势表位的细胞内表达。在上述任何情况下，也可使用基因组DNA的DNA测序来确认所需的基因靶向事件。在一些可选方式中，可同时靶向用于敲除、敲入或这两者的基因数目可为2个-5个。
在一些可选方式中，通过细胞分选或其它细胞富集方法将其中的目的基因已被靶向的T细胞富集。如果富集的细胞旨在用于治疗、改善和/或抑制受试者中的疾病和/或病症，则将富集的细胞给予该受试者。例如，在一些可选方式中，因为受试者中的T细胞“耗尽”，因此不能有效地清除来自疾病和/或病症的一种或多种抗原，受试者可患有该疾病和/或病症。
通过靶向一种或多种“耗尽”标志物(例如PD1、TIGIT、Lag3和Tim3)，可逆转T细胞的“耗尽”状况。在一些可选方式中，将靶向T细胞给予受试者(例如通过静脉内途径)。对受试者进行后续测试以评估靶向T细胞的状态以及它们对疾病和/或病症的作用。例如，在一些可选方式中，在给予靶向T细胞之后，以不同时间间隔从受试者中抽取血液。在一些可选方式中，例如通过评估给予的T细胞的细胞因子(例如IL-2、TNFα)分泌来进行测试，以确定给予的T细胞是否被活化。在一些可选方式中，还进行测试来确定给予靶向T细胞对疾病和/或病症的作用。
本文提供的关于人类的任何系统和/或方法也可提供给一种或多种伴侣动物或为商业利益而驯化的动物。伴侣动物不受限制地可为狗、猫、豚鼠、小鼠、大鼠、兔或仓鼠。为商业利益而驯化的动物不受限制地可为山羊、绵羊、牛、猪、猴或大象。
实施例
下文详细描述的是参考附图来说明如何实施CRISPR基因编辑的一些非限制性实施例。这些实施例并不意味着是限制性的，其它核酸内切酶和包含其它核酸内切酶的系统和方法的可选方式以及这些示例性可选方式的变型和修饰是可能的，并不需要过多实验。所有这些变型和修饰都在当前教导的范围内。
实施例1：mRNA/AAV递送方法影响原代人类T细胞中Cas9介导的基因破坏
在一些可选方式中，提供了使用mRNA/AAV共递送在原代人类T细胞中进行的CRISPR基因编辑。
基于AAV6衣壳的AAV载体能够实现足够的人类原代T细胞和CD34+细胞的转导效率，以作为TALEN和其它核酸酶催化的同源重组的模板。因此，假设AAV载体可作为安全且有效的载体，用于瞬时表达向导RNA以及用于递送针对Cas9诱导的基因靶向的重组模板。
在一些可选方式中，所用细胞可不受限制地为：原代淋巴细胞、CD34+干细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、神经胶质细胞、肌肉细胞或肠细胞。
在一些可选方式中，向导RNA瞬时表达的持续时间可为1分钟至1周或者在由上述任何两个值所限定的范围内。
在一些可选方式中，重组模板的大小可在0.05kb-1kb的范围内。在一些可选方式中，同源臂的长度可为0.05kb、0.075kb、0.1kb、0.15kb、0.2kb、0.25kb、0.3kb、0.35kb、0.4kb、0.45kb、0.5kb、0.55kb、0.6kb、0.65kb、0.7kb、0.75kb、0.8kb、0.85kb、0.9kb、0.95kb或1kb或者在由上述任何两个值所限定的范围内。
通过这一系列实验和我们之前关于其它核酸酶平台的经验，观察到首先进行mRNA电穿孔步骤看起来能够最可靠地工作。因此，在一些可选方式中，采用mRNA电穿孔继以AAV转导作为我们的标准手段。在一些优选的可选方式中，mRNA电穿孔在AAV转导之前进行。
在一些可选方式中，为了评估mRNA/AAV递送方法(其中通过mRNA电穿孔来表达spCas9，并且使用AAV载体来提供向导RNA表达)的潜力，生成了包含U6启动子驱动的向导RNA表达盒和MND启动子驱动的GFP表达盒(后者提供对AAV转导效率的跟踪)的AAV构建体。
图1A的上图示出了克隆到不同自有(in-house)骨架中以产生mRNA的mCherry构建体和Cas9-T2A-mCherry构建体的示意图。图1A的中图和下图示出了TCR基因组基因座内的向导位置的示意图。使用自身互补AAV载体骨架和单链AAV载体骨架来表达向导。
在一些可选方式中，可使用单个mRNA或多个mRNA来递送一种或多种核酸酶。在一些可选方式中，可使用单个mRNA或多个mRNA来递送1种-5种核酸酶。在一些可选方式中，可使用单个mRNA或多个mRNA来递送1种、2种、3种、4种或5种核酸酶。
在一些可选方式中，在考虑之列的是借助AAV来递送可能需要的核酸酶、向导RNA、辅助蛋白、具有同源区(homologous region)的模板以及任何额外组分。在一些可选方式中，在考虑之列的是借助mRNA来递送可能需要的核酸酶、向导RNA、辅助蛋白、具有同源区的模板以及任何额外组分中的任一种并借助AAV来递送剩余组分。在一些可选方式中，在考虑之列的是借助mRNA来递送可能需要的核酸酶、向导RNA、辅助蛋白、具有同源区的模板以及任何额外组分中的任何两种并借助AAV来递送剩余组分。在一些可选方式中，在考虑之列的是借助mRNA来递送可能需要的核酸酶、向导RNA、辅助蛋白、具有同源区的模板以及任何额外组分中的任何三种并借助AAV来递送剩余组分。在一些可选方式中，在考虑之列的是借助mRNA来递送可能需要的核酸酶、向导RNA、辅助蛋白、具有同源区的模板以及任何额外组分中的任何四种并借助AAV来递送剩余组分。在一些可选方式中，在考虑之列的是借助mRNA来递送核酸酶、向导RNA、辅助蛋白和具有同源区的模板。
在一些可选方式中，可使用单个mRNA或多个mRNA来递送一种或多种报告子。在一些可选方式中，可使用单个mRNA或多个mRNA来递送1种-5种报告子。在一些可选方式中，可使用单个mRNA或多个mRNA来递送1种、2种、3种、4种或5种报告子。
在一些可选方式中，可使用AAV转导来递送一种或多种报告子。在一些可选方式中，可使用AAV转导来递送1种-5种报告子。在一些可选方式中，可使用AAV转导来递送1种、2种、3种、4种或5种报告子。
在一些可选方式中，可使用单个mRNA或多个mRNA来递送一种或多种核酸酶以及一种或多种报告子。在一些可选方式中，可使用单个mRNA或多个mRNA来递送1种-5种核酸酶以及1种-5种报告子。在一些可选方式中，可使用单个mRNA或多个mRNA来递送1种、2种、3种、4种或5种核酸酶以及1种、2种、3种、4种或5种报告子。
在一些可选方式中，在用于向导递送的AAV转导之前和之后均对Cas9(作为Cas9-T2A-mCherry融合体)的mRNA电穿孔进行测试，并且使用借助两种不同向导的几种方案在TCRα基因的恒定区内实现了适度有效的Cas9切割。
在一些可选方式中，可使用AAV转导来递送一种或多种向导RNA。在一些可选方式中，可使用AAV转导来递送1种-5种向导RNA。在一些可选方式中，可使用AAV转导来递送1种、2种、3种、4种或5种向导RNA。
在一些可选方式中，使用化学修饰的向导RNA在考虑之列。在一些可选方式中，化学修饰的向导RNA可作为单独的RNA来提供。因此，在一些可选方式中，当针对一种或多种目标靶基因设计一种或多种向导RNA时，各向导RNA作为单独的化学修饰的向导RNA来提供。例如，当考虑使用10种向导RNA来针对10种不同的目标靶基因时，各向导RNA是化学修饰的向导RNA并且各向导RNA是单独的且不同于其它向导RNA的RNA分子。在一些可选方式中，可将10种不同的向导RNA以任何顺序依次地或同时导入细胞中。
在一些可选方式中，当考虑使用预先复合有(pre-complexed with)向导RNA的Cas9蛋白质连同腺病毒蛋白时，所述向导RNA作为化学修饰的向导RNA来提供，其中当针对一个或多个目标靶基因设计一种或多种向导RNA时，各向导RNA作为单独的化学修饰的向导RNA来提供。
因此，在一些可选方式中，mRNA电穿孔可在AAV转导之前进行。在一些可选方式中，mRNA电穿孔可在AAV转导之后进行。在一些可选方式中，mRNA和AAV可进行共递送。
在一些可选方式中，为了优化原代人类T细胞中的Cas9 mRNA转染，借助Neon电穿孔系统，使用不同浓度的Cas9-T2A-mcherry mRNA对CD4+ T细胞进行转染，并在初始的24小时在30℃下进行培养，随后将它们转移至37℃。在用所标明的量的Cas9-T2A-mCherry mRNA进行电穿孔24小时后，进行T细胞的流式细胞分析(图1C)。mCherry阳性细胞的百分比示于图1C中。
在一些可选方式中，原代人类T细胞中AAV-向导剂量的分析通过用1μg Cas9-T2A-mcherry mRNA转染CD4+ T细胞来进行。电穿孔后2小时，用MOI 600和MOI 6000(分别对应于1％和10％的培养体积)的表达TCRα向导的AAV对细胞进行转导。在初始的24小时将细胞培养在30℃下，随后将细胞转移至37℃并在实验期间保存在37℃。在EP/转导后第7天，通过流式细胞术对细胞进行表面CD3表达损失(作为TCRα基因敲除的指标)的分析(图1D)。
在一些可选方式中，为确定使Cas9切割效率最大化和使毒性最小化的范围，使用mRNA/AAV转导方案对一定范围内的Cas9 mRNA和AAV-向导剂量进行了评估(图1C和图1D)。在一些可选方式中，mRNA剂量看起来是饱和的(在我们的标准电穿孔条件中为1μg)。在一些可选方式中，mRNA剂量可处在0.05μg-3μg的范围内。在一些可选方式中，mRNA剂量可为0.05μg、0.1μg、0.15μg、0.2μg、0.25μg、0.3μg、0.35μg、0.4μg、0.45μg、0.5μg、0.55μg、0.6μg、0.65μg、0.7μg、0.75μg、0.8μg、0.85μg、0.9μg、0.95μg、1μg、1.25μg、1.5μg、1.75μg、2μg、2.25μg、2.5μg、2.75μg或3μg，或者在由上述任意两个剂量所限定的范围内。
在一些可选方式中，观察到由多至最大耐受MOI的AAV引起的敲除的剂量依赖性增加。在一些可选方式中，AAV剂量可处在60至60,000的范围内。在一些可选方式中，AAV剂量可为60、125、250、500、1,000、2,000、4,000、8,000、16,000、30,000或60,000，或者在由上述任意两个剂量所限定的范围内。
在一些可选方式中，对于针对将Cas9/AAV.sgRNA递送至原代人类T细胞之后发生的切割的T7核酸内切酶I测定(T7EI)而言，将原代CD4+T细胞用Cas9 mRNA进行电穿孔，2个小时后再进行AAV.sgRNA转导。电穿孔/转导10天后，从细胞中分离基因组DNA，并进行T7核酸内切酶测定(图1B)。箭头指示由T7EI切割的DNA条带的预期位置(图1B)。
