CN108135955A

CN108135955A - 肌肉增强剂

Info

Publication number: CN108135955A
Application number: CN201680060046.XA
Authority: CN
Inventors: 本田真; 本田真一; 横田真; 横田真一; 小椋峰子; 加藤雅纪
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2015-10-16
Filing date: 2016-10-06
Publication date: 2018-06-08
Also published as: EP3363449B1; JPWO2017065077A1; US20190070243A1; EP3363449A4; EP3363449A1; JP6817950B2; WO2017065077A1; US10729737B2

Abstract

本发明的目的在于，提供能够有效地增加或保持肌肉量、肌肉力量，并且能够抑制肌肉量、肌肉力量的下降的安全的肌肉增强剂、含有该肌肉增强剂的肌肉增强组合物、及使用该肌肉增强剂或肌肉增强组合物用于增强肌肉的方法。本发明的肌肉增强剂的特征在于，含有柠檬香桃提取物作为有效成分。

Description

肌肉增强剂

技术领域

本发明涉及能够有效地预防或治疗肌肉量、肌肉力量的下降的安全的肌肉增强剂及肌肉增强方法。

背景技术

近年来，随着由交通工具的发达等导致的运动不足、高龄化的进行，肌肉量、肌肉力量的下降(肌肉萎缩)成为大问题。通常可以说从40岁前后起肌肉量、肌肉力量会下降，可以说大多高龄者处于肌肉减少症(sarcopenia，增龄性肌肉减少症)的状态。肌肉减少症主要是指由年龄增加导致的肌肉量、肌肉力量的下降，是运动障碍综合症(LocomotiveSyndrome，运动器官综合症：因肌肉、骨、关节、软骨、椎间盘等运动器官的障碍而引起移动功能的下降，成为要介护、或呈变成要介护的危险高的状态)、虚弱(肌肉力量、身心的活力下降的状态)的重要的因素，被指出成为要介护的原因。这样，肌肉量、肌肉力量的下降不仅与生活质量(QOL：Quality Of Life)的下降密切相关，还与日常生活能力(ADL：Activitiesof Daily Living)的下降、并发症的发生、介护负担的增加密切相关。在美国健康风险位居前5位，估算相关医疗费为约2.5兆日元。

为了增强肌肉，即增加及保持肌肉量、肌肉力量，进而抑制肌肉量、肌肉力量的下降，必须兼顾适当的营养摄取和运动这两者。但是，尤其对于高龄者，不仅由食欲减退引起摄食量的下降，而且由于咽下功能、唾液量、消化器官功能的下降等，有对营养的摄取量的吸收量下降的倾向。另外，从吸收的肽、氨基酸向肌肉蛋白转化的生物功能效率也下降。此外，对于高龄者而言，不仅运动的机会少，而且由运动带来的肌肉量的增加效率也下降。因此，例如若高龄者的活动量因受伤、生病等而减少，则随之肌肉量、肌肉力量进而会下降，有时陷入活动量下降和肌肉萎缩恶化这样的负循环。

另外，出于提高运动中的运动能力、预防或改善肥胖、代谢综合症(metabolicsyndrome)、瘦身等目的，另外，对于人以外的动物也是，出于促进生长发育、增加肉量、改善肉质等的目的，期望肌肉的增强。

为了使肌肉增强，需要增大构成肌肉的肌纤维、或保持其大小。肌纤维为多核的细胞，其核的数量控制细胞的大小。因此，为了增大或保持肌纤维，需要增加核的数量，但肌纤维的核不增殖，从细胞外向肌纤维供给核是不必可少的。在构成肌肉的肌细胞的基底膜与细胞膜之间存在的肌卫星细胞(也称为卫星细胞)承担着核向肌纤维的供给。通常，肌卫星细胞处于静止状态，为未分化的状态，但在运动负荷、肌肉的损伤、成长时，肌卫星细胞被活化，通过增殖、分化、与肌纤维的融合等一系列的过程，向肌纤维供给核。因此，将肌卫星细胞活化有助于肌肉的增强。

