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CN108135885A - 用于靶向治疗癌症的光动力治疗剂的合成和组合物 - Google Patents

用于靶向治疗癌症的光动力治疗剂的合成和组合物 Download PDF

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CN108135885A
CN108135885A CN201680059632.2A CN201680059632A CN108135885A CN 108135885 A CN108135885 A CN 108135885A CN 201680059632 A CN201680059632 A CN 201680059632A CN 108135885 A CN108135885 A CN 108135885A
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CN
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cancer
amino acid
disease
tumor
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Application number
CN201680059632.2A
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S·A·库拉拉特恩
P·嘉嘉里
C·H·迈耶斯
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On Target Laboratories Inc
Original Assignee
On Target Laboratories Inc
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Abstract

本发明描述用于图像引导式手术和光动力疗法的新化合物。尤其是，在化合物被递送至患病组织比如癌瘤之后，该化合物可以靶向细胞核或线粒体，其利用靶向在患病组织上表达的受体的配体和随后受体介导的内吞作用，从而提供对癌细胞以及其它障碍的有效活性。还描述了使用其的方法和组合物。

Description

用于靶向治疗癌症的光动力治疗剂的合成和组合物
相关申请
本专利申请涉及和要求2015年9月9日提交的U.S.临时专利申请Ser.No.62/216,148的优先权益处，在此通过援引将其全部内容并入本公开中。
公开领域
本公开涉及治疗表达叶酸受体的患病细胞比如癌细胞、肿瘤相关的巨噬细胞的方法和用于其中的组合物和化合物。本公开提供运用靶向光动力治疗的(PDT)试剂治疗肿瘤的方法。PDT试剂可以加以修饰以靶向线粒体或细胞核，然后缀合至配体比如叶酸或叶酸盐/酯，其靶向在病原/患病细胞中过表达的受体比如叶酸受体，以便经由适宜连接体增加化合物的特异性和检测，所述连接体用来改善水溶解度、药代动力学特性、和生物利用度等，以便在患病细胞内释放PDT试剂、由此引导至细胞中的线粒体或细胞核，以便预防通过流出泵[例如ATP结合盒家族(ABC运载体)]发展药物抗性等。预期的是，牵涉其应用的使用缀合化合物的治疗方法。
公开背景
治疗癌症最通常牵涉手术，放疗，激素给药和/或化疗。不幸地，这些疗法均未能对转移疾病高度有效。此外，各自具有很多缺点以致患者常常拒绝这些疗法。
手术除去恶性病是初步治疗癌症最常见且有效治疗性干预之一。切除全部可检测的恶性病灶引起在大约50％的全部癌患者中不可检测的疾病复发并且可以延长预期寿命或降低观察到癌症复发的患者的发病。并不令人惊讶地，实现更定量的细胞减少的手术方法目前正接受更高的关注。
为了最佳的癌手术切除重要的是，手术医师定位全部癌组织和淋巴结，并且能够除去癌瘤和淋巴结而不显著危害相邻结构和器官的残余功能。据估计，在超过40％的癌患者中手术切除仍在患者中余留某些癌细胞(甚至在切除之后)，原因是不能鉴定出癌性组织，或如果鉴定出则无法适当切除。这些"脱逃的"恶性细胞导致疾病复发或甚至死亡的显著风险，除非将它们找到并除去。在前列腺癌中，原发肿瘤能够通过除去前列腺而治疗。然而，激进的前列腺切除术(完全除去前列腺)具有显著缺点和可以引起失去排尿控制和阳痿。
又一治疗性干预牵涉单独或作为组合治疗方案的一部分的放疗。然而，放疗能够增加出现第二类癌症的风险。例如，用放疗治疗前列腺癌能够增加结肠癌和膀胱癌的风险。侵入性或转移癌的治疗常常局限于治标性激素疗法和/或化疗。虽然激素治疗诱导激素响应性癌的缓解，但是肿瘤缓解寿命是受限的并且其并非不具有显著毒性，包括与所给予的药物有关的肝损害，心血管疾病，重量增加和骨质疏松症。
尽管化疗还可以扩展寿命，这种抗有丝分裂药物的副作用常常超过它们的益处。绝大多数癌症疗法目前牵涉用细胞毒素药物治疗，其在给药时无差别地分布至实质上身体的全部细胞并同时导致对恶性细胞和健康细胞类似的损害。因为所述常规化疗主要设计用来杀死快速分裂中的细胞，它们也毁坏增殖中的健康细胞，导致脱靶毒性，所述毒性能够包括骨髓抑制，粘膜炎，脱发，恶心/呕吐，贫血，外周神经病和疲劳等。清楚的是，能够靶向选择性病理细胞、避免误伤健康细胞的细胞毒素疗法会是癌症治疗中的显著进步。因此，非常需要更安全的且更有效的治疗癌症的方法。
图像引导式手术是发展中的技术，其帮助手术医师更精确地识别和除去恶性组织而不危害周围的健康组织。图像引导式手术领域的固有挑战之一是开发成像剂(探针)，其对癌组织特异性和敏感并且选择性地蓄积在肿瘤当中以帮助识别肿瘤。对于不能通过一般技术容易识别的潜在病灶来说，这尤其重要。虽然FDA已批准吲哚菁绿(ICG)，非靶向的近红外(NIR)-染料用于某些癌症的图像引导式手术，已发现其在识别肿瘤组织中具有关于敏感性和特异性的显著局限。
受到需要改善的肿瘤识别的激励，发明人当中的某些已预先发开出了新的高亲和力的靶向叶酸受体(FR)的NIR探针(OTL38)，用于叶酸受体阳性癌症的图像引导式肿瘤手术中。OTL38在合成和贮藏期间是高度稳定的，在小规模至GMP制备中展示合成便利，并且对原发和转移癌细胞来说在培养物中和在动物模型中对FR-阳性癌细胞有高度特异性，在大鼠和犬中没有毒性。基于这些成功的临床前数据，OTL38在2014年1月于荷兰Leiden进入一期临床试验，对于卵巢癌和肺癌在USA的6个不同地点进入二期临床试验。在该研究中，与不使用OTL38相比，大约5X多的恶性病灶借助OTL38除去。另外，全部切除的荧光病灶都被病理确认是恶性的。使用OTL38-引导的切除能够除去大约95％的肿瘤细胞。从而，需要找到或改善疗法从而能尽可能地消除剩余5％的所述癌症。
本发明的一部分是鉴定出使用OTL38(靶向叶酸的NIR染料)和靶向叶酸的治疗剂的混合物的新途径，其能在图像引导式手术之后或在图像引导式手术期间使用。然而，该途径的一个缺点是OTL38和靶向叶酸的治疗剂两者将竞争相同叶酸受体，并且较高受体亲和力的化合物将发挥支配作用。例如，如果OTL38具有与靶向叶酸的治疗剂相比更低的亲和力，则肿瘤中的荧光会更少，从而手术医师可能无法切除与肉眼相比5x多的肿瘤。另一方面，如果成像剂具有更高的受体亲和力，则治疗剂将可能无法有效产生希望的治疗结果。因此，有必要找到两种化合物的正确比率或调节靶向叶酸的治疗剂的药代动力学特性以匹配OTL38。另选地，能够改变给予OTL38进行图像引导式手术和给予靶向叶酸的治疗剂进行治疗之间的时间，而不是调节靶向叶酸的治疗剂的药代动力学特性使之区别于OTL38。在又一备择中，能满足图像引导式手术以及治疗剂两种意图的治疗模式会是理想情况。
光动力疗法(PDT)是能用于图像引导式手术以及治疗两者当中的新技术。该治疗模式使用光敏剂(PS)和与之组合的特别类型的光源。在适当剂量的PS被辐射的情况下，发生光动力反应并产生反应性氧类(ROSs)。这些ROSs诱导患病细胞比如恶性细胞、炎性细胞和微生物细胞的细胞死亡和坏死。PDT已用来治疗疾病，其范围从癌症到年龄相关性黄斑变性和对抗生素有抗性的感染
在光敏剂暴露于特定波长的光的情况下，其从光吸收光子(能量)从基态(单线态)活化为激发态(三线态)。然后，其以三种方式弛豫至基态：通过非辐射衰变、发出光子和/或能量转移。发出光子的可检测结果是荧光。能量转化导致产生ROS，最终导致光毒性。然而，在这两种过程(荧光与光毒性之间)的比率取决于所用PS的类型。因此，发现具有正确平衡的正确PS对其在手术期间或在手术之后在PDT中作为图像引导式手术以及治疗的完美候选物是重要的。
基于产生的ROS类型，存在两种类型的能够发生的光动力反应。类型I PDT：首先，活化的致敏物能够与底物比如细胞膜或分子直接反应，并通过抽取电子形成超氧化物阴离子残基(O2 -)或转移电子或氢原子形成羟基残基(OH*)和/或过氧化物残基(OOH*)而产生自由基。这些自由基然后与氧相互作用产生含氧产物(1O2)。
类型II PDT：活化的致敏物能够将其能量直接转移至氧以形成单线态氧(1O2)，其是高度反应性氧类。这些种类氧化各种底物。
在PS活化之后，类型I和类型II PDT反应都能够发生。然而，这些过程之间的比率取决于所用PS的类型，底物浓度，组织中存在的氧量，集中在底物或组织中的PS分子数量。
因此，存在未满足的开发创新技术的医学需求，所述技术能够选择性地使PS不仅靶向患病细胞而且还靶向患病细胞内的适当腔室，并且消除疾病。此外，PS应克服常规非靶向PDT试剂所存在的缺点。例如，上述分子应具有高效能，高特异性，较高水溶解度，对健康细胞的低毒性，不具有副作用或具有最低的副作用(特别是皮肤毒性)。
基于叶酸受体(FR)在普通组织中的有限分布和在各种疾病细胞中的较高受体表达水平，叶酸(FA)仍是有吸引力的和高亲和力的配体，其用于选择性递送治疗剂和成像剂至FR+癌细胞，活化的巨噬细胞和肿瘤有关的巨噬细胞。迄今，已鉴定出FR的4个同种型(FR-α，FR-β，FR-γ和FR-δ)，然而仅FR-α和FR-β以适当数量表达，可用于诊断和治疗应用。在上皮衍生癌中过表达的FR-α以高水平存在与癌症比如肺癌，卵巢癌，肾癌，乳腺癌，髓性癌和脑癌中。与之相对，FR-β在与炎性疾病状态有关的活化巨噬细胞和肿瘤相关的巨噬细胞上表达，但不在休眠的或静息的巨噬细胞上表达。重要地，绝大多数细胞经由还原的叶酸载体或质子偶合的叶酸运载体蓄积它们所需要的FA(维生素B9)，所述运载体无法运输叶酸缀合物。由于FR受体在特定类型细胞上的这种选择性过表达，靶向叶酸的99mTc和111In SPECT成像剂、19F PET成像剂和NIR旋光成像剂(OTL38)已被开发用于在诊所中检测FR+癌和炎性条件。此外，还评价了靶向叶酸的化疗药剂。
本公开概要
本公开提供合成光动力治疗剂的方法，所述治疗剂通过适宜的连接体缀合至靶向在患病细胞上过表达的受体的配体。治疗剂能够用于光动力疗法以治疗肿瘤和其它恶性病灶。在某些实施方式中，本公开涉及化合物或其盐衍生物，其包含叶酸或蝶酰基配体，氨基酸(连接体)，一旦PDT试剂位于患病细胞中则引导PDT试剂的细胞器靶向部分，和光动力治疗剂。本发明试剂具有高水溶解度，更佳的PK特性，和高PDT效力。可释放的连接体在患病细胞内释放靶向细胞器的PDT试剂，由此靶向细胞器的PDT试剂能够移动至特定的细胞器。在某些实施方式中，氨基酸能够是天然氨基酸。在某些实施方式中，联接基团能够是聚醚化合物，磺酸，聚糖，氨基酸，其异构体、衍生物或外消旋混合物。在某些实施方式中，可释放的连接体含有二硫醚键，酸敏感基团，酶敏感基团，等。在其它方面，靶向细胞器的试剂是靶向线粒体或细胞核的试剂。在又一方面，光动力治疗剂能够选自Bpheid-a缀合物和Visudyne缀合物。
在某些方面，本公开提供用靶向试剂修饰光动力治疗剂的方法，其中靶向试剂能够靶向细胞核或线粒体。应注意，本发明化合物可以特别用于治疗癌症。特别优选的本发明化合物包括但不限于化合物9，化合物11a，化合物11b，化合物12b，化合物13，化合物14，化合物15，化合物26，化合物27，化合物41，化合物58a，化合物59a，化合物60a，化合物64，化合物65a，化合物65c，化合物76a，化合物76c，化合物88a，化合物89，化合物92a，化合物99，化合物100，化合物104，化合物112a，化合物112b，化合物116，和化合物117。所述化合物可以单独使用或与其它疗法组合使用。确实，具有比BPheid-a更佳的EC50值的本文描述的任何化合物都可以用作本发明的治疗、诊断或研究化合物。制备前述化合物的方法和组合物在下文实例中详述。
在本公开的某些方面，联接基团是氨基酸。在其它方面，联接基团是聚醚，磺酸及其衍生物，聚糖及其衍生物，或氨基酸及其衍生物。
在其它方面，本公开提供将联接基团与叶酸配体缀合的方法，其中联接基团是聚乙二醇(PEG)，聚氧化乙烯(PEO)或聚氧乙烯(POE)。
本公开提供将联接基团缀合至蝶酰基配体的方法，其中联接基团是聚乙二醇(PEG)，聚氧化乙烯(PEO)或聚氧乙烯(POE)。
在其它方面，本公开提供将联接基团与叶酸配体缀合的方法，其中联接基团是磺酸或二硫醚化合物。
本公开提供将联接基团缀合至蝶酰基配体的方法，其中联接基团是磺酸或二硫醚化合物。
在某些方面，本公开提供将氨基酸缀合至光动力治疗剂的方法，其中氨基酸是酪氨酸，丝氨酸，苏氨酸，赖氨酸，精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸，硒代半胱氨酸，其异构体或衍生物，并且与光动力治疗剂的缀合是通过二硫醚键。
本公开提供将氨基酸缀合至靶向试剂的方法，其中氨基酸是酪氨酸，丝氨酸，苏氨酸，赖氨酸，精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸，硒代半胱氨酸，其异构体或衍生物，并且与靶向试剂的缀合是通过胺键。
在某些方面，本公开提供将氨基酸缀合至靶向试剂的方法，其中氨基酸是酪氨酸，丝氨酸，苏氨酸，赖氨酸，精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸，硒代半胱氨酸，其异构体或衍生物，并且与靶向试剂的缀合是通过二硫醚键。
在其它方面，化合物高度选择性地靶向表达靶标受体的肿瘤细胞。
在某些方面，本公开涉及将氨基酸联接基团缀合至PDT试剂，所述试剂具有约500nm至约900nm的吸收最大值和发射最大值。在其它方面，氨基酸联接基团缀合至PDT试剂，其具有约600nm至约800nm的吸收最大值和发射最大值。
在特定的实施方式中，本公开涉及使用靶向叶酸的、靶标细胞器的可释放的二硫醚连接的BPheid-a缀合物，用于癌症的光动力疗法、光化疗、光放疗、光照疗法，法医应用，采矿应用，牙应用，凝胶染色，DNA测序，神经染色，或整形手术。
在某些方面，本公开涉及用于靶向肿瘤疗法的化合物，其中所述化合物能用于研究、诊断或治疗意图。在其它实施方式中，本公开提供组合物，其包含光动力疗法化合物和药学上可接受的载体，赋形剂，稀释剂或盐。
在其它方面，本公开涉及化合物，其具有选自下述的结构式：
附图各视图的简述
图1描述非靶向PDT试剂的结构(5，6，7已经批准和2&4在临床试验中)。
图2描述药物浓度对KB细胞生存的效果[人类宫颈癌细胞系HeLa(HeLa具有高数量的叶酸受体)细胞系的衍生物]。以指出的浓度将溶于DMSO的游离药物加至不含叶酸的RPMI培养基中的KB细胞，在37℃温育2小时。然后除去培养基，用新鲜培养基洗涤，用新鲜培养基替换(不含药物)。细胞然后暴露于激光束(6mW/cm2，12J/cm2和暴露直径＝6cm，25孔)32分钟和在37℃温育额外24小时。细胞存活率用CellTiter Glo(Promega)测量。误差柱状图代表s.d.(n＝3)。