在一些可选方式中，检测出作为插入缺失(indel)形成的Cas9切割(由对TCRα中预测靶位点周围的扩增子进行的T7测定来证明)(图1B)。在一些可选方式中，通过流式细胞术检测表面TCR/CD3复合物表达的损失(TCR/CD3复合物表达需要功能性TCRα链的表达)(图1D)。
在一些可选方式中，对于TCRα基因座和CCR5基因座这两者，T7核酸内切酶I测定获得了相似水平的切割效率。
在一些可选方式中，对单链AAV载体和自身互补AAV载体进行了比较(图1E)。图IE中的sgTCRα表示单向导(single guide)TCRα。在一些可选方式中，对以scAAV和ssAAV-GFP进行的TCRα敲除(通过将原代T细胞用编码对照mCherry蛋白或Cas9-T2A-mCherry蛋白的mRNA进行电穿孔，静置3小时，并用驱动向导RNA表达的AAV进行转导来进行)进行流式细胞比较。在初始的24小时将细胞培养在30℃下，随后将细胞转移至37℃。电穿孔/转导24小时和96小时后，使用流式细胞术对细胞的mCherry表达和GFP表达进行分析；并在电穿孔/转导7天后，对表面CD3表达进行分析。
在一些可选方式中，如通过表面CD3损失所评估的，在Cas9靶向切割的效率方面，在自身互补AAV和单链AAV之间没有观察到显著差异(图1E)。因此，在一些可选方式中，Cas9-mRNA和向导-AAV在原代细胞中介导了有效的TCR敲除，并且自身互补向导RNA和单链向导RNA两者产生了相似水平的CD3敲除。
因此，在一些可选方式中，AAV载体可为单链的。在一些可选方式中，AAV载体可为自身互补的。在一些可选方式中，AAV载体可同时为单链的和自身互补的。
实施例2：腺病毒血清型5 E4ORF6和E1B55K辅助蛋白增强原代人类T细胞对AAV转导的受纳性
在一些可选方式中，提供了使用腺病毒E4ORF6/E1B55K蛋白来解除进入后AAV限制机制而在原代人类T细胞中提高AAV介导的基因表达。
在我们最初的分析中观察到的Cas9切割效率对AAV剂量的依赖性提示了我们AAV转导的效率是将mRNA/AAV方法应用于T细胞中的关键限制因素。已知许多人类细胞类型中的AAV转导由于衣壳的表面受体表达结合性质而在细胞进入阶段受到限制，并且基于多种机制受到进入后限制。在培养的转化细胞中，来自于多种腺病毒血清型的E4ORF6蛋白和E1B55K蛋白的基于质粒的表达能有效地解除对AAV表达的进入后限制(其中包括DNA损伤应答蛋白的基因组连环化(concatemerization)、细胞周期DNA损伤检查点的激活以及促凋亡DNA损伤信号)。
因此，在一些可选方式中，E4ORF6蛋白和E1B55K蛋白可来自于多种腺病毒血清型。在一些可选方式中，腺病毒血清型可为Ad1、Ad2、Ad3、Ad4、Ad5、Ad6或Ad7。其它可选血清型也在考虑之列并且在当前公开的范围内。在一些可选方式中，E4ORF6蛋白和E1B55K蛋白可来自于相同的腺病毒血清型。在一些可选方式中，E4ORF6可来自于一种腺病毒血清型而E1B55K来自于另一种血清型。
由于基于DNA质粒的表达对原代T细胞是有毒的，在一些可选方式中，评估了腺病毒血清型5 E4ORF6/E1B55K mRNA的电穿孔是否可在原代T细胞中实现对基于AAV的表达的进入后限制的短暂解除(图2)。
在一些可选方式中，为了评估由E4ORF6/E1B55K解除了进入后AAV限制后的AAV介导的GFP表达，将原代CD4+ T细胞用编码腺病毒血清型5 E4ORF6/E1B55K的mRNA(各0.33μg)进行电穿孔，静置2-4小时，然后用驱动GFP表达的AAV进行转导。将细胞置于培养中，持续所标明的时间段(图2A，左图)，随后收集细胞并通过流式细胞术分析GFP表达。遵循与左图所述的相同方案，在所标明的暴露至E4ORF6/E1B55K mRNA转染和AAV转导之后，分析细胞群的扩增(图2A，右图)。
在一些可选方式中，在E4ORF6/E1B55K基于mRNA在原代T细胞中共表达(而不是单独的任一蛋白；数据未显示)之后，实现了：GFP平均荧光强度(MFI)增加了4log，并且GFP表达增加了8倍(由编码启动子/GFP表达盒的AAV载体驱动)(图2A，左图)，而且没有损害细胞的扩增率(图2A，右图)。
在一些可选方式中，GFP(或一种或多种其它报告子)的MFI的增加可处于2log至8log的范围内。在一些可选方式中，GFP(或一种或多种其它报告子)的MFI的增加可为2log、3log、4log、5log、6log、7log或8log，或者在由上述任何两个值所限定的范围内。
在一些可选方式中，GFP(或一种或多种其它报告子)的表达的提高可处于2倍至16倍的范围内。在一些可选方式中，GFP(或一种或多种其它报告子)的表达的提高可为2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍或16倍，或者在由上述任何两个值所限定的范围内。
在一些可选方式中，通过将原代CD4+ T细胞用编码E4ORF6/E1B55K蛋白的mRNA(各0.33μg)进行电穿孔，静置2-4小时，并用驱动GFP表达的单链AAV6或自身互补AAV6进行转导(两种病毒的MOI为2×104)，进行了E4ORF6/E1B55K蛋白对自身互补AAV6和单链AAV6介导的基因表达的作用的比较(图2B)。将细胞置于培养中，持续所标明的时间段，随后收集细胞并通过流式细胞术分析GFP表达(图2B)。
在一些可选方式中，不管是使用自身互补AAV还是单链AAV，观察到了相同的增加作用(图2B)，表明E4ORF6/E1B55K复合物在原代人类T细胞中具有强大的解除对AAV表达的进入后限制的能力(这与第二链DNA合成的起始无关)。因此，在一些可选方式中，AAV载体可为单链的。在一些可选方式中，AAV载体可为自身互补的。在一些可选方式中，AAV载体可同时为单链的和自身互补的。
实施例3：MRN复合物是原代人类T细胞对AAV转导的主要进入后限制机制
在一些可选方式中，评估了E4ORF6/E1B55K突变体对驱动GFP表达的AAV的作用。
据报道，E4ORF6/E1B55K蛋白在培养细胞模型中提高AAV表达的能力取决于它们靶向Mre11/Rad51/NBS1DNA修复复合物(MRN)以进行降解、从而允许进入的AAV基因组避开核内检测和沉默的能力。
在一些可选方式中，为了确定该相同机制是否适用于原代人类T细胞，进行了单独的AAV驱动的基因表达或者在瞬时表达野生型E4ORF6/E1B55K蛋白或E4ORF6/E1B55K-H373A突变体和E4ORF6/E1B55K-H354突变体后的AAV驱动的基因表达的比较(图2C)。这两种突变体均在很大程度上丧失了诱导MRN降解的能力，同时完全保留了野生型E4ORF6/E1B55K的其它功能。
在一些可选方式中，以所标明的RNA剂量用编码Cas9-2A-mCherry的mRNA(1μg)以及编码E4ORF6/E1B55K(野生型)蛋白或所标明的E1B55K突变体的mRNA对原代CD4+ T细胞进行电穿孔，将其静置2-4小时，并用同时驱动TCRα向导和GFP表达的ssAAV进行转导(图2C)。对于各个所标明的点，E4ORF6 mRNA剂量与各E1B55K RNA剂量相同(图2C)。将细胞置于培养中2天，随后收集细胞并通过流式细胞术分析GFP MFI。也参见图3，证明了由E4ORF6/E1B55KH373A突变体复合物催化的GFP表达增加了2-3倍，而在与由野生型E4ORF6/E1B55K复合物催化的GFP表达相同的规模上，这一增加是不可见的。
在一些可选方式中，如通过GFP MFI所评估的，与野生型E4ORF6/E1B55K相比，E1B55K突变体在以剂量依赖性方式解除对AAV表达的进入后限制方面的效率明显较低。因此，在一些可选方式中，E1B55K MRN降解突变体证明了需要MRN失活以完全解除对AAV介导的表达的进入后限制(图2C)。
在一些可选方式中，进行重复(replicate)实验，其中，将原代CD4+人类T细胞或CD3+人类T细胞用编码Cas9-2A-mCherry蛋白质的mRNA(1μg)和编码野生型E4ORF6/E1B55K或所标明的E4ORF6/E1B55K突变体的mRNA(各0.03μg)进行电穿孔，静置2-4小时，并用驱动向导表达和GFP的AAV进行转导。将细胞置于培养中，持续所标明的时间段，随后收集细胞并通过流式细胞术分析GFP表达和平均荧光强度(MFI)并进行定量。图3A和图3B表示n＝5-6次独立实验。
在一些可选方式中，使用E1B55K-H373A突变体以较小规模进行分析的重复实验证明了，相比于在不存在E4ORF6/E1B55K表达的情况下观察到的结果，E4ORF6/E1B55K-H373A表达能够支撑显著更高水平(在96小时为1.58±0.09倍)的GFP表达，这与其具有解除进入后转导或表达限制的残余能力一致(图3A和图3B)。
在一些可选方式中，使用两个另外的突变体：破坏E1B55K催化p53降解的能力的E1B55K R240A(SEQ ID NO：22；图33)；以及低效地结合至E1B55K而通常产生功能减退的E4ORF6/E1B55K复合物的E4ORF6AXA(SEQ ID NO：23；图34)，对其它已知的E4ORF6/E1B55K功能性能力在解除T细胞中对AAV转导的进入后限制方面的作用进行了评估。在一些可选方式中，E4ORF6AXA突变体具有两种多态性：R243A和L245A(SEQ ID NO：23；图34)。
这些突变体表现出降解MRN复合物的完全能力(R240A)或部分能力(AXA)，并且与MRN在T细胞中对AAV表达的进入后限制的关键作用一致。这些突变体保留了在AAV转导T细胞后提高GFP表达的全部能力(R240A)或部分能力(AXA；数据未示出)(图3C和图3D)。在一些可选方式中，如图3所示，AXA/E1B55K表达仅能够在高剂量mRNA电穿孔(0.33μg)下提高来自AAV载体的GFP表达，并且不低于10倍。
因此，在一些可选方式中，在考虑之列的是使用E4ORF6蛋白和E1B55K蛋白的野生型和突变形式的各种组合。例如，在一些可选方式中，E4ORF6蛋白不同形式中的任一种(例如野生型或AXA突变体)可与E1B55K蛋白不同形式中的任一种(例如野生型、H373A突变体、H354突变体、R240A突变体)联合使用。在一些可选方式中，E4ORF6和E1B55K的野生型和突变形式的各种组合可以作为不同的mRNA递送。在一些可选方式中，E4ORF6和E1B55K的野生型和突变形式的各种组合可以作为单个mRNA递送。