另外，如上所述，肌肉量、肌肉力量的下降因年龄增加而进行，因此可以说应该在未明显化时预防。此外，高龄者有时为了抑制慢性病而持续服用常用药，合成医药品存在由合用导致的不能预测的副作用的问题。

因此，正在从安全的成分中探索具有肌肉增强作用的物质。

例如专利文献1中公开了将茶饮料中所含的儿茶素类作为有效成分的肌肉功能下降抑制剂。专利文献2中记载了包含在印度、斯里兰卡、东南亚各国自然生长的卫矛科的五层龙(Salacia)属植物或其提取物的肌肉增强剂。另外，非专利文献1中报告了作为支链氨基酸的亮氨酸的肌肉蛋白合成作用。另外，专利文献3中公开了一种以作为夹竹桃科植物的罗布麻或其提取物作为有效成分的卫星细胞分化促进剂，但只不过是示出了对源自骨骼肌的细胞的分化诱导效果，没有将肌卫星细胞活化。

另外，柠檬香桃为澳大利亚原产的蒲桃科的常绿树，学名称为柠檬巴毫(Backhousia citriodora)。其是包含很多柠檬醛作为精油成分、并具有强的清凉感的芳香的药草(herb)的一种，在料理等中使用，也对它进行了研究。例如专利文献4～6中分别公开了包含柠檬香桃或其提取物、表现出酪氨酸酶抑制活性的美白用组合物、用于预防及改善由紫外线等导致的皮肤问题的皮肤成纤维细胞增殖促进剂、对糖尿病或糖尿病并发症的预防及治疗有用的晚期糖基化终末产物生成抑制剂。但是，目前为止关于对柠檬香桃的肌肉的效果没有任何研究。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2008-13473号公报

专利文献2：日本特开2010-235542号公报

专利文献3：日本特开2012-77010号公报

专利文献4：日本特开2009-57325号公报

专利文献5：日本特开2010-202520号公报

专利文献6：日本特开2015-24982号公报

非专利文献

非专利文献1：Crozier SJ et al，J.Nutr.，vol.135，No.3，376-82，2005

发明内容

发明所要解决的问题

如上所述，近年来，随着社会高龄化，肌肉量、肌肉力量的下降已成为深刻的问题，正在谋求其对策。也正在进行用于增加、保持肌肉量、肌肉力量的研究，但作为实际的对策，仅推荐了适当的营养摄取和运动。用于预防、治疗肌肉量、肌肉力量的下降的药剂等正在流通，但安全且表现出充分的肌肉增强效果的药剂等还未流通。

因此，本发明的目的在于，提供能够有效地增加或保持肌肉量、肌肉力量、并且能够抑制肌肉量、肌肉力量的下降的安全的肌肉增强剂、含有该肌肉增强剂的肌肉增强组合物、及使用该肌肉增强剂或肌肉增强组合物用于增强肌肉的方法。

解决问题的方法

本发明人等为了解决上述问题而反复进行了深入研究。结果发现，源自柠檬香桃的提取物是安全的，并且会将对肌肉量、肌肉力量的增加、保持发挥重要作用的肌卫星细胞活化，从而完成了本发明。