图3描述在调节阈值之后半身(上栏)和全身(下栏)荧光图像在白光图像上的重叠。向带KB肿瘤的小鼠注射10nmol BPheid-a(1)和用IVIS成像仪(ex＝745nm，em＝ICG，暴露时间＝1s)在不同的时间间隔成像。
图4A描述50nmol剂量的BPheid-a(1)对皮下KB肿瘤生长的效果。在注射磷酸缓冲盐水PBS(药物载体)中的50nmol BPheid-a三小时(3h)之后，将有45mm3肿瘤的小鼠用激光束(75mW/cm2，137J/cm2，暴露直径＝7.5-8mm)处理38分钟。监测肿瘤生长(拍摄图像)和用测径器测量肿瘤体积。
图4B描述PBS(药物载体或对照)对皮下KB肿瘤生长的效果。在注射PBS三小时(3h)之后，将有65mm3肿瘤的小鼠用激光束(75mW/cm2，137J/cm2，暴露直径＝7.5-8mm)处理38分钟。监测肿瘤生长(拍摄图像)和用测径器测量肿瘤体积。
图5描述靶向线粒体的修饰的BPheid-a，靶向线粒体的带正电分子的结构。
图6描述药物浓度对KB细胞生存(HeLa细胞系衍生物和HeLa细胞是人类宫颈癌细胞系)的效果。以指出浓度将溶于DMSO的游离药物加至在不含叶酸的RPMI培养基中的KB细胞，在37℃温育2小时。然后除去培养基，用新鲜培养基洗涤，和用新鲜培养基替换(不含药物)。细胞然后暴露于激光束(6mW/cm2，12J/cm2和暴露直径＝6cm，25孔)32分钟，在37℃温育额外24小时。细胞存活率用CellTiter Glo(Promega)测量。误差柱状图代表s.d.(n＝3)。
图7描述在调节阈值之后半身(上栏)和全身(下栏)荧光图像在白光图像上的重叠。向带KB肿瘤的小鼠注射10nmol(14)和用IVIS成像仪(ex＝745nm，em＝ICG，暴露时间＝1s)在不同的时间间隔成像。
图8描述50nmol剂量的(14)对皮下KB肿瘤生长的效果。在注射50nmol 14三小时(3h)之后，将有53mm3肿瘤的小鼠用激光束75mW/cm2，137J/cm2，暴露直径＝7.5-8mm)处理38分钟。监测肿瘤生长(拍摄图像)和用测径器测量肿瘤体积。
图9描述靶向细胞核的PDT试剂的结构。
图10描述药物浓度对KB细胞生存的效果(HeLa细胞系的衍生物和HeLa细胞是人类宫颈癌细胞系)。以指出浓度将溶于DMSO的游离药物加至在不含叶酸的RPMI培养基中的KB细胞，在37℃温育2小时。然后除去培养基，用新鲜培养基洗涤，和用新鲜培养基替换(不含药物)。细胞然后暴露于激光束(6mW/cm2，12J/cm2和暴露直径＝6cm，25孔)32分钟，在37℃温育额外24小时。细胞存活率用CellTiter Glo(Promega)测量。误差柱状图代表s.d.(n＝3)。
图11描述与可释放的连接体缀合的靶向叶酸的BPheid-a缀合的结构，具有产生基础药物的不同机理。
图12描述药物浓度对KB细胞生存的效果(HeLa细胞系的衍生物和HeLa细胞是人类宫颈癌细胞系)。将溶于不含叶酸的RPMI的叶酸药物缀合物以指出浓度加至在不含叶酸的RPMI培养基中的KB细胞，在37℃温育2小时。然后除去培养基，用新鲜培养基洗涤，和用新鲜培养基替换(不含药物)。细胞然后暴露于激光束(6mW/cm2，12J/cm2和暴露直径＝6cm，25孔)32分钟，在37℃温育额外24小时。细胞存活率用CellTiter Glo(Promega)测量。误差柱状图代表s.d.(n＝3)。
图13描述在调节阈值之后全身荧光图像在白光图像上的重叠。向带KB肿瘤的小鼠注射10nmol的65a和用IVIS成像仪(ex＝745nm，em＝ICG，暴露时间＝1s)在不同的时间间隔成像。
图14描述50nmol剂量的65a对皮下KB肿瘤生长的效果。在注射50nmol 65a三小时(3h)之后，将具有53mm3肿瘤的小鼠用激光束75mW/cm2，137J/cm2，暴露直径＝7.5-8mm)处理38分钟。监测肿瘤生长(拍摄图像)和用测径器测量肿瘤体积。肿瘤完全治愈，在监测时间期间无复发(13周)。
图15A描述25nmol剂量的65a对皮下KB肿瘤生长的效果。在注射25nmol 65a三小时(3h)之后，将具有28mm3肿瘤的小鼠用激光束75mW/cm2，137J/cm2，暴露直径＝7.5-8mm)处理38分钟。监测肿瘤生长(拍摄图像)和用测径器测量肿瘤体积。肿瘤完全治愈，在监测时间期间无复发(4周)。
图15B描述50nmol剂量的65c对皮下KB肿瘤生长的效果。在注射50nmol 65c三小时(3h)之后，将具有37mm3肿瘤的小鼠用激光束75mW/cm2，137J/cm2，暴露直径＝7.5-8mm)处理38分钟。监测肿瘤生长(拍摄图像)和用测径器测量肿瘤体积。肿瘤完全治愈，在监测时间期间无复发(3天)。
图16描述与不同的可溶连接体缀合的靶向叶酸的可释放的二硫醚连接的BPheid-a的结构。
图17描述药物浓度对KB细胞生存的效果(HeLa细胞系的衍生物和HeLa细胞是人类宫颈癌细胞系)。将溶于不含叶酸的RPMI的叶酸药物缀合物以指出浓度加至在不含叶酸的RPMI培养基中的KB细胞，在37℃温育2小时。然后除去培养基，用新鲜培养基洗涤，和用新鲜培养基替换(不含药物)。细胞然后暴露于激光束(6mW/cm2，12J/cm2和暴露直径＝6cm，25孔)32分钟，在37℃温育额外24小时。细胞存活率用CellTiter Glo(Promega)测量。误差柱状图代表s.d.(n＝3)。
图18描述在调节阈值之后全身荧光图像在白光图像上的重叠。向带KB肿瘤的小鼠注射10nmol的76a和76c，用IVIS成像仪(ex＝745nm，em＝ICG，暴露时间＝1s)在不同的时间间隔成像。
图19描述50nmol剂量的76a对皮下KB肿瘤生长的效果。在注射50nmol 76a三小时(3h)之后，将具有26mm3肿瘤的小鼠用激光束75mW/cm2，137J/cm2，暴露直径＝7.5-8mm)处理38分钟。监测肿瘤生长(拍摄图像)和用测径器测量肿瘤体积。肿瘤完全治愈，在监测时间期间无复发(3周)。
图20描述50nmol剂量的76b对皮下KB肿瘤生长的效果。在注射50nmol 76b三小时(3h)之后，将具有26mm3肿瘤的小鼠用激光束75mW/cm2，137J/cm2，暴露直径＝7.5-8mm)处理38分钟。监测肿瘤生长(拍摄图像)和用测径器测量肿瘤体积。肿瘤完全治愈，在监测时间期间无复发(3周)。
图21描述50nmol剂量的76c对皮下KB肿瘤生长的效果。在注射76c三小时(3h)之后，将具有28mm3肿瘤的小鼠用激光束75mW/cm2，137J/cm2，暴露直径＝7.5-8mm)处理38分钟。监测肿瘤生长(拍摄图像)和用测径器测量肿瘤体积。肿瘤完全治愈，在监测时间期间无复发(4周)。
图22描述与不同的可溶连接体缀合的靶向叶酸的可释放的二硫醚连接的visudyne的结构。
图23描述药物浓度对KB细胞生存的效果(HeLa细胞系的衍生物和HeLa细胞是人类宫颈癌细胞系)。将溶于不含叶酸的RPMI的叶酸药物缀合物以指出浓度加至在不含叶酸的RPMI培养基中的KB细胞，在37℃温育2小时。然后除去培养基，用新鲜培养基洗涤，和用新鲜培养基替换(不含药物)。细胞然后暴露于激光束(6mW/cm2，12J/cm2和暴露直径＝6cm，25孔)32分钟，在37℃温育额外24小时。细胞存活率用CellTiter Glo(Promega)测量。误差柱状图代表s.d.(n＝3)。
图24描述在调节阈值之后全身荧光图像在白光图像上的重叠。向带KB肿瘤的小鼠注射10nmol的80或86，用IVIS成像仪(ex＝640nm，em＝720nm，暴露时间＝1s)在不同的时间间隔成像。
图25描述靶向叶酸的可释放的二硫醚连接的BPheid-a缀合物的结构，其在癌细胞内产生带正电的PDT类似物。
图26描述药物浓度对KB细胞生存的效果(HeLa细胞系的衍生物和HeLa细胞是人类宫颈癌细胞系)。将溶于不含叶酸的RPMI的叶酸药物缀合物以指出浓度加至在不含叶酸的RPMI培养基中的KB细胞，在37℃温育2小时。然后除去培养基，用新鲜培养基洗涤，和用新鲜培养基替换(不含药物)。细胞然后暴露于激光束(6mW/cm2，12J/cm2和暴露直径＝6cm，25孔)32分钟，在37℃温育额外24小时。细胞存活率用CellTiter Glo(Promega)测量。误差柱状图代表s.d.(n＝3)。
图27描述在调节阈值之后时间依赖的全身荧光图像在白光图像上的重叠。向带KB肿瘤的小鼠注射10nmol 89a，在89a给予2h之后于不同的时间间隔用IVIS成像仪成像(ex＝745nm，em＝ICG，暴露时间＝1s)。
图28描述50nmol剂量的89对皮下KB肿瘤生长的效果。在注射89三小时(3h)之后，将具有26mm3肿瘤的小鼠用激光束(75mW/cm2，137J/cm2，暴露直径＝7.5-8mm)处理38分钟。监测肿瘤生长(拍摄图像)和用测径器测量肿瘤体积。肿瘤完全治愈，在监测时间期间无复发(4周)。
图29描述50nmol剂量的92对皮下KB肿瘤生长的效果。在注射92三小时(3h)之后，将具有26mm3肿瘤的小鼠用激光束(75mW/cm2，137J/cm2，暴露直径＝7.5-8mm)处理38分钟。监测肿瘤生长(拍摄图像)和用测径器测量肿瘤体积。肿瘤完全治愈，在监测时间期间无复发(4周)。
图30描述靶向叶酸的可释放的二硫醚连接的BPhied-a缀合物的结构，其在癌细胞内产生两性离子的PDT类似物。
图31描述药物浓度对KB细胞生存的效果(HeLa细胞系的衍生物和HeLa细胞是人类宫颈癌细胞系)。将溶于不含叶酸的RPMI的叶酸药物缀合物以指出浓度加至在不含叶酸的RPMI培养基中的KB细胞，在37℃温育2小时。然后除去培养基，用新鲜培养基洗涤，和用新鲜培养基替换(不含药物)。细胞然后暴露于激光束(6mW/cm2，12J/cm2和暴露直径＝6cm，25孔)32分钟，在37℃温育额外24小时。然后细胞存活用CellTiter Glo(Promega)测量。误差柱状图代表s.d.(n＝3)。
图32描述在调节阈值之后全身荧光图像在白光图像上的重叠。向带KB肿瘤的小鼠注射10nmol的100，用IVIS成像仪(ex＝745nm，em＝ICG，暴露时间＝1s)在不同的时间间隔成像。
图33描述50nmol剂量的99对皮下KB肿瘤生长的效果。在注射99三小时(3h)之后，将具有61mm3肿瘤的小鼠用激光束75mW/cm2，137J/cm2，暴露直径＝7.5-8mm)处理38分钟。监测肿瘤生长(拍摄图像)和用测径器测量肿瘤体积。肿瘤完全治愈，在监测时间期间无复发(2周)。
图34描述50nmol剂量的100对皮下KB肿瘤生长的效果。在注射100三小时(3h)之后，将有122mm3肿瘤的小鼠用激光束75mW/cm2，137J/cm2，暴露直径＝7.5-8mm)处理38分钟。监测肿瘤生长(拍摄图像)和用测径器测量肿瘤体积。肿瘤完全治愈，在监测时间期间无复发(2周)。
图35描述靶向叶酸的可释放的二硫醚连接的BPheid-a和visudyne缀合物的结构，其在癌细胞内产生阴离子PDT(带负电)类似物。
图36描述药物浓度对KB细胞生存的效果(HeLa细胞系的衍生物和HeLa细胞是人类宫颈癌细胞系)。将溶于不含叶酸的RPMI的叶酸药物缀合物以指出浓度加至在不含叶酸的RPMI培养基中的KB细胞，在37℃温育2小时。然后除去培养基，用新鲜培养基洗涤，和用新鲜培养基替换(不含药物)。细胞然后暴露于激光束(6mW/cm2，12J/cm2和暴露直径＝6cm，25孔)32分钟，在37℃温育额外24小时。细胞存活率用CellTiter Glo(Promega)测量。误差柱状图代表s.d.(n＝3)。
图37描述在调节阈值之后全身荧光图像在白光图像上的重叠。向带KB肿瘤的小鼠注射10nmol 104，用IVIS成像仪(ex＝745nm，em＝ICG，暴露时间＝1s)在不同的时间间隔成像。
图38描述104对皮下KB肿瘤生长的效果。在注射50nmol 104三小时(3h)之后，将具有81mm3肿瘤的小鼠用激光束75mW/cm2，137J/cm2，暴露直径＝7.5-8mm)处理38分钟。监测肿瘤生长(拍摄图像)和用测径器测量肿瘤体积。
图39描述104对皮下KB肿瘤生长的效果。在注射25nmol 104三小时(3h)之后，将具有23mm3肿瘤的小鼠用激光束75mW/cm2，137J/cm2，暴露直径＝7.5-8mm)处理38分钟。监测肿瘤生长(拍摄图像)和用测径器测量肿瘤体积。
图40描述靶向叶酸的可释放的二硫醚连接的BPheid-a缀合物的结构，其在癌细胞内产生阴离子PDT(带负电的)化合物。
图41描述药物浓度对KB细胞生存的效果(HeLa细胞系的衍生物和HeLa细胞是人类宫颈癌细胞系)。将溶于不含叶酸的RPMI的叶酸药物缀合物以指出浓度加至在不含叶酸的RPMI培养基中的KB细胞，在37℃温育2小时。然后除去培养基，用新鲜培养基洗涤，和用新鲜培养基替换(不含药物)。细胞然后暴露于激光束(6mW/cm2，12J/cm2和暴露直径＝6cm，25孔)32分钟，在37℃温育额外24小时。细胞存活率然后用CellTiter Glo(Promega)测量。误差柱状图代表s.d.(n＝3)。
图42描述在调节阈值之后全身荧光图像在白光图像上的重叠。向带KB肿瘤的小鼠注射10nmol 112a，用IVIS成像仪(ex＝745nm，em＝ICG，暴露时间＝1s)在给予112a之后2h成像。
图43描述117对皮下KB肿瘤生长的效果。在注射25nmol 117三小时(3h)之后，将具有20mm3肿瘤的小鼠用激光束75mW/cm2，137J/cm2，暴露直径＝7.5-8mm)处理38分钟。监测肿瘤生长(拍摄图像)和用测径器测量肿瘤体积。
本公开的详述
本发明涉及特异性的靶向叶酸的-靶向细胞器(线粒体或细胞核)的-PDT试剂，其具有高水溶解度、更佳的PK特性，和在细胞培养物中和在动物模型中对叶酸受体(FR)-阳性的癌症、肿瘤相关的巨噬细胞和骨髓衍生的抑制性细胞的高PDT效力。这些化合物对健康组织是非毒性的或具有最低毒性，并且不具有可检测的副作用。此外，这些分子具有高荧光并且在给药一小时内集中在肿瘤当中。在其它组织未观察到荧光，导致很高的肿瘤-与-背景(信噪)比率。因此，这些分子能够用于成像FR阳性疾病，图像引导式手术和光动力疗法中。
手术是全部实体肿瘤比如前列腺，卵巢，肺，乳腺，结肠和胰癌的最佳疗法之一。手术在50％的US实体肿瘤患者中有效，而化疗和放疗单独在小于5％的全部癌患者中有效。US每年超过700,000名患者经历癌症手术而40％的手术患者在5年内具有局部疾病的复发。尽管肿瘤学领域在过去十年有大幅进展，该领域始终存在需要克服的重大障碍。例如，难以实现负边缘的原发肿瘤的完全切除，除去含有转移癌细胞的淋巴结和鉴定卫星疾病。在这三种情况中实现改善不仅改善疾病清除率而且也指导关于术后化疗和放疗的决定。
除了图像引导的手术之外，本发明还提供对PDT有效的特异性PS分子。对于在肿瘤学中的使用，PDT通过3种主要机理促进肿瘤的破坏。首先，PDT产生的ROS能够直接毁坏恶性细胞。其次，PDT还能够损害肿瘤相关的脉管系统，由此抑制血液流向肿瘤和导致肿瘤梗塞。最后，PDT能够将免疫细胞重定向至肿瘤细胞并活化对肿瘤细胞的免疫应答。全部三种机理的组合可以一起产生疾病的长期治愈。