实施例4：H373A和H354突变型E4ORF6/E1B55K表达提高原代人类T细胞中CRISPR介导的敲除
在一些可选方式中，评估了通过使用腺病毒E4ORF6/E1B55K蛋白来提高原代人类T细胞中CRISPR介导的基因敲除。
基于本文分析中E4ORF6/E1B55K蛋白提高AAV驱动的GFP表达的能力，假设它们的瞬时表达将类似地提高来自于整合到AAV基因组的polIII驱动的U6启动子/向导RNA表达盒的向导RNA表达的水平和/或持续时间，并且因此可通过mRNA/AAV系统提高Cas9介导的基因破坏效率。
在一些可选方式中，该假设通过使用mRNA/AAV共递送方案表达野生型E4ORF6/E1B55K蛋白来进行测试，所述共递送方案通过在电穿孔步骤中包括它们各自的mRNA和Cas9，接着用编码TCRα向导RNA和启动子/GFP表达盒两者的AAV载体转导细胞。因此，评估了E4ORF6/E1B55K突变体对AAV驱动的GFP表达的作用。
在一些可选方式中，如从图2中的分析所预期的，野生型E4ORF6/E1B55K蛋白的表达显著增加了来自于TCRα向导/GFP AAV的GFP表达。
在一些可选方式中，尽管基于AAV的表达显著增加，但仅观察到TCRα敲除水平适度增加(图4A)，并且仅在较低的AAV载体剂量下观察到(图4B，上图)。
在一些可选方式中，观察到了在缺少Cas9表达时未观察到的明显毒性(表现为随时间推移的CD3-细胞损失，而不是稳定水平)。在一些可选方式中，用编码Cas9-T2A-mCherry蛋白质的mRNA(1μg)以及所标明的高剂量或低剂量(0.33μg或0.03μg)的编码E4ORF6/E1B55K野生型蛋白或所标明的突变体的mRNA对原代CD4+人类T细胞或CD3+人类T细胞进行电穿孔，将其静置2-4小时，并用驱动TCRα向导表达的AAV进行转导。将细胞置于培养中，并在所标明的时间点通过流式细胞术分析TCRα/CD3表达(图5A)。
在一些可选方式中，为了获得有关E4ORF6/E1B55K复合物的特定生化活性对基因编辑结果的影响的信息，还表达了H373A突变体、H354突变体、R240A突变体和AXA突变体，并比较了各种情况下的TCRα敲除效率(图4)。
在一些可选方式中，示出了关于原代CD4+ T细胞的代表性实验的数据，所述细胞用编码Cas9-T2A-mCherry的mRNA(1μg)、编码E4ORF6/E1B55K(野生型)或者所标明的突变体的mRNA(各为0.33μg或0.03μg)进行电穿孔，静置2-4小时，并用驱动TCRα向导表达的AAV进行转导(图4A)。在EP/转导后，将细胞置于培养中，随后在所标明的时间点收集细胞并通过流式细胞术分析CD3表达。图4A的上图示出了CD3敲除的定量。图4A的下图示出了在EP/转导7天后来自实验子集的代表性流式图。
在一些可选方式中，E1B55K突变体提高了使用mRNA/AAV递送CRISPR组分而实现的基因敲除。尽管E4ORF6与E1B55K-H373A突变体和E1B55K-H354突变体的表达对GFP表达产生了预料之中的小得多的影响(即图2C)，但是出乎意料的是，也观察到了不伴有毒性或CD3-细胞损失的TCRα敲除效率的大幅增加(图4A和图5A)。
在一些可选方式中，尽管它们不能完全地解除对AAV基因表达的转导后限制，但是这些E1B55K突变体保留了足以显著提高用mRNA/AAV递送手段可实现的基因敲除的整体效率的残余活性。在一些可选方式中，这得到了当表达E4ORF6/E1B55K R240A突变体时获得的结果的支持。在一些可选方式中，获得了相对于野生型E4ORF6/E1B55K所获得的毒性而言增强的毒性以及显著降低的CD3敲除效率(图4A和图4C)。在一些可选方式中，p53失活(在这方面，R240A效力不足但H373A突变体和H354突变体中得以保留)有助于H373A和H354的敲除增强特性。
在一些可选方式中，正如通过将原代CD4+ T细胞用编码Cas9-T2A-mCherry蛋白的mRNA(1μg)以及编码野生型E4ORF6/E1B55K蛋白或者所标明的E1B55K突变体的mRNA进行电穿孔，静置2-4小时，并用驱动TCRα向导表达的AAV进行转导所确定的，使用mRNA/AAV递送而编辑的T细胞显示出正常的扩增动力学。将细胞置于培养中，持续所标明的时间段，在此期间收集等份细胞并计数以对细胞扩增进行定量。图4C的左图示出了电穿孔低剂量(0.03μg)E4ORF6/E1B55K突变体及转导高剂量AAV(MOI～6000)。图4C的右图示出了低剂量和高剂量(0.33μg)E4ORF6/E1B55K-R240A RNA以及低剂量和高剂量AAV的电穿孔和转导。
在一些可选方式中，H373A突变体和H354突变体在它们对Cas9介导的基因破坏的作用方面表现出相当大的功效，H373A突变体的剂量/应答测试证明了在mRNA剂量低至<0.04μg时，其保持几乎全部的提高TCRα敲除的作用(图5B)。在一些可选方式中，mRNA剂量可为0.01μg-1μg。在一些可选方式中，mRNA剂量可为0.01μg、0.02μg、0.03μg、0.04μg、0.05μg、0.06μg、0.07μg、0.08μg、0.09μg、0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg、0.5μg、0.6μg、0.7μg、0.8μg、0.9μg或1μg，或者在由上述任何两种剂量所限定的范围内。
在一些可选方式中，在图5B中示出了原代CD4+人类T细胞的代表性流式图，该细胞用编码Cas9-T2A-mCherry蛋白的mRNA(1μg)和所标明的剂量的编码E4ORF6/E1B55K H373A的mRNA进行电穿孔，静置2-4小时，并用驱动TCRα向导表达的AAV进行转导。将细胞置于培养中一周，然后收集细胞并通过流式细胞术分析TCRα/CD3表达(图5B)。
在一些可选方式中，评估了E4ORF6/E1B55K MRN-失活缺陷型突变体对CRISPR介导的敲除的作用(图4B)。在一些可选方式中，进行了两个不同AAV MOI下的n＝3-4的独立实验的定量。在一些可选方式中，使用原代人类CD4+ T细胞或CD3+ T细胞的数据表明了E1B55KH373A突变体和H354突变体均显著增加CRISPR介导的TCRα敲除(在EP/转导7天后通过CD3染色进行定量)(图4B)。因此，在一些可选方式中，E4ORF6/E1B55K突变体提高了TCR敲除。
在一些可选方式中，评估了E4ORF6/E1B55K MRN突变体对indel谱的作用。将原代CD4+人类T细胞用编码Cas9-T2A-mCherry蛋白的mRNA(1μg)和编码E4ORF6/E1B55K H373A或H354的mRNA(0.03μg)进行电穿孔，静置2-4小时，并用驱动TCRα向导表达的AAV进行转导。将细胞置于培养中一周，随后收集细胞，分离基因组DNA，使用PCR扩增TCRα周围的区域，克隆到载体中，并使用Sanger测序进行分析(图5C)。
在一些可选方式中，在H373A突变体和H354突变体E4ORF6/E1B55K复合物二者的情况下，由Cas9介导的基因破坏产生的indel谱的扩增子测序证明了在预料之中的较高的突变率以及跨越预测的Cas9切割位点的较大缺失(高达150bp)的比例增加(图5C)。在一些可选方式中，突变率增加1.5倍-10倍。在一些可选方式中，突变率增加1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍或10倍，或者在由上述任何两个值所限定的范围内。
实施例5：E4ORF6/E1B55K H373A突变体和E4ORF6/E1B55K H354突变体提高原代人类T细胞中CRISPR/Cas9介导的同源重组
考虑到它们的生化活性和提高由mRNA/AAV共递送方法可实现的基因破坏效率的能力，假设E4ORF6/E1B55K H373A突变体和E4ORF6/E1B55K H354突变体将对同源介导的基因靶向率具有类似的增加作用。为了检验这一假设，将Cas9 mRNA与E4ORF6和野生型E1B55K、H373A突变体或H354突变体mRNA一起电穿孔至原代人类T细胞中，然后分别用不同的AAV载体转导细胞以提供向导RNA表达和重组模板递送(图10)。
在一些可选方式中，可在不同AAV载体中提供一种或多种向导RNA。在一些可选方式中，可在不同AAV载体中提供用于同源重组的一种或多种模板。在一些可选方式中，可在相同AAV载体中提供一种或多种向导RNA以及用于同源重组的一种或多种模板。在一些可选方式中，可在不同AAV载体中提供一种或多种针对特定靶基因的向导RNA和用于同源重组的模板。在一些可选方式中，可在相同AAV载体中提供一种或多种针对特定靶基因的向导RNA和用于同源重组的模板。
使用MaxCyte GT系统或Neon系统将原代CD4+ T细胞或CD3+ T细胞用编码Cas9-2A-mCherry蛋白的mRNA(1μg)和编码野生型E4ORF6/E1B55K蛋白或所标明的E1B55K突变体的mRNA(各0.03μg)进行电穿孔，静置2-4小时，并用驱动CCR5向导表达以及针对CCR5基因座的靶向模板的不同AAV进行转导(图15)。将细胞置于培养中，随后收集细胞并通过流式细胞术分析BFP表达。示出了来自n＝5-6的独立实验的EP/转导3周后的由所标明的操作而来的代表性流式图(图10A)。
在一些可选方式中，进行了在EP/转导3周后相对于基线(Cas9+向导+供体)的敲入频率(BFP+细胞)的倍数变化的n＝5-6的独立实验的定量(图10B)。
在这些实验中，单独的Cas9加上两种AAV允许以17.6±4.0％的效率将启动子-BFP表达盒整合到CCR5基因座中。在一些可选方式中，与本文中使用各种E4ORF6/E1B55K复合物观察到的结果一致，相对于H373A突变体或H354突变体或没有任何Ad5蛋白的情况，观察到由野生型E4ORF6/E1B55K复合物引起的早期BFP表达大幅增强(图6，上图)。
在一些可选方式中，使用E4ORF6/E1B55K-H354突变体或E4ORF6/E1B55K-H373A突变体和CRISPR/Cas9时HDR的倍数变化显著增加(图10B)。在一些可选方式中，类似于这些突变体复合物各自对基因敲除的作用，任一突变体复合物的表达产生了显著更高的基于重组的基因组编辑效率(图10A和图10B)，将HDR增加了1.8倍(H373A的BFP+为31.2±5.7％；H354的BFP+为30.8±1.8)。
