CN108102913A - 基于软光刻技术的三维细胞培养芯片、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于软光刻技术的三维细胞培养芯片、其制备方法及应用。该制备方法包括：采用软光刻技术制作具有设定图案结构的掩模；以液态高分子化合物或高分子化合物溶液均匀覆盖所述掩模，并形成一定厚度的液层；使该液层固化，之后移除掩模，获得印章，其印面具有设定立体结构；以所述印面与修饰剂接触，使修饰剂以可脱离方式附着在所述印面上；以所述印面与选定基底表面接触，之后将所述印章从选定基底上移离，从而使至少部分修饰剂脱离所述印面而附着在所述选定基底表面并形成图纹结构，所述图纹结构包括若干能够吸附单细胞的图案组成的阵列。本发明的三维细胞培养芯片易于简单、低成本、大规模的制备，且能够提供理想的3D细胞培养环境。

Description

基于软光刻技术的三维细胞培养芯片、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种生物芯片，特别涉及一种基于软光刻技术的三维细胞培养芯片、其制备方法及应用。

背景技术

在当前的生物和医学研究中，首选的是进行细胞学试验对药物等进行检测，且多数情况下还是采用传统的细胞二维贴壁培养的方式进行，这与机体内真是的组织细胞的存在状态(三维状态且具有ECM环境)有本质的区别。生物体内的细胞是在三维的立体微环境中生长的，而二维细胞培养并不是细胞生长的天然状态，培养微环境与体内微环境差异太大，影响细胞的基因表达、信号转导等，导致所培养的细胞逐渐丧失其在生物体内的生物学特性及功能，失去研究及应用价值。而且二维细胞培养还有很多明显的缺陷，如细胞的分化不均一，不利于细胞分化研究所及其相关的研究；另外，二维培养时细胞数量较多，而其中有用细胞数目很难分选，且浪费试剂。

现有的3D培养是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养,使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长,构成三维的细胞-载体复合物。但这类3D培养技术往往存在如下缺点：

(1)无法为细胞提供有效的ECM培养环境，多数仅仅依靠立体结构提供3D培养的空间，细胞仅仅通过直接接触培养基获取营养，无法接触到真正适于3D培养的ECM环境，使得细胞容易过度过早聚集，进而使细胞缺氧和物质代谢不畅通，最终导致细胞凋亡或抑制增殖和干细胞分化；

(2)无法精确控制三维细胞球体的性状和细胞数目，也无法保持细胞的同质性，只能实现随机位置的三维培养，进而也难以定位观察和分析，且通量较低，在药物筛选方面的应用具有较大的局限性；

(3)一般需要细胞直接接触有机化合物，难以排除对细胞的增殖或分化造成损伤。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种基于软光刻技术的三维细胞培养芯片、其制备方法及应用，以克服现有技术中的不足。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例提供了一种基于软光刻技术的三维细胞培养芯片的制备方法，其包括：

采用软光刻技术制作具有设定图案结构的掩模；

以液态高分子化合物或高分子化合物溶液均匀覆盖所述掩模，并形成具有设定厚度的液层；

使所述液层固化，之后移除掩模，获得印章，所述印章的印面具有设定立体结构；

以所述印章的印面与修饰剂接触，使所述修饰剂以可脱离方式附着在所述印面上；

以所述印面与选定基底表面接触，之后将所述印章从选定基底上移离，从而使至少部分修饰剂脱离所述印面而附着在所述选定基底表面并形成图纹结构，所述图纹结构包括由复数个图案组成的阵列，所述图案至少能够吸附单细胞，从而获得所述三维细胞培养芯片。

