CN108135918A

CN108135918A - Glp-1分泌促进剂

Info

Publication number: CN108135918A
Application number: CN201680044368.5A
Authority: CN
Inventors: 矢田俊彦; 岩崎有作; 原博; 比良彻; 岸本由香; 南真知子
Original assignee: Hokkaido University NUC; Matsutani Chemical Industries Co Ltd; Jichi Medical University
Current assignee: Hokkaido University NUC; Matsutani Chemical Industries Co Ltd; Jichi Medical University
Priority date: 2015-07-29
Filing date: 2016-07-29
Publication date: 2018-06-08
Also published as: JP6896247B2; EP3329922A1; WO2017018500A1; EP3329922A4; US20180214467A1; JPWO2017018500A1; KR20180035878A

Abstract

本发明以提供不以蔗糖为必须的成分、可以促进GLP‑1的分泌的、相对廉价且安全性优异的作为肠促胰岛素激素相关药的GLP‑1分泌促进剂为课题，通过特征在于含有D‑阿洛酮糖作为有效成分的GLP‑1分泌促进剂解决上述课题。

Description

GLP-1分泌促进剂

技术领域

本发明涉及对糖耐量异常(耐糖能異常)的治疗或糖尿病的预防等有用的、作为肠促胰岛素激素的GLP-1的分泌促进剂。

背景技术

胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)是由于饮食摄取而由消化道分泌、具有促进来自胰腺的胰岛素分泌的作用的肠促胰岛素激素的一种。GLP-1响应营养素向消化道管腔内的流入，由作为消化道的内分泌细胞之一的L细胞分泌，与位于胰腺的β细胞表面的GLP-1受体结合，促进来自β细胞内的胰岛素分泌。GLP-1抑制使血糖值上升的激素即胰高血糖素的分泌，另外，胰腺β细胞的保护作用、增殖促进等的作用也在动物中得以确认。作为其它的作用，还有心脏保护作用或增加心输血量、或者高血压改善作用、减弱炎性免疫应答的作用、延迟摄取的食物从胃排出的作用等，具有促进GLP-1分泌的作用的物质极其有用。

另一方面，国际糖尿病联盟(IDF)在汇总了全球糖尿病相关调查的《糖尿病ATLAS第6版 2014 UPDATE (糖尿病アトラス第6版 2014 UPDATE)》中，全球糖尿病人口正爆发性地持续增加，在2014年(现在)患有糖尿病的病人数超过3亿8,670万人(患病率8.3%)，若不实行有效的对策则预计到2035年将增加到5亿9,190万。即，明确了糖尿病是全球性严重的疾病。

在日本糖尿病学会公布的《基于科学根据的糖尿病诊疗指导方针2013 (科学的根拠に基づく糖尿病診療ガイドライン2013)》的“糖尿病诊断的方针”中，糖尿病的诊断以是否为慢性高血糖加上症状等来进行，关于是否为高血糖，通过基于空腹时血糖值与75g经口糖负荷试验(OGTT) 2小时值的组合的判断、和以HbAc1 (NGSP)值≥6.5%为基准的判断来进行。而且，空腹时血糖值划分成126mg/dl以上为糖尿病区，110~126mg/dl为临界区(境界域)，另外，OGTT 2小时值划分成200mg/dl以上为糖尿病区，140~200mg/dl为临界区，在美国糖尿病学会或WHO，将以空腹时血糖值定义的IFG (Impaired Fasting Glucose)和以OGTT2小时值定义的IGT (Impaired Glucose Tolerance)加以区别，而在日本糖尿病学会将二者汇总称为“临界型”。该“临界型”在不施行任何治疗等处理的情形会向“糖尿病型”发展，因此恰当的治疗或处理是必要的。

在这些“临界型”和“糖尿病型”的糖尿病相关疾病的治疗中，近年来，作为肠促胰岛素激素的葡萄糖依赖性胰岛素分泌刺激多肽(GIP)或胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)相关药受到关注。尤其是，日本人被认为胰岛素分泌能、特别是餐后的胰岛素分泌能低，目前为止通常采用通过胰岛素的注射确实地降低血糖值的治疗法，但胰岛素也有使血糖值过度降低的风险，因此不会过度降低血糖值的上述肠促胰岛素激素相关药受到关注。