在一些可选方式中，与使用野生型E4ORF6/E1B55K蛋白时的情况相比，使用E4ORF6/E1B55K-H354或E4ORF6/E1B55K-H373A和CRISPR/Cas9可将HDR率增加1.5倍-3.5倍。在一些可选方式中，HDR率可增加1.5倍、1.75倍、2倍、2.25倍、2.5倍、2.75倍、3倍、3.25倍或3.5倍，或者在由上述任何两个值所限定的范围内。
因此，在一些可选方式中，使用E1B55K突变蛋白可实现提高的靶向敲入。在一些可选方式中，E4ORF6/E1B55K突变体可提高靶向CRISPR敲入。在一些可选方式中，E4ORF6/E1B55K H373A突变体和E4ORF6/E1B55K H354突变体提高了用mRNA/AAV共递送实现的CRISPR介导的重组。
为了确定经由mRNA/AAV CRISPR介导的重组而编辑的T细胞是否显示正常的扩增动力学，将原代T细胞用编码对照或Cas9-2A-mCherry蛋白的mRNA(1μg)和编码野生型E4ORF6/E1B55K和E1B55K突变体的mRNA(各0.03μg)进行电穿孔，静置2-4小时，并用驱动CCR5向导表达的AAV以及AAV CCR5BFP模板进行转导。将细胞置于培养中，持续所标明的时间段，随后收集细胞并计数以对细胞扩增进行定量(图10C)。
重要的是，E4ORF6/E1B55K复合物(无论是野生型还是突变型)的表达没有影响已经经受同源介导的基因靶向的T细胞的扩增率(图10C)。
实施例6：E4ORF6/E1B55K突变体蛋白不提高非同源AAV插入
在一些可选方式中，将原代CD3+ T细胞或CD4+ T细胞用编码Cas9-2A-mCherry蛋白的mRNA(1μg)和编码野生型E4ORF6/E1B55K蛋白或所标明的E1B55K突变体的mRNA(各0.03μg)进行电穿孔，静置2-4小时，并用驱动CCR5向导表达的AAV和含有启动子-GFP表达盒而没有侧翼同源臂的AAV进行转导。将细胞置于培养中，持续所标明的时间段，随后收集细胞并通过流式细胞术分析GFP表达。在96小时时检测到的GFP荧光反映了主要来自于游离(episomal)AAV基因组的表达。在3周时检测到的GFP荧光表示了来自于残留的游离AAV基因组或整合的AAV基因组二者的表达。n＝5-6次独立实验(图6)。
在一些可选方式中，图6中所示的原代T细胞的代表性流式图证明了由缺乏同源臂的AAV引起的Cas9诱导的双链断裂处的插入事件率较低。
重要的是，正如通过共递送Cas9与表达相同向导的AAV和缺少CCR5同源臂的启动子/荧光团表达盒之后的长期荧光团表达率所评估的，E4ORF6/E1B55K复合物(无论是野生型还是突变型)的表达并没有影响非同源AAV整合率(图6，上图)。
因此，在一些可选方式中，E4ORF6/E1B55K野生型蛋白轻度地增加CRISPR敲除的靶位点处的非特异性AAV整合，而突变蛋白则不会。
实施例7：E4ORF6/ElB55K突变体提高除TCR基因座之外的其它基因座处的CRISPR单敲除(single knockouts)
在一些可选方式中，评估了E4ORF6/E1B55K H373A突变体复合物和E4ORF6/E1B55KH354突变体复合物在其它基因组靶点处对CRISPR/Cas9基因破坏的效率的影响。在一些可选方式中，产生并验证了靶向四种翻译相关的人表面蛋白靶标(T细胞抑制检查点蛋白PD-1、TIGIT、LAG-3和Tim3)的向导RNA。靶向这些蛋白的向导RNA中针对PD1的示于SEQ ID NO：18(图31)中、针对TIGIT的示于SEQ ID NO：19(图31)中、针对LAG-3的示于SEQ ID NO：20(图31)中以及针对Tim3的示于SEQ ID NO：21(图31)中。在一些可选方式中，将这些向导RNA中的一种或多种在MND-GFP表达盒的上游并入AAV载体骨架中的U6-向导表达盒中，以提供对转导/表达的追踪，并包装到AAV载体中。
使用MaxCyte GT系统将原代人类CD3+ T细胞用编码Cas9-2A-mCherry蛋白的mRNA(1μg)和编码E4ORF6/E1B55K-H373A蛋白的mRNA(各0.03μg)进行电穿孔，静置2-4小时，并用驱动针对所标明的表面蛋白的向导表达的AAV进行转导。将细胞置于培养中并使其扩增；在初次刺激9-12天后，使用Dynal CD3/CD28珠再次刺激细胞48小时，随后收集细胞并通过流式细胞术分析所标明的表面蛋白的表达，并通过扩增子测序对敲除进行评估。代表性流式细胞图表明了使用mRNA/AAV共递送而编辑的T细胞显示出靶向表面检查点蛋白的损失。数据代表n＝3-5的独立编辑实验。代表性流式细胞数据示于图7A中。
在一些可选方式中，由流式细胞术进行的敲除分析通过诱导表面蛋白表达的百分比损失来进行评估。数据表示n＝3-5的独立编辑实验(图7B)。来自基因敲除的流式细胞分析以及来自基因组靶位点的扩增子的测序分析的定量和总结数据示于图7B中。
因此，在一些可选方式中，敲除效率可通过对来自基因组靶位点的扩增子进行测序分析来评估。在一些可选方式中，敲除效率可通过流式细胞术(如果靶基因编码的蛋白质在表面上表达)来评估。因此，在一些可选方式中，敲除效率可通过对来自基因组靶位点的扩增子进行测序分析以及通过流式细胞术对表面表达进行分析(如果靶基因编码的蛋白质在表面上表达)来评估。
在一些可选方式中，基于MaxCyte GT电穿孔系统，以规模加大的扩增/制造方案来使用这些AAV载体与E4ORF6/E1B55K H373A突变体导致产生如下人类T细胞群：正如来自测序分析(PD-1、TIGIT、Tim3)或流式细胞术(LAG-3)的结果，所述人类T细胞群在PD-1、TIGIT、LAG-3和Tim3的预期切割位点处各自大概的靶向基因破坏效率分别为：71.6±2.7％、59.1±14.8％、59.2±8.5％和66.1±14.3％的indel。
因此，在一些可选方式中，以mRNA/AAV递送实施CRISPR/Cas9能够在多个基因组位点处实现有效敲除。
从这些实验中得到的第二个重要的观察结果是，当特定向导RNA的活性相对较低时，E4ORF6/E1B55K H373A突变体复合物对基因破坏效率的影响尤其突出。例如，与在缺少E4ORF6/E1B55K表达的情况下的敲除率(分别为仅36.4±10.9％和40.4±3.6％)相比，在存在E4ORF6/E1B55K H373A的情况下，以所选择的向导RNA进行的PD-1和TIGIT基因座处的敲除率加倍。在一些可选方式中，通过测序来评估比率。
因此，在一些可选方式中，E4ORF6/E1B55K H373A表达的特别突出的特征是它可以“挽救”不良向导RNA活性。换言之，在一些可选方式中，E4ORF6/E1B55K H373A表达可增强不良向导RNA的活性。在一些可选方式中，E4ORF6/E1B55K蛋白表达并不能有效地增强高活性向导RNA的作用。
在一些可选方式中，不良向导RNA的效率只有5％-30％。在一些可选方式中，不良向导RNA的效率仅有5％、10％、15％、20％、25％或30％，或者在由上述任何两个值所限定的范围内。在一些可选方式中，E4ORF6/E1B55K H373A表达使不良向导RNA的活性增强了5％-150％。在一些可选方式中，E4ORF6/E1B55K H373A表达使不良向导RNA的活性增强了5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％或150％，或者在由上述任何两个值所限定的范围内。
实施例8：H373A突变型E4ORF6/E1B55K表达提高原代人类T细胞中CRISPR介导的两个基因的多重敲除
根据本文中我们的分析，假设使用单个AAV载体来递送多个向导可成功地实现有效水平的多重敲除。在一些可选方式中，可使用单个AAV载体来递送一种或多种向导。在一些可选方式中，可使用单个AAV载体来递送1种-5种向导。在一些可选方式中，可使用单个AAV载体来递送1种、2种、3种、4种或5种向导。在一些可选方式中，使用1个AAV载体来递送单个向导。在一些可选方式中，使用不同AAV载体来递送不同向导。
在一些可选方式中，使用MaxCyte GT系统，将原代人类CD3+ T细胞用编码Cas9-2A-mCherry蛋白的mRNA(1μg)和编码E4ORF6/E1B55K-H373A蛋白的mRNA(各0.03μg)进行电穿孔，静置2-4小时，并用驱动针对Tim3和TCRα的向导表达以及用于追踪转导效率的GFP表达的AAV进行转导。将细胞置于培养中并使其扩增；在EP/转导后7天，通过CD3染色评估细胞的TCRα敲除。初次刺激后3周，使用PMA/离子霉素(ionomycin)对细胞再次刺激3-4小时并使其恢复48小时，然后收集细胞并通过流式细胞术分析Tim3表达(图8)。
在一些可选方式中，使用与单AAV向导载体相同的构造，构建了双向导Tim3/TCRα载体(两种向导均由各自的U6启动子驱动)。具有各自的U6启动子的表达针对Tim3和TCRα的向导RNA的多重AAV载体的示意图示于图8A中。在一些可选方式中，在用Cas9或E4ORF6/E1B55K-H373A进行MaxCyte电穿孔并用单Tim3向导AAV或含有双Tim3/TCRα向导的AAV进行AAV转导后，对TCRα和Tim3敲除进行分析。
在EP/转导7天后，通过CD3染色进行的TCRα敲除的代表性流式细胞分析示于图8B中。在初次刺激3周后的TCRα敲除和Tim3敲除的代表性流式细胞分析示于图8C中。在一些可选方式中，为了独立于TCR而上调Tim3表面表达，使用PMA/离子霉素(分别为10ng/mL和1μg/mL)刺激细胞3-4小时并静置48小时。
在一些可选方式中，通过对进行和不进行PMA/离子霉素处理的对照细胞(仅经AAV处理)以及具有Tim3敲除的经刺激的细胞(与同时缺失Tim3和TCRα的经刺激的细胞相比)进行比较来评估进行和不进行PMA/离子霉素刺激的Tim3的上调。在TCRα信号传导十分有效的细胞和TCRα信号传导有缺陷的细胞之间没有差异，说明了PMA/离子霉素刺激独立于该途径。如图8D中所示的，灰色阴影的是未染色的细胞。
在一些可选方式中，获得了如下结果：用单个AAV成功敲除了两种靶基因；以及当E4ORF6/E1B55K-H373A与Cas9共转染时，敲除效率增加。
在一些可选方式中，观察到单Tim3向导AAV和双Tim3向导/TCRα向导AAV之间的敲除效率的显著差异。另外，在一些可选方式中，大部分Tim3-细胞也是CD3-细胞(因此为TCRα-)，这与预期的结果(对于经充分良好的转导以驱动向导表达来切割一个靶基因的任何细胞而言，同样经历了针对其它靶基因的高水平向导表达)一致。