因此重要的是，设计和/或开发有用PS，其具有精确PDT特性使得其适用于在细胞内集中。PS应具有在荧光与光毒性之间的良好比率，在类型I与类型II ROS产生之间的良好比率，对患病细胞的高选择性和特异性，和正确的细胞内集中比如患病细胞中的线粒体或细胞核。此外，易于小规模和大规模合成，在合成和贮藏期间的稳定性，低成本原料的可获得性，水溶解度，有效减少患病细胞但对其它组织无毒，长期安全也是在设计PS之前考虑的重要因素和特征。
蓝光穿透组织的效率最低，而红色和红外辐射产生更深的穿透(1-1.5cm)。600至1200nm的光波长常常称为组织的光学窗。然而，仅多至大约800nm的光具有产生单线态氧(1O2)的充足能量，因为更长波长具有对引发光动力反应来说不足的能量。因此，700-800nm的PS激发波长是优选的，原因是其适合组织光学窗以及具有引发光动力反应的适当波长。
光源的选择必须基于PS的吸收(荧光激发和作用谱)，疾病(病灶位置、尺寸，可访问性，和组织特征)，成本和尺度。PDT的临床效力取决于复合的剂量测定法：总光剂量，光暴露时间，光递送模式(单次vs分开或甚至节律)和注量率。
激光和白炽光源均已用于PDT并且已显示相似效力。与大且效率低的泵染料激光相比，二极管激光更小，更成本有效和安装简易。它们也具有自动化的剂量测定法和更长操作寿命的校准特征。发光二极管(LEDs)是备择光源，具有相对窄的光谱带宽和高注量率。激光能够偶合至纤维当中，具有扩散尖端以最低介入性方法来治疗肿瘤。内侧覆盖强光散射物质和配合器官形成的可充气气球也是可商购的。于是，非常可行的是在图像引导式途径下在身体深处的实体器官中植入光源。
PS、光源和治疗参数的最佳组合的选择是成功PDT的关键。所产生的光损伤和细胞毒性的程度也是多因素的并且取决于PS类型，其细胞外(生物分布)和细胞内集中(细胞器)，给予的总剂量，总光暴露(能量和时间的量)，光注量率，氧可获得性，和在给予药物与光暴露之间的时间。
在肿瘤学中，理想PS应具有数种特征，包括：以纯形式已知化学成分可获得，高单线态氧量子产率(ΦΔ)，在可见光谱NIR区域的强吸收(700-800nm)且高消光系数(εmax＝50,000-100,000M-1cm-1)，低光漂白，在肿瘤组织中的有效聚集和具有对光敏剂及其代谢物的低避光毒性，在循环中和在组织液中的稳定性和溶解度，容易经由注射或其它方法递送至疾病组织位点，并且其必须在完成治疗后容易从身体分泌，并且其必须具有容易放大的合成以大量制备供人类使用需要。
一系列光敏剂已报告于文献中，绝大多数属于卟啉，叶绿素和染料类(大部分是近红外染料)。卟啉和叶绿素在更长波长(750-850nm)具有较高吸收，高单线态氧量子产率，低光漂白和天然荧光，使得基于卟啉的PS是图像引导式疗法的完美候选物。
数种光敏剂比如Photofrin，Visudyne，Foscan，Allumera，Levulan，Metvix，Hexvix，Cysview和Laserphyrin是临床应用可商购的。数种光敏剂比如Tookad，Antrin，Photochlor，Photosens，Photrex，Lumacan，Cevira，Visonac，BF-200，ALA，Amphinex，和Azadipyrromethenes处于各种临床试验阶段或临床前开发阶段。
尽管PDT的有效性，传统非靶向光敏剂具有许多缺点。这些非靶向的光敏剂高度疏水和具有很劣的水溶解度。因此，在给予患者之前已使用配制试剂比如cremophor、吐温20等。然而，这些配制试剂熟知对人有毒性。另外，甚至在配制为可施用的配制剂之后，PS将需要在24小时内来集中于肿瘤或患病位点，具有更长的前导时间。此外，由于劣水溶解度，药物在肿瘤或患病组织中的生物可获得性很低，使得药物效果更低。由于原先可获得的PS的非靶向性质，它们是高度非特异性的并聚集在健康组织中。此外，虽然可能避免内部器官比如肝的避光毒性(因为医学从业者避免光照疾病组织)，皮肤吸收的光毒性则是充分建立的(延长的阳光敏感性)。因此，进行传统PDT的患者必须避免光暴露甚至日光，在避光环境中停留延长的时间段。另一方面，PS在健康组织中的聚集导致非PDT有关的毒性以及导致严重副作用，原因是对健康细胞免疫应答的活化。因此需要新PS试剂，其是特异性的并且靶向患病细胞。
发明人评价了5种可商购PS，发现它们是水不溶的，在癌细胞中效果低，在裸鼠中具有很高皮肤吸收，需要超过24小时来聚集在携带肿瘤异种移植物的小鼠肿瘤中，具有很低的荧光(可能由于缺少PS分子在肿瘤中的聚集)，并且不能从小鼠上的肿瘤异种移植物消除。从而，需要改善的肿瘤靶向途径，所述途径通过靶向肿瘤组织和/或肿瘤细胞中的细胞器进行。
PS集中于细胞中的位置(细胞内室比如线粒体或细胞核)或靶向细胞器的PS也是PDT中PS的重要特征。在药物递送中两种最重要的细胞器是线粒体和细胞核。线粒体是细胞发电站以及细胞凋亡和细胞死亡的关键调节剂。细胞核具有遗传物质和控制细胞的主要生物学活性。
在治疗途径中靶向线粒体已被认识到是PDT中的关键因素，原因是靶向这些细胞器能够引起细胞代谢活性的停止。线粒体产生绝大多数细胞的三磷腺苷(ATP)供给,用作化学能量来源。线粒体也具有很高含量的氧。除了氧化磷酸化和代谢之外，还线粒体在细胞死亡，瘤形成，细胞分化，先天免疫系统，氧和缺氧感应和钙代谢中发挥中枢作用。
存在将PS递送至线粒体的许多方式。第一是开发PS，其选择性地聚集在线粒体中。第二是将PS缀合至选择性地结合至线粒体中的靶标的分子。第三，可能使用膜电位，将PS缀合至带正电分子，并以此方式通过线粒体内的高负电位将PS驱赶入线粒体中。
亲油阳离子和靶向线粒体的肽均已开发以使得药物和生物学活性分子靶向线粒体。亲油阳离子比如三苯基鏻(TPP)衍生物在体内快速地和广泛地被线粒体吸收，受高线粒体的膜电位驱动。使用这些策略能够导致线粒体内较高浓度的靶向化合物，由此增加效能和使得可以使用减少剂量的化合物，最小化能够导致灭活、分泌或毒性副作用的线粒体外代谢。此外，该途径也使得出于各种原因(例如疏水性)被线粒体不良吸收的分子可以在体内被导向线粒体。然而，用亲油阳离子和靶向线粒体的肽的主要限制是，它们并非器官特异性的并且所述化合物一般优先聚集在高线粒体的含量的组织中，导致脱靶的毒性。
基于上述发现，通过缀合至选择性结合线粒体内靶标的分子或缀合至带正电分子(利用线粒体的负电位)，发明人已设计和开发了靶向线粒体的PS库。发明人发现，与诊所目前可获得的PS相比，绝大多数本发明靶向线粒体的PS都是很具活性的。本文鉴定的PS分子能够减少培养物中的癌细胞(在体外)。然而，PS分子并非肿瘤特异性的并且需要长时间来从健康组织清除。该劣肿瘤特异性是由于药物对肿瘤细胞的非靶向性质。此外，化合物的高度疏水性质导致劣水溶解度和劣药代动力学特性，由此导致化合物对肿瘤细胞的劣生物利用度。因此，用靶向线粒体的试剂修饰的光敏剂必须靶向患病组织。递送试剂至线粒体的又一问题是其高度不可渗透的内膜。
不同于线粒体，围绕细胞核的膜-核膜(NE)允许生物分子经由核孔复合物运输。小药物分子能够因此进入细胞核并且潜在导致DNA损害和细胞循环停止。因此，通过缀合至DNA染色剂、DNA烷基化剂等，发明人也设计和开发了靶向细胞核的PS库。靶向DNA的PS是活性的和能够杀死培养物中的癌细胞，但在动物模型(带肿瘤小鼠)中还是具有低活性。劣溶解度和劣肿瘤靶向可以是动物模型中低效力的原因。
通常，靶向细胞器的疗法具有改善PDT作为靶向疗法的潜力，然而该技术有数个其它问题要克服。在PS能够用于PDT中之前待克服障碍中的数种是：实际上达到期望靶标的低浓度药物，对期望组织的低特异性，从健康组织的缓慢清除，低信号背景比，由于在健康组织中非特异性吸收的不良作用，对所给予物质的免疫应答，劣水溶解度，和在循环期间快速降解。为了光动力疗法有用，克服这些缺点是重要的。
从而，在制备光动力疗法缀合物时考虑数个标准。易于合成和化学稳定性是主要化学特质。考虑光谱特性比如吸收和发射谱图和量子产率。评价数种生物学特性，比如在细胞研究中的结合亲和力，用带肿瘤小鼠的全身动物成像，和生物分布。特别是对生物分布考虑数个方面，包括在2小时之后的死亡小鼠每口服分布，活小鼠成像和剂量的逐步增加。最终，安全考虑包括最大耐受剂量(MTD)，免疫组织化学(IHC)分析，和一般临床病理分析。
本公开提供光动力疗法缀合物，其是稳定的，在红外范围发荧光，和深度穿透靶向组织以根除表达叶酸受体的组织区域的肿瘤。更特别地，蝶酰基缀合物连接至光动力剂，其已通过联接基团和氨基酸用靶向试剂修饰。甚至更特别地，已发现在联接基团是氨基酸的情况下，连接体是可释放的。
氨基酸定义为包括胺连接至羧酸官能团的官能团，和各氨基酸特定的侧链。α氨基酸是通式R5CH(NH2)COOH的任何化合物(α-氨基酸)，其中R5选自H或任何已知的氨基酸侧链。
β氨基酸定义为包括在β碳连接的胺官能团和在α碳连接的羧酸官能团。β高氨基酸定义为包括在β碳连接的胺官能团，在α碳连接的羧酸官能团，和在α碳或β碳开始的侧链，其中侧链结合至又一氨基酸。
天然氨基酸能够划分为下述四组：(1)酸性氨基酸，(2)碱性氨基酸，(3)中性极性氨基酸，和(4)中性非极性氨基酸。这些各组中的代表性的氨基酸包括但不限于：(1)酸性(带负电的)氨基酸比如天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性(带正电的)氨基酸比如精氨酸，组氨酸，和赖氨酸；(3)中性极性氨基酸比如甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，和谷氨酰胺；和(4)中性非极性(疏水)氨基酸比如丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，和甲硫氨酸。
天然氨基酸序列中的氨基酸的保守取代能够选自该天然氨基酸所属类别的其它成员。例如，氨基酸的脂族侧链组是甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，和异亮氨酸。天然氨基酸缬氨酸的保守取代包括使用甘氨酸，丙氨酸，亮氨酸，或异亮氨酸。
氨基酸的脂族-羟基侧链组是丝氨酸和苏氨酸。氨基酸的含酰胺的侧链组是天冬酰胺和谷氨酰胺。氨基酸的芳族侧链组是苯丙氨酸，酪氨酸，和色氨酸。氨基酸的碱性侧链组是赖氨酸，精氨酸，和组氨酸。氨基酸的含硫的侧链组是半胱氨酸和甲硫氨酸。天然保守氨基酸取代的实例是：缬氨酸取代亮氨酸，丝氨酸取代苏氨酸，苯丙氨酸取代酪氨酸，赖氨酸取代精氨酸，半胱氨酸取代甲硫氨酸，和天冬酰胺取代谷氨酰胺。
在优选的实施方式中，本文显示所述光动力疗法缀合物特别靶向组织内的肿瘤细胞和引起肿瘤细胞的治疗性破坏。从而，本公开化合物导致更经济的成像技术。此外，额外优势是较低剂量的本公开化合物与常规成像化合物相比使得毒性和与向身体给予外来物质随之而来的其它副作用最小化。
另外，使用所述光动力疗法缀合物将导致更精确的和更有效的产生负边缘的原发肿瘤切除，以及精确鉴定和除去含转移癌细胞的淋巴结和鉴定卫星疾病。这些优势各自与治疗患者的更佳临床结果正相关。
化合物能够与荧光介导的分子断层摄影成像系统一起使用，比如设计用来检测深部组织近红外荧光活化的那些。化合物提供分子和组织特异性，产生高荧光对比，更亮的荧光信号，和降低背景自体荧光，允许体内患病组织(例如癌)的改善早期检测和分子靶标评价。化合物能够用于深部组织三维成像，靶向手术，和定量生物学样品中靶标细胞类型的量的方法。
化合物
在一个方面，本公开涉及具有下式的化合物：式(I)：
或其药学上可接受的盐，或其同位素，其中
L是氨基酸，
L/是改善药代动力学(PK)特性的连接体，
L//是释放靶向细胞器的光动力治疗(PDT)试剂的可释放的连接体
X是靶向细胞器的试剂，和
Y是光动力治疗剂。
所述氨基酸的非限制性实例能够包括半胱氨酸，甲硫氨酸，苏氨酸，丝氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸，赖氨酸，鸟氨酸，精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，和谷氨酰胺，或其衍生物。
在特定的优选实施方式中，本文公开的化合物包括配体，其有效使化合物靶向特定细胞或组织类型并且允许靶向细胞或组织的成像。优选的是，配体是蝶酰基部分或叶酸部分；更优选的是，配体是蝶酰基部分。然而，技术人员预期可以使用一些其它配体来使化合物靶向特定的细胞表面蛋白质或有关的受体蛋白质。在特定和优选的实施方式中，配体包含蝶酰基：
合成化合物
本文公开的化合物能够用已知于文献中的常规方法制备。参见例如，光动力疗法试剂化合物按预先的报告合成。
然而，在特定的优选实施方式中，本公开提供更有效的合成方法来制备本文描述的化合物(即式I化合物)。例如，本发明化合物能够按照一般方案制备，如下文各方案1-12所述。
合成基础药物
方案1：试剂和条件：(a)MeOH，在氩下，14h，(b)TFA，在氩下，1h(c)NH2CH2CH2SO3H，DMF，12小时
方案1，说明原先用来产生目前处于临床试验中的非靶向PDT试剂的合成方案。在一种实施方式中，将菌叶绿素-a与甲醇反应在氩下14小时，产生Bpheid-a(产品(1))。将Bpheid-a与三氟乙酸在氩下反应，产生化合物(2)。将化合物(2)与牛磺酸和二甲基甲酰胺(DMF)反应12小时，产生化合物(3)和(4)。化合物(5)，(6)和(7)是可商购的。
然而，需注意这些可商购的PDT一般都是劣水溶性的，在癌细胞中无效，具有很高的裸鼠皮肤吸收，并且它们在小鼠肿瘤模型中需要长时间来聚集，它们展示很低的荧光和劣清除。从而发明人致力于通过制备修饰的Bpheid化合物来克服这些缺点。
合成所选的修饰的Bpheid-a化合物
方案2：试剂和条件：(a)NH2NH2，DMF，在氩下，23℃，3h；(b)CH3I，CHCl3，23℃，在氩下，4天
方案2，说明用来产生修饰的Bpheid-a化合物的合成方案。在一种实施方式中，将化合物(1)与肼和二甲基甲酰胺在氩下在23℃反应3小时。将所得化合物(24)与碘甲烷和氯仿在23℃在氩下反应4天，产生化合物(26)。在又一实施方式中，将化合物(2)与肼和二甲基甲酰胺在氩下在23℃反应3小时。将所得化合物(25)与碘甲烷和氯仿在23℃在氩下反应4天，产生化合物(27)。
方案3：试剂和条件：(a)硫酸二甲酯，MeOH/H2O，65℃，2h；(b)H2/Pd，DCM，23℃，4h；(c)(i)HATU，DIPEA，DMF，23℃，15分钟，(ii)34，DIPEA，DMF，23℃，2h
方案3，说明用来产生修饰的Bpheid-a化合物的合成方案的又一实施方式。在一种实施方式中，将化合物(32)与硫酸二甲酯反应，MeOH/H2O，65℃，2h。将所得化合物(33)与H2/Pd反应，DCM，23℃，4h，产生化合物(34)。将化合物(1)与HATU反应，DIPEA，DMF，23℃，15分钟，然后与化合物(34)反应，DIPEA，DMF，23℃，2h，产生化合物(9)。在又一实施方式中，将化合物(2)与HATU反应，DIPEA，DMF，23℃，15分钟，然后与化合物(34)反应，DIPEA，DMF，23℃，2h，产生化合物(10)。
方案4：试剂和条件：(a)(i)Ph3P(+)CH2CH2COOH/HATU，DIPEA，DMF，23℃，15min，(ii)32，DIPEA，DMF，23℃，2h；(b)H2/Pd，DCM，23℃，2h；(c)(i)HATU，DIPEA，DMF，23℃，15分钟，(ii)36，DIPEA，DMF，23℃，2h；(d)NH2NH2，DMF，在氩下，23℃，3h。