GIP是通过刺激主要存在于肠道上部的K细胞而分泌的肠促胰岛素激素，如上所述，GLP-1是通过刺激主要存在于肠道下部的L细胞而分泌的肠促胰岛素激素。肠促胰岛素激素作用于胰腺，在高血糖时促进胰岛素分泌，在非高血糖的情形不促进胰岛素分泌，因此引起低血糖的风险小。但是，另一方面，肠促胰岛素激素有通过肠促胰岛素分解酶(DPP-4)迅速分解的缺点，因此进行抑制肠促胰岛素分解的“DPP-4抑制剂”或不受DPP-4作用的“肠促胰岛素激素类似物”的开发、作为副作用少的药物而非常地受到期待。但是，任何的肠促胰岛素激素相关药均不是自然界中存在的物质，其制造成本并非廉价。

作为肠促胰岛素激素相关药，除了上述DPP-4抑制剂或肠促胰岛素激素类似物药之外，还已知有阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇等二糖类分解酶抑制药(α-GI剂)。但是，这些药是合成药，并非廉价，虽然可以与日常饮食一起经口摄取，但需要医师的处方。

并且，这些以往的α-GI剂是拮抗型的二糖类分解酶抑制剂，因此其抑制作用有偏差，并非总能获得一定的效果，为了解决该问题，提出了一种药剂，其特征在于，代替拮抗型抑制剂，含有非拮抗型的蔗糖分解酶抑制剂(L-阿拉伯糖、D-木糖和/或D-塔格糖)及蔗糖作为有效成分或者与含蔗糖食品一同摄取(专利文献1)。但是，该药剂以含有蔗糖作为必须的有效成分为特征，导致原本对糖尿病患者应该施行摄取限制的蔗糖为必须，因此其使用方法需要严加细心的注意，不方便。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：特开2013-63947号公报

非专利文献

非专利文献1：Tech. Bull. Fac. Agr. Kagawa Univ., Vol. 58, 27-32, 2006。

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的目的在于，鉴于上述现有技术，提供即使不以蔗糖作为必须的有效成分、或者不另行给予蔗糖，也促进GLP-1分泌的、相对廉价且安全性优异的作为肠促胰岛素激素相关药的GLP-1促进剂。

用于解决课题的手段

本发明人在为了解决上述课题而进行种种研究时，意外地发现：D-阿洛酮糖不以蔗糖为必须而促进GLP-1的分泌。

D-阿洛酮糖作为α-GI剂而已知(非专利文献1)，因此当初发明人推测：与作为蔗糖分解酶抑制剂而已知的L-阿拉伯糖、D-木糖或D-塔格糖同样，D-阿洛酮糖也可能只要不与蔗糖同时摄取就不促进GLP-1的分泌。另外，详细内容在后文中描述，但在来自小鼠大肠的GLP-1产生细胞的GLP-1分泌实验中，与已知分泌GLP-1的难消化性糊精(阳性对照)不同，D-阿洛酮糖未分泌GLP-1，根据所述实验结果完全无法设想：D-阿洛酮糖不以蔗糖为必须的有效成分、或者不同时摄取蔗糖或含蔗糖食品而促进GLP-1的分泌。因此，通过使哺乳动物仅仅经口摄取仅D-阿洛酮糖可以促进GLP-1分泌的事实是出乎意料的发现。并且明确了：关于如上所述的GIP，虽然与GLP-1同样作为促进胰岛素分泌的肠促胰岛素激素而已知，但与GLP-1不同，已知GIP通过活化脂肪合成系统而诱导脂肪蓄积，同时，本发明的GLP-1分泌促进剂不促进GIP的分泌。