因此，在一些可选方式中，Cas9 mRNA/AAV向导递送能够在具有E4ORF6/E1B55KH373A表达的原代人类T细胞中实现有效的CRISPR介导的多重敲除。在一些可选方式中，E4ORF6/E1B55K突变体增强CRISPR介导的对超过一个基因的多重敲除。在一些可选方式中，E4ORF6/E1B55K突变体增强CRISPR介导的对两个基因的多重敲除。
实施例9：H373A突变型E4ORF6/E1B55K表达增强原代人类T细胞中CRISPR介导的5个基因的多重敲除
在一些可选方式中，进行了5个基因的多重敲除。在一些可选方式中，将细胞培养3周，并在进行分析之前使其扩增。未受刺激的细胞未显著表达细胞表面蛋白。用PMA(10ng/mL)和离子霉素(1μg/mL)对各条件下的一百万个细胞进行刺激以上调表面检查点蛋白表达。将PMA/离子霉素留在培养基中3小时，然后用PBS洗涤细胞4次，并留在完全培养基中恢复48小时，并对指定的细胞表面蛋白(CD3、PD1、Tim3、Lag3和TIGIT)进行染色作为基因敲除的量度。
数据示于图9中。上图示出了仅接受Cas9RNA和AAV向导构建体的细胞的数据。下图示出了在电穿孔期间接受Cas9RNA、AAV向导构建体和E4ORF6/E1B55K-H373A RNA的细胞的数据。
在一些可选方式中，实现了5个基因的同时多重缺失。因此，在一些可选方式中，本公开的方法可用于缺失至少2个基因。在一些可选方式中，本公开的方法可用于缺失至少5个基因。在一些可选方式中，本公开的方法可用于缺失1个-10个基因。在一些可选方式中，本公开的方法可用于缺失1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个基因。在一些可选方式中，本公开的方法可用于缺失至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个基因。
在一些可选方式中，可使用AAV转导来递送靶向一个或多个基因的一种或多种向导RNA。在一些可选方式中，可使用AAV转导来递送靶向1个-10个基因的1种-5种向导RNA。在一些可选方式中，可使用AAV转导来递送靶向1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个基因的1种、2种、3种、4种或5种向导RNA。
实施例10：当在CCR5基因座处使用较短同源臂进行CRISPR-Cas9基因敲入时，添加E4ORF6/E1B55K H373A挽救了HDR
在一些可选方式中，评估了添加Ad5蛋白(两种E1B55K突变体H373A或H354，两者都和E4ORF6一起)对由使用具有较短同源臂的模板和CRISPR/Cas9导致的较低水平的HDR敲入的作用。
在一些可选方式中，图11中示出了原代人类T细胞的n＝2-5次实验的定量，该T细胞用Cas9RNA、表达针对CCR5基因的向导的AAV、含有具有不同同源臂长度(0.8kb、0.5kb和0.25kb)的GFP敲入构建体的AAV供体以及表达E4ORF6/E1B55K H354突变蛋白或E4ORF6/E1B55K H373A突变蛋白的RNA进行处理。HR的倍数变化在电穿孔和转导3周后基于从基线(此处定义为CRISPR-Cas9和含有0.8kb同源臂的AAV供体)起的变化来计算。
在一些可选方式中，同源臂的长度可处于0.05kb-1kb的范围内。在一些可选方式中，同源臂的长度可为0.05kb、0.075kb、0.1kb、0.15kb、0.2kb、0.25kb、0.3kb、0.35kb、0.4kb、0.45kb、0.5kb、0.55kb、0.6kb、0.65kb、0.7kb、0.75kb、0.8kb、0.85kb、0.9kb、0.95kb或1kb，或者在上述任何两个长度所限定的范围内。
在一些可选方式中，如图11中所示，添加E4ORF6/E1B55K H373A蛋白显著挽救了因使用较短同源臂而造成的低HDR率。针对CCR5基因座示出了数据。
在一些可选方式中，添加Ad5蛋白(两种E1B55K突变体H373A或H354，两者均和E4ORF6一起)可挽救由于使用具有较短同源臂的模板和CRISPR/Cas9导致的较低水平的HDR敲入。在一些可选方式中，HDR的倍数变化可处于50％到150％的范围内。在一些可选方式中，HDR的倍数变化可为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％或150％，或者在由上述任何两个值所限定的范围内。
实施例11：当在TCR基因座处使用较短同源臂进行CRISPR-Cas9基因敲入时，添加E4ORF6/E1B55K H354挽救了HDR
在一些可选方式中，针对TCR基因座，评估了当使用较短同源臂进行CRISPR-Cas9基因敲入时，添加E4ORF6/E1B55K H354对同源介导的修复(HDR)的作用。
在一些可选方式中，用CD3/CD28珠刺激1×106个T细胞48小时，并用编码图中(图12A)图例上所标明的蛋白质的RNA组合进行电穿孔。Cas9mRNA为1.0μg。Ad5蛋白各为0.1μg(0.1μg E4ORF6和0.1μg E1B55K H354突变体)。编码修复模板和向导的AAV是以培养体积的10％来使用的碘克沙醇浓缩的病毒制剂。
在一些可选方式中，H354突变体增加TCR基因座处的敲入(图12A)。在图12B的柱状图中，NHEJ率显示为红色，HR率显示为蓝色。在一些可选方式中，使用H354突变体大幅增加了通过同源介导的修复测定而消除的断裂的百分比。
在一些可选方式中，所观察到的HDR早在电穿孔后第4天就已经发生了(图12C)。在一些可选方式中，H354突变体偏向于增加HDR而不显著增加NHEJ。在一些可选方式中，当存在模板时，H354突变体偏向于增加HDR而不显著增加NHEJ。
实施例12：具有E4ORF6/E1B55K H373A的经编辑的原代T细胞显示出正常表面标志物表型
在一些可选方式中，为了评估E4ORF6/E1B55K H373A突变体的表达是否在编辑过程中不利地影响了T细胞表型或信号传导性质，在编辑2周后，评估了一组表面标志物的表达以及测量的PHA诱导的钙信号传导。
在一些可选方式中，图13A中示出了原代CD4+ T细胞的代表性流式图，该原代CD4+T细胞用编码Cas9-2A-mCherry蛋白的mRNA(1μg)和编码E4ORF6/E1B55K H373A蛋白的mRNA(各0.03μg)进行电穿孔，并用驱动TCRα向导表达的AAV进行转导(图13A)。将细胞置于培养中，并在EP/转导16-20天后，通过流式细胞术评估表面蛋白标志物。n＝2次独立实验(图13A)。
对细胞表面标志物(在使用mRNA/AAV共递送来编辑的T细胞中限定初始T细胞群和记忆T细胞群)的流式细胞评估显示了正常表面标志物表型，并且在经编辑的群体与未经编辑的群体之间没有差异(图13A)。
实施例13：经由mRNA/AAV共递送使TCR有缺陷的T细胞在TCR信号传导中有缺陷
在一些可选方式中，将原代CD4+ T细胞用编码Cas9-T2A-mCherry蛋白的mRNA(1μg)和编码E4ORF6/E1B55K H373A的mRNA(各0.03μg)进行电穿孔，静置2小时，并用驱动TCRα向导表达的AAV进行转导。EP/转导9天后，将CD3-细胞用CD3微珠(Miltenyi Biotech)进行纯化并放回培养中。将细胞扩增十天，随后收集细胞，重悬于Hanks钙信号缓冲液中，用100μM Indo钙染料孵育30分钟，并通过流式细胞术分析抗CD3-刺激的(anti-CD3-stimulated)钙信号传导。用200μg/mL PHA刺激细胞。各条件下使用500万个细胞(图13B)。
在一些可选方式中，经编辑的T细胞在TCRα基因编辑后显示出表面TCR的损失，相对于保留表面TCR的细胞而言显示出动员Ca2+以应答PHA刺激的能力损失(图13B)。因此，在一些可选方式中，使用E4ORF6/E1B55K突变体而得的TCR敲除T细胞在Ca2+信号传导中有缺陷。
实施例14：细胞在多重CRISPR编辑后显示出正常核型
由于同时诱导多重双链断裂的潜在后果是易位，所以在一些可选方式中，将核型分析作为检测与细胞工程化相关的易位的无偏手段(unbiased approach)而进行，并且在来自各种条件下的20个中期展布(metaphase spreads)的任一者中没有观察到任何明显异常(图14)。
在一些可选方式中，GTW染色后的G显带分析表明在经过由E4ORF6/E1B55K-H373A进行的CRISPR/Cas9编辑的细胞中表型正常(图14)。使用PMA/离子霉素刺激细胞3-4小时，并使其恢复72小时。所有样品都实现了中期展布。每个样品创建20个中期展布并使用G显带核型分析来进行分析。在一些可选方式中，在所有样品中均没有检测到异常(图14)。
在一些可选方式中，代表性图像(图14A)示出了用Cas9(1μg)和表达针对Tim3和TCRα的向导的AAV处理的细胞中的正常核型。敲除频率可见于图8B和图8C。
代表性图像(图14A)示出了用Cas9(1μg)和表达针对Tim3和TCRα的向导的AVV以及E4ORF6/E1B55K-H373A RNA(0.03μg)处理的细胞中的正常核型。敲除频率可见于图8B和图8C。
对核型分析而言，在一些可选方式中，在PMA/离子霉素刺激后对于每个样品将约20×106个细胞用于分析，并从各样品中成功地获得了中期展布。来自核型分析结果的数据示于表1中。
表1
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在一些可选方式中，在所标明的条带分辨率下，在所分析的20个展布的任一者中没有检测到可辨别的异常，说明易位率小于5％，表明了具有双基因敲除的细胞通常不具有明显的重排/核型异常。
实施例15：用E4ORF6/E1B55K H373A或E4ORF6/E1B55K H354进行CRISPR-Cas9断裂后的精确HDR事件的分子确认
HDR事件的分子性质通过经由接合(junctions)进行测序以确认无缝(seamless)HDR来评估(图15)。示出了具有同源臂和BFP插入片段的供体模板的示意图。标明了引物结合位点，所得扩增子(1.3kb)示于图15A中。图15A中示出了指明来自引物的PCR结果的代表性琼脂糖凝胶图。结果来自于n＝3的独立PCR实验，来自于由图10所示的数据获得的细胞。将来自于图15B的PCR产物进行纯化，克隆到载体中并进行测序。如图15A所示，示出的代表性扩增子表明了在3'同源臂上游区域和下游区域处的精确接合(分别为1和2)。没有获得具有非精确接合的克隆，也没有获得包含基于AAV的ITR序列的任何克隆。