进一步的，在一些实施方案中，所述的制备方法包括：至少将所述印章的印面完全浸渍于液态的修饰剂或修饰剂溶液中，之后取出，使所述修饰剂以可脱离方式附着在所述印面上。

本发明实施例还提供了由所述方法制备的三维细胞培养芯片。

本发明实施例还提供了一种三维细胞培养芯片，其包括：

选定基底；

以及，形成于所述选定基底表面的图纹结构，所述图纹结构包括由复数个图案组成的阵列，所述图案由至少能够促使单细胞附着的修饰剂组成。

进一步的，所述图纹结构中，任一图案的面积由所需的吸附细胞面积决定，而任意两个相邻图案的距离由所需的相邻细胞的间距决定。

本发明实施例还提供了一种细胞培养方法，其包括：

提供权所述的三维细胞培养芯片；

在所述三维细胞培养芯片表面施加细胞悬浮液，再置于细胞培养环境中进行细胞培养。

本发明实施例还提供了一种三维支架的制作方法，其包括：

将能够稳定表达选定细胞因子的细胞在培养基中培养至所需的细胞密度，之后从培养基中移出，获得细胞支架；

将所述细胞支架与基质胶混合形成基质胶支架材料；

将所述基质胶支架材料施加到所述三维细胞培养芯片的表面，并至少将所述选定基底表面的图纹结构完全覆盖，其后置入细胞培养环境中孵育至所述基质胶支架材料充分固化。

本发明实施例还提供了由所述方法制作的三维支架。

本发明实施例还提供了一种细胞培养方法，其包括：

提供所述的三维支架；

以细胞培养完全培养基覆盖所述三维支架，并在细胞培养环境中持续培养。

与现有技术相比，本发明的优点包括：

(1)本发明提供的基于软光刻技术的三维细胞培养芯片的制作方法简单易实施，只需一次光刻反应，即可获得足够的印章，进而只需利用所述印章重复进行简单的印制操作，即可大批量的制取质量稳定的三维细胞培养芯片，成本低，可控性好。

(2)本发明提供的基于软光刻技术的三维细胞培养芯片具有高可靠性、高稳定性、高通量性等优点。

(3)本发明提供的基于软光刻技术的三维细胞培养芯片能够使细胞共同生长、互相交流和形成三维结构，细胞功能状态和细胞性状更加接近体内状态，而且通过调整预设图纹结构能够精确控制三维细胞球体的性状，可以完全控制3D细胞球来源是否为单细胞或不是，或者来源几个细胞。能长久保持细胞的同质性和不同细胞球来源的稳定性。

(4)本发明提供的基于软光刻技术的三维细胞培养芯片能够保证单细胞3D培养的空间相对独立性，每个细胞可以获得均一和优化的3D培养为环境，促进细胞存活、增殖、干细胞的维持，以及均一调控干细胞分化。

(5)藉由本发明提供的基于软光刻技术的三维细胞培养芯片，还能够针对性的为所培养细胞提供特异性的三维微环境，并降低细胞死亡率。

附图说明

图1是本发明一典型实施方案中一种PDMS印章的制备工作流程图；

图2是本发明一典型实施方案中一种单细胞微阵列的形成过程示意图；

图3是本发明一典型实施例中由单细胞来源的三维细胞连续培养的光学图片。

具体实施方式

鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。

本说明书涉及的一些技术术语的释义如下：

光刻：是通过一系列生产步骤，将晶圆表面薄膜的特定部分除去的工艺。在此之后，晶圆表面会留下带有微图形结构的薄膜。通过光刻工艺过程，最终在晶圆上保留的是特征图形部分。

软光刻：是涉及传统光刻、有机分子(例如硫醇和硅氧烷等)自组装、电化学、聚合物科学等领域的一类综合性技术的统称。

细胞外基质(extracellular matrix,ECM)：由细胞分泌到细胞外间质中的大分子物质，构成复杂的网架结构，支持并连接组织结构、调节组织的发生和细胞的生理活动。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)：是中胚层来源的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞，广泛存在于全身多种组织中，可在体外培养扩增，并能在特定条件下分化为神经细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等。