即，本发明是根据上述见解完成、由以下(1)~(6)构成的发明。

(1) GLP-1分泌促进剂，其特征在于，含有D-阿洛酮糖作为有效成分。

(2) 上述(1)所述的GLP-1分泌促进剂，其特征在于，不含蔗糖。

(3) 上述(1)或(2)所述的GLP-1分泌促进剂，其特征在于，空腹时给予。

(4) 上述(1)~(3)的任一项所述的GLP-1分泌促进剂，其特征在于，作为有效成分的D-阿洛酮糖以一次5g以上的量的方式给予。

(5) 上述(1)~(4)的任一项所述的GLP-1分泌促进剂，其特征在于，不摄取蔗糖或含蔗糖食品而进行给予。

(6) GLP-1分泌促进组合物，其特征在于，含有上述(1)~(5)的任一项所述的GLP-1分泌促进剂和水溶性食物纤维作为有效成分。

发明效果

本发明的GLP-1分泌促进剂以D-阿洛酮糖作为有效成分，该D-阿洛酮糖的食用经验和安全性已被确认，既未看到药剂那样的副作用，也不以蔗糖为必须成分，因此非常易于使用，可以简便地促进哺乳动物的GLP-1分泌。而且，D-阿洛酮糖虽然是0千卡的，却具有砂糖的70%左右的甜味，即使不以蔗糖为必须成分也具有优异的GLP-1分泌能力，因此，与具有2千卡/g的热量且在GLP-1分泌中蔗糖是必须的D-塔格糖相比，在可以大幅降低摄取卡路里的方面有用。

附图简述

[图1] 图1是显示在来自小鼠大肠的GLP-1产生细胞中针对D-阿洛酮糖10mM、20mM、40mM的各溶液或难消化性糊精(纤维溶胶2 (Fibersol-2)) 10mM溶液的GLP-1分泌实验的结果的图。

[图2] 图2是显示对绝食小鼠经口给予1g/kg的D-阿洛酮糖后的经时性的门静脉中的活性GLP-1浓度(a)、总GLP-1浓度(b)和总GIP浓度(c)的图。

[图3] 图3是显示对小鼠各自经口给予生理盐水、D-阿洛酮糖0.3g/kg或1.0g/kg、D-塔格糖1.0g/kg或D-葡萄糖1.0g/kg，给予30分钟后的门静脉血中的活性GLP-1浓度(a)和总GIP浓度(b)的图。

[图4] 图4是显示GLP-1受体抑制剂(毒蜥外泌肽-9 (Exendin-9，胰高血糖素样肽的抑制剂-9)，Ex-9)对于通过使用绝食小鼠经口给予D-阿洛酮糖1g/kg而得的摄食抑制效果的效果的图。即，对绝食小鼠腹腔内给予Ex-9 (200mmol/kg)或生理盐水，其后立即经口给予生理盐水或D-阿洛酮糖1g/kg，将从给予后30分钟到6小时后的经时性的摄食量通过能量值(kcal)显示的图。

[图5] 图5是将D-阿洛酮糖或D-塔格糖的各1g/kg对小鼠经口给予后，将从1小时到6小时后的经时性的摄食量通过相对于将生理盐水经口给予时的摄食量的相对值显示的图。

[图6] 图6是显示将D-阿洛酮糖、难消化性糊精(纤维溶胶2)、糊精(松谷化学工业株式会社制品“Pinedex ＃2”)的各0.2g/kg分别给予SD大鼠后从0分钟到240分钟后的经时性的血中葡萄糖浓度(a)和总GLP-1浓度(b)的图。

[图7] 图7是显示使人摄取水200ml或D-阿洛酮糖5g/200ml、10g/200ml或15g/200ml后，将15分钟后、30分钟后、60分钟后、120分钟后和180分钟后的各血中的总GLP-1进行定量，计算血中浓度-时间曲线下面积(AUC)的结果的图。

具体实施方式

本发明的药剂促进GLP-1的分泌，对糖耐量异常的治疗或糖尿病的预防/治疗等、经由GLP-1功能的各种各样的生理功能和疾病/症状的改善极其有用。

关于作为本发明的GLP-1分泌促进剂的有效成分的D-阿洛酮糖，以往公知的任何物质均可使用，不论其精制程度如何，有从鼠刺(Itea)等的植物提取而得的物质、通过碱异构化法将D-葡萄糖或D-果糖作为原料进行异构化而得的物质(例如，松谷化学工业(株)制“Rare Sugar Sweet”)、通过利用从微生物或其重组体而得的酶(异构酶或表异构酶等)的酶法将D-葡萄糖或D-果糖作为原料进行异构化而得的物质(例如，松谷化学工业(株)制“Astraea Allulose”)等，可以比较容易地获取。

为了使本发明的GLP-1分泌促进剂发挥其效果，经口摄取D-阿洛酮糖是重要的，此时，蔗糖在肠内同时存在的状态并非必须。即，没有必要使本发明的GLP-1分泌促进剂在含蔗糖食品中含有，而且，也没有必要将本发明的GLP-1分泌促进剂与蔗糖或含蔗糖食品同时摄取或在摄取后给予。