方案4，说明用来产生修饰的Bpheid-a化合物的合成方案的又一实施方式。在一种实施方式中，将化合物(32)与(i)Ph3P(+)CH2CH2COOH/HATU反应，DIPEA，DMF，23℃，15min。将所得化合物(35)与化合物(32)反应，DIPEA，DMF，23℃，2h，产生化合物(36)。将化合物(1)与HATU反应，DIPEA，DMF，23℃，15分钟，然后与化合物(36)反应，DIPEA，DMF，23℃，2h。所得化合物(13a)与NH2NH2反应，DMF，在氩下，23℃，3h，产生化合物(14a)。在又一实施方式中，将化合物(2)与HATU反应，DIPEA，DMF，23℃，15分钟，然后与化合物(36)反应，DIPEA，DMF，23℃，2h。将所得化合物(13b)反应，产生NH2NH2，DMF，在氩下，23℃，3h，产生化合物(14b)
方案5：试剂和条件：(a)(i)HATU，DIPEA，DMF，23℃，15分钟；(ii)NH2-Glu-(OtBu)-OH，DIPEA，DMF，23℃，2h；(b)(i)HATU，DIPEA，DMF，23℃，15分钟；(ii)氨基葡萄糖，DIPEA，DMF，23℃，2h；(iii)TFA，23℃，1h
方案5，说明用来产生修饰的Bpheid-a化合物的合成方案的又一实施方式。在一种实施方式中，将化合物(1)与HATU反应，DIPEA，DMF，23℃，15分钟；(ii)NH2-Glu-(OtBu)-OH，DIPEA，DMF，23℃，2h。将所得化合物(37)与下述)反应：(i)HATU，DIPEA，DMF，23℃，15分钟；(ii)氨基葡萄糖，DIPEA，DMF，23℃，2h；(iii)TFA，23℃，1h，产生化合物(19a)。在又一实施方式中，将化合物(2)与HATU反应，DIPEA，DMF，23℃，15分钟；(ii)与NH2-Glu-(OtBu)-OH反应，DIPEA，DMF，23℃，2h。所得化合物(38)与下述反应：(i)HATU，DIPEA，DMF，23℃，15分钟；(ii)氨基葡萄糖，DIPEA，DMF，23℃，2h；(iii)TFA，23℃，1h，产生化合物(19b)。
本发明涉及制备特异性靶向细胞核的PDT试剂。
(a)合成所选的靶向细胞核的PDT试剂
方案6：试剂和条件：(a)(i)苯达莫司汀/HATU，DIPEA，DMF，23℃，15min，(ii)32，DIPEA，DMF，23℃，2h；(b)H2/Pd，DCM，23℃，2h；(c)(i)HATU，DIPEA，DMF，23℃，15分钟，(ii)51，DIPEA，DMF，23℃，2h；(iii)TFA，23℃，1h
方案6，说明用来产生靶向细胞核的PDT试剂的合成方案的实施方式。在一种实施方式中，将化合物(32)与(i)苯达莫司汀/HATU反应，DIPEA，DMF，23℃，15min，与(ii)32反应，DIPEA，DMF，23℃，2h。所得化合物(50)与H2/Pd反应，DCM，23℃，2小时，产生化合物(51)。化合物(1)与下述反应：i)HATU，DIPEA，DMF，23℃，15分钟，(ii)51，DIPEA，DMF，23℃，2h；(iii)TFA，23℃，1h，产生化合物(42a)。在又一实施方式中，化合物(2)与下述反应：i)HATU，DIPEA，DMF，23℃，15分钟，(ii)51，DIPEA，DMF，23℃，2h；(iii)TFA，23℃，1h，产生化合物(42b)。
方案7：试剂和条件：(a)(i)N10-甲基-4-氨基-4-脱氧蝶酸(R＝CH3)或4-氨基-4-脱氧蝶酸(R＝H)/HATU，DIPEA，DMF，23℃，15min，(ii)32，DIPEA，DMF，23℃，2h；(b)TFA，23℃，1h(c)(i)HATU，DIPEA，DMF，23℃，15分钟，(ii)54或55，DIPEA，DMF，23℃，2h。
方案7，说明用来产生靶向细胞核的PDT试剂的合成方案的实施方式。在一种实施方式中，化合物(32)与4-氨基-4-脱氧蝶酸(R＝H)/HATU反应，DIPEA，DMF，23℃，15min。所得化合物(52)与TFA在23℃反应1h，产生化合物(54)。
在又一实施方式中，化合物(32)与N10-甲基-4-氨基-4-脱氧蝶酸(R＝CH3)反应，DIPEA，DMF，23℃，15min。所得化合物(53)与TFA在23℃反应1h，产生化合物(55)。
在一种实施方式中，化合物(1)与HATU反应，DIPEA，DMF，23℃，15分钟，然后与化合物(54)反应，DIPEA，DMF，23℃，2h，产生化合物(43a)。在又一实施方式中，化合物(1)与HATU反应，DIPEA，DMF，23℃，15分钟，然后与化合物(54)反应，DIPEA，DMF，23℃，2h，产生化合物(43b)。
在一种实施方式中，化合物(2)与HATU反应，DIPEA，DMF，23℃，15分钟；然后与化合物(54)反应，DIPEA，DMF，23℃，2h，产生化合物(44a)。在又一实施方式中，化合物(1)与HATU反应，DIPEA，DMF，23℃，15分钟；然后与化合物(54)反应，DIPEA，DMF，23℃，2h，产生化合物(44b)。
方案8：试剂和条件：(a)(i)3-(4-二羟硼基苯基)-丙酸/HATU，DIPEA，DMF，23℃，15min，(ii)32，DIPEA，DMF，23℃，2h；(b)H2/Pd，DCM，23℃，2h；(c)(i)HATU，DIPEA，DMF，23℃，15分钟，(ii)57，DIPEA，DMF，23℃，2h
方案8，说明用来产生靶向细胞核的PDT试剂的合成方案的实施方式。在一种实施方式中，化合物(32)与3-(4-二羟硼基苯基)-丙酸/HATU反应，DIPEA，DMF，23℃，15min；然后，DIPEA，DMF，23℃，2h。所得化合物(56)与H2/Pd反应，DCM，23℃，2h，产生化合物(57)。化合物(1)与HATU反应，DIPEA，DMF，23℃，15分钟，然后与化合物(57)反应，DIPEA，DMF，23℃，2h，产生化合物(49a)。
在又一实施方式中，化合物(2)与HATU反应，DIPEA，DMF，23℃，15分钟，然后与化合物(57)反应，DIPEA，DMF，23℃，2h，产生化合物(49b)。
方案9：合成叶酸-Asp(SO3H)-Cys-SH连接体。试剂和条件：(a)(i)20％哌啶/DMF，r.t.，10min；(ii)Fmoc-Asp(SO3H)-OH，HATU，DMF/DIPEA，2h；b)(i)20％哌啶/DMF，r.t.，10min；(ii)Fmoc-Glu(OtBu)-OH，HATU，DMF/DIPEA，2h；c)(i)20％哌啶/DMF，r.t.，10min；(ii)N10-TFA-蝶酸，HATU，DMF/DIPEA，2h；d)TFA：H2O：TIPS：EDTA(92.5:2.5:2.5:2.5)，1h。
方案10：合成二硫醚活化的Bpheid-a。试剂和条件：(a)i)MeOC(O)SCl/CH3CN，0℃，0.5小时；ii)2,2/-二吡啶基-二硫醚/CH3CN，0℃，2小时；(b)i)双光气，HOBt，TEA/CH3CN，0℃；ii)Δ/50℃，24小时；(c)NH2NH2，DIPEA/CH2Cl2，0℃至r.t.，45分钟；(d)i)HATU，DIPEA/DMF，-15℃，45分钟；ii)74，DMF，-15℃至r.t.，45分钟。Py＝吡啶基。
方案11a：(a)试剂和条件：(a)i)H2O/NaHCO3(pH＝7±0.2)，氩，r.t.；ii)75a或b/DMSO，氩，r.t.，15分钟。
使用方法
本发明化合物将用于光动力疗法。术语"光动力疗法(PDT，光化疗)"在本文中所用是指通过光敏剂(PDT试剂，光动力治疗剂)的存在和能够激发光敏剂的光线损伤和破坏病灶的疗法。在给予光敏剂的PDT中，在光辐射之后，细胞被反应性氧类(ROS)损害。在光动力疗法中，不产生热，并且使得可以进行局部治疗。因此，由于不发生蛋白质热变性，靶标位点和围绕靶标位点的组织并不坏死，从而能够可靠地损伤单独的靶标位点。在仅使用光线比如激光束而不用光敏剂的情况下，在激光束辐射的位点不能产生热。因此，周围组织不会损伤。因此，与单独用激光辐射而不用光敏剂的方法或设备相比，使用本发明光动力疗法的方法也具有优异效果。
在特定的实施方式中，本公开涉及掺入至少一种本文公开的化合物(例如式I，I(a)，I(b)，I(c)和/或I(d))的方法，能够用来特异性和敏感地根除和/或切除组织内的肿瘤，具有最低介入程序。以该方式，本公开化合物可以用于治疗表达叶酸受体的任何生物学组织障碍和具有过表达受体的疾病。在某些实施方式中，疾病选自癌症，神经变性疾病，呼吸系统疾病，代谢病，遗传病，骨疾病，皮肤病，和环境疾病。本发明化合物特别用于治疗癌症。
本发明公开的化合物和方法可以用于靶标组织或肿瘤成像，治疗任何种类的癌症或肿瘤或两者。所公开的化合物适用于深部组织肿瘤的光动力治疗，包括但不限于卵巢癌，肺癌，头颈癌，胰癌，肠系膜癌，前列腺癌，肾癌，胃癌，直肠癌，胃癌，膀胱癌，白血病(包括多毛细胞白血病和慢性髓性白血病)，乳腺癌，黑色素瘤，恶性黑色素瘤，肾细胞癌，结直肠癌，结肠癌，晚期结直肠癌的肝转移，淋巴瘤(包括腺淋巴瘤)，恶性淋巴瘤，卡波西肉瘤，非黑色素瘤皮肤癌(包括鳞状细胞癌和基底细胞癌)，血管瘤多发性骨髓瘤，和神经胶质瘤。所公开的化合物适于治疗数种类型的哺乳动物肿瘤，包括但不限于实体肿瘤，皮肤肿瘤和实体乳腺肿瘤生长。
所公开的化合物的剂量可以被技术人员优化，其取决于因素比如但不限于光动力疗法化合物的选择，治疗方案的性质，个体受试者，本领域从业者的判断。
相应地，在公开的诊断方法中，患病组织(和结合或吸收的靶向结构)"暴露"于激发光(例如通过手术形成的开口或内窥镜将光送入体内场所。所公开的方法特别适于体内检测位于受试者内部场所的患病组织，比如在天然体腔中或手术形成的开口中，其中患病组织是"可视的"(即暴露于人眼)以使得便于活组织检查程序或手术切除通过吸收本公开化合物已高亮的区域。肿瘤组织的精确位置和/或表面积通过吸收本公开化合物容易地确定，所用本公开化合物的方法向手术医师提供有价值引导，其需要实时"看到"待切除团块的精确形状、尺寸等，其使用光动力治疗剂和激光来源(在手术期间和成像能够使用低能量)。在术后，残余的肿瘤细胞能够通过高能激光源减少。
从而，在特定的实施方式中，本公开牵涉靶向疾病的和靶向细胞器的PDT试剂，其具有高溶解度和更佳的PK特性，能够用于图像引导式手术和随后的光动力治疗。
以类似方式，本公开化合物用来识别生物学样品中的靶标细胞类型：将生物学样品与所述化合物接触一段时间且其条件允许化合物与靶标细胞类型的至少一个细胞结合。然后经由受体介导的内吞作用使结合的化合物内化，在患病细胞的核内体中释放靶向细胞器的PDT试剂。然后取决于连接至PDT试剂的引导分子，靶向细胞器的PDT试剂将被携带至患病细胞的线粒体或细胞核。在该情况中，最优选靶向的患病细胞类型是肿瘤细胞或肿瘤细胞已扩散至的淋巴结，或肿瘤相关的巨噬细胞或骨髓衍生的抑制性细胞。
实际上，技术人员会给予单独的本公开化合物或作为靶向可检测部分的混合物的一部分，允许这些化合物和靶向部分结合至可以存在于调查位点中的任何靶向组织和/或被该组织吸收，然后提供光源供给。一般地，本公开化合物和任意额外的靶向部分将在手术之前给予一段时间，且其条件允许本公开的荧光化合物以及任意额外的荧光结构被靶标组织吸收。
本领域技术人员将能够设计依次给予的发荧光靶向结构的组合，其各自特异性结合至靶标位点。优选的是，所述混合物所用的全部发荧光靶向结构都识别包含荧光团的靶标组织，其在与本公开化合物相同的波长带或相同波长发荧光(例如对本公开化合物的近红外光波长是发荧光敏感的)，以最小化用来同时激发所公开方法的实践中使用的全部不同靶向结构的荧光所需的不同光源数目。然而，预期的是不同于本公开化合物的额外靶向部分可以响应不同于本公开荧光化合物的颜色的辐射光(即具有不同的波长)而发荧光。本公开化合物散发的荧光和额外靶向化合物的那些之间的颜色差异可以帮助观察者确定患病组织的位置和尺寸。在某些实例中，可以希望在靶向普通组织的靶向结构和靶向患病组织的本公开化合物中包括荧光团，从而在患病组织与普通组织之间的对比度被进一步加强，帮助观察者确定靶标组织的位置和尺寸。使用除了本公开化合物以外的这种额外荧光团和靶向试剂提供优势：从普通组织散发的任何天然荧光被荧光团散发的荧光掩蔽，所述荧光团属于靶向身体中普通组织的补充靶向结构。在普通组织散发的荧光与靶标组织散发的荧光之间颜色的差异越大，则观察者越容易看出靶标组织的形状和尺寸。例如，靶向发荧光靶向结构包含从本公开化合物向靶标组织(即异常组织)产生红外光的荧光团，以及向健康组织产生绿光的荧光团，以帮助观察者区别靶标组织和普通组织。本领域技术人员能够容易地选择荧光团组合，带来明显的视觉色彩对比。
特别有用的组合将是，将本发明PDT与用OTL38的图像引导式手术组合使用。使用OTL38的方法和组合物公开于例如US专利9,061,057，其通过援引并入本文。
选择在所公开方法的实践中使用的光谱，使之含有相应于靶向结构或靶向结构中含有的生物学相容的发荧光部分的优势激发波长的至少一个波长。一般地，所公开方法的实践中所用的激发光包括近红外波长的范围是约600nm至约850nm的至少一个激发波长的光。
然而，在于不同波长发荧光的靶向配体的组合用于本公开实践的情况下，激发光的光谱必须足够宽，以向各所用荧光团提供至少一个激发波长。例如，在选择不同颜色的荧光团以区别普通组织和患病组织的情况下，特别有益的是光的激发光谱包括靶向普通和靶标组织的荧光团的激发波长。
如本文所述，本公开化合物通过将蝶酰基或叶酸配体作为本公开化合物的一部分特异性靶向叶酸受体。在使用额外靶向部分的实施方式，选择所述额外靶向部分的靶向结构以结合至有关靶标组织和/或被有关靶标组织特异性吸收，例如结合至细胞表面和内部含有的抗原或其它表面特征，其指征靶标组织中的疾病或异常状态。在其它诊断测试中，希望的是靶向结构结合至靶标组织或被靶标组织选择性吸收或结合至与疾病或异常状态有关的抗原；然而，同样结合至健康组织或细胞结构或被健康组织或细胞结构吸收的含有配体部分的靶向结构能够用于所公开方法的实践中，条件是靶标组织中的抗原浓度或靶向结构对靶标组织的亲和力充分地大于视野内健康组织的那些，从而代表靶标组织的荧光图像能够清楚地可视化，其区别于来自视野内健康组织或结构的任何荧光。
例如，结肠癌常常由癌胚抗原(CEA)表征，但该抗原也与健康个体的某些组织有关。然而，CEA在癌性结肠组织中的浓度常常大于健康组织，从而抗-CEA抗体能用作本公开实践中的配体部分。在又一实例中，脱氧葡萄糖被健康组织不同程度地吸收和运用，但是其在除某些已知器官比如心脏以外的健康组织中的代谢实质上低于肿瘤。脱氧葡萄糖消耗的体内已知模式能够因此用来帮助确定那些区域，其中出乎意料高的脱氧葡萄糖吸收指出肿瘤细胞的存在。
通过所公开的方法检测的疾病或异常状态能够是已知靶标组织的存在所表征的任何类型，对该组织来说特异性结合配体是已知的。例如，各种心脏病症表征为产生坏死或缺血组织或产生动脉粥样硬化组织，其特异性结合配体是已知的。作为又一示例性实例，乳腺癌表征为产生由单克隆抗体CA15-3，CA19-9，CEA或HER2/neu鉴定的癌性组织。预期的是，靶标组织可以由细胞表征，其产生结合配体为已知的表面抗原或细胞内标记物(即抗原)，原因是许多靶向结构穿透细胞膜。能够用所公开的方法鉴定的代表性疾病状态包括各种病症比如不同类型的肿瘤等。如本文所用"异常"组织包括癌症前期病症，坏死或缺血的组织，和与结缔组织疾病有关的组织，和自免疫障碍等。此外，适于用所公开的方法诊断或检查靶标组织类型的实例包括心脏，乳腺，卵巢，子宫，肺，内皮，血管，胃肠道，结直肠，前列腺组织，内分泌组织，等，以及它们中任意两个或更多个的组合。