又及，若非特别说明，则本说明书中述及的其它术语的含义均是本领域技术人员所知悉的，此处不再赘述。

本发明实施例提供的一种基于软光刻技术的三维细胞培养芯片的制备方法包括：

采用软光刻技术制作具有设定图案结构的掩模；

以液态高分子化合物或高分子化合物溶液均匀覆盖所述掩模，并形成具有设定厚度的液层；

使所述液层固化，之后移除掩模，获得印章，所述印章的印面具有设定立体结构；

以所述印章的印面与修饰剂接触，使所述修饰剂以可脱离方式附着在所述印面上；

以所述印面与选定基底表面接触，之后将所述印章从选定基底上移离，从而使至少部分修饰剂脱离所述印面而附着在所述选定基底表面并形成图纹结构，所述图纹结构包括由复数个图案组成的阵列，所述图案至少能够吸附单细胞，从而获得所述三维细胞培养芯片。

在一些实施方案中，所述的制备方法具体可以包括：在基片上涂覆一层光刻胶，之后烘烤、曝光，并再次烘烤，其后显影，制得所述掩模。

其中，所述掩模的厚度可以依据实际需求设置，例如可以优选为7～15μm。

在一些实施方案中，所述印章印面的设定立体结构由一个以上凸设于所述印章印面的突出部和/或一个以上凹设于所述所述印章印面的下凹部组成。

在一些实施方案中，所述的制备方法还可以包括：至少将所述印章的印面完全浸渍于液态的修饰剂或修饰剂溶液中，之后取出，使所述修饰剂以可脱离方式附着在所述印面上。

在一些实施方案中，所述的制备方法具体可以包括：在室温条件下，将所述印章的印面完全浸渍于液态的修饰剂或修饰剂溶液中，保持10min以上，之后取出，洗涤、干燥，使所述修饰剂以可脱离方式附着在所述印面上。

进一步的，所述高分子化合物包括能够光固化和/或热固化的高分子化合物。优选的，所述高分子化合物包括高分子有机硅化合物，例如可优选为聚二甲基硅氧烷(PDMS)等，且不限于此。

在一些实施方案中，所述选定基底表面上除所述图纹结构所在区域之外的其它区域具有排斥细胞的特性。

相应的，在一些实施方案中，前述三维细胞培养芯片的制备方法还可以包括：先对所述选定基底进行表面处理，以至少使所述选定基底表面具有排斥细胞的特性(防止细胞贴附)，之后将所述印面与选定基底表面接触，从而在所述选定基底表面形成所述图纹结构。

前述表面处理的方式可以包括：以等离子体(plasma，例如氧等离子体)对所述选定基底表面进行处理。

或者，前述表面处理的方式也可以包括：以化学物质对所述选定基底表面进行表面修饰。所述化学修饰处理用的试剂可以包括聚苯乙烯磺酸钠(PSS)或硅烷化的聚乙二醇等，且不限于此。

其中，单独的Plasma处理可以产生足够的block细胞的负电效应(不仅可以防止细胞贴附，也利于增强印面表面的正电性聚合物类修饰剂的转移)，但与采用PSS等试剂修饰的方式相比，Plasma对环境要求更高，适用于环境条件较高的实验室，例如无尘室等。但如果进行化学修饰(例如PSS修饰)，则基底表面需要提前修饰，相应的方法也是业界已知的，此处不再赘述。

在一些实施方案中，所述的制备方法具体可以包括：将印面附着有修饰剂的印章一次性放置在所述选定基底上，使所述印面与选定基底表面在设定压力下(例如可以手轻压)接触并保持30s以上(例如30～40s)，然后移除所述印章，从而在所述选定基底表面形成由修饰剂组成的图纹结构。