本发明的GLP-1分泌促进剂的剂型无特别限制，例如可以是片状、颗粒状、粉末状、胶囊状、凝胶状、溶胶状的任一种，而且，制剂化按照公知的方法进行即可，可以通过将有效成分的D-阿洛酮糖与淀粉或羧甲基纤维素等的药学上可接受的载体混合，进一步根据必要添加稳定剂、赋形剂、粘结剂、崩解剂等来进行。

关于本发明的GLP-1分泌促进剂，作为有效成分的D-阿洛酮糖优选以一次0.07/体重kg以上的量的方式给予，更优选一次为0.07~2.0g/体重kg、进一步优选一次为0.1~0.6g/体重kg的量。

本发明的GLP-1分泌促进剂优选在空腹时摄取。具体而言，优选在餐前5分钟以前摄取，更具体而言，更优选在之前的餐后3小时经过后且在下一餐前10分钟以前摄取。

本发明进一步提供GLP-1分泌促进组合物，其特征在于，除了上述GLP-1分泌促进剂之外，还含有水溶性食物纤维作为有效成分。

作为水溶性食物纤维，可以示例：果胶、魔芋甘露聚糖(Konjak Mannan)、褐藻酸、胍尔豆胶、琼脂等的高粘性食物纤维，或难消化性糊精、聚糊精(Polydextrose，聚葡萄糖)、胍尔豆胶分解物等的低粘性食物纤维。

这些之中，从效果的观点出发，特别优选难消化性糊精、胍尔豆胶水解物、聚糊精等。

这些之中，从操作和至大肠为止的移动时间短的观点出发，优选低粘性食物纤维。低粘性的水溶性食物纤维是指含有50质量%以上的食物纤维、溶解于常温水中形成低粘性的溶液的食物纤维素材料，所述低粘性的溶液是在大约5质量%水溶液中显示20mPas以下的粘度的溶液。作为低粘性食物纤维，更具体而言，可以列举：难消化性糊精、胍尔豆胶水解物、聚糊精(例如Litesse (利体素)等)、来自半纤维素的物质等。

难消化性糊精是将各种的淀粉，例如马铃薯淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉、小麦粉淀粉等于130℃以上加热分解，将其用淀粉酶进一步水解，按照常规方法，根据必要进行脱色、脱盐制造而得的物质。食物纤维的平均分子量为500至3000左右、优选为1400~2500、进一步优选为2000前后。葡萄糖残基为α-1,4、α-1,6、β-1,2、β-1,3、β-1,6-糖苷键合、还原末端的一部为左旋葡聚糖(1,6-无水葡萄糖)的分枝结构发达的糊精。以“Nutriose” (Roquette社制)、“Pine Fibre”、“纤维溶胶2” (松谷化学工业株式会社制)的商品名市售(“食品新原料Forum”NO.3 (1995、食品新原料协议会编))。

胍尔豆胶的水解物是将胍尔豆胶通过酶水解而得的物质，其性质通常为低粘性且冷水可溶，水溶液为中性且无色透明。作为胍尔豆胶水解物，以“Sunfiber” (太阳化学社)、“Fibaron” (大日本制药社)的商品名市售。

来自半纤维素的物质通常是用碱从玉米的外皮中提取、精制而制造的物质，平均分子量较大为约20万，5%水溶液的粘度较低为10cps左右，溶解于水中成为透明的液体。来自半纤维素的物质以“Cellace” (日本食品化工社)的商品名市售。

聚糊精(Litesse)是将葡萄糖与山梨糖醇在柠檬酸的存在下液压加热进行聚合、精制而得的物质，为水溶性且低粘性。作为“Litesse” (Pfizer社)而市售。

这些低粘性的水溶性食物纤维之中，难消化性糊精效果最好，因此优选。

作为本发明的GLP-1分泌促进剂的有效成分，可以单独使用D-阿洛酮糖，在希望长时间维持GLP-1分泌的情形，优选并用难消化性糊精。这是因为难消化性糊精比D-阿洛酮糖更延迟地发挥GLP-1的分泌促进效果，因此通过并用可以长时间维持GLP-1的分泌。