因此，在一些可选方式中，正如通过用E4ORF6/E1B55K H373A或E4ORF6/E1B55KH354进行CRISPR-Cas9断裂后的精确HDR事件所确认的，靶向整合的确是无缝整合。
实施例16：用于产生TCR敲除的不同向导RNA的可选方式的比较
在一些可选方式中，将CRISPR-Cas9系统用于产生TCR敲除。人类TCRαδ基因座对应于chr14NG_001332.2。TCRα基因内的位置对应于1,071,537-1,071,809。
在一些可选方式中，使用向导1(SEQ ID NO：15；图16A)、向导2(SEQ ID NO：16；图16A)、向导3(SEQ ID NO：17；图16A)以及向导4(SEQ ID NO：5；图16A)的向导RNA。
在一些可选方式中，将原代T细胞用Cas9-mCherry mRNA进行转染，随后用AAV向导进行转导。来自四个不同实验的数据示于图16B-图16I中。
在一些可选方式中，比较了当使用向导1-向导4的向导RNA时来自供体1的原代T细胞中TCR敲除的产生效率。在来自供体1的原代T细胞中24小时时的Cas9-mCherry表达是可比的，与所用向导RNA序列的可选方式无关(图16B)。所有AAV向导RNA使用相同的MOI。对照示于图16B的上图中。
在一些可选方式中，比较了当使用向导1-向导4的向导RNA时来自供体1的原代T细胞中TCR敲除的产生效率，显示出向导4(图16A)获得了最高的敲除效率(90％)(图16C)。使用抗CD3-Alexa488抗体在168小时时进行流式细胞分析。对照示于图16C的上图中。图21也示出了向导4产生了最高的TCRα敲除的数据。
在一些可选方式中，比较了当使用不同体积的Cas9/向导样品时来自供体1的原代T细胞在24小时时的Cas9-mCherry表达水平，显示出在20μL体积下表达Cas9-mCherry的细胞的百分比(96.4％)略高于10μL(87.2％)或15μL(85.1％)下的情况(图16D)。对照示于图16D的上图中。
在一些可选方式中，比较了当使用不同体积的含有向导4的样品时来自供体1的原代T细胞中TCR敲除的产生效率，在20μL体积下产生了最高的效率(91.9％)。在10μL下的效率为73.2％，在15μL下的效率为78.2％(图16E)。使用抗CD3-Alexa488抗体在168小时时进行流式细胞分析。对照示于图16E的上图中。
在一些可选方式中，比较了当使用不同体积的Cas9/向导样品时来自供体2的原代T细胞在24小时时的Cas9-mCherry表达水平，显示出在5μL(91％)、10μL(90.2％)和20μL(90.8％)的样品体积下表达Cas9-mCherry的细胞的百分比相似(图16F)。
在一些可选方式中，比较了当使用不同体积的含有向导4的向导RNA的样品时来自供体2的原代T细胞中TCR敲除的产生效率，在20μL体积下产生了最高的效率(68.4％)。在5μL下的效率为30.7％，在10μL下的效率为38.4％(图16G)。使用抗CD3-Alexa488抗体在168小时时进行流式细胞分析。对照示于图16G的上图中。
在一些可选方式中，在Jurkat T细胞中24小时时的Cas9-mCherry表达是可比的，与所用向导RNA序列的可选方式无关(图16H的下图)。向导1的Cas9-mCherry的表达是最低的。所有AAV向导RNA使用相同的MOI。对照示于图16H的上图中。
在一些可选方式中，比较了当使用向导1-向导4的向导RNA时Jurkat T细胞中TCR敲除的产生效率，显示出向导4(图16A)产生最高的敲除效率(83.3％)(图16I的下图)。使用抗CD3-Alexa488抗体在168小时时进行流式细胞分析。对照示于图16I的上图中。
实施例17：使用向导4的TCRαCRISPR向导RNA的CRISPR/Cas9系统
在一些可选方式中，将原代人类CD4+ T细胞由冷冻分离物解冻，在存在细胞因子(IL-2、IL-7和IL-15)的情况下，用CD3/CD28Dynabeads(Life Technologies)在不含抗生素的培养基中刺激60小时。接下来，将珠移除，将各条件的4.5×105个细胞用10μL Neon tip进行电穿孔(电穿孔后为3×105个细胞)，并在电穿孔后3小时加入AAV。以1.5μg/样品的量(电穿孔后为1μg)使用Cas9RNA，并以1.33×104/样品的MOI添加向导特异性AAV。电穿孔后，将细胞铺于96孔板中的含有细胞因子的200μl培养基中，并置于30℃的CO2培养箱中24小时，之后将细胞移至37℃的CO2培养箱中。
在电穿孔24小时后，使用BD LSRII，用CD3-Alexa488抗体(Biolegend)检查细胞的Cas9-mCherry表达，随后在72h、96h和168h检查mCherry和TCR敲除这二者。在整个实验期间保持相同的电压。
在一些可选方式中，数据显示出向导4的TCRαCRISPR向导RNA产生了最高的TCRα敲除(图16B-图16I)。
实施例18：原代人类T细胞中CRISPR介导的基因敲除的提高的效率
CRISPR/Cas9可编程核酸内切酶系统的转化应用受到需要瞬时且同时表达足够水平的Cas9蛋白和向导RNA以在原代细胞中实现高的命中目标(on-target)的核酸酶活性的阻碍。在一些可选方式中，提供了允许在原代人类T细胞中高效进行CRISPR介导的基因编辑的mRNA/AAV分离载体系统。该手段利用mRNA表达Cas9连同腺病毒血清型5 E4ORF6蛋白和E1B55K蛋白(后者用于使T细胞能够受纳AAV转导以达到向导RNA表达的目的)。在一些可选方式中，该手段用于以高达60％的效率破坏T细胞受体α亚基基因(与翻译相关的靶标)，并证明了所获得的经编辑的T细胞群在其它方面与亲代群体在表型上是不可区分的。在一些可选方式中，该手段可偶联至基于mRNA的TREX2核酸外切酶表达，以实现甚至更高的编辑效率，表明分离-载体手段的灵活性和效力。Ad5wt蛋白的瞬时表达增加了人类T细胞中的AAV转导。Ad5wt蛋白的瞬时表达增加了ssAAV6和scAAV6这二者的AAV转导。Ad5MRN-蛋白的瞬时表达增加了原代人类T细胞中的CRISPR敲除效率。
实施例19：用TALEN增加HDR率
在一些可选方式中，在Neon转染系统(Life Technologies)上将原代人类CD4+ T细胞用0.5μg各一半的CCR5TALEN mRNA(图32A)或CD40L TALEN mRNA(图32B)不连同或连同E4ORF6/E1B55K-H373A mRNA或者不连同或连同E1B55K-H354 mRNA(各0.03μg)进行电穿孔。在电穿孔后立即将细胞置于30℃下24小时，并在培养期间恢复至37℃。电穿孔2小时后，以10％培养体积的量用含有供体模板的AAV6对细胞进行转导。在电穿孔/转导3周后，在LSRII流式细胞仪(BD Biosciences)上分析细胞的供体模板(GFP+)的敲入。
在一些可选方式中，TALEN与Ad5突变体联合使用在两个不同基因座处增加了基因靶向。因此，在一些可选方式中，TALEN与Ad5突变体联合使用在CCR5基因座(图32A)处和CD40L基因座(图32B)处增加了基因靶向。
在一些可选方式中，可使用TALEN靶向的基因数目在1个-10个之间。在一些可选方式中，可使用TALEN靶向的基因数目为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，或者在由上述任何两个数目所限定的范围内。
实施例20：基于核酸内切酶的基因组编辑
在考虑之列的是用于编辑细胞中至少一个靶基因的系统以及使用该系统进行基因组编辑的方法。所述靶基因是可通过基因破坏进行编辑的目的基因。所述细胞是原代T细胞。
所述系统包含编码一种或多种向导RNA的第一核酸序列和编码核酸内切酶蛋白的第二核酸序列。所述核酸内切酶可为本文公开的任何核酸内切酶和/或其在当前公开范围内的可选变型和修饰。所述第二核酸是mRNA并且编码任何核酸内切酶蛋白。编码核酸内切酶蛋白的第二核酸序列经密码子优化以在真核细胞中表达。所述一种或多种向导RNA与细胞中至少一个靶基因互补。所述一种或多种向导RNA在载体中提供。所述载体可为病毒载体。所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。所述AAV载体可为自身互补载体、或单链载体、或者自身互补载体和单链载体的组合。
由于许多细胞类型具有对AAV载体的进入后限制，使得AAV介导的转基因(包括向导RNA)的表达效率非常低，所以在额外的核酸序列上提供了抑制对AAV载体的进入后限制的蛋白。因此，所述系统包含编码第一腺病毒蛋白的第三核酸序列和编码第二腺病毒蛋白的第四核酸序列。所述第三核酸和第四核酸是经密码子优化以在真核细胞中表达的mRNA。所述核酸序列可以以任何顺序依次地导入细胞中，或可以同时导入细胞中。
所述第一腺病毒蛋白和第二腺病毒蛋白来自于血清型5的AAV。所述第一腺病毒蛋白是野生型E4ORF6或E4ORF6的AXA突变体。所述第二腺病毒蛋白是野生型E1B55K、或E1B55K的H373A突变体、或E1B55K的H354突变体、或E1B55K的R240A突变体。尽管突变型蛋白在抑制对AAV载体的进入后限制方面不如野生型蛋白有效，但是它们在提高基因靶向方面相对地更有效。
将所述第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列和第四核酸序列可操作地连接至在真核细胞中可操作的调控元件。所述第一核酸序列可编码一种或多种向导RNA，并且每个向导RNA可操作地连接至各自的调控元件。编码向导RNA的第一核酸序列在细胞中瞬时表达。所述一种或多种向导RNA序列与以下基因互补：TCRα基因、PD1基因、TIGIT基因、Lag3基因和/或Tim3基因。所述系统还包含与目的基因具有同源性的核酸序列区域。
将包含上述组分的系统导入原代T细胞中。与目的基因具有同源性的这些核酸序列区域指导基于核酸内切酶的系统靶向特定基因。靶向特定基因可导致基因敲除、基因敲入或两者皆有。
根据基因靶向手段的性质(敲除或敲入)，可通过流式细胞术或测序或这两者来确定结果。例如，如果所述系统用于敲除编码细胞表面表达的蛋白质的目的基因，可使用流式细胞术来检查该蛋白质的细胞表面表达的抑制和/或缺乏。或者，如果所述系统用于敲除编码细胞内表达的蛋白质的目的基因，可使用流式细胞术来检查该蛋白质的细胞内表达的抑制和/或缺乏。或者，如果所述系统用于敲入(例如将抗原的优势表位敲入编码细胞表面表达的蛋白质的目的基因)，可使用流式细胞术来检查该优势表位的细胞表面表达。或者，如果将所述系统用于敲入(例如将抗原的优势表位敲入编码细胞内表达的蛋白质的目的基因)，可使用流式细胞术来检查该优势表位的细胞内表达。在上述任何情况下，也可使用基因组DNA的DNA测序来确认所需的基因靶向事件。可同时靶向用于敲除、敲入或这两者的基因数目可为2个-5个。