简单举例，一些常见恶性的抗原和它们一般存在的身体位置是本领域技术人员已知的，并且靶向配体比如抗体或这些抗原或配体，其中抗原是本领域已知的受体。例如，CEA(癌胚抗原)一般存在于结肠、乳腺和肺的肿瘤中；PSA(前列腺特异性抗原，或有时称为前列腺特异性膜抗原(PSMA))对于是前列腺癌特异性的；CA-125一般存在于卵巢癌来源的肿瘤中，CA 15-3、CA19-9、MUC-1、雌激素受体、黄体酮受体和HER2/neu一般存在于乳腺癌肿瘤中，α-胎蛋白存在于睾丸癌和肝癌肿瘤中，β-人类绒促性素存在于睾丸癌和绒毛膜癌中，雌激素受体和黄体酮受体也存在于子宫癌肿瘤中，而表皮生长因子受体一般存在于膀胱癌肿瘤中。其它肿瘤特异性配体和标记物是本领域技术人员熟知的。在优选的实施方式中，本公开用叶酸或蝶酰基部分来靶向叶酸受体，而用PMSA靶向部分来使得染料靶向前列腺癌细胞。
预期的是，任何这些一般已知的肿瘤标记物能够用本文描述的染料靶向(将蝶酰基部分交换为特异性靶向这些标记物的部分)，或另选地这些标记物能够额外且一起与用本公开化合物靶向的叶酸受体被靶向。如前文讨论，可以特别有利的是具有靶向给定肿瘤上的数个不同标记物的靶向部分来充当诊断混合物，其中靶向数个标记物从而更明亮和清楚地将肿瘤可视化。
除了化学化合物之外，所述混合物中的靶向部分还可以包括蛋白质或多肽比如抗体或其生物学上活性的片段，优选单克隆抗体。所公开方法的实践中所用的补充发荧光靶向结构还可以是或包含荧光团标签化的多克隆或单克隆抗体。术语"抗体"在本公开中所用包括完整分子及其功能片段比如Fab，F(ab')2和Fv，其能够结合表位决定簇。制备这些片段的方法是本领域已知的。(参见例如，Harlow&Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1988，通过援引并入本文)。如本公开中所用，术语"表位"意指抗原上的任何抗原性决定簇，抗体的互补位与其结合。表位决定簇通常由化学活性分子比如氨基酸或糖侧链的表面组合组成，和通常具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。
除了抗体之外，混合物还可以包含化合物，其中荧光靶向结构连接至的配体部分选自许多生物学相容的化合物，其特异性结合受体和/或优先被肿瘤细胞吸收，和能够在本公开中用作靶向结构的配体部分。优先被肿瘤细胞"吸收"的化合物可以通过细胞脂质双层中的表面或核受体(例如激素受体)、孔、亲水"窗"等进入细胞。
靶向肿瘤的示例性该类化合物是生长抑素，生长抑素受体-结合性肽，脱氧葡萄糖，甲硫氨酸等。特别有用的生长抑素受体-结合性肽是生长抑素的长效八肽类似物，称为奥曲肽(D-苯基丙氨酰基-L-半胱氨酰-L-苯基丙氨酰基-D-色氨酰基-L-赖氨酰基-L-苏氨酰-N-[2-羟基-1-(羟基甲基)丙基]--L-半胱氨酰胺环状(2→7)-二硫醚)，兰瑞肽，奥曲肽口服配制剂，P829，P587，等。生长抑素-结合性肽公开于U.S.专利号5,871,711，和在还原条件下将所述肽通过其羧基末端氨基酸共价连接至放射性同位素的方法公开于U.S.专利号5,843,401，其都通过援引全部并入本文。本领域技术人员能够通过用本公开的发荧光部分取代放射性同位素来容易地使得所述教导适于制备荧光敏感的生长抑素受体-结合性肽。
生长抑素和生长抑素受体-结合性肽特别有效地用作靶向结构中的靶向肿瘤的配体部分，条件是疾病状态是神经内分泌或内分泌肿瘤。能够用所公开的方法诊断的神经内分泌肿瘤的实例包括腺瘤(GH-产生和TSH-产生)，胰岛细胞肿瘤，类癌，未分化的神经内分泌癌，小细胞和非小细胞肺癌，神经内分泌和/或中间体细胞癌，卵巢、宫颈、子宫内膜、乳腺、肾、喉、鼻旁窦和唾腺的神经内分泌肿瘤，脑膜瘤，良好分化的神经胶质衍生的肿瘤，嗜铬细胞瘤，成神经细胞瘤，神经节(母细胞)瘤，副神经节瘤，甲状腺细胞中的乳头状、小囊和髓质癌，梅克尔细胞癌，和黑色素瘤，以及肉芽肿和淋巴瘤。这些肿瘤细胞已知具有生长抑素受体和能够用生长抑素或生长抑素受体结合肽在本公开荧光靶向结构中作为靶向肿瘤的配体。
用于VIP受体闪烁照相术(I.Virgolini，Eur J.Clin.Invest.27(10)：793-800，1997的血管活性肠肽(VIP)也用于所公开的方法来诊断小原发腺癌，肝转移和胃肠道的某些内分泌肿瘤。
优先地被肿瘤吸收靶向肿瘤的配体的又一示例性分子是脱氧葡萄糖，其已知优先地在各种不同类型的肿瘤中吸收。能够用脱氧葡萄糖作为靶向肿瘤的配体来检测的示例性类型肿瘤包括黑色素瘤，结直肠和胰肿瘤，淋巴瘤(HD和NHL)，头颈肿瘤，骨髓瘤，卵巢癌，乳腺癌，和脑癌(高级和垂体腺瘤)，肉瘤(级别依赖性)，肝瘤，睾丸癌，甲状腺(级别依赖性)小细胞肺癌，膀胱和子宫癌等。
能够用于本发明混合物的其它靶向肿瘤的化合物包括1-氨基-环丁烷-1-羧酸和L-甲硫氨酸。L-甲硫氨酸是蛋白质合成所需的必需氨基酸。已知的是，恶性细胞已改变甲硫氨酸代谢和需要外部来源的甲硫氨酸。
特异性结合至肿瘤受体和/或优先被肿瘤细胞吸收的生物学相容的靶向肿瘤的化合物的额外实例包括哺乳动物激素类，特别是性激素，神经递质，和肿瘤细胞为了相互通信而表达的化合物，其优先被肿瘤细胞吸收，比如产生自染色体畸变的新分泌的蛋白质结构，比如克隆中的转移或翻转。
激素类包括性激素，细胞生长激素类，细胞因子，内分泌激素类，红细胞生成素等也良好充当肿瘤靶向部分。本领域已知的是，许多肿瘤类型表达激素类例如雌激素、黄体酮、雄激素比如睾酮等的受体。所述激素类优先被肿瘤细胞吸收，例如经由特异性受体吸收。
所公开方法的实践中所用的靶向结构和补充的靶向结构能够通过本领域技术人员已知的任何途径给予，比如局部，关节内，池内，眼内，心/脑室内，鞘内，经静脉内，经肌肉内，经腹膜内，皮内，气管内，腔内等，以及它们中任何两个或更多个的任意组合。
最适宜的给药途径取决于待治疗的疾病状态、或怀疑的病症位置或待诊断的肿瘤而变化。例如，为了治疗炎性病症和各种肿瘤，局部给药、包括通过直接注射入待用激发光辐射的身体部分给药(例如腔内)提供的优势是，靶向结构(例如荧光标签化的抗体)能够以高浓度给予而无可以伴随全身给药的并发症风险。
用于包含本公开化合物的诊断混合物中的本公开化合物以及任意额外的靶向结构以诊断"有效量"给予。有效量是必需的靶向结构的量，其辅助受试者中位于所调查身体部分中的任何靶标组织的直接造影。"受试者"作为在本文中所用的术语预期包括任意哺乳动物比如驯养宠物、农场动物或动物园动物，但是优选是人类。诊断有效量当然取决于待研究的身体部分的尺寸和位置，靶向结构对靶标组织的亲和力，靶标组织的类型，以及给药途径。靶向结构的局部给药将一般需要比任何全身给药模式更小的剂量，尽管靶向结构的局部浓度可以在某些情况下在局部给药之后高于安全全身性给药能够实现的浓度。
由于单独的受试者可以具有宽范围变化的症状严重性和各靶向结构具有独特的诊断特征，包括靶向结构对靶标的亲和力、靶向结构通过身体过程的清除率、其中所含荧光团的特性等，本领域从业者将衡量各因素和相应地变化剂量。
本公开的化合物以及包含这些化合物的混合物能够根据已知方法用适宜的分散或润湿剂和助悬剂配制为无菌可注射悬浮液。无菌可注射制剂还可以是非毒性经肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如是1-4丁二醇中的溶液。无菌非挥发油常规用作溶剂或悬浮介质。出于该意图可以使用任意温和非挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯，脂肪酸(包括油酸)，天然植物油比如芝麻油、椰子油、花生油、棉籽油等，或合成的脂肪媒介物比如油酸乙酯等。缓冲液、防腐剂、抗氧化剂等能够视需要掺入，或另选地能够包含配制剂。
本领域技术人员清楚可以对本公开进行各种变化而不背离其主旨和范围，因此本公开涵盖说明书并未特别公开的、但所附权利要求中已指出的实施方式。
下述实施例仅出于示例本公开的具体实施方式的意图提供，并非意在限制所附权利要求的范围。如本文讨论，所公开化合物和方法的特定特征能够以各种方式修饰，其并非它们提供的可操作性或优势所必需。例如，化合物能够掺入各种氨基酸和氨基酸衍生物以及靶向配体，其取决于化合物所用于的特定用途。本领域技术人员将理解，所述修饰属于所附权利要求范围以内。
实施例
在下述实施例中，解释用于光动力疗法(PDT)的新的靶向患病组织的以及靶向细胞器的光敏剂(PS)的合成并且提供那些化合物的合成。
在下述实施例中，化合物的体外效力用KB细胞确定。在这些测试中，KB细胞生长至70％汇合度和用增加浓度的PS脉冲2小时。在洗涤除去未结合的缀合物之后，细胞暴露于激光束(6mW/cm2，12J/cm2和暴露直径＝6cm，25孔)32分钟，在37℃在新鲜培养基中温育额外24小时。细胞存活率通过用细胞滴定度定量Glo释放的ATP的生物发光来测量。选择前述的2小时暴露的原因是，发现小分子药物在体内(从非靶向组织)在<2小时内清除，意味着更长暴露于药物可能获得非生理学的结果。
在下述实施例中展示的数据显示EC50值。EC50是半最大有效浓度，并且代表观察到最大效果的50％的化合物浓度。EC50值越低则活性越高。我们认为EC50<50nM的化合物是活性的而EC50<10nM则是高度活性的。
在下述实施例中，化合物的体内效力用裸鼠中的KB肿瘤细胞异种移植物来确定。在这些研究中，KB细胞经皮下植入，并监测肿瘤生长。对于时间依赖性全身成像，一旦肿瘤变为250-350mm3，则经由尾部静脉注射化合物，并借助荧光成像用IVIS成像仪监测PS在肿瘤中的聚集(在48小时内)。此外，一旦肿瘤生长至～50mm3，则经由尾部静脉注射化合物。在注射化合物三小时(3h)之后，肿瘤用激光束(75mW/cm2，137J/cm2，暴露直径＝7.5-8mm)处理38分钟。BPheid-a的体内效力通过监测肿瘤体积减少来评价。
实施例1：
在本实施例中，发明人进行了可商购的非靶向PDT试剂或目前临床试验中的相似试剂的临床前评价。研究目的是两方面。首先，目的是评价可商购光敏剂在癌细胞中的光动力疗效，其次是评价可商购光敏剂在肿瘤异种移植物小鼠模型的癌细胞中的光动力疗效。
合成Tookad及其类似物
将类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)的含水糊剂(150g)悬浮于甲醇(2.2L)，将氩鼓泡通过绿色悬浮液，同时避光搅拌14小时。悬浮液过滤通过烧结玻璃漏斗，残余物用甲醇洗涤直至滤液几乎无色。滤液在旋转式蒸发仪上蒸发，在高真空下干燥，获得粗制菌叶绿素-a(8)，是深绿色固体。
将前步获得的粗制菌叶绿素-a(8)悬浮于TFA(120mL，80％，在水中)。将氩鼓泡通过反应混合物10分钟，避光搅拌内容物1小时。将反应混合物倾至水中(400mL)和用氯仿萃取(3x 300mL)。经合并的有机层用盐水洗涤，在无水硫酸钠上干燥，浓缩。残余物溶于氯仿(50mL)，在激烈搅拌下倾倒至己烷(800mL)。过滤沉淀的深褐色固体，在高真空下干燥，获得菌脱镁叶绿酸-a(BPheid-a)(1)。
在激烈搅拌下，将用氩鼓泡10分钟的氯仿(60mL)加入Pd(OAc)2(784mg，3.53mmol，6当量)和抗坏血酸钠(700mg，3.53mmol，6当量)的混合物，随后加入脱气甲醇(360mL)。在又一烧瓶中，将BPheid-a(360mg，0.59mmol，1当量)溶于脱气氯仿(100mL)，在2分钟内缓慢地加入上述的溶液。用氩鼓泡反应内容物10分钟，在23℃避光搅拌15小时。完成后，反应混合物过滤通过C盐，浓缩。将所得深褐色-紫色固体再溶于甲醇/氯仿(20/100mL)和过滤通过C盐，浓缩。粗制固体通过柱色谱法纯化，用抗坏血酸钠(0.4％)处理的二氧化硅和0-10％甲醇/二氯甲烷，形成化合物2(Tookad)。
将牛磺酸(32mg，0.26mmol)溶于1M K2HPO4(1mL)，用aq.HCl调节pH至8.2。将水蒸发，固体在高真空下干燥。向该固体加入Pd-Bpheid-a(化合物(3))(20mg，0.032mmol)和DMSO(3mL)，将氩鼓泡通过溶液2分钟。在60℃搅拌反应混合物6小时。过滤反应混合物，通过制备型HPLC用C18柱纯化，获得化合物3，是深褐色固体。
将Pd-Bpheid-a(3)(50mg，0.07mmol)溶于DMSO(7.5mL)，将氩鼓泡通过溶液2分钟。在又一烧瓶中，将牛磺酸(70mg，0.55mmol)溶于1M K2HPO4(2.17mL)，用aq.HCl调节pH至8.2。将该溶液加入上述溶液。将氩再鼓泡通过反应混合物5分钟，在40℃搅拌内容物5小时。用旋转式蒸发仪在40℃从反应混合物除水，在40℃搅拌内容物40小时。过滤反应混合物，通过制备型HPLC用C18柱纯化，获得tookad soluble(4)，是深褐色固体。
对KB细胞测试化合物1至5以确定其效力。图2显示这些药物的浓度对细胞存活的效果。
表1：各种非靶向PDT试剂在培养物中对KB细胞生存的效果。
化合物 EC50(nM) 激发波长(nm)
BPheid-a(1) 745 750
Tookad(2) 10,360 760
3 1750 740
4 7,763 750
Visudyne(5) 838.2 689
Foscan(6) 无活性 652
Photofrin(7) NA 630
为了确定非靶向PS的体外效力，在实施例开始时将KB细胞按下文的描述使用。
经测试的全部非靶向PS的EC50值显示，这些试剂在癌细胞中无活性从而不适于PDT。这种活性缺乏可以存在许多原因，包括例如劣水溶解度，劣细胞穿透，和在癌细胞内低效的细胞器集中。
还注意到，Pd螯合的化合物(3和4)与非螯合的分子(1和2)相比活性更低。此外，化合物4与化合物1相比活性更低。这种活性损失可以是由于亲核物质打开五元环(其具有酮基团和甲基酯)。
为了建立这些非靶向PS对癌细胞的特异性，将BPheid-a注射入肩部携带KB肿瘤的裸鼠。借助荧光成像用IVIS成像仪监测小鼠的肿瘤中PS聚集。时间依赖性全身图像显示BPheid-a在小鼠皮肤中的非特异性吸收。此外，从皮肤清除的时间较长。BPheid-a需要～24小时来在肿瘤中聚集，并且肿瘤中的荧光很低，这指出很少的BPheid-a分子实际上达到肿瘤组织。BPheid-a分子可获得性的缺乏可以可归因于各种理由，包括例如劣水溶解度，劣细胞穿透，药物的低生物利用度，药物未向肿瘤提供充足数量的分子，和癌细胞中的低效细胞器集中。
过表达叶酸受体的KB细胞经皮下植入雌性裸鼠，在开始用50nmol BPheid-a(1)处理之前让其生长至～50mm3。在注射50nmol BPheid-a三小时(3h)之后，肿瘤用激光束(75mW/cm2，137J/cm2，暴露直径＝7.5-8mm)处理38分钟。BPheid-a的体内效力通过监测肿瘤体积减少来评价。用BPheid-a处理的KB肿瘤生长双倍<1周的时间，在两周治疗时间段结束时达到>600mm3，小鼠在第3周由于大肿瘤体积不得不安乐死。另一方面，PBS(磷酸缓冲盐水)处理的小鼠肿瘤在3周内生长至超过600mm3，随后由于肿瘤溃疡形成安乐死。这指出，与未处理的对照小鼠相比BPheid-a对肿瘤具有一些效果。