本发明的GLP-1分泌促进剂和难消化性糊精以质量比计优选以1：0.1~1：100之比含有，更优选为1：0.5~1：50。

实施例

以下，具体地显示本发明的GLP-1分泌促进剂的优异效果。需说明的是，实施例的记载仅仅是为了理解发明而列举的，本发明不受这些实施例限定。需说明的是，在显示实施例之前，为了参考而显示预备试验的结果。

已知活性型(active) GLP-1在血中由于受到作为酶的DPP-4的非常迅速的限定性分解而失去生理活性，成为无活性型GLP-1。因此，在希望测定活性型GLP-1的情形，将血液立即地保存于加入有肽分解抑制剂(DPP-4抑制剂)的采样注射器中进行测定或者采集相当量的血液等的办法是必要的。因此，通过将组合有活性型(active) GLP-1和无活性型GLP-1、不受DPP-4的影响的血中的总GLP-1进行定量，可以获知其体内分泌量本身，所以，原则上通过将总GLP-1进行定量来确认GLP-1分泌促进效果，就实验而言，为了参考活性GLP-1也一并进行了测定。

对于GIP，测定了组合有活性型和无活性型的总GIP。

(预备试验)

＜培养细胞＞

将来自小鼠大肠的胰高血糖素样肽-1 (Glucagon-Like Peptide-1，GLP-1)产生细胞株GLUTag用含有10%FBS的达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle'sMedium)在37℃、5% CO₂存在下进行了培养。

＜GLP-1分泌试验＞

将GLUTag细胞在48孔板中培养2、3日至亚融合为止。在添加各样品(D-阿洛酮糖或难消化性糊精)之前，使用Hepes缓冲液(140mM NaCl、4.5mM KCl、20mM Hepes、1.2mM CaCl₂、1.2mM MgCl₂、10mM D-glucose、0.1%BSA、pH7.4)洗涤孔，添加溶解于相同缓冲液中的样品溶液80μl，以37℃培育了60分钟。将上清回收后，通过离心分离(800×g、5分钟、4℃)使细胞沉淀，将其上清70μl进行了冷冻保存。将该上清中的总GLP-1使用市售的“酶免疫试剂盒(Enzyme Immunoassay Kit)” (株式会社矢内原研究所制)进行了测定。

＜结果＞

加入D-阿洛酮糖的10mM、20mM、40mM的各溶液或难消化性糊精(松谷化学工业株式会社制品“纤维溶胶2” (DE10)) 10mM溶液，进行上述GLP-1分泌试验时，难消化性糊精显著地促进GLP-1分泌，另一方面，在D-阿洛酮糖中，是稍微见到分泌促进倾向的程度(图1)。即，未观察到D-阿洛酮糖通过对GLP-1产生细胞株的直接作用促进GLP-1分泌的效果。

(实施例1)

作为实验动物，使用C57BL/6J雄性小鼠(9-11周龄)。对从实验前日的18时00分钟开始绝食16小时的小鼠，于上午10:00将D-阿洛酮糖1g/kg进行了经口胃内给予。经口给予量为10ml/kg。D-阿洛酮糖给予前和从给予起30分钟和60分钟后，在异氟醚麻醉下进行了门静脉釆血。需说明的是，在采样注射器中预先加入了血液凝固抑制剂(肝素(终浓度50IU/ml))、肽分解抑制剂(抑肽酶(终浓度500KIU/ml)和维达列汀(Vildagliptin) (终浓度10μM))。对采集的血液进行冷却离心，将所得的血浆至分析为止于-80℃进行了保存。活性GLP-1、总GLP-1和总GIP的定量分析使用ELISA试剂盒(Millipore社制。分别为EGLP-35K、EZGLP1T-36K和EZRMGIP-55K)来进行。而且，关于统计分析，进行单向方差分析(有配对(対応あり))，接着进行将D-阿洛酮糖给予前(0分钟)作为对照的Dunnett检验。结果示于图2。需说明的是，图2中，*为p＜0.05，**为p＜0.01。而且，图2中的棒图内的数值表示实验数。