本发明实施例还提供了由所述方法制备的三维细胞培养芯片。

本发明实施例提供的一种三维细胞培养芯片包括：

选定基底；

以及，形成于所述选定基底表面的图纹结构，所述图纹结构包括由复数个图案组成的阵列，所述图案由至少能够促使单细胞附着的修饰剂组成。

在一些实施方案中，所述选定基底表面上除所述图纹结构所在区域之外的其它区域具有排斥细胞的特性。这样的特性可以通过前文所述的表面处理方式而得以实现。

进一步的，前述实施例中的图纹结构中，任一图案的面积由所需的吸附细胞面积决定，而任意两个相邻图案的距离由所需的相邻细胞的间距决定。

进一步的，前述实施例中的相邻图案之间的间距应足以区分开不同细胞分泌的抗体。优选的，相邻图案之间的间距可以为30μm以上，例如30μm～100μm，例如30μm～60μm，例如60μm～100μm，当然，也可以为30μm以下或100μm以上，但若相邻图案之间的间距过小，则可能导致相邻图案上的不同细胞分泌的抗体相互干扰，而若间距过大，则将导致相同面积上的筛选通量过小。

进一步的，前述实施例中的各图案用以吸附细胞的面积可以为5μm×5μm～15μm×15μm，若过小会使图案对细胞的吸附力量过小，容易脱落，而若过大，将难以保证各图案上吸附的细胞为单细胞。

进一步的，前述实施例中的图纹结构中的图案可以完全相同，也可以是部分图案相同，其可以依据实际应用的需要而进行相应设置。优选的，前述图纹结构中的图案完全相同，以利于加工，也利于后续的细胞甄别。

进一步的，前述实施例中的图纹结构的厚度可以优选为7～15μm。

进一步的，前述实施例中的修饰剂包括能够在选定基底表面修饰活性氨基的试剂，例如可以选用丙基多巴乙酰胺(PDAC)、对氨基马尿酸(PAH)、聚醚酰亚胺(PEI)或纤维连接蛋白(fibronectin)等，且不限于此。

进一步的，前述实施例中的选定基底表面可优选为平整面。

进一步的，前述实施例中的选定基底可以优选为透明基底，例如可以选用玻璃片等，利用普通盖玻片玻璃，如此便于在细胞培养过程中观察细胞生长和各种不同指标特征。

本发明实施例提供的一种细胞培养方法包括：

提供所述的三维细胞培养芯片；

在所述三维细胞培养芯片表面施加细胞悬浮液，再置于细胞培养环境中进行细胞培养。

进一步的，所述的细胞培养方法还可包括：在完成细胞培养后，除去所述三维细胞培养芯片表面的培养基，并以新鲜培养基或者磷酸缓冲液润洗所述三维细胞培养芯片表面，去除多余的细胞，获得单细胞阵列。

进一步的，所述细胞悬浮液中细胞总数为所述三维细胞培养芯片表面的图案数量的2～3倍。

本发明通过将软光刻技术与细胞培养技术相结合，所制备的细胞培养芯片具有明显的优势，例如能将细胞的二维阵列和三维培养有机结合，为单细胞提供理想的3D培养环境，克服传统方法造成的细胞缺氧和物质代谢不畅通等缺点，在一定时间内实现细胞3D培养的空间调控。

另外，由于细胞培养的特殊性，生物相容性差的材料可能抑制细胞的生长或者分化，影响对于细胞正常生理生化状态和分化过程的研究以及试验结果的可靠性。

因而，本发明实施例还提供了一种三维支架的制作方法，其包括：

将能够稳定表达选定细胞因子的细胞在培养基中培养至所需的细胞密度，之后从培养基中移出，获得细胞支架；

将所述细胞支架与基质胶混合形成基质胶支架材料；

将所述基质胶支架材料施加到所述三维细胞培养芯片表面，并至少将所述选定基底表面的图纹结构完全覆盖，其后置入细胞培养环境中孵育至所述基质胶支架材料充分固化。

进一步的，所述的制作方法还可包括：将能够稳定表达选定细胞因子的细胞在培养基中培养至细胞密度＞95％，之后从培养基中移出、干燥(优选采用冻干方式，其不仅可以保持ECM细胞骨架原形态利于细胞贴附，而且制作过程中使用的化学试剂少，减少对后续培养细胞的影响，另外所需仪器设备简单，容易获得)，获得细胞支架。