以下，示出本发明。

[1]一种肌肉增强剂，其含有柠檬香桃提取物作为有效成分。

[2]根据上述[1]所述的肌肉增强剂，其中，上述柠檬香桃提取物为利用水、或利用水与水混合性溶剂的混合溶剂得到的提取物。

[3]根据上述[1]所述的肌肉增强剂，其中，上述柠檬香桃提取物为利用水得到的提取物。

[4]根据上述[1]所述的肌肉增强剂，其中，上述柠檬香桃提取物为利用水与乙醇的混合溶剂得到的提取物。

[5]根据上述[1]～[4]中任一项所述的肌肉增强剂，其中，上述柠檬香桃提取物源自柠檬香桃的叶。

[6]根据上述[1]～[5]中任一项所述的肌肉增强剂，其每1天给药1mg/kg体重/天以上。

[7]一种肌肉增强组合物，其含有上述[1]～[6]中任一项所述的肌肉增强剂。

[8]一种肌肉增强方法，其包括：对动物给药上述[1]～[6]中任一项所述的肌肉增强剂或上述[7]所述的肌肉增强组合物的工序。

[9]一种柠檬香桃提取物的用途，上述柠檬香桃提取物用于增强肌肉。

[10]根据上述[9]所述的用途，其中，上述柠檬香桃提取物为利用水、或利用水与水混合性溶剂的混合溶剂得到的提取物。

[11]根据上述[9]所述的用途，其中，上述柠檬香桃提取物为利用水得到的提取物。

[12]根据上述[9]所述的用途，其中，上述柠檬香桃提取物为利用水与乙醇的混合溶剂得到的提取物。

[13]根据上述[9]～[12]中任一项所述的用途，其中，上述柠檬香桃提取物源自柠檬香桃的叶。

[14]根据上述[9]～[13]中任一项所述的用途，其中，上述柠檬香桃提取物每1天给药1mg/kg体重/天以上。

[15]一种肌肉增强方法，其包括：给药柠檬香桃提取物作为有效成分的工序。

[16]根据上述[15]所述的肌肉增强方法，其中，上述柠檬香桃提取物是使用水、或使用水与水混合性溶剂的混合溶剂作为提取溶剂进行提取而得到的。

[17]根据上述[15]所述的肌肉增强方法，其中，上述柠檬香桃提取物是使用水作为提取溶剂进行提取而得到的。

[18]根据上述[15]所述的肌肉增强方法，其中，上述柠檬香桃提取物是使用水与乙醇的混合溶剂作为提取溶剂进行提取而得到的。

[19]根据上述[15]～[18]中任一项所述的肌肉增强方法，其中，上述柠檬香桃提取物源自柠檬香桃的叶。

[20]根据上述[15]～[19]中任一项所述的肌肉增强方法，其中，上述柠檬香桃提取物每1天给药1mg/kg体重/天以上。

发明的效果

由于本发明的肌肉增强剂的有效成分是也在料理时用于调味剂等中的柠檬香桃提取物，因此是安全的，每天恒定的摄取也成为可能。另外，与运动同样地表现出活化肌卫星细胞的作用，能够用于增加或保持肌肉量、肌肉力量，进而用于抑制肌肉量、肌肉力量的下降。

具体实施方式

本发明的肌肉增强剂含有柠檬香桃提取物作为有效成分。本发明的肌肉增强剂具有肌肉增强作用。

在本发明中，“肌肉增强”是指，增加或保持肌肉量、肌肉力量，而且抑制肌肉量、肌肉力量的下降。因此，本发明的“肌肉增强剂”能够用于增加或保持肌肉量、肌肉力量，进而抑制肌肉量、肌肉力量的下降。本发明的肌肉增强剂对于期望肌肉增强的健康的正常人及运动员、需要身体发育的儿童及青年可以用于促进肌肉的增强。此外，本发明的肌肉增强剂对于运动不足、由长期安静卧床、用石膏固定等导致的不活动、低营养、年龄增加(肌肉减少症)、肌源性的疾病(肌营养不良、先天性肌病等)、神经源性的疾病(肌萎缩性侧索硬化症、脊髓性肌萎缩症等)等导致的肌肉量、肌肉力量的下降，也可以用于其预防、改善。另外，对于运动障碍综合症、虚弱等起因于肌肉量、肌肉力量的下降的状态、疾患，也可以用于其预防、改善。另外，本发明的肌肉增强剂也可以对期望促进成长发育或肉量增加、肉质改善的家畜等动物使用。需要说明的是，本发明的肌肉增强剂由于能够增强肌肉，因此也可以用于肥胖、代谢综合症的预防或改善、瘦身等目的。

肌卫星细胞是指在构成肌肉的肌细胞的基底膜与细胞膜之间存在的未分化的肌肉干细胞。本发明中的“肌卫星细胞活化”是指处于静止状态的肌卫星细胞向增殖期转移，经分化和向肌纤维的融合而向肌纤维供给核。肌卫星细胞的活化使控制肌纤维大小的核的数量增加，因此会引起肌纤维的肥大、进而引起肌肉的增强。肌卫星细胞的活化可以通过测定细胞数、核酸量、溴脱氧尿苷等DNA类似物质的摄入量等来进行评价。