其结果，若将D-阿洛酮糖经口给予，则从给予后30分钟至60分钟后为止，时间依赖性地门静脉中的活性GLP-1和总GLP-1浓度上升(图2(a)、(b))。即，利用使用小鼠的实验首次明确了通过D-阿洛酮糖的单独经口给予诱导GLP-1的分泌，作为其作用机理，推测为D-阿洛酮糖直接作用于GLP-1产生细胞(L细胞)。另一方面，D-阿洛酮糖的经口给予在至给予后60分钟为止的期间，未影响GIP分泌(图2(c))。根据上文，明确了D-阿洛酮糖的单独经口给予不影响促进脂肪合成的GIP的分泌，强烈诱导具有胰岛素分泌促进、食欲抑制、胃排出抑制等作用的GLP-1的分泌。

(实施例2)

对从实验前日的18时00分钟开始绝食16小时的C57BL/6J雄性小鼠(9-11周龄)，于上午10:00将D-阿洛酮糖0.3g/kg或1g/kg、D-塔格糖或D-葡萄糖各1g/kg、或生理盐水进行了经口胃内给予。经口给予量为10ml/kg。从给予起30分钟后，在异氟醚麻醉下进行了门静脉釆血。需说明的是，在采样注射器中预先加入了血液凝固抑制剂(肝素(终浓度50IU/ml))、肽分解抑制剂(抑肽酶(终浓度500KIU/ml)和维达列汀(Vildagliptin) (终浓度10μM))。对采集的血液进行冷却离心，将血浆至分析为止于-80℃进行了保存。活性GLP-1和总GIP的定量分析使用上述的试剂盒来进行。而且，关于统计分析，进行单向方差分析(无配对(対応なし))，接着进行将生理盐水作为对照的Dunnett检验。结果示于图3。需说明的是，图3中，*为p＜0.05，**为p＜0.01。而且，图中的棒图内的数值表示实验数。

其结果，D-葡萄糖1g/kg的经口给予完全不改变给予后30分钟的门静脉中活性GLP-1浓度，另一方面，D-阿洛酮糖0.3g/kg的经口给予有使给予后30分钟的门静脉中活性GLP-1浓度上升的倾向，D-阿洛酮糖1g/kg的经口给予使门静脉中的活性GLP-1浓度显著地上升(图3(a))。而且，若将D-塔格糖(1g/kg)单独经口给予，则给予后30分钟后的门静脉中活性GLP-1浓度有上升的倾向，但是，其值与对照组比较无显著性上升，若与D-阿洛酮糖1g/kg的值比较，则是低值(图3(a))。因此，显示出D-阿洛酮糖是比D-塔格糖更有利的GLP-1分泌促进剂。最后，测定D-阿洛酮糖0.3g/kg或1g/kg、D-葡萄糖1g/kg或D-塔格糖1g/kg的经口给予后的门静脉中总GIP，其结果仅D-葡萄糖给予组的GIP浓度显著地上升(图3(b))。因此，明确了：在基于单糖的经口给予的GLP-1和GIP分泌机制中，存在各自独立的分泌促进机理。

(实施例3)

将C57BL/6J雄性小鼠(9-11周龄)在单独笼内预备饲养1周以上，通过实验者进行操纵，使其顺应饲养、实验环境。从实验前日的18时00分钟开始绝食16小时后，从9时45分钟开始将生理盐水或GLP-1受体抑制剂(Exendin-9，Ex-9，200nmol/kg)腹腔内给予，之后立刻将生理盐水或D-阿洛酮糖1g/kg进行了经口胃内给予。腹腔内给予和经口给予的各给予容量分别为5ml/kg和10ml/kg。从10时00分钟开始，使小鼠自由摄食CE-2饲料(营养平衡的摄取的一般的小鼠用饲料，日本CLEA制)，将0.5小时、1小时、2小时、3小时和6小时后的摄食量经时性地进行了测定。关于摄食量，以将经口胃内给予的每1g D-阿洛酮糖作为0kcal、每1g CE-2饲料作为3.45kcal的能量摄取量(kcal)形式进行了计算。关于统计分析，对于各时间点的结果进行单向方差分析(无配对)，进行了基于Tukey's检验的全组比较。结果示于图4。需说明的是，图4中，*为p＜0.05，**为p＜0.01。