相应的，本发明实施例还提供了由所述方法制作的三维支架。

前述三维支架可以为适于不同种类的细胞(包括干细胞)的三维培养和增殖分化的、包含不同细胞因子的胶原水凝胶支架。

藉由前述三维支架，能为细胞培养提供优化的细胞三维培养的微环境，使之更接近于体内的真实环境，从而允许单细胞或多细胞按照预先设计的图案聚集、三维生长或分化。

本发明实施例还提供了一种细胞培养方法，其包括：提供所述的三维支架；以及，以细胞培养完全培养基覆盖所述三维支架，并在细胞培养环境中持续培养。

以下结合典型实施例及附图对本发明的技术方案作更为详细的解释说明。

请参阅图1所示，在本发明的一典型实施案例中，一种基于软光刻技术的三维细胞培养芯片的制备方法可以包括步骤：

1.掩模(Master)的制作：

1)利用软件(Photoshop/AutoCAD/Clewin)等设计图案，然后制作。

2)取干净的硅片，氮气吹去表面的杂质颗粒。浸泡于酸液中(体积比为3:1的H₂SO₄和H₂O₂)，80℃、1h。

3)用蒸馏水润洗3遍以上，从而去除硅片表面的酸性物质及油脂等。

4)将洗净的硅片放置于溶液中(体积比为5:1:1的H₂O:NH₄OH:H₂O₂)，室温浸泡1h。

5)用蒸馏水润洗3遍去除硅片表面的化学物质并用氮气吹干，之后于120℃加热处理5min，取下放置冷却至室温。

6)涂胶：利用旋转法(Spin Coater)在硅片上涂一薄层粘附性好、厚度适当、均匀的光刻胶。将清洁的硅片放置于甩胶盘中心托盘上，然后用滴管滴上数滴光刻胶于片子上，利用转动时产生的离心力，将片子上多余的胶液甩掉，在光刻胶表面粘附能力和离心力的共同作用下形成厚度均匀的胶膜。要求：厚度适当(根据试验要求和参考说明书)，胶膜层均匀，粘附良好，表面无颗粒无划痕。以Su8 2005为例，若其厚度为5μm，则相应操作条件包括：500rpm、5-10s，100rpm/s；2500rpm、30s，300rpm/s)

7)前烘：将硅片放置于加热台上烘烤，促使胶膜内溶剂充分地挥发掉，使胶膜干燥，增加胶膜与硅片之间的粘附性和提高胶膜的耐磨性，不沾污掩模板，只有干燥的光刻胶才能充分进行光化学反应。前烘时间(与胶的种类和厚度相关，以Su8 2005为例，若其厚度为5μm，则相应工艺条件为：65℃、2min，95℃、9min)，之后取下硅片冷却至室温。

8)曝光：在专用的光刻机上或者UV光源下曝光，包括“定位”和“曝光”两部分。预热紫外光灯(高压水银灯)使光源稳定—将光刻掩模板安装在支架上，使有图形的玻璃面向下---把涂有光刻胶的硅片放在可微调的工作台上胶面朝上---在显微镜下仔细调节微动装置，使掩模板上的图形与硅片相应的位置准确吻合---使硅片和掩模板紧密接触---复查是否对准---曝光---取下片子。曝光时间的选择根据光源强弱、光刻胶性能及光刻图形尺寸大小相关。一般情况下，先试曝光一片，显影后检查一下表面，看其图形是否清晰。曝光不足会导致光刻胶反应不充分，显影时部分胶膜被溶解，显微镜下观察胶膜发黑；曝光时间过长会导致不感光部分的边缘微弱感光，产生“晕光”现象，边界模糊，出现皱纹。曝光时间：约8s～25s不等。(以Su8 2005为例，若其厚度约5μm，则相应工艺条件包括：100W UV、15s)。