柠檬香桃为澳大利亚原产的蒲桃科的常绿树，学名称为柠檬巴毫(Backhousiacitriodora)。特别是从叶发出独特的芳香，其精油可用作香料等。

作为柠檬香桃提取物的原料部位，不特别限定于叶、茎、根、枝、花等，但优选叶。另外，使用形态也没有特别限定，例如包括未加工的状态、干燥物、其干燥物的粉碎物等全部形态。

本发明的肌肉增强剂可以通过包括将柠檬香桃和提取溶剂混合、提取用于肌肉增强的有效成分的工序的方法来制造。

作为用于获得本发明的柠檬香桃提取物的提取溶剂，没有特别限定，优选水性溶剂。水性溶剂是指水、水混合性溶剂、及水与水混合性溶剂的混合溶剂。作为水混合性溶剂，例如可列举出甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、仲丁醇、异丁醇、叔丁醇等C_1-4醇；丙酮等酮类溶剂；二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺等酰胺类溶剂；二甲基亚砜等亚砜类溶剂；乙腈等腈类溶剂；乙酸等有机酸溶剂等，优选C_1-4醇、更优选C_2-3醇，从安全性的方面出发，更进一步优选乙醇或异丙醇，特别优选乙醇。

作为提取溶剂，优选水、及水与水混合性溶剂的混合溶剂。该混合溶剂中的水混合性溶剂的比例的上限没有特别限定，优选95v/v％以下，更优选90v/v％以下、80v/v％以下或70v/v％以下，进一步优选60v/v％以下。该比例的下限也没有特别限制，为0％、即仅由水也可获得表现优异的效果的提取物，但如果期待由水混合性溶剂带来的提取效果时，作为该比例优选5v/v％以上。特别优选90v/v％以下的乙醇水、更优选80v/v％以下或70v/v％以下的乙醇水、进一步优选60v/v％以下的乙醇水。

对提取溶剂的使用量没有特别限制，适宜调整即可。该使用量的下限也没有特别限定，例如，对于干燥状态的柠檬香桃原料或未加工的柠檬香桃，优选1mL/g以上、更优选2mL/g以上、进一步优选3mL/g以上。另外，该使用量的上限也没有特别限定，例如，对于干燥状态的柠檬香桃原料或未加工的柠檬香桃，优选50mL/g以下、更优选20mL/g以下、进一步优选10mL/g以下。

提取温度也适宜调整即可。该温度的下限没有特别限定，优选-20℃以上、更优选1℃以上、进一步优选10℃以上。另外，该温度的上限也没有特别限定，优选121℃以下、更优选100℃以下、进一步优选90℃以下。需要说明的是，在溶剂的沸点以上进行提取的情况下，优选使提取容器密闭或进行加压。另外，也可以对提取溶剂进行加热回流。此外，提取温度也可以逐步地变更。需要说明的是，提取可以在搅拌或静置下进行，另外，根据需要可以重复多次。

提取时间也适宜调整即可。该时间的合计的下限没有特别限定，优选5分钟以上、更优选10分钟以上、进一步优选30分钟以上。另外，该时间的合计的上限也没有特别限定，优选48小时以下、更优选24小时以下、进一步优选10小时以下。

提取后的混合液可以直接使用，也可以进行通常的后处理。例如，可以通过过滤、离心分离等从提取残渣中分离提取液，并且，适宜组合浓缩、加热干燥、喷雾干燥、减压干燥、冷冻干燥等，对经分离的提取液进行干燥。可以进而通过间接加热方式、直接加热方式、电加热方式、微波加热方式等进行加热杀菌。只要不含有作为饮品食品、医药品不适当的杂质，就可以直接以提取液、或以粗提取物或者半纯化提取物的形式来使用。柠檬香桃具有以柠檬醛为代表的特有的芳香，为了将其从柠檬香桃提取物中去除，优选进行浓缩、加热干燥、喷雾干燥、减压干燥、冷冻干燥等干燥操作。