其结果，若将“对照组”(生理盐水腹腔内给予-生理盐水经口给予、白)和“D-阿洛酮糖组”(生理盐水腹腔内给予-D-阿洛酮糖经口给予、网点)比较，则D-阿洛酮糖1g/kg经口给予从给予后30分钟至6小时为止显著地降低了摄食量。“GLP-1受体抑制剂单独给予组”(Ex9腹腔内给予-生理盐水经口给予、网眼斜线)与“对照组”相比，在所有的时间带中是相同水平的摄食量(图4)，暗示了：由于CE-2饲料的摄取而分泌的内源性GLP-1对摄食量不产生影响。

另一方面，若对“GLP-1受体抑制剂+D-阿洛酮糖组” (Ex9腹腔内给予-D-阿洛酮糖经口给予、斜线)进行比较，则给予后30分钟的“GLP-1受体抑制剂+D-阿洛酮糖组”的摄食量与“对照组”或“GLP-1受体抑制剂单独给予组”相比显著地减少，是与“D-阿洛酮糖组”相同水平的摄食量。因此，暗示了：给予后30分钟后的D-阿洛酮糖所导致的摄食抑制作用是GLP-1以外的摄食抑制作用(图4)。给予后1小时之后的摄食量与“对照组”或“GLP-1受体抑制剂单独给予组”的摄食量无显著的差异，与此相反，比“D-阿洛酮糖组”显著地增加了摄食量(图4)。即，显示了：D-阿洛酮糖经口给予后1小时至6小时的摄食抑制作用由于GLP-1受体抑制剂的腹腔内给予而消失。根据上文，明确了：D-阿洛酮糖1g/kg的经口给予经由GLP-1分泌促进而抑制摄食量。

(实施例4)

将C57BL/6J雄性小鼠(7-11周龄)在单独笼内预备饲养1周以上，通过实验者进行操纵，使其顺应饲养、实验环境。从实验前日的18时00分钟开始绝食16小时后，从9时50分钟开始将生理盐水、D-阿洛酮糖1g/kg或D-塔格糖1g/kg分别进行了经口胃内给予。给予容量为10ml/kg。从10时00分钟开始，使小鼠自由摄食CE-2饲料，将1小时、2小时和6小时后的摄食量经时性地进行了测定。关于摄食量，以将经口胃内给予的每1g D-塔格糖作为2kcal、每1gCE-2饲料作为3.45kcal的能量摄取量(kcal)形式进行了计算。关于统计分析，对各时间点的结果进行单向方差分析(无配对)，进行了基于Tukey's检验的全组比较。结果示于图5。需说明的是，图5中，*为p＜0.05、**为p＜0.01。

其结果，关于“D-阿洛酮糖组” (网点)，在D-阿洛酮糖经口给予后从1小时开始至6小时为止，相比“对照组” (生理盐水给予、白)，摄食量是显著的低值(图5)。关于“D-塔格糖给予组” (斜线)，给予后1小时的摄食量相比“对照组”是显著的低值，而相比“D-阿洛酮糖组”是显著的高值。而且，关于“D-塔格糖给予组” (斜线)，D-塔格糖给予后2小时和6小时的摄食量与“对照组”为相同程度，相比“阿洛酮糖组”是显著的高值，未确认到摄食抑制作用。

因此，虽然在D-塔格糖1g/kg经口给予时可见摄食抑制作用，但其作用是至给予后1小时为止的短期作用，明确了：若与D-阿洛酮糖1g/kg经口给予比较，则其作用程度弱。作为D-塔格糖1g/kg经口给予所导致的摄食抑制作用弱的理由，推测为：相比D-阿洛酮糖，GLP-1分泌促进效果弱(图3)。

(实施例5)

自一夜绝食的Sprague Dawley大鼠(8~9周龄的雄性)的尾静脉进行了样品给予前(0分钟)的釆血。使用喂食管(feeding tube)将去离子水(对照组)、D-阿洛酮糖、难消化性糊精(DE10)、糊精(松谷化学工业株式会社制品“Pinedex ＃2” (DE10))的各溶液以2g/kg体重(10mL/kg体重)进行了经口给予。其后，于15分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、150分钟、180分钟、210分钟、240分钟后，自尾静脉进行了釆血。

血液回收到预先添加有DPP-IV抑制剂(Millipore社制)、抑肽酶(和光纯药工业社制)、肝素(Nacalai Tesque社制)的管中。通过离心分离回收血浆，于-80℃进行了冷冻保存。将所得的血浆中的总GLP-1浓度利用市售的ELISA试剂盒(Millipore社制 MlutiSpecies GLP-1 Total ELISA)进行了测定。血浆中的葡萄糖浓度利用葡萄糖CII-TestWako (和光纯药工业社制)进行了测定。