9)后烘：将曝光后的硅片放置于加热台上烘烤直至曝光影像出现(对于小尺度的图形，可能会很难看到)。后烘时间及温度(和胶的种类和厚度相关，以Su8 2005为例，若其厚度约5μm，则相应工艺条件包括：65℃、2min，95℃、7min。之后取下硅片冷却至室温。

10)显影：将未感光部分的光刻胶溶除，以获得曝光所需图形。以厚度5μm的Su82005为例，将曝光后的片子放入Su8显影液中不断震荡直至曝光图案逐渐清晰，立即放入蒸馏水中清洗。

11)观察：将水清洗干净的硅片用氮气吹干，置于显微镜下观察所曝光图案的质量，制得掩模，置于封闭容器中待用。

2.PDMS印章的制作及表面修饰

1)PDMS原始溶液(两种：有机硅橡胶silicone elastomer base,有机硅固化剂silicone elastomer curing agent)按照10:1的质量比混合均匀；将均匀混合的PDMS溶液倾倒在掩模表面(提前将掩模放到容器中，可以是塑料培养皿)直至均匀的覆盖整个表面并使高度达到要求(一般1cm左右)；置于真空干燥器中除气(时间大概1h，期间不断观察)；将覆盖PDMS溶液的掩模放到烘箱中固化(60℃过夜)；固化完成后，取出并切割成所需大小，显微镜观察质量，获得PDMS印章，待用。

2)PDMS修饰：将清理过的PDMS印章浸泡在1％(V/V)的PDAC或者PAH溶液中，在室温下保持10min。取出，用蒸馏水润洗3次，氮气吹干并待用。

3)玻璃片修饰：将清理过的玻璃片浸泡在1％(V/V)的PPS(聚苯乙烯磺酸钠)溶液中，在室温下保持10min。取出，用蒸馏水润洗3次，氮气吹干并待用。

4)PDAC或PAH微阵列的形成：将修饰好的PDMS印章轻轻的放在修饰好的玻璃片上(不要移动，一次性放置)，稍稍加力使两表面接触并保持30s～40s，然后揭掉PDMS印章，于玻璃片上形成所需的图纹结构，即为三维细胞培养芯片。该过程可以参阅图2所示。

3.单细胞阵列的形成

1ml细胞悬浮液(细胞数量根据图案不同决定，大体来说，细胞总数为图案数量的2～3倍)被置于修饰好(盖好印章图案后)的玻璃片上，将载有细胞的玻璃片放置于细胞培养箱内20～30min。之后，取出玻璃片，小心的将培养基除去，并用新鲜培养基或者PBS轻轻的润洗玻璃片，从而去除多余的细胞，获得单细胞阵列(该过程可继续参阅图2所示)。最后，用显微镜观察单细胞阵列的质量。

请参阅图3所示的是本发明一典型实施例中形成的单细胞阵列的在连续培养3-5天后的显微照片，其中每个单细胞均形成了环境相对独立的三维细胞团。在该典型实施例中，采用了10μm×100μm的图案结构形成单细胞阵列。同时，将多种细胞因子(EGF、BDNF、GDNF等)通过构建慢病毒载体(pLVX)和慢病毒，最终得到稳定表达各种因子的MSC细胞株。将表达不同细胞生长因子的MSC进行等比例混合后进行传统的2D培养，待细胞密度达到100％后在进行10天左右的诱导，使分泌大量的生长因子并结合在细胞骨架上。之后进行常规冻干，透析等过程进行脱细胞化，最终得到包含大量多重细胞因子的ECM支架。将此支架溶解到胶原水凝胶中制作成可溶性的ECM支架并覆盖在单细胞阵列上，从而模拟体外细胞三维培养的微环境。经过连续3-5天的细胞培养(常规细胞培养条件)，由图片中可以看到，每个单细胞都独立的形成了3D细胞球，且周围具有包含多重细胞生长因子的ECM支架的保卫。需要说明的是，还可以通过调整吸附细胞面积的大小和间距对细胞的阵列方式进行改进。细胞可以是单细胞来源、多细胞来源混合、可以是单细胞阵列或多细胞阵列等不同方式，也可以做到对3D细胞球大小的控制(细胞球之间没有接触，独立生长，可用于体外3D细胞组织团块的药物筛选或者细胞球之间接触形成体外类器官模型)。