需要说明的是，关于本发明的柠檬香桃提取物中含有的成分中哪种成分发挥了肌肉增强作用，有可能该成分是微量成分而不是主成分，而且，另外也有多种成分协同作用的可能性，目前还难以确定。

本发明的肌肉增强剂可以以与其它成分组合而成的肌肉增强组合物的形式使用。例如，可以使用柠檬香桃提取液本身、干燥柠檬香桃提取物本身，也可以是将干燥柠檬香桃提取物再溶解、悬浮于适当的溶剂而成的物质。另外，也可以是将柠檬香桃提取物制成制剂而成的物质。作为制剂没有特别限制，例如，可列举出片剂、散剂、胶囊剂、糖衣片、颗粒剂、液体制剂、外用剂等。本发明的肌肉增强剂可以根据剂型使用药学上可允许的添加剂。作为所述添加剂，例如可列举出赋形剂、崩解剂、润滑剂、结合剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂、凝聚防止剂、有效成分的溶解辅助剂、稳定剂等。作为上述赋形剂，没有特别限制，例如可列举出白糖、乳糖、葡萄糖、玉米淀粉、糊精、甘露醇、微晶纤维素、磷酸钙、硫酸钙、硫酸镁等。作为上述崩解剂，没有特别限制，例如可列举出淀粉、琼脂、柠檬酸钙、碳酸钙、碳酸氢钠、糊精、微晶纤维素、羧甲基纤维素、黄蓍胶等。作为上述润滑剂，没有特别限制，例如可列举出滑石、硬脂酸镁、聚乙二醇、二氧化硅、氢化植物油等。作为上述结合剂，没有特别限制，例如可列举出乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、黄蓍胶、虫胶、明胶、阿拉伯胶、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、山梨糖醇等。作为上述抗氧化剂，没有特别限制，例如可列举出抗坏血酸、生育酚、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、柠檬酸等。作为上述着色剂，没有特别限制，例如可列举出医药品、被许可在食品中添加的着色剂等。作为上述甜味剂，没有特别限制，例如可列举出被许可在医药品、食品中添加的甜味剂等。作为上述凝聚防止剂，没有特别限制，例如可列举出硬脂酸、滑石、轻质无水硅酸、含水二氧化硅等。作为上述有效成分的溶解辅助剂，没有特别限定，可列举出富马酸、琥珀酸、苹果酸等有机酸等。作为上述稳定剂，没有特别限制，例如可列举出苯甲酸、苯甲酸钠、对羟基苯甲酸乙酯、乙二醇等。

含有本发明的肌肉增强剂的肌肉增强组合物也可以用作例如饮品食品、医药品、医药部外品、饲料、宠物食品或动物用医药品。

表现肌肉增强作用的特定保健用食品等饮品食品、医药品、医药部外品、补充剂(supplement)、饲料、宠物食品或动物用医药品中含有本发明的肌肉增强剂而使用的情况下，可以直接摄取。另外，本发明的肌肉增强组合物可以为口服摄取用制剂的形态。作为口服摄取用制剂，可列举出胶囊剂(硬胶囊、微胶囊、软胶囊)、片剂、散剂、咀嚼制剂、糖浆剂、液体制剂等能够口服摄取的形态。作为制成胶囊剂时的胶囊基材，没有特别限制，以源自牛骨、牛皮、猪皮、鱼皮等的明胶为代表，也可以使用包含其它基材例如可用作食品添加物的角叉菜胶、海藻酸等海藻来源品、刺槐豆胶、瓜尔胶等植物种子来源品、支链淀粉(pullulan)、凝胶多糖等微生物来源品、纤维素类的制造用剂。