＜试验结果＞

图6显示血糖值的变化和血中总GLP-1浓度的变化。血糖值通过给予糊精而上升，通过难消化性糊精而略微上升，通过给予D-阿洛酮糖观察到与对照组(给予水)同样的略微改变(图6(a))。由该结果确认了：D-阿洛酮糖没有使血糖值上升的作用。

另一方面，关于GLP-1浓度，通过给予D-阿洛酮糖使给予后60分钟~120分钟作为峰值而大幅上升，与此相对，通过给予难消化性糊精在给予后90分钟之后上升，但是比D-阿洛酮糖弱的作用，通过由作为GLP-1的分泌刺激而最为周知的葡萄糖构成的消化性糊精(Pinedex ＃2)的给予，没有促进GLP-1分泌(图6(b))。由该结果显示出：D-阿洛酮糖具有较强的GLP-1分泌促进作用，且是以给予后60~120分钟为峰值的具有持续性的作用。

(实施例6)

＜试验方法＞

预先设置1周以上的休止期后，对于健康受试者6名(男3名和女3名。体重53.3±7.4kg)，每次随机地摄取水200ml (对照饮料)或D-阿洛酮糖5g/200ml (若以体重换算，则为D-阿洛酮糖0.07~0.11g/kg)、10g/200ml (若以体重换算，则为D-阿洛酮糖0.14~0.22g/kg)或15g/200ml (试验饮料) (若以体重换算，则为D-阿洛酮糖0.21~0.33g/kg)。摄取对照饮料或试验饮料之日(试验日)的前夜，摄取指定的晚餐，从前夜21时之后至试验当日的上午9时为止，禁止摄取除水和茶饮料之外的饮食物(foods and beverages)。上述指定食物为下述菜单的任一种的选择性，其为几乎不含食物纤维、乳酸菌、发酵性糖质之类的具有可利用肠内细菌发酵的物质的菜单(咖喱、鸡蛋鸡肉盖饭、牛肉盖饭、中华盖饭)。在试验日当日的上午9时的空腹时釆血后，摄取对照饮料或试验饮料，在其摄取后15分钟、30分钟、60分钟、120分钟和180分钟后进行了釆血。需说明的是，在其采血期间，可仅摄取指定分量的水。采血通过如下操作来进行：各受试者本身利用血细胞比容管采集用糖尿病患者用而市售的穿刺器刺破指尖所得的出血液。采集的血液转移至微管(Microtube)供于离心分离器，将离心分离的血浆的总GLP-1量使用Merck (株)制品“Multi Species GLP-1 Total ELISA”进行了测定。需说明的是，受试者需遵守：在试验期间即约1个月间，需要保持规则性的生活避免过激的运动或暴饮暴食，以及试验中在室内安稳地度过。

＜试验结果＞

以各血中的总GLP-1为纵轴，以上述D-阿洛酮糖摄取后15分钟~180分钟后的各时间为横轴，计算出绘制折线图时的血中总GLP-1浓度-时间曲线下面积(AUC)，所得的数值示于图7。明确了：依赖于D-阿洛酮糖摄取量，AUC数值变大，通过每1次摄取0.07g/体重kg以上D-阿洛酮糖，获得促进血中的总GLP-1分泌量的效果。

Claims

1. GLP-1分泌促进剂，其特征在于，含有D-阿洛酮糖作为有效成分。

2.权利要求1所述的GLP-1分泌促进剂，其特征在于，不含蔗糖。

3.权利要求1或2所述的GLP-1分泌促进剂，其特征在于，空腹时给予。

4.权利要求1~3的任一项所述的GLP-1分泌促进剂，其特征在于，作为有效成分的D-阿洛酮糖以一次0.07g/体重kg以上的量的方式给予。

5.权利要求1~4的任一项所述的GLP-1分泌促进剂，其特征在于，不摄取蔗糖或含蔗糖食品而进行给予。

6. GLP-1分泌促进组合物，其特征在于，含有权利要求1~5的任一项所述的GLP-1分泌促进剂和水溶性食物纤维作为有效成分。