进一步的，在本发明的一典型实施案例中，可以利用前述三维细胞培养芯片进行表达多重生长因子的MSC胶原水凝胶支架的制作，其可以包括如下步骤：

1)根据所需培养细胞种类的不同，可以在业界已知的数据库内查询获得相关适于细胞培养、增殖分化的细胞因子。之后还可以通过PCR扩增、载体构建等业界已知的方法获得包含因子基因的慢病毒载体pLVX–puro。

2)参阅《细胞生物学实验手册》(ISBN：9787030203830)等工具书，通过慢病毒转染法将相关因子基因整合到MSC基因组上，得到稳定表达相关因子的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)。

3)连续培养至细胞密度为95％以上，移出培养基后立即冻干。将体积比为1：1的冻干MSC支架和基质胶(matrigel)进行混合，制作成包含生长因子的MSC基质胶支架(亦可认为是改良的基质)。

4)取以上获得改良的基质胶约100～200μl，缓慢滴加至前述三维细胞培养芯片上直到将细胞区域(前述图纹结构)全部覆盖。

5)放置于细胞培养箱中孵育15min，使基质胶充分固化。取出，加入适量(覆盖住基质胶即可)细胞培养完全培养基持续培养并进行后续试验分析，这些后处理工序可以参考本领域的工具书(如前述的《细胞生物学实验手册》)实施，此处不再赘述。

应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (22)

1.一种基于软光刻技术的三维细胞培养芯片的制备方法，其特征在于包括：

采用软光刻技术制作具有设定图案结构的掩模；

以液态高分子化合物或高分子化合物溶液均匀覆盖所述掩模，并形成具有设定厚度的液层；

使所述液层固化，之后移除掩模，获得印章，所述印章的印面具有设定立体结构；

以所述印章的印面与修饰剂接触，使所述修饰剂以可脱离方式附着在所述印面上；

以所述印面与选定基底表面接触，之后将所述印章从选定基底上移离，从而使至少部分修饰剂脱离所述印面而附着在所述选定基底表面并形成图纹结构，所述图纹结构包括由复数个图案组成的阵列，所述图案至少能够吸附单细胞，从而获得所述三维细胞培养芯片。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于具体包括：在基片上涂覆光刻胶，之后烘烤、曝光，并再次烘烤，其后显影，制得所述掩模；和/或，所述掩模的厚度为7μm～15μm。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述印章印面的设定立体结构由一个以上凸设于所述印章印面的突出部和/或一个以上凹设于所述所述印章印面的下凹部组成。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于包括：至少将所述印章的印面完全浸渍于液态的修饰剂或修饰剂溶液中，之后取出，使所述修饰剂以可脱离方式附着在所述印面上。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于包括：在室温条件下，将所述印章的印面完全浸渍于液态的修饰剂或修饰剂溶液中，保持10min以上，之后取出，洗涤、干燥，使所述修饰剂以可脱离方式附着在所述印面上。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述高分子化合物包括能够光固化和/或热固化的高分子化合物；优选的，所述高分子化合物包括高分子有机硅化合物，优选的，所述高分子化合物包括聚二甲基硅氧烷。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述图纹结构中，任一图案的面积由所需的吸附细胞面积决定，而任意两个相邻图案的距离由所需的相邻细胞的间距决定；优选的，相邻图案之间的间距在30μm以上，尤其优选为30μm～100μm；优选的，所述图案用以吸附细胞的面积为5μm×5μm～15μm×15μm；和/或，所述选定基底表面上除所述图纹结构所在区域之外的其它区域具有排斥细胞的特性；和/或，所述图纹结构的厚度为7～15μm。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于包括：先对所述选定基底进行表面处理，以至少使所述选定基底表面具有排斥细胞的特性，之后将所述印面与选定基底表面接触，从而在所述选定基底表面形成所述图纹结构；优选的，所述表面处理包括等离子体处理或者化学修饰处理；优选的，所述化学修饰处理用的试剂包括聚苯乙烯磺酸钠或硅烷化的聚乙二醇。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于包括：将印面附着有修饰剂的印章一次性放置在所述选定基底上，使所述印面与选定基底表面在设定压力下接触并保持30s以上，然后移除所述印章，从而在所述选定基底表面形成所述图纹结构。