另外，本发明的肌肉增强剂也可以添加至通常的饮品食品中。添加本发明的肌肉增强剂的饮品食品没有特别限定，例如可以在乳饮料、清凉饮料、运动饮料、营养饮料、美容饮料、液体营养剂等饮料；口香糖、巧克力、糖果、果冻、蛋糕、饼干、脆饼(cracker)等糖果类；冰淇林、冰点心等冰制食品类；面条、中华面、意大利面、方便面等面类；鱼糕、筒状鱼卷(竹輪)、鱼肉山芋饼(半片)等鱼糕制品；调料、蛋黄酱、调味汁等调味料；面包、火腿、杂烩粥、米饭、汤、各种蒸煮食品、各种冷冻食品等中适宜添加而使用。含有本发明的肌肉增强剂的饮品食品可以用于所谓健康食品、补充剂、功能性食品、功能性表现食品、营养辅助食品、特定保健用食品、营养功能食品、介护食品、微笑护理食物(スマイルケア食)、咀嚼·咽下辅助食品、浓流质食品、患者用食品等用途。很明显，也可以以其它食品形态的形式利用。此外，也可以在宠物食品、家畜饲料等中利用。

此外，本发明的肌肉增强组合物可以为非口服剂的形态。例如也可以采用涂布于皮肤的形态。该情况下，剂型没有特别限定，例如可列举出：使本发明的肌肉增强剂溶解或混合分散于基剂中，形成乳霜状、糊状、果冻状、凝胶状、乳液状、液状的形状的剂型(软膏剂、搽剂、洗剂、喷雾剂等)；将使上述组合物溶解或混合分散于基剂中而成的物质在支撑体上展开而成的剂型(巴布剂等)；将使上述组合物溶解或混合分散于粘合剂中而成的物质在支撑体上展开而成的剂型(膏药剂、胶布剂等)。

将本发明的组合物用作医药部外品的情况下的医药部外品是指药事法中规定的医药部外品，可列举出口服剂(提取剂、酏剂、糖浆剂、酊剂、柠檬水剂等液体制剂和胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、片剂等固体制剂)等。

本发明的肌肉增强剂表现肌卫星细胞的活化作用等优异的肌肉增强作用。所述肌卫星细胞活化作用例如可以通过以下的in vitro试验进行评价。具体而言，在从被检动物分离出的肌卫星细胞的培养液中添加被检物质，培养24小时后，添加溴脱氧尿苷(BrdU)以使终浓度成为10μM，进行2小时培养。接着，使用经水冷的添加有0.1％H₂O₂的甲醇将肌卫星细胞在4℃下固定10分钟，进而使用2N盐酸在37℃下进行1小时DNA改性处理后，使用抗BrdU抗体作为一次抗体、使用HRP结合抗小鼠IgG抗体作为二次抗体，用二氨基联苯胺(DAB)使其显色，对BrdU阳性细胞进行检测。可以求出BrdU阳性细胞在总细胞数中所占的比例，作为肌卫星细胞活化率。作为本发明的肌肉增强剂的肌卫星细胞活化率，优选42％以上或43％以上、更优选44％以上或45％以上、更进一步优选46％或48％以上。

本发明的肌肉增强剂不仅可以对人给药，也可以对人以外的动物给药。即，本发明还涉及一种肌肉增强方法，其包括对动物给药本发明的肌肉增强剂或本发明的肌肉增强组合物的工序。作为给药对象动物，例如可列举出养殖动物、宠物动物、比赛动物等。作为养殖动物，没有特别限定，可例示出马、牛、猪、羊、山羊、骆驼、羊驼等家畜、小鼠、大鼠、豚鼠、兔子等实验动物、鸡、鸭、火鸡、鸵鸟等家禽、鱼类、甲壳类或贝类。作为宠物动物，没有特别限定，可例示出狗、猫等。作为比赛动物，没有特别限定，可例示出赛马等。其中，从专利的对象的问题出发，可以将人从给药本发明的肌肉增强剂或本发明的肌肉增强组合物的动物中除去。

本发明的肌肉增强剂的给药频率、给药量根据给药对象、年龄、性别、状态等适宜调整即可，对给药对象给药能够发挥肌肉增强效果的量。例如对人的给药量的下限没有特别限定，优选每1天1mg/kg体重以上、优选2mg/kg体重以上、进一步优选3mg/kg体重以上。另外，例如对人的给药量的上限也没有特别限定，优选每1天50mg/kg体重以下、更优选40mg/kg体重以下、进一步优选30mg/kg体重以下。另外，每1天的给药次数没有特别限定，可以在期望的给药范围内单次给药、或分几次给药。