从这些研究得出的结论是，非靶向常规PDT试剂充其量是低效的PDT分子。它们高度不溶于水，在细胞培养物中显得具有低效力。此外，它们是高度非特异性的，同时具有高皮肤吸收，和低肿瘤-与-背景的比率。这些常规的和批准的PDT分子需要24小时或更多来在肿瘤中集中，并且在集中的情况下仅展示肿瘤中药物分子的低浓度和在动物模型中显得具有很低的效力。此外，这些分子的使用受到肿瘤中的低浓度PDT试剂的妨碍，这意味着存在很低水平的荧光，其不足以用于肿瘤成像或用于图像引导式手术。
实施例2：靶向线粒体的修饰的PDT试剂的临床前评价
在该实施例中，目的是通过缀合至亲油阳离子分子或阳离子肽或选择性结合线粒体内靶标的分子来修饰BPheid-a使之靶向线粒体；评价线粒体靶向的修饰的BPheid-a类似物在癌细胞中的光动力疗效；和评价体内全身成像能力和在细胞培养物中最有活性的分子在带肿瘤异种移植物的小鼠中的PDT效力。
(a)所选的修饰的Bpheid-a类似物的合成
将肼(10.2uL，0.33mmol，10当量)加入BPheid-a(1)(20mg，0.033mmol，1当量)或tookad(2)的二甲基甲酰胺(3.3mL)溶液。反应混合物用氩脱气5分钟和在23℃在氩下搅拌3小时。反应通过制备型HPLC用C18柱纯化，获得化合物(24)或(25)，是深褐色固体。
将二异丙基乙胺(13.5uL，0.078mmol)和CH3I(50uL)加入化合物(24)(5mg，0.0078mmol)或(25)溶于脱气CHCl3(3mL)的溶液。混合物在23℃搅拌4天。反应混合物通过制备型HPLC用C18柱纯化，获得化合物(26)，是深褐色固体。
将硫酸二甲酯(0.52mL，5.57mmol)加入化合物(32)(400mg，1.11mmol)、K2CO3(1.5g，11.1mmol)在MeOH(8mL)和水(5mL)中的混合物。在23℃搅拌悬浮液1小时。完成后，反应混合物用水稀释和用EtOAc(3×70mL)萃取。有机物用水、盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，过滤和浓缩，获得化合物(33)，是淡黄色油状物。
将钯/炭(80mg)加入化合物(33)(250mg，0.57mmol)的DCM(10mL)溶液。反应内容物在氢气球气氛下搅拌4小时。完成后，反应混合物过滤通过C盐，浓缩，获得化合物(34)，是透明油状物。
将DIPEA(21uL，0.123mmol，3当量)加入BPheid-a(25mg，0.041mmol，1当量)和HATU(15.5mg，0.041mmol，1当量)的脱气DMF(2mL)溶液，在23℃在氩下搅拌内容物15分钟。在该时间之后，将5-氨基-1-(叔丁氧基)-N,N,N-三甲基-1-氧代戊烷-2-铵甲基硫酸酯(35mg，0.054mmol，1当量)的脱气DMF(0.5mL)溶液引入反应容器。在23℃再搅拌反应混合物1小时。加入0.5mL水破坏偶联剂，反应通过制备型HPLC用C18柱纯化，获得化合物(16)，是深褐色固体。
将二异丙基乙胺(146uL，0.842mmol)加入化合物(32)(140mg，0.337mmol)，HATU(128mg，0.337mmol)和(2-羧乙基)三苯基鏻溴化物(121mg，0.337mmol)的DMF(3.5mL)溶液。反应内容物在23℃搅拌1小时。完成后，反应混合物用水稀释和用EtOAc(3×100mL)萃取。有机物用水、盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，过滤和浓缩，获得化合物(35)，是透明粘稠油状物。
将钯/炭(50mg)加入化合物(33)(100mg，0.148mmol)的DCM(10mL)溶液。反应内容物在氢气球气氛下搅拌24小时。完成后，反应混合物过滤通过C盐，浓缩，用HPLC纯化，获得化合物(36)。
将DIPEA(21uL，0.123mmol，3当量)加入BPheid-a(25mg，0.041mmol，1当量)和HATU(15.5mg，0.041mmol，1当量)的脱气DMF(2mL)溶液，在23℃在氩下搅拌内容物15分钟。在该时间之后，将(S)-(3-((5-氨基-1-(叔丁氧基)-1-氧代戊烷-2-基)氨基)-3-氧代丙基)三苯基鏻溴化物(30mg，0.054mmol，1当量)的脱气DMF(0.5mL)溶液引入反应容器。在23℃再搅拌反应混合物1小时。加入0.5mL水破坏偶联剂，反应通过制备型HPLC用C18柱纯化，获得化合物13a，是深褐色固体。
将肼(3.1uL，0.10mmol，5当量)加入化合物13(20mg，0.02mmol，1当量)的二甲基甲酰胺(2mL)溶液。反应混合物用氩脱气5分钟，在23℃在氩下搅拌1小时。反应通过制备型HPLC用C18柱纯化，获得化合物14a，是深褐色固体。
将二异丙基乙胺(120uL，0.697mmol)加入Bpheid-a(85mg，0.139mmol)，HATU(63.5mg，0.167mmol)的DMF(13.9mL)溶液。将氩鼓泡通过混合物5分钟，避光搅拌20分钟(溶液A)。在又一烧瓶中，将(S)-3-氨基-4-(叔丁氧基)-4-氧代丁酸(34mg，0.167mmol)溶于DMSO(5mL)以形成透明溶液(溶液B)。经由套管将溶液B加入溶液A，搅拌内容物1小时。完成后，反应混合物通过制备型HPLC用C18柱纯化，获得化合物(37)。
将二异丙基乙胺(38uL，0.214mmol)加入化合物(37)(57mg，0.072mmol)，HATU(27.2mg，0.072mmol)的DMF(7.1mL)溶液。将氩鼓泡通过混合物5分钟，避光搅拌15分钟(溶液A)。在又一烧瓶中，将D-(α)-氨基葡萄糖.HCl(15.4mg，0.72mmol)溶于DMSO(2.5mL)，加入二异丙基乙胺(25uL，0.143mmol)(溶液B)。经由套管将溶液B加入溶液A，搅拌内容物1小时。完成后，反应混合物通过制备型HPLC用C18柱纯化。
将纯化产品(50mg，0.055mmol)溶于脱气TFA(3mL)，在氩下在23℃搅拌1小时。减压蒸发溶剂，粗制残余物通过制备型HPLC用C18柱纯化，获得化合物(19a)，是深褐色固体。
体外研究
表2：在培养物中靶向线粒体的修饰的PDT试剂对KB细胞生存的效果
化合物 EC50(nM) 化合物 EC50(nM)
9 27 19 550
10 167.9 24 316
11a 51.4 25 361.7
11b 23.1 26 8.4
12a 1346 27 64.8
12b 15.4 28 1770
13 20.5 29 7917
14 3.7 30 97.4
15 47.6 31 477.7
16 26.6 BPheid-a(1) 745
为了确定靶向线粒体的BPheid-a分子的体外效力，在实施例开始时将KB细胞按下文的描述使用。数据报告为EC50值。
通过缀合至亲油阳离子分子或阳离子肽或选择性结合线粒体内的靶标比如糖类等的分子用线粒体靶向的试剂修饰BPheid-a，这导致发现与BPheid-a相比活性很高的化合物。特别是，14和26在低纳摩尔每升范围(3.7nM和8.4nM分别)均有活性，并且高度活性地杀灭癌细胞。此外，化合物9，11b，12b，13和16也有效地减少癌细胞。这些活性化合物中的绝大多数具有阳离子电荷比如季铵[-N(+)(CH3)3]或酰肼[-NH-N(+)(CH3)3]或三苯基鏻[-P(+)Ph3]。
我们还注意到，疏水分子比亲水分子更具活性，例如化合物9、12b和13比11a和12a更疏水。虽然化合物11a和12a确实具有游离羧酸基团，但在化合物9、12b和13中那些酸基团是用疏水保护基团叔丁基保护的。因此，11a和12a比9、12b和13更亲水。不受具体理论或作用机理所限，疏水阳离子更具活性的原因可能是，亲油阳离子穿过血浆和线粒体内膜的运动。阳离子的大疏水表面积和大离子半径导致通过膜的活化能量有效降低。Nernst公式足以描述亲油阳离子的膜电位依赖性吸收，对于每～60mV膜电位其增加10-倍，导致它们在线粒体中数百倍的吸收。
我们观察到，Pd螯合的化合物比它们的非螯合对应物活性更低(例如9Vs 10和26Vs 27和30vs 31)。这可以是由于Pd金属猝灭自由基形成。
最后，除了化合物26，亲核物质打开五元环(其具有酮基团和甲基酯)导致活性损失或降低PDT试剂效力。
(b)体内研究
为了建立我们靶向线粒体的PS对癌细胞的特异性，将化合物14(在癌细胞中活性最高的化合物)注射入肩部携带KB肿瘤的裸鼠，并借助荧光成像用IVIS成像仪监测肿瘤聚集。时间依赖性全身图像显示化合物14在小鼠皮肤和肾中的非特异性吸收。肾中的荧光还可以是由于药物通过肾清除。从这些数据显得，尽管修饰BPheid-a以靶向线粒体在细胞培养物中提供高度活性的数据，但体内数据则并非如细胞培养物数据一样有希望。
过表达叶酸受体的KB细胞经皮下植入雌性裸鼠，并在开始用50nmol化合物(14)处理之前让其生长至～50mm3。在注射50nmol化合物(14)三小时(3h)之后，肿瘤用激光束(75mW/cm2，137J/cm2，暴露直径＝7.5-8mm)处理38分钟。14的体内效力通过监测肿瘤体积减少来评价。用14处理的KB肿瘤生长双倍<1周时间并在2周治疗时间段结束时达到～500mm3。体内效力的这种缺少可以是由于劣溶解度，劣PK特性，和分子缺乏肿瘤靶向。
实施例3.靶向细胞核的PDT试剂的临床前评价
该实施例的目的是通过缀合至DNA结合试剂、DNA烷基化剂等来修饰BPheid-a使之靶向细胞核，评价靶向细胞核的修饰的BPheid-a类似物在癌细胞中的光动力疗效，和评价体内全身成像能力和在细胞培养物中最有活性的分子在带肿瘤异种移植物小鼠中的PDT效力。
将二异丙基乙胺(120uL，0.691mmol)加入N10-甲基-4-氨基-4-脱氧蝶酸(75mg，0.23mmol)，HATU(88mg，0.23mmol)的DMF(5mL)溶液，在23℃搅拌15分钟(溶液A)。在又一烧瓶中，将化合物(32-a)(47mg，0.23mmol)溶于DMSO(5mL)，加入二异丙基乙胺(120uL，0.691mmol)(溶液B)。经由套管将溶液B加入溶液A，搅拌内容物1小时。完成后，反应混合物通过制备型HPLC用C18柱纯化。DMF(3.5mL)中的(2-羧乙基)三苯基鏻溴化物(121mg，0.337mmol)。反应内容物在23℃搅拌1小时。完成后，将反应混合物加入乙醚(500mL)，过滤沉淀的固体，在高真空下干燥，获得化合物(53)，是粘稠油状物。
将化合物(53)(100mg mg，0.195mmol)溶于TFA(6mL)，在氩下在23℃搅拌2小时。在真空下蒸发溶剂，粗制残余物通过制备型HPLC用C18柱纯化，获得化合物(55)，是黄色固体。
将二异丙基乙胺(30uL，0.175mmol)加入Bpheid-a(35.6mg，0.058mmol)，HATU(22.1mg，0.058mmol)的DMF(5.8mL)溶液，在23℃搅拌15分钟(溶液A)。在又一烧瓶中，将化合物(55)(24mg，0.058mmol)溶于DMSO(5mL)，加入二异丙基乙胺(30uL，0.175mmol)(溶液B)。经由套管将溶液B加入溶液A，搅拌内容物1小时。完成后，反应混合物通过制备型HPLC用C18柱纯化，获得化合物(44)。
表3：在培养物中靶向细胞核的修饰的PDT试剂对KB细胞生存的效果
化合物 IC50(nM)
39 无活性*
40 4078
41 68
43 342
44 425
BPheid-a 745
为了确定靶向细胞核的体外效力，下文如在实施例部分开始那样使用KB细胞，根据EC50值报告数据。
用靶向细胞核的试剂修饰BPheid-a导致发现与BPheid-a比较的活性PS。在我们合成的化合物当中，化合物41是活性最高的。该BPheid-a分子用氮芥菜烷基化剂类化疗药修饰。该DNA烷基化剂(美法仑)具有两个烷基氯基团，其能够与咪唑环7位氮原子反应，由此抑制DNA合成和细胞增殖。
5.靶向叶酸的可释放的BPheid-a缀合物的临床前评价。组A：可释放的连接体部分的变化(通过不同释放机理释放游离药物)
该实施例的目的是通过在不同条件下经由不同可释放机理的各种可释放连接体缀合至叶酸(叶酸盐/酯，维生素B9)来使得BPheid-a靶向叶酸受体阳性肿瘤细胞，和评价癌细胞中的光动力疗效，评价体内全身成像能力和在细胞培养物中有活性的绝大多数分子在带肿瘤异种移植物小鼠中的PDT效力。
合成
方案11b：合成叶酸盐/酯-Asp(SO3H)-Cys-SH连接体。试剂和条件：(a)(i)20％哌啶/DMF，r.t.，10min；(ii)Fmoc-Asp(SO3H)-OH，HATU，DMF/DIPEA，2h；b)(i)20％哌啶/DMF，r.t.，10min；(ii)Fmoc-Glu(OtBu)-OH，HATU，DMF/DIPEA，2h；c)(i)20％哌啶/DMF，r.t.，10min；(ii)N10-TFA-蝶酸，HATU，DMF/DIPEA，2h；d)TFA：H2O：TIPS：EDTA(92.5:2.5:2.5:2.5)，1h。
使用下述合成方案：
1.L-Cys(Trt)-2-氯三苯甲基树脂(700mg，0.49mmol)用二氯甲烷(DCM)(10mL)、随后二甲基甲酰胺(DMF，10mL)膨胀。
2.将20％哌啶的DMF(3×10mL)溶液加入树脂，每次将氩鼓泡10分钟。
3.树脂每次用DMF(3×10mL)和DCM(1×10mL)洗涤5分钟。
4.进行Kaiser试验以确定形成游离胺。
5.加入Fmoc-Asp(SO3H)-OH(500mg，1.29mmol)，HATU(490mg，1.29mmol)和DIPEA(448uL，2.58mmol)的DMF(8mL)溶液。将氩鼓泡2小时。
6.树脂每次用DMF(3×10mL)和DCM(1×10mL)洗涤5分钟。
7.进行Kaiser试验确定偶联效率。
8.将20％哌啶的DMF(3×10mL)溶液加入树脂，每次将氩鼓泡10分钟。
9.树脂每次用DMF(3×10mL)和DCM(1×10mL)洗涤5分钟。
10.进行Kaiser试验确定形成游离胺。
11.加入Fmoc-Glu-(α-OtBu)-OH(625mg，1.47mmol)，HATU(559mg，1.47mmol)和DIPEA(6.0当量)的DMF(8mL)溶液。将氩鼓泡2小时。
12.树脂每次用DMF(3×10mL)和DCM(1×10mL)洗涤5分钟。
13.进行Kaiser试验确定偶联效率。
14.将20％哌啶的DMF(3×10mL)溶液加入树脂，每次将氩鼓泡10分钟。
15.树脂每次用DMF(3×10mL)和DCM(1×10mL)洗涤5分钟。
16.进行Kaiser试验确定形成游离胺。
17.加入Pte_10N-TFA-OH(600g，1.47mmol)HATU(559mg，1.47mmol)和DIPEA(6.0当量)的DMF(8mL)溶液。将氩鼓泡2小时。
18.树脂每次用DMF(3×10mL)和异丙醇(3×10mL)洗涤5分钟。
19.进行Kaiser试验确定偶联效率。
20.树脂用DCM(10mL)膨胀。
21.从树脂用三氟乙酸TFA：H2O：三异丙基硅烷(TIPS)：EDT混合物(92.5:2.5:2.5:2.5)裂解最终化合物(3×10mL×30分钟)，在搅拌下将混合物洗涤液滴加至乙醚(300mL)，获得浅黄色沉淀。
22.过滤沉淀的固体，用醚洗涤(5×50mL)和在高真空下干燥，获得希望的化合物(70)，是米色固体。
23.