10.根据权利要求1、4或5所述的制备方法，其特征在于：所述修饰剂包括能够在选定基底表面修饰活性氨基的试剂；优选的，所述修饰剂包括丙基多巴乙酰胺、对氨基马尿酸、聚醚酰亚胺或纤维连接蛋白。

11.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述选定基底表面为平整面。

12.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述选定基底包括透明基底；优选的，所述选定基底包括玻璃片。

13.由权利要求1-12中任一项所述方法制备的三维细胞培养芯片。

14.一种三维细胞培养芯片，其特征在于包括：

选定基底；

以及，形成于所述选定基底表面的图纹结构，所述图纹结构包括由复数个图案组成的阵列，所述图案由至少能够促使单细胞附着的修饰剂组成。

15.根据权利要求14所述的三维细胞培养芯片，其特征在于：所述图纹结构中，任一图案的面积由所需的吸附细胞面积决定，而任意两个相邻图案的距离由所需的相邻细胞的间距决定，优选的，相邻图案之间的间距在30μm以上，尤其优选为30μm～100μm；优选的，所述图案用以吸附细胞的面积为5μm×5μm～15μm×15μm；和/或，所述图纹结构的厚度为7～15μm；和/或，所述选定基底表面上除所述图纹结构所在区域之外的其它区域具有排斥细胞的特性。

16.一种细胞培养方法，其特征在于包括：

提供权利要求13-15中任一项所述的三维细胞培养芯片；

在所述三维细胞培养芯片表面施加细胞悬浮液，再置于细胞培养环境中进行细胞培养。

17.根据权利要求16所述的细胞培养方法，其特征在于还包括：

在完成细胞培养后，除去所述三维细胞培养芯片表面的培养基，并以新鲜培养基或者磷酸缓冲液润洗所述三维细胞培养芯片表面，去除多余的细胞，获得单细胞阵列。

18.根据权利要求16所述的细胞培养方法，其特征在于：所述细胞悬浮液中细胞总数为所述三维细胞培养芯片表面的图案数量的2～3倍。

19.一种三维支架的制作方法，其特征在于包括：

将能够稳定表达选定细胞因子的细胞在培养基中培养至所需的细胞密度，之后从培养基中移出，获得细胞支架；

将所述细胞支架与基质胶混合形成基质胶支架材料；

将所述基质胶支架材料施加到权利要求13-15中任一项所述三维细胞培养芯片的表面，并至少将所述选定基底表面的图纹结构完全覆盖，其后置入细胞培养环境中孵育至所述基质胶支架材料充分固化。

20.根据权利要求19所述的制作方法，其特征在于包括：将能够稳定表达选定细胞因子的细胞在培养基中培养至细胞密度＞95％，之后从培养基中移出、干燥，获得细胞支架。

21.由权利要求19-20中任一项所述方法制作的三维支架。

22.一种细胞培养方法，其特征在于包括：

提供权利要求21所述的三维支架；

以细胞培养完全培养基覆盖所述三维支架，并在细胞培养环境中持续培养。