出于提高增加或保持肌肉量、肌肉力量的效果的目的，本发明的肌肉增强剂可以适宜与抗阻力运动等运动、理学疗法、康复训练等组合使用。另外，出于提高增加或保持肌肉量、肌肉力量的效果的目的，本发明的肌肉增强剂也可以与其它医药品、具有肌肉增强作用的食品等组合使用来使用。作为具有上述肌肉增强作用的食品，没有特别限制，可列举出乳清蛋白、乳清肽、酪素、酪素肽、大豆蛋白、大豆肽、小麦蛋白、小麦肽、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸等氨基酸、肌酸、β-羟基-β-甲基丁酸等。

本申请基于2015年10月16日申请的日本专利申请第2015-204255号主张优先权的利益。将2015年10月16日申请的日本专利申请第2015-204255号的说明书的全部内容援引至本申请中用于参考。

实施例

以下，举出实施例更具体地对本发明进行说明，但本发明根本不受下述实施例限制，当然也可以在可适合于上述/后述的主旨的范围内适当地加以变更来实施，它们均包含在本发明的技术范围中。

实施例1：柠檬香桃提取物的制备

将柠檬香桃的干燥叶(100g)浸渍于表1所示的水或乙醇水(500mL)，在50℃下搅拌2小时并进行提取。通过过滤将固体成分分离，得到提取液。进一步对得到的提取液进行减压浓缩及冷冻干燥而去除溶剂，得到柠檬香桃提取物。

[表1]

提取溶剂	提取物量
		水	16.1g
20v/v％乙醇	20.8g
		40v/v％乙醇	24.1g
60v/v％乙醇	24.1g
		80v/v％乙醇	18.5g
90v/v％乙醇	12.5g
		95v/v％乙醇	10.5g
99.5v/v％乙醇	4.5g

实施例2：用于肌卫星细胞活化能评价的in vitro试验

(1)肌卫星细胞的分离

从6月龄的雄性SD大鼠(Japan SLC,Inc.)摘出大腿部肌肉组织，将脂肪及结缔组织等去除/切碎后，在37℃下、用1.25mg/mL蛋白酶水溶液(Sigma公司)处理1小时。通过差速离心分离将肌纤维碎片等去除后，播种到涂布有聚赖氨酸(Sigma公司)及纤连蛋白(Sigma公司)的板上，在5％CO₂气氛中、37℃下进行24小时前培养后，用PBS进行清洗，由此分离出肌卫星细胞。作为培养基，使用添加有10％马血清(Life Technologies公司)的DMEM(达尔伯克改良伊格尔培养基，Dulbecco’s Modified Eagle Medium，Life Technologies公司)。以下，将该培养基简记为“10％HS-DMEM”。

(2)被检物质处理

将实施例1中制备的各柠檬香桃提取物溶解或悬浮于水中后，添加至10％HS-DMEM，制备包含被检物质的10％HS-DMEM。将分离肌卫星细胞的培养基更换为包含被检物质的10％HS-DMEM，进行24小时培养。需要说明的是，被检物质的处理浓度设为2.5μg/mL，使用水作为溶剂对照。

(3)肌卫星细胞活化评价

在自培养结束起2小时前，向培养基中添加溴脱氧尿苷(BrdU，Sigma公司)以使终浓度成为10μM。培养结束后，使用经水冷的添加有0.1％H₂O₂的甲醇将经被检物质处理的肌卫星细胞在4℃下固定10分钟。进一步使用2N盐酸，在37℃下进行1小时DNA改性处理后，使用抗BrdU抗体(Sigma公司)作为一次抗体、使用HRP结合抗小鼠IgG抗体(Sigma公司)作为二次抗体，用二氨基联苯胺(DAB，Sigma公司)使其显色，对BrdU阳性细胞进行检测。求出BrdU阳性细胞在总细胞数中所占的比例，作为肌卫星细胞活化率。将结果示于表2。