方案11c：合成二硫醚活化的Bpheid-a。试剂和条件：(a)i)MeOC(O)SCl/CH3CN，0℃，0.5小时；ii)2,2/-二吡啶基-二硫醚/CH3CN，0℃，2小时；(b)i)双光气，HOBt，TEA/CH3CN，0℃；ii)Δ/50℃，24小时；(c)NH2NH2，DIPEA/CH2Cl2，0℃至r.t.，45分钟；(d)i)HATU，DIPEA/DMF，-15℃，45分钟；ii)74，DMF，-15℃至r.t.，45分钟。Py＝吡啶基。
在0℃向甲氧羰基硫基氯(3.1mL，34.25mmol)的CH3CN(30.0mL)溶液滴加CH3CN(1.0mL)中的2-巯基乙醇(2.4mL，34.25mmol)，反应混合物在-10℃搅拌30分钟。将2-硫吡啶(3.46g，31.13mmol)的CH3CN(18.0mL)溶液加入反应混合物，回流2小时。反应混合物然后在10℃搅拌1小时，过滤。固体用CH3CN洗涤，r.t.减压干燥，产生纯产品(72)，是无色固体(4.0g，57.5％)。
在0℃向2-(吡啶-2-基-二硫烷基)乙醇(2.0，8.94mmol)，HOBT(1.58g，11.71mmol)和TEA(1.25mL，8.94mmol)的CH3CN(35mL)溶液加入双光气(0.72mL，5.98mmol)。反应混合物加热至50℃和搅拌24小时。过滤固体，用CH3CN洗涤，r.t.减压干燥，产生纯产品(73)，是淡白色固体(3.48g，95.7％)。
在0℃向2-[苯并三唑-1-基-(氧基羰氧基)-乙基二硫烷基]-吡啶盐酸盐(685mg，1.62mmol)和DIPEA(600uL，3.4mmol)的CH2Cl2(5.0mL)溶液加入肼。反应混合物在0℃搅拌15分钟，r.t.30分钟。过滤沉淀后，粗制化合物用快速柱色谱法(硅胶，2％MeOH/CH2Cl2)纯化，产生产品(74)，是无色油状物(371mg，93.4％)。
将二异丙基乙胺(29uL，0.163mmol，2.4当量)加入BPheid-a(化合物2)(40mg，0.065mmol，1当量)和HATU(30mg，0.079mmol，1.2当量)的DMF(3mL)溶液。将氩鼓泡通过反应混合物5分钟，避光搅拌20分钟(溶液A)。在又一烧瓶中，将化合物74溶于DMF以形成透明溶液(溶液B)。经由套管将溶液B加入溶液A，搅拌内容物1小时。完成后，反应混合物通过制备型HPLC用C18柱纯化，获得化合物(75a)。
方案12：(a)试剂和条件：(a)i)H2O/NaHCO3(pH＝7±0.2)，氩，r.t.；ii)75a或75b/DMSO，氩，r.t.，15分钟。
将化合物(75a)(8.5mg，0.0104mmol，1当量)和化合物(70)(18.3mg，0.02048mmol，2当量)的DMSO(0.5mL)溶液用氩脱气，在23℃在氩下搅拌7小时。反应混合物通过制备型HPLC用C18柱纯化，获得化合物(65a)，是深褐色固体。
体外研究
表6：在培养物中靶向叶酸的药物浓度对KB细胞生存的效果
化合物 EC50(nM)
64 8.4
65a 2.5
65b 138.1
65c 11.6
为了确定叶酸-和线粒体-靶向的-BPheid-a缀合物的体外效力，在实施例开始部分按下文描述使用KB细胞，数据报告为EC50值。
EC50是半最大有效浓度，代表观察到50％的最大效果的化合物浓度。EC50值越低则活性越高。我们认为EC50<50nM的化合物有活性而EC50<10nM有高度活性。
靶向叶酸的可释放的修饰的BPheid-a缀合物在癌细胞在培养物中有高度活性，特别是64、65a和65c。这可以是由于药物缀合物的溶解度越高，则使得越多药物进入细胞。此外，药物缀合物通过叶酸受体介导的内吞作用内化，在核内体中释放药物。释放的药物分子可以被携带至必要的细胞器。
(a)体内研究
(i)时间依赖性全身成像
为了建立靶向叶酸的和靶向线粒体的可释放的BPheid-a对癌细胞的特异性，将化合物65a注射入肩部携带KB肿瘤的裸鼠，借助荧光成像用IVIS成像仪监测肿瘤聚集。时间依赖性全身图像表明靶向叶酸的和靶向线粒体的可释放的BPheid-a在给予药物1小时内集中至肿瘤和在24小时内保留在肿瘤中而不失去其荧光特性。化合物65a对FR-阳性肿瘤高度特异性并且未观察到其它组织中的荧光，带来高的肿瘤背景比。此外，与靶向叶酸的非可释放的BPheid-a缀合物(59a)相比，含化合物65a的肿瘤具有更高的荧光，指出比59a更大量的65a分子达到肿瘤。这些增加的药代动力学特性可以是由于65a与59a相比更高的溶解度。此外，叶酸缀合物在癌细胞内的释放可以增加游离受体循环率。更特别地，可能的是靶向线粒体的BPheid-a在癌细胞内的释放可以增加BPheid-a的线粒体集中。
(ii)靶向叶酸的非可释放的-BPhied-a对携带FR-阳性KB肿瘤的小鼠的效果
过表达叶酸受体的KB细胞经皮下植入雌性裸鼠，在开始用50nmol或25nmol化合物65a或65c处理之前生长至～50mm3。在注射药物三小时(3h)之后，肿瘤用激光束(75mW/cm2，137J/cm2，暴露直径＝7.5-8mm)处理38分钟。缀合物的体内效力通过监测肿瘤体积减少来评价。两种化合物都抑制KB肿瘤生长。用65a或65c处理的小鼠在两种剂量(50和25nmol)显示肿瘤消退，其持续至研究时间段结束。化合物65a和65c展示的数据显示它们是有希望用作抗肿瘤治疗的临床候选物。
实施例6.靶向叶酸的可释放的BPheid-a缀合物的临床前评价。组B：变化水可溶的连接体部分以改善药物的生物利用度
该实施例的目的是通过经由含水可溶连接体的可释放连接体缀合至叶酸(叶酸盐/酯，维生素B9)使得BPheid-a靶向叶酸受体阳性肿瘤细胞，评价癌细胞中的光动力疗效，和评价体内全身成像能力和在细胞培养物中最有活性的分子在带肿瘤异种移植物小鼠中的PDT效力。
(a)合成
全部化合物用与实施例v中65a相似的方法和程序合成。
(b)体外研究
表7：在培养物中修饰的PDT试剂上靶向叶酸的药物浓度对KB细胞生存的效果
化合物 EC50(nM)
65a 2.7
65b 137.3
65c 11.6
76a 0.001
76b 320
76c 0.007
76d 339
BPheid-a 745
为了确定靶向叶酸的和靶向线粒体的BPheid-a缀合物的体外效力，在实施例开始时将KB细胞按下文的描述使用，数据用EC50值报告。
全部化合物与BPheid-a(1)相比是高度活性的。化合物65a，65c，76a和76c对癌细胞极度有效。这些不寻常的活性可以归因于增加的水溶解度，药物在细胞内释放，叶酸介导的内吞作用和线粒体集中。
(c)体内研究
为了建立靶向叶酸的和靶向线粒体的可释放的BPheid-a对癌细胞的特异性，将化合物76a&76c注射入肩部携带KB肿瘤的裸鼠，借助荧光成像用IVIS成像仪监测肿瘤聚集(来自65a-c相似研究的数据包括在实施例v中)。时间依赖性全身图像表明靶向叶酸的和靶向线粒体的可释放的BPheid-a在给予药物1小时内主要集中在肿瘤中并且在24小时内保持在肿瘤中而不失去其荧光特性。化合物76a&76c对FR-阳性肿瘤高度特异性并且未观察到其它组织中的荧光。从而这些化合物产生有用且高的荧光的肿瘤背景比。此外，与靶向叶酸的非可释放的BPheid-a缀合物(59a)相比肿瘤具有更高荧光指出与59a相比更大量的76a&76c分子存在于肿瘤内。由于两种分子具有相似数目的亲水官能团和相似的溶解度特性，活性差异可以归因于靶向线粒体的BPheid-a在癌组织内的释放。
过表达叶酸受体的KB细胞经皮下植入雌性裸鼠，在开始用50nmol 76a-c处理之前生长至～50mm3(65a-c相似研究的数据包括在实施例v中)。在注射药物三小时(3h)之后，肿瘤用激光束(75mW/cm2，137J/cm2，暴露直径＝7.5-8mm)处理38分钟。缀合物的体内效力通过监测肿瘤体积减少来评价。全部三种化合物抑制KB肿瘤生长。然而，应注意用76c处理的小鼠显示更长时间的肿瘤消退，显示作为临床候选物的良好前景。此外，虽然仍然有效，Pd-螯合的缀合物76b与76a和76c相比在小鼠中活性更低。
实施例7：靶向叶酸的可释放的Visudyne缀合物的临床前评价。组C：变化水可溶的连接体部分以改善药物的生物利用度
该实施例的目的是通过经由含水可溶连接体的可释放连接体缀合至叶酸(叶酸盐/酯，维生素B9)使得visudyne靶向叶酸受体阳性肿瘤细胞，评价癌细胞中的光动力疗效，和评价体内全身成像能力和在细胞培养物中最有活性的分子在带肿瘤异种移植物小鼠中的PDT效力。
a)合成
全部化合物用与实施例V中65a的描述相似的方法和程序合成。
b)体外研究
表8：在培养物中修饰的PDT试剂上靶向叶酸的药物浓度对KB细胞生存的效果
化合物 EC50(nM)
81 无活性*
85 无活性*
87 无活性*
为了确定靶向叶酸的和靶向线粒体的visudyne缀合物的体外效力，在实施例开始时将KB细胞按下文的描述使用，数据根据EC50值报告。这些数据显示三种缀合物81、85和87在癌细胞中无活性。
(c)体内研究
FR阳性KB肿瘤异种移植物用(80)和(86)的时间依赖性全身成像为了建立靶向叶酸的和靶向线粒体的可释放的visudyne对癌细胞的特异性，将化合物80&86注射入肩部携带KB肿瘤的裸鼠，借助荧光成像用IVIS成像仪监测化合物的肿瘤聚集。时间依赖性全身图像表明两种缀合物在给予药物1小时内主要集中在肿瘤中。然而，肿瘤中的荧光小于叶酸-BPheid-a缀合物(59a，65a，76a&76c)。这可以是由于在BPheid-a与visudyne之间的光学特性差异。我们也注意到80和86均聚集在小鼠眼中。文献中有充分记载，visudyne倾向于聚集在眼中。
实施例8：靶向叶酸的可释放的BPheid-a缀合物的临床前评价。组D：阳离子BPheid-a类似物(带正电的PDT试剂)在癌细胞内的释放。
该实施例的目的是通过经由含水可溶连接体的可释放连接体缀合至叶酸(叶酸盐/酯，维生素B9)使得BPheid-a靶向叶酸受体阳性肿瘤细胞，其最终在细胞内释放阳离子BPheid-a类似物。第二目的是评价癌细胞中的光动力疗效，和评价体内全身成像能力和在细胞培养物中最有活性的分子在带肿瘤异种移植物小鼠中的PDT效力。
方案13：在核内体中，在二硫醚还原剂比如谷胱甘肽、硫氧还蛋白等存在下，二硫醚介导的带正电修饰的PDT试剂从靶向叶酸的自牺牲前药比如65a释放的可能机理。
合成：全部化合物用与实施例5中65a的描述相似的方法和程序合成。
(b)体外研究
表9：在培养物中在修饰的PDT试剂上靶向叶酸的药物浓度对KB细胞生存的效果
为了确定靶向叶酸的和靶向线粒体的BPheid-a的体外效力，在实施例开始时将KB细胞按下文的描述使用，数据用EC50值报告。
绝大多数化合物与非靶向的BPheid-a(1)相比有活性。化合物65a和89a在该类别中是极度有效的，而88a和92a也能够视为活性分子。
(c)体内研究
为了建立靶向叶酸的和靶向线粒体的可释放的BPheid-a对癌细胞的特异性，化合物89a注射入肩部携带KB肿瘤的裸鼠，借助荧光成像用IVIS成像仪监测肿瘤聚集。于2h时间点的全身图像表明靶向叶酸的和靶向线粒体的可释放的BPheid-a(89a)主要集中在肿瘤中。化合物89a对FR-阳性肿瘤高度特异性并且未观察到其它组织中的荧光，带来高肿瘤背景比。此外，与靶向叶酸的非可释放的BPheid-a缀合物(59a)(和非靶向的BPheid-a和靶向线粒体的BPheid-a)相比，肿瘤是高度荧光的。分子的高溶解度和释放可以在此引起差异。
过表达叶酸受体的KB细胞经皮下植入雌性裸鼠，在开始用50nmol 89a或92a处理之前生长至～50mm3。在注射药物三小时(3h)之后，肿瘤用激光束(75mW/cm2，137J/cm2，暴露直径＝7.5-8mm)处理38分钟。缀合物的体内效力通过监测肿瘤体积减少来评价。两种化合物完全减少肿瘤和显示更长时间的肿瘤消退，这显示作为临床候选物的良好前景。
实施例9：靶向叶酸的可释放的BPheid-a的临床前评价，组E：两性离子的BPheid-a类似物(电中性的PDT试剂)在癌细胞内的释放
该实施例的目的是通过经由含水可溶连接体的可释放连接体缀合至叶酸(叶酸盐/酯，维生素B9)使得BPheid-a靶向叶酸受体阳性肿瘤细胞，其最终在细胞内释放电中性的BPheid-a类似物。第二目的是评价癌细胞中的光动力疗效，评价体内全身成像能力和在细胞培养物中最有活性的分子在带肿瘤异种移植物小鼠中的PDT效力。
方案14：在核内体中，在二硫醚还原剂比如谷胱甘肽、硫氧还蛋白等存在下，二硫醚介导的两性离子PDT试剂从靶向叶酸的自牺牲前药比如99释放的可能机理。
(a)合成
将DIPEA(21uL，0.123mmol，3当量)加入BPheid-a(25mg，0.041mmol，1当量)和HATU(15.5mg，0.041mmol，1当量)的脱气DMF(2mL)溶液，在23℃在氩下搅拌内容物15分钟。在该时间之后，将5-氨基-1-(叔丁氧基)-N,N,N-三甲基-1-氧代戊烷-2-铵甲基硫酸酯(35mg，0.054mmol，1当量)的脱气DMF(0.5mL)溶液引入反应容器。在23℃再搅拌反应混合物1小时。加入0.5mL水破坏偶联剂，反应通过制备型HPLC用C18柱纯化，获得化合物(16)，是深褐色固体。
将化合物(16)(10mg，0.011mmol)溶于脱气的80％TFA/水(6mL)，在氩下在23℃搅拌6小时。减压蒸发溶剂，粗制残余物通过制备型HPLC用C18柱纯化，获得化合物(18)，是深褐色固体。
将二异丙基乙胺(29uL，0.163mmol，2.4当量)加入BPheid-a(化合物2)(40mg，0.065mmol，1当量)和HATU(30mg，0.079mmol，1.2当量)的DMF(3mL)溶液。将氩鼓泡通过反应混合物5分钟，避光搅拌20分钟(溶液A)。在又一烧瓶中，2-(苯基二硫烷基)乙基肼羧酸酯溶于DMF以形成透明溶液(溶液B)。经由套管将溶液B加入溶液A，搅拌内容物1小时。完成后，反应混合物通过制备型HPLC用C18柱纯化，获得化合物(4)。