通过细胞分选或其它细胞富集方法将其中的目的基因已被靶向的T细胞富集。如果富集的细胞旨在用于治疗、改善和/或抑制受试者中的疾病和/或病症，则将富集的细胞给予该受试者。例如，因为受试者中的T细胞“耗尽”，因此不能有效地清除来自疾病和/或病症的一种或多种抗原，受试者可患有该疾病和/或病症。
通过靶向一种或多种“耗尽”标志物(例如PD1、TIGIT、Lag3和Tim3)，可逆转T细胞的“耗尽”状况。将靶向T细胞给予受试者(例如通过静脉内途径)。对受试者进行后续测试以评估靶向T细胞的状态以及它们对疾病和/或病症的作用。例如，在给予靶向T细胞之后，以不同时间间隔从受试者中抽取血液。例如通过评估给予的T细胞的细胞因子(例如IL-2、TNFα)分泌来进行测试，以确定给予的T细胞是否被活化。还进行测试来确定给予靶向T细胞对疾病和/或病症的作用。
实施例21：材料和方法
DNA构建体Cas9从Addgene(质粒#41815)获得，经PCR扩增并分别克隆到pWNY骨架(自有的修饰pUC57)、pEVL200和pEVL300(具有200个或300个编码的poly A尾的线性mRNA载体)(具有T7启动子和两个核定位信号(NLS)(N端和C端分别各一个))中。以不改变氨基酸序列的方式对Cas9进行修饰以去除BsaI位点来克隆到pEVL载体中。在Cas9的3'末端用T2A肽将mCherry连接至Cas9。还在pWNY和pEVL200中产生在mCherry的5'末端含有T7启动子和单个NLS的仅有mCherry的对照。基因合成E4ORF6和E1B55K基因(Integrated DNATechnologies，IDT)，并在T7启动子下游克隆到pWNY中。使用定点突变(QuikChange II XL定点突变试剂盒，Agilent)产生E1B55K突变体。
针对单向导RNA(sgRNA)的AAV构建体的设计、克隆和表达使用在线CRISPR设计工具(http://crispr.mit.edu和Broad研究所的sgRNA设计工具http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-desi gn)设计靶向TCRα、PD-1、TIGIT、Lag3、Tim3和CCR5的恒定区的向导。然后通过商业化DNA合成(Integrated DNATechnologies)将向导生成为gblock。使用标准克隆技术将gblock克隆到scAAV6或ssAAV6-GFP构建体中。
如果在向导的起始处不存在“G”，则将gblock克隆到在向导的起始处具有“GG”(T7启动子要求)或“G”(U6启动子)的scAAV或ssAAV-GFP构建体中。一些带有U6启动子的向导具有“GG”，但是具有“GG”或“G”的编辑效率是相似的。在ITR检查后，将构建体用于生成AAV6。
在一些可选方式中，所使用的向导靶标对应于以下向导序列：TCRα向导靶标：ACAAAACTGTGCTAGACATG(SEQ ID NO：16；)；PD1向导靶标：GCCCACGACACCAACCACCA(SEQ IDNO：18)；TIGIT向导靶标：TCTTCCCTAGGAATGATGAC(SEQ ID NO：19)；Lag3向导靶标：GCGGTCCCTGAGGTGCACCG(SEQ ID NO：20)；Tim3向导靶标：AGAAGTGGAATACAGAGCGG(SEQ IDNO：21)。
重组AAV6载体的制备通过在HEK293T细胞中三重转染AAV载体、血清型辅助蛋白和腺病毒辅助蛋白(HGT1-Adeno)质粒来产生AAV原液(stocks)。48小时后收集转染细胞，通过冻融法进行裂解，用核酸酶(benzonase)进行处理然后用碘克沙醇密度梯度进行纯化。通过AAV基因组的qPCR来确定病毒原液的滴度，范围为1010-1012/ml。
mRNA制备DNA模板用特有限制性酶进行线性化，并且线性化质粒用QiaQuick PCR纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化。对制造商的方案稍作修改，使用商业化试剂盒(mMessagemMachine T7Ultra；Ambion或T7 mScript标准RNA生产系统；CellScript)在体外转录mRNA。简单地说，IVT反应孵育2.5h-3h，接着用DNase处理1h。如果需要，进行poly(A)加尾1小时，并使用RNeasy(Qiagen)纯化mRNA。
通过电穿孔和转导进行原代人类T细胞转染使用CD4+分离试剂盒或CD3+分离试剂盒(Miltenyi Biotec)从冷冻PBMC中获得T细胞。简单地说，逐滴加入冷DNase I缓冲液(PBS、5mM MgCl2、20Kunitz单位/ml DNase I(EMD-Millipore))使PBMC解冻，随后离心，并置于添加有低剂量IL-15(0.1ng/mL)的T细胞培养基(RPMI、20％FBS、1％HEPES、1％L-谷氨酰胺)中静置过夜。根据制造商的说明书在第二天将T细胞分离，并将纯化的T细胞以1×106个活细胞/ml重悬于T细胞生长培养基(添加有分别为5ng/mL和1ng/mL的IL-2和IL-15的培养基)中，并以1:1的细胞-珠比使用CD3/CD28珠(Dynal珠，Life Technologies)刺激72小时。接着去除珠，并使细胞在T细胞生长培养基中静置0.5h-2h。接下来，如下所述使用Neon转染系统(图1、图2、图4)或MaxCyte GT(图3)将细胞用mRNA进行电穿孔：将细胞用PBS洗涤两次，以4.5×107个细胞/ml(Neon)或1.25×108个细胞/ml(MaxCyte)的密度重悬于Neon缓冲液T或MaxCyte缓冲液中。混合后，对细胞进行电穿孔(Neon的条件：1400V，10ms，3个脉冲，10μl tip；MaxCyte的条件由制造商针对原代T细胞来确定)并立即分配到96孔板中的200μL预热的T细胞生长培养基中。立即将细胞在30℃下进行孵育，在电穿孔后2h-4h将AAV加入培养物中，然后继续在30℃下孵育额外的20小时。除非另有说明，无论滴度如何(～1×104- 5MOI)，以最终培养体积的10％加入AAV供体。随后，使用标准条件(37℃，在T细胞生长培养基中进行扩增，每2-3天根据需要进行补充以保持约1×106个细胞/ml的密度)培养经编辑的细胞。
流式细胞术和抗体使用LSRII流式细胞仪(BD Biosciences)对敲除(TCRα、PD-1、TIGIT、Lag3和Tim3)和HDR(BFP)进行分析，并使用FlowJo软件(Treestar)对数据进行分析。除非另有说明，所有抗体均来自Biolegend。为了评估表面标志物的敲除，使用如下缀合有荧光团的抗体来标记细胞：CD3-Alexa488、CD3-PerCPCy5.5或CD3-APC克隆HIT3a；PD1-APC克隆ehl2.2H7；TIGIT-Alexa 700克隆741182(Novus Biologicals)；Tim3-APC-Cy7克隆F38-2E2；以及Lag3-FITC克隆3DS223H(eBioscience)。使用CD4-BFP(克隆OKT4)或CD8-BFP(RPA-T8)进行CD4染色或CD8染色。为了上调T细胞耗尽标志物的表面表达，在初次刺激后9-12天，使用CD3/CD28珠刺激T细胞48小时(除了在缺少TCRα的情况下使用PMA/离子霉素刺激(参见下文))。洗涤细胞，并通过在活细胞上设门(gating)基于前向散射和侧向散射(forward and side scatter)在LSRII上进行分析以用于下游分析。
PMA/离子霉素刺激以1×106的密度将细胞铺在48孔板或24孔板中。向培养基中加入10ng/mL PMA(Sigma)和1μg/mL离子霉素(Sigma)3h-4h，将细胞用含有2％FBS的PBS洗涤3-4次，然后用新鲜培养基重新铺板。在流式细胞术之前使细胞恢复48小时，或者恢复72小时以用于核型分析。
核型分析使细胞以每个样品1×106-1.5×106的密度在T-25烧瓶中生长。各样品用PMA/离子霉素刺激3h-4h，然后在完全培养基和细胞因子中静置72小时。核型分析由华盛顿大学细胞遗传学和基因组学实验室作为研究测试完成。对每个样品的20个细胞进行标准G显带(GTW染色)染色体分析。
T7核酸内切酶I(T7EI)测定使用T7EI测定针对TCRα基因座和CCR5基因座两者评估Cas9和sgRNA的切割效率。使用制造商的说明书，利用Accuprime Pfx或Hifi Platinum TaqDNA聚合酶(Life Technologies)扩增靶向基因组基因座。将400ng纯化产物(Qiaquick PCR纯化试剂盒，Qiagen)变性，在37℃下进行T7EI(New England Biolabs)消化30分钟，并在1％-2％的琼脂糖凝胶上进行分析(图2B)。
钙信号的分析每个样品使用5×106个细胞。将细胞在HBSS(含有Ca2+和Mg2+)(Thermofisher)中洗涤，添加HBSS中的30μM Indo-1AM(分子探针，Life Technologies)，并在37℃下孵育30分钟，洗涤两次，并在缓冲液中重悬。获取基线流(baseline flow)30秒，之后用200μg/mL PHA刺激细胞以刺激T细胞，并收集数据5分钟。
统计分析用Prism 6(GraphPad软件)进行统计分析。除非另有说明，数据显示为平均值±SEM。使用非配对双尾学生t检验进行统计显著性检验，在适当的时候对于不等标准偏差使用Welsh’s校正。
在一些可选方式中，提供了在原代人类T细胞中使用mRNA/AAV共递送方法来实施CRISPR/Cas9核酸酶技术，其中，mRNA用于Cas9表达，而AAV载体用于向导RNA表达和/或重组模板递送。
由于证明了在mRNA/AAV共递送方法的初始开发过程中，AAV转导是功效的重要限制因素，在一些可选方式中，评估了E4ORF6/E1B55K腺病毒辅助蛋白和一组突变体的基于mRNA的共表达，以确定是否能够鉴定出使对AAV介导的基因表达的进入后限制失效并同时保持有利于有效基因编辑的细胞DNA修复环境的生化活性的组合。