[表２］

评价检体	肌卫星细胞活化率
		溶剂对照	41.9±1.9％
水提取物	50.0±2.1％
		20v/v％乙醇提取物	49.5±2.8％
40v/v％乙醇提取物	50.3±2.2％
		60v/v％乙醇提取物	47.7±1.9％
80v/v％乙醇提取物	44.4±0.8％
		90v/v％乙醇提取物	43.2±0.9％
95v/v％乙醇提取物	42.9±2.0％
		99.5v/v％乙醇提取物	41.5±1.0％

如表2所示的结果所示，与溶剂对照相比，柠檬香桃的水提取物及20～95v/v％乙醇水提取物中可观察到明确的肌卫星细胞活化效果。

实施例3：用于肌卫星细胞活化能评价的in vivo试验

(1)被检物质给药

将14周龄的雄性SD大鼠(Japan SLC,Inc.)以体重为基准、以每组6只分为对照组、柠檬香桃水提取物给药组、柠檬香桃乙醇水提取物给药组这3组。对各组以成为500mg/kg体重的方式、分别1天给药1次水、柠檬香桃水提取物或柠檬香桃60v/v％乙醇水提取物，进行4天口服给药。此外，在解剖2小时前以50mg/kg体重的比例腹腔内给药溴脱氧尿苷(BrdU，Sigma公司)。

(2)肌卫星细胞的分离

从上述大鼠摘出大腿部肌肉组织，将脂肪及结缔组织等去除/切碎后，在37℃下、用1.25mg/mL蛋白酶水溶液(Sigma公司)处理1小时。通过差速离心分离将肌纤维碎片等去除后，播种到涂布有聚赖氨酸(Sigma公司)及纤连蛋白(Sigma公司)的板上，在5％CO2气氛中、在37℃下进行24小时前培养后，用PBS进行清洗，由此分离出肌卫星细胞。作为培养基，使用上述实施例2(1)中使用的10％HS-DMEM。

(3)肌卫星细胞活化评价

使用经水冷的添加有0.1％H₂O₂的甲醇将经分离的肌卫星细胞在4℃下固定10分钟。进一步使用2N盐酸在37℃下进行1小时DNA改性处理后，使用抗BrdU抗体(Sigma公司)作为一次抗体、使用HRP结合抗小鼠IgG抗体(Sigma公司)作为二次抗体，用二氨基联苯胺(DAB，Sigma公司)使其显色，对BrdU阳性细胞进行检测。求出BrdU阳性细胞在总细胞数中所占的比例，作为肌卫星细胞活化率。此外，以对照组的肌卫星细胞活化率为基准，将各组的肌卫星细胞活化率的比作为肌卫星细胞活化度。将结果示于表3。

[表3]

组	肌卫星细胞活化率
		对照组	1.0±0.4
水提取物给药组	2.0±0.2^*
		60v/v％乙醇提取物组	1.7±0.2^*

如表3所示的结果所示，与对照组相比，柠檬香桃的水提取物及60v/v％乙醇水提取物的肌卫星细胞活化效果分别为约2.0倍及约1.7倍。进行Dunnett检验后，结果在水提取物给药组及60v/v％乙醇水给药组中在危险率5％以下可观察到显著的肌卫星细胞活化效果。表3中，“＊”表示相对于对照组有显著性差异。

Claims

1.一种肌肉增强剂，其含有柠檬香桃提取物作为有效成分。

2.根据权利要求1所述的肌肉增强剂，其中，所述柠檬香桃提取物为利用水、或利用水与水混合性溶剂的混合溶剂得到的提取物。

3.根据权利要求1所述的肌肉增强剂，其中，所述柠檬香桃提取物为利用水得到的提取物。

4.根据权利要求1所述的肌肉增强剂，其中，所述柠檬香桃提取物为利用水与乙醇的混合溶剂得到的提取物。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的肌肉增强剂，其中，所述柠檬香桃提取物源自柠檬香桃的叶。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的肌肉增强剂，其每1天给药1mg/kg体重/天以上。

7.一种肌肉增强组合物，其含有权利要求1～6中任一项所述的肌肉增强剂。

8.一种肌肉增强方法，其包括：对动物给药权利要求1～6中任一项所述的肌肉增强剂或权利要求7所述的肌肉增强组合物的工序。