(a)体外研究
表10：在培养物中在修饰的PDT试剂上靶向叶酸的药物浓度对KB细胞生存的效果
化合物 EC50(nM)
99 5.3
100 12.8
101 158.9
为了确定靶向叶酸的和靶向线粒体的BPheid-a的体外效力，在实施例开始时根据下文描述的方法使用KB细胞，数据根据EC50值报告。
测试的三种化合物与非靶向的BPheid-a(1)相比有活性。化合物99和100在此类中是极度有效的。
体内研究：
(i)FR阳性KB肿瘤异种移植物用(100)的时间依赖性全身成像
为了建立靶向叶酸的和靶向线粒体的可释放的BPheid-a对癌细胞的特异性，将化合物100注射入肩部携带KB肿瘤的裸鼠，借助荧光成像用IVIS成像仪监测肿瘤聚集。时间依赖性全身图像表明，靶向叶酸的和靶向线粒体的可释放的BPheid-a(100)在1小时内主要集中在肿瘤中。化合物100对FR-阳性肿瘤高度特异性并且未观察到其它组织中的荧光，带来高肿瘤背景比。此外，与靶向叶酸的非可释放的BPheid-a缀合物(59a)(和非靶向的BPheid-a和靶向线粒体的BPheid-a)相比，肿瘤是高度荧光的。分子的较高溶解度和释放可以解释此处的差异。
将过表达叶酸受体的KB细胞经皮下植入雌性裸鼠，在开始用50nmol 99或100处理之前生长至～100mm3。在注射药物三小时(3h)之后，肿瘤用激光束(75mW/cm2，137J/cm2，暴露直径＝7.5-8mm)处理38分钟。缀合物的体内效力通过监测肿瘤体积减少来评价。两种化合物完全治愈肿瘤和显示持续2周的肿瘤消退。
实施例10：靶向叶酸的可释放的BPheid-a缀合物的临床前评价。组F：阴离子修饰的BPheid-a类似物(带负电)在癌细胞内的释放
该实施例的目的是通过经由含水可溶连接体的可释放连接体缀合至叶酸(叶酸盐/酯，维生素B9)使得BPheid-a靶向叶酸受体阳性肿瘤细胞，其最终在细胞内释放带负电的BPheid-a类似物。第二目的是评价癌细胞中的光动力疗效，和评价体内全身成像能力和在细胞培养物中最有活性的分子在带肿瘤异种移植物小鼠中的PDT效力。
方案15：在核内体中，在二硫醚还原剂比如谷胱甘肽、硫氧还蛋白等存在下，二硫醚介导的两性离子的PDT试剂从靶向叶酸的自牺牲前药比如104释放的可能机理。
(a)体外研究
表11：在培养物中在修饰的PDT试剂上靶向叶酸的药物浓度对KB细胞生存的效果
化合物 EC50(nM)
64 4.8
104 1.8
105 45.3
BPheid-a 745
为了确定靶向叶酸的和靶向线粒体的BPheid-a的体外效力，在实施例开始部分按照下文描述使用KB细胞，数据根据EC50值报告。
两种化合物64和104活跃地杀死癌细胞。
(b)体内研究
(i)全身成像
为了建立靶向叶酸的和靶向线粒体的可释放的BPheid-a对癌细胞的特异性，将化合物104注射入肩部携带KB肿瘤的裸鼠，借助荧光成像用IVIS成像仪监测肿瘤聚集。时间依赖性全身图像表明，靶向叶酸的和靶向线粒体的可释放的BPheid-a(104)在1小时内主要集中在肿瘤中。化合物104对FR-阳性肿瘤高度特异性并且未观察到其它组织中的荧光。从而，化合物104可用于产生高肿瘤背景比。此外,与靶向叶酸的非可释放的BPheid-a缀合物(59a)(和非靶向的BPheid-a和靶向线粒体的BPheid-a)相比，肿瘤具有更高的荧光。分子的较高溶解度和释放可以解释该差异。
将过表达叶酸受体的KB细胞经皮下植入雌性裸鼠，在开始用50nmol 104处理之前生长至～20mm3(化合物64的相似数据报告于先前的实施例中)。在注射药物三小时(3h)之后，肿瘤用激光束(75mW/cm2，137J/cm2，暴露直径＝7.5-8mm)处理38分钟。缀合物的体内效力通过监测肿瘤体积减少来评价。化合物64和104能够完全治愈肿瘤并显示持续2周的肿瘤消退。两种化合物都能视为临床候选物。
实施例11.靶向叶酸的可释放的BPhied-a的临床前评价，组G：杂项
(a)体外研究
表12：在培养物中在修饰的PDT试剂上靶向叶酸的药物浓度对KB细胞生存的效果
化合物 EC50(nM)
112a 0.5
117 2846
119 538
为了确定靶向叶酸的和靶向细胞核的BPheid-a的体外效力，在实施例开始部分按照下文描述使用KB细胞，数据根据EC50值报告如上。
(b)体内研究
(i)全身成像
为了建立靶向叶酸的和靶向细胞核的可释放的BPheid-a对癌细胞的特异性，将化合物112a注射入肩部携带KB肿瘤的裸鼠，借助荧光成像用IVIS成像仪监测肿瘤聚集。全身图像表明，靶向叶酸的和靶向细胞核的可释放的BPheid-a(112a)主要集中于肿瘤中。化合物112a对FR-阳性肿瘤高度特异性并且不存在其它组织中的荧光。从而该化合物产生高肿瘤背景比。此外，与靶向叶酸的非可释放的BPheid-a缀合物(59a)(和非靶向的BPheid-a和靶向线粒体的BPheid-a)相比，肿瘤具有更高的荧光。分子的较高溶解度和释放可以引起此处的差异。
将过表达叶酸受体的KB细胞经皮下植入雌性裸鼠，在开始用50nmol 117处理之前生长至～20mm3。在注射药物三小时(3h)之后，肿瘤用激光束(75mW/cm2，137J/cm2，暴露直径＝7.5-8mm)处理38分钟。缀合物的体内效力通过监测肿瘤体积减少来评价。化合物117能够完全治愈肿瘤并且显示持续3周的肿瘤消退。

Claims (77)

1.具有下式的光动力治疗化合物：
或其药学上可接受的盐，或其同位素，其中
L是氨基酸，
L/是改善药代动力学特性的连接体，
L//是可释放的连接体，其释放靶向细胞器的光动力治疗(PDT)试剂，
X是靶向细胞器的试剂，和
Y是光动力治疗的试剂。
2.权利要求1的化合物，其中Y选自：
3.权利要求1的化合物，其中Y具有可视光谱内的吸收最大值和发射最大值。
4.权利要求3的化合物，其中Y具有约680nm至约800nm的吸收最大值和发射最大值。
5.权利要求1的化合物，其中Y具有高消光系数(€max)。
6.权利要求5的化合物，其中Y具有约50,000至约100,000M-1cm-1范围的€max。
7.权利要求1的化合物，其中Y具有高单线态氧量子产率(ΦΔ)。
8.权利要求1的化合物，其中所述化合物具有下式：
及其钾盐、钠盐或铵盐。
9.权利要求1的化合物，其中使得化合物在组织细胞中分布之后发荧光。
10.权利要求1的化合物，其中通过使化合物经受近红外波长的激发光来使化合物发荧光。
11.权利要求1的化合物，其中所述化合物具有对叶酸受体靶标的结合亲和力，其类似于叶酸对叶酸受体的结合亲和力。
12.权利要求1的化合物，其中所述化合物高度选择性地靶向肿瘤细胞。
13.权利要求1的化合物，其中L选自氨基酸和氨基酸衍生物。
14.权利要求13的化合物，其中氨基酸或氨基酸衍生物选自谷氨酸，天冬氨酸，赖氨酸，鸟氨酸，半胱氨酸，丝氨酸，精氨酸，及其异构体和衍生物。
15.权利要求14的化合物，其中氨基酸或氨基酸衍生物选自α氨基酸，高氨基酸和β氨基酸。
16.权利要求14的化合物，其中氨基酸通过单肽键或二肽键缀合至蝶酰基配体。
17.权利要求1的化合物，其中L/选自聚醚，磺酸，聚糖，氨基酸或其衍生物。
18.权利要求17的化合物，其中聚醚选自聚乙二醇，聚氧化乙烯和聚氧乙烯。
19.权利要求17的化合物，其中磺酸及其衍生物选自：
20.权利要求17的化合物，其中聚糖及其衍生物选自：
21.权利要求17的化合物，其中氨基酸或氨基酸衍生物选自天然氨基酸或氨基酸衍生物。
22.权利要求21的化合物，其中氨基酸或氨基酸衍生物选自α氨基酸，高氨基酸，β氨基酸，带正电氨基酸，带负电氨基酸及其衍生物。
23.权利要求22的化合物，其中包括带正电侧链的氨基酸或氨基酸衍生物选自精氨酸，赖氨酸，鸟氨酸，组氨酸及其衍生物。
24.权利要求22的化合物，其中包括带负电侧链基团的氨基酸或氨基酸衍生物是天冬氨酸，谷氨酸，其异构体或衍生物。
25.权利要求21的化合物，其中氨基酸或氨基酸衍生物包括含硫的侧链基团。
26.权利要求29的化合物，其中包括含硫的侧链基团的氨基酸或氨基酸衍生物是半胱氨酸。
27.权利要求21的化合物，其中氨基酸或氨基酸衍生物包括含硫族元素的侧链基团。
28.权利要求31的化合物，其中包括含硫族元素的侧链基团的氨基酸或氨基酸衍生物是硒代半胱氨酸。
29.权利要求1的化合物，其中L//选自可释放的连接体或非可释放的连接体及其衍生物。
30.权利要求33的化合物，其中可释放的连接体及其衍生物选自：
31.权利要求1的化合物，其中X是靶向细胞器的试剂，其靶向患病细胞中的细胞器。
32.权利要求31的化合物，其中靶向细胞器的试剂使得所述PDT试剂靶向患病细胞的线粒体。
33.权利要求32的化合物，其中靶向线粒体的PDT试剂选自：
34.权利要求31的化合物，其中靶向细胞器的试剂使所述PDT试剂靶向患病细胞的细胞核。
35.权利要求34的化合物，其中靶向细胞核的PDT试剂选自：
36.一种组合物，包含权利要求1的化合物和药学上可接受的载体，赋形剂或稀释剂。
37.在表达叶酸受体的生物学组织上进行光动力疗法的方法，所述方法包括：
(a)将生物学组织与权利要求1的组合物接触，
(b)留出时间使得组合物中的化合物在生物学靶标内分布并且不在非靶向组织中分布；
(c)用化合物可吸收的波长的激发光光照组织；
其中组合物产生反应性氧类(ROSs)由此诱导患病细胞的细胞死亡和坏死和毁坏生物学组织。
38.权利要求37的方法，其中组织在受试者中且受试者是动物或人类。
39.权利要求37的方法，其中患有疾病的生物学组织过表达所述受体。
40.权利要求39的方法，其中患病细胞是选自恶性细胞、肿瘤相关的巨噬细胞和骨髓衍生的抑制性细胞的叶酸受体表达细胞。
41.权利要求39的方法，其中疾病选自癌症，神经变性疾病，呼吸系统疾病，代谢病，遗传病，骨骼病，环境疾病，和皮肤病。
42.权利要求41的方法，其中组织是表达叶酸受体的癌症或淋巴结。
43.权利要求42的方法，其中癌症选自卵巢癌，肺癌，子宫内膜癌，子宫癌，乳腺癌，肾癌，肝癌，膀胱癌，胃癌，结直肠癌，胰癌，垂体癌，甲状腺癌，宫颈癌，间皮瘤癌，脑癌，头颈癌，前列腺癌，睾丸癌，皮肤癌，和食管癌。
44.权利要求42的方法，其中癌症是卵巢癌。
45.权利要求42的方法，其中癌症是肺癌。
46.权利要求42的方法，其中癌症是子宫内膜癌。
47.权利要求42的方法，其中癌症是子宫癌。
48.权利要求42的方法，其中癌症是乳腺癌。
49.权利要求42的方法，其中癌症是肾癌。
50.权利要求42的方法，其中癌症是宫颈癌。
51.权利要求37的方法，其中组织或淋巴结是肿瘤组织，其具有表达叶酸受体的肿瘤相关的巨噬细胞。
52.权利要求37的方法，其中激发光是近红外波长光。
53.权利要求52的方法，其中激发光波长在约600至约1000纳米的范围内。
54.权利要求52的方法，其中激发光波长在约670至约850纳米的范围内。
55.包含权利要求1的化合物的试剂盒。
56.权利要求的试剂盒，其中疾病选自癌症，神经变性疾病，呼吸系统疾病，代谢病和皮肤病。
57.权利要求55的试剂盒，还包含权利要求1的化合物的衍生物。
58.化合物，其选自化合物9、化合物11a、化合物11b、化合物12b、化合物13、化合物14、化合物15、化合物26、化合物27、化合物41、化合物58a、化合物59a、化合物60a、化合物64、化合物65a、化合物65c、化合物76a、化合物76c、化合物88a、化合物89、化合物92a、化合物99、化合物100、化合物104、化合物112a、化合物112b、化合物116和化合物117。
59.化合物，其选自
60.在表达叶酸受体的生物学组织上进行光动力疗法的方法，所述方法包括：
(a)将生物学组织与权利要求59的化合物接触，
(b)留出时间使组合物中的化合物在生物学靶标中分布；
(c)用化合物可吸收的波长的激发光光照组织；
其中组合物产生反应性氧类(ROSs)，由此诱导患病细胞的细胞死亡和坏死和毁坏生物学组织。
61.治疗实体癌症的方法，包括向所述实体肿瘤给予包含权利要求72的化合物的组合物，并且一旦所述化合物分布至所述肿瘤就光照所述化合物以产生细胞死亡，细胞减少或者另外进行对所述实体癌症的治疗。
62.权利要求61的方法，其中所述肿瘤在给予所述组合物之前，在给予所述组合物之后，或与给予所述组合物同时切除。
63.权利要求61的方法，其中所述患病组织借助OTL38可视化(靶向叶酸受体的NIR染料)，其中OTL38具有下述结构：
或其外消旋混合物，其中：
X选自：
或其外消旋混合物；和
Y由下式代表：
其中
R1独立地选自O，S，NH，CH2和CH2CH2；
R2独立地选自CH2和CH2CH2。
64.权利要求63的方法，其中生物学组织在受试者中且受试者是动物或人类。
65.权利要求64的方法，其中生物学组织具有过表达受体的疾病。
66.权利要求65的方法，其中疾病位于表达叶酸受体且选自恶性细胞、炎性细胞和微生物细胞的细胞中。
67.权利要求66的方法，其中疾病选自癌症，炎性疾病，免疫学疾病，自身免疫性疾病，心血管疾病，神经变性疾病，呼吸系统疾病，代谢病，遗传病，传染病，骨骼病，环境疾病，和皮肤病。
68.权利要求67的方法，其中组织是表达叶酸受体的癌症或淋巴结。
69.权利要求68的方法，其中癌症选自卵巢癌，肺癌，子宫内膜癌，子宫癌，乳腺癌，肾癌，肝癌，膀胱癌，胃癌，结直肠癌，胰癌，垂体癌，甲状腺癌，宫颈癌，间皮瘤癌，脑癌，头颈癌，前列腺癌，睾丸癌，皮肤癌，和食管癌等。
70.权利要求68的方法，其中癌症是卵巢癌。
71.权利要求68的方法，其中癌症是肺癌。
72.权利要求68的方法，其中癌症是子宫内膜癌。
73.权利要求68的方法，其中癌症是子宫癌。
74.权利要求68的方法，其中癌症是乳腺癌。
75.权利要求68的方法，其中癌症是肾癌。
76.权利要求68的方法，其中癌症是宫颈癌。
77.权利要求68的方法，其中组织或淋巴结是肿瘤组织，其具有表达叶酸受体的肿瘤相关的巨噬细胞。
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