在一些可选方式中，突变体中的两种(E4ORF6/E1B55K H373A和E4ORF6/E1B55KH354)被鉴定为独特地能够支撑大幅度地提高CRISPR-Cas9介导的基因破坏和同源介导的基因靶向两者的效率。
腺病毒血清型4E4ORF6/E1B55K复合物在培养的细胞模型中提高CRISPR介导的基因靶向(但不是基因破坏)，这是由抑制DNA连接酶IV活性以及由此而来的降低的非同源末端连接修复活性造成的作用。
因此，在一些可选方式中，在考虑之列的是用mRNA/AAV共递送进行腺病毒血清型5E4ORF6/E1B55K复合物表达可通过同时抑制DNA连接酶IV活性并解除AAV进入后转导限制来对基因靶向效率产生协同作用。
在一些可选方式中，尽管野生型E4ORF6/E1B55K复合物的瞬时表达在解除对AAV驱动的基因表达的限制方面是高度有效的，但是在原代人类T细胞的情况中，其仅仅适度地提高基因破坏或基因靶向的效率。相反，在一些可选方式中，观察到E4ORF6/E1B55K H373A突变体或E4ORF6/E1B55K H354突变体(仅表现出适度地增加AAV驱动的基因表达的能力)在基因破坏和基因靶向的效率两方面产生大幅增加。
H373A突变体和H354突变体对AAV驱动的基因表达的适度作用(例如，如图3所示)(预测这将在向导RNA表达的水平和持续时间上均产生相应的适度增加)可部分地解释它们提高基因破坏和基因靶向两方面的能力。它们共有的残留生化活性还可以使保持可参与同源介导的修复的AAV基因组的比例增加，从而有助于提高基因靶向效率。
然而，相对于野生型E1B55K，两种已知生化活性被认为是这些突变体能够提高基因破坏和基因靶向效率的核心：1)它们保留MRN依赖性DNA损伤信号(其通过同源介导的DNA修复的各种形式来促进双链断裂消除)；同时2)限制p53依赖性DNA损伤信号(其应答于DNA双链断裂而使细胞停滞在G1期)。因此，在一些可选方式中，预测表达这些复合物的T细胞将允许高比例的Cas9诱导的双链断裂以过渡到S期(其中，在没有重组模板时，它们将通过突变替代末端连接进行修复；或者在提供重组模板的情况下，通过同源介导的修复进行修复)。
在一些可选方式中，腺病毒血清型5 E4ORF6/E1B55K H373A突变体和E4ORF6/E1B55K H354突变体“辅助”蛋白被鉴定为具有在原代人类T细胞中提高Cas9介导的基因编辑效率的能力。总的来说，在一些可选方式中，我们的结果表明，由于E4ORF6/E1B55K-H373A在多种类型的基因编辑应用中表现出最一致的活性，E4ORF6/E1B55K-H373A可能是对通用工具感兴趣的研究人员而言提高CRISPR/Cas9基因编辑的最佳选择。
这些蛋白质的生化活性表明它们对基因编辑效率的作用有可能是由于它们促进DNA双链断裂的S期修复。因此，在一些可选方式中，它们可能是原代人类细胞中提高同源介导的基因组修饰的普适方法。在一些可选方式中，它们可能是在包含可选核酸酶平台的情况下在原代人类细胞中提高同源介导的基因组修饰的普适方法。在一些可选方式中，它们可能是在包含AAV以外的可选病毒模板递送方法的情况下在原代人类细胞中提高同源介导的基因组修饰的普适方法。
此外，由于来自许多人类病毒的辅助蛋白可失效或修饰细胞DNA损伤应答和修复机制的各种组分，因此这些蛋白质可表现出丰富的生化活性以用作人类基因组工程中的工具。
因此，在一些可选方式中，使用失效和/或修饰细胞DNA损伤应答和/或修复机制的各种组分的来自其它人类(和/或哺乳动物)病毒的辅助蛋白在本文提供的CRISPR/Cas9系统考虑之列。在一些可选方式中，认为这类蛋白质表现出丰富的生化活性以用作人类基因组工程中的工具。
以上描述和实施例详细说明了本发明的某些可选方式。然而，无论文中如何详述上述内容，将理解的是，本发明可以以多种方式实施，并且本发明应该根据所附权利要求书及其任何等同物来解释。尽管本发明的教导已经根据这些示例性可选方式进行了描述，但是本领域技术人员将容易地理解，这些示例性可选方式的众多变型和修饰是可能的，并不需要过多实验。所有这些变型和修饰都在当前教导的范围内。
提供上述实施例来更好地说明所公开的教导，并不是旨在限制本文给出的教导的范围。以引用的方式将本文中引用的所有参考文献(包括专利、专利申请、论文、教科书等；以及本文引用的参考文献中未被引用的范围)整体并入本文。
认为前述内容足以使本领域技术人员能够实施本发明。以上描述和实施例详细说明了本发明的某些优选可选方式，并且描述了发明人所考虑到的最佳实施方式。如果所并入的文献和类似材料中的一个或多个与本申请不同或相矛盾(包括但不限于定义的术语、术语的使用、所描述的技术等)，则以本申请为准。
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Claims (41)

1.用于编辑细胞中靶基因座的系统，所述系统包含：
(a)编码Cas9核酸内切酶的核酸，其中，所述核酸内切酶能够靶向切割；
(b)编码腺病毒E4ORF6蛋白的核酸，其中，所述E4ORF6蛋白为SEQ ID NO：3所示的野生型E4ORF6或SEQ ID NO：23所示的AXA突变体；以及
(c)编码突变型腺病毒E1B55K蛋白的核酸，其中，所述突变型腺病毒E1B55K蛋白为SEQID NO：2所示的H373A突变体或SEQ ID NO：4所示的H354突变体。
2.如权利要求1所述的系统，其中，所述系统进一步包含：(d)编码与所述靶基因座互补的CRISPR向导RNA(gRNA)的核酸。
3.如权利要求1或2所述的系统，其中，所述细胞是真核细胞。
4.如权利要求1或2所述的系统，其中，所述细胞是哺乳动物细胞。
5.如权利要求1或2所述的系统，其中，所述细胞是人类细胞。
6.如权利要求1或2所述的系统，其中，所述细胞是原代细胞。
7.如权利要求1或2所述的系统，其中，所述细胞不是转化细胞。
8.如权利要求1或2所述的系统，其中，所述细胞是原代淋巴细胞、CD34+干细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、神经胶质细胞、肌肉细胞或肠细胞。
9.如权利要求2所述的系统，所述系统进一步包含含有所述(d)的核酸的载体。
10.如权利要求9所述的系统，其中，所述载体是病毒载体。
11.如权利要求10所述的系统，其中，所述病毒载体是慢病毒载体。
12.如权利要求10所述的系统，其中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。
13.如权利要求12所述的系统，其中，所述AAV载体是自身互补载体。
14.如权利要求12所述的系统，其中，所述AAV载体是单链载体。
15.如权利要求12所述的系统，其中，所述AAV载体是自身互补载体和单链载体的组合。
16.如权利要求1或2所述的系统，其中，所述(a)的核酸是mRNA。
17.如权利要求1或2所述的系统，其中，所述(a)的核酸经密码子优化以在真核细胞中表达。
18.如权利要求1或2所述的系统，其中，所述(b)的核酸是mRNA。
19.如权利要求1或2所述的系统，其中，所述(b)的核酸经密码子优化以在真核细胞中表达。
20.如权利要求1或2所述的系统，其中，所述(c)的核酸是mRNA。
21.如权利要求1或2所述的系统，其中，所述(c)的核酸经密码子优化以在真核细胞中表达。
22.如权利要求1或2所述的系统，其中，所述(a)的核酸、(b)的核酸和(c)的核酸各自可操作地连接至在真核细胞中可操作的调控元件。
23.如权利要求22所述的系统，其中，所述调控元件包括U6启动子。
24.如权利要求2所述的系统，其中，所述(d)的核酸编码多种gRNA，其中，所述多种gRNA中的每种gRNA可操作地连接至各自的调控元件。
25.如权利要求2所述的系统，其中，所述gRNA与TCRα基因互补，并包含示于SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17中的序列。
26.如权利要求2所述的系统，其中，所述gRNA：
(i)与PD1基因互补，并包含示于SEQ ID NO：18中的序列；
(ii)与TIGIT基因互补，并包含示于SEQ ID NO：19中的序列；
(iii)与Lag3基因互补，并包含示于SEQ ID NO：20中的序列；或
(iv)与Tim3基因互补，并包含示于SEQ ID NO：21中的序列。
27.如权利要求1或2所述的系统，其中，所述Cas9蛋白来自于酿脓链球菌。
28.如权利要求2所述的系统，其中，所述(d)的核酸在所述细胞中组成型表达。
29.如权利要求2所述的系统，其中，所述(d)的核酸在所述细胞中瞬时表达。
30.权利要求1-29中任一项所述的系统在制备用于治疗、改善和/或抑制疾病的药物中的用途。
31.如权利要求30所述的用途，其中，所述疾病为癌症、局部缺血、糖尿病视网膜病变、黄斑变性、类风湿性关节炎、银屑病、HIV感染、镰状细胞性贫血、Alzheimer病、肌营养不良、神经退行性疾病、血管疾病、囊性纤维化、中风、高IGE综合征或血友病。
32.用于编辑细胞基因组中的靶基因座的体外方法，所述方法包括将如权利要求2-29中任一项所述的系统导入所述细胞。
33.如权利要求32所述的方法，其中，在将所述(d)的核酸导入之前，将所述(a)的核酸导入所述细胞中。
34.如权利要求32所述的方法，其中，在将所述(a)的核酸导入所述细胞中之前，将所述(d)的核酸导入所述细胞中。
35.如权利要求32所述的方法，其中，将所述(a)的核酸和所述(d)的核酸同时导入所述细胞中。
36.如权利要求32-35中任一项所述的方法，其中，AAV载体包含所述(d)的核酸。
37.如权利要求32-35中任一项所述的方法，其中，所述导入包括将所述(a)的核酸以0.01μg-1μg的量递送至细胞，其中所述(a)的核酸是mRNA。
38.如权利要求32-35中任一项所述的方法，其中，与用包含野生型E1B55K的方法编辑的细胞中的突变率相比，所述细胞中的突变率增加了1.5倍-9倍。
39.如权利要求32-35中任一项所述的方法，其中，所述导入包括将所述(a)的核酸、(b)的核酸和(c)的核酸瞬时导入所述细胞中。
40.如权利要求32-35中任一项所述的方法，其中，将所述(a)的核酸、(b)的核酸和(c)的核酸导入所述细胞中不会转化所述细胞。
41.如权利要求32-35中任一项所述的方法，其中，AAV载体包含所述(b)的核酸和(c)的核酸。
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