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CN108079286B - 一种13价肺炎球菌多糖-蛋白结合物组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种13价肺炎球菌多糖-蛋白结合物组合物及其制备方法和应用 Download PDF

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CN108079286B CN201810053602.1A CN201810053602A CN108079286B CN 108079286 B CN108079286 B CN 108079286B CN 201810053602 A CN201810053602 A CN 201810053602A CN 108079286 B CN108079286 B CN 108079286B
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Abstract

本发明公开了一种13价肺炎球菌多糖‑蛋白结合物组合物及其制备方法和应用。所述组合物包括13种不同的肺炎球菌多糖‑蛋白结合物，其中每种肺炎球菌多糖‑蛋白结合物包含来自不同肺炎球菌血清型的荚膜多糖和载体蛋白，所述荚膜多糖来源于1型、3型、4型、5型、6A型、6B型、7F型、9V型、14型、18C型、19A型、19F型和23F型肺炎球菌，载体蛋白是单体纯度≥90％的TT。本发明提供的组合物经三期临床研究验证在2月龄‑5周岁人群均可诱导产生血清型特异的IgG抗体，其中在主要目标人群2‑6月龄经3针基础免疫后，所有血清型特异性IgG浓度≥0.35μg/ml的比例均≥85％，经加强免疫后比例均≥95％。

Description

一种13价肺炎球菌多糖-蛋白结合物组合物及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于肺炎球菌多糖蛋白结合物技术领域，尤其涉及一种13价肺炎球菌多糖-蛋白结合物组合物及其制备方法和应用。
背景技术
肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)是全球婴幼儿中脑膜炎、肺炎和严重侵袭性疾病的主要病因，根据世界卫生组织发布的《肺炎球菌疫苗立场文件》，WHO预测全球每年5岁以下儿童死亡880万，其中因为肺炎球菌感染导致的儿童死亡为47.6万。发展中国家肺炎球菌疾病的发病率和死亡率均高于发达国家，且死亡病例主要出现在非洲、亚洲。我国每年5岁以下婴幼儿死于肺炎球菌疾病的人数超过3万人。
肺炎球菌根据荚膜多糖不同可以分为90个血清型，年龄、症状、疾病严重程度、地理位置和肺炎疫苗使用情况等因素均影响肺炎球菌血清型的分布。
研究表明，肺炎球菌荚膜多糖是肺炎球菌的主要保护性抗原。1977年，美国批准14价肺炎球菌多糖疫苗上市(1、2、3、4、6A、7F、8、9N、12F、14、18C、19F、23F、25F)，后来又在进一步监测肺炎球菌致病菌株的基础上开发出了23价肺炎球菌多糖疫苗，1983年23价肺炎球菌多糖疫苗被批准上市，23价肺炎球菌多糖疫苗2岁以上儿童、青少年、成人在老年人中均显示了预防肺炎球菌疾病的良好效果。但是由于肺炎球菌多糖属于T细胞-非依赖性抗原，婴幼儿对于肺炎球菌多糖的免疫应答很弱，惠氏公司(现为辉瑞子公司)成功研发了全球第一个肺炎球菌结合疫苗——7价肺炎球菌结合疫苗(Prevnar)，并于2000年经FDA批准上市。
7价肺炎球菌结合疫苗仅含有来自血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的荚膜多糖，每种多糖与CRM197(Cross reacting material 197)载体蛋白结合，由于该疫苗包括血清型别较少，以及其血清型选型主要基于美国、欧洲肺炎球菌疾病流行病学数据，其在美国的覆盖率为86％，在欧洲的覆盖率为71％，而在亚洲地区仅有约38％的覆盖率。
在美国、欧洲婴幼儿广泛使用7价肺炎球菌结合疫苗免疫接种后，由4、6B、9V、14、18C、19F和23F引起的肺炎球菌疾病大幅度降低，而非疫苗血清型引起肺炎球菌疾病则呈现一定的上升。为提高疫苗保护率，葛兰素史克开发并上市了10价肺炎球菌结合疫苗(Synflorix)，其中较7价肺炎球菌结合疫苗增加了1、5、7F；惠氏开发并上市了13价肺炎球菌结合疫苗(Prevnar 13)，其中较7价肺炎球菌结合疫苗增加了1、3、5、6A、7F、19A。13价肺炎球菌结合疫苗在美国的覆盖率为92％，欧洲覆盖率为89％，在亚洲覆盖率为74％。
中国专利申请CN200680017776.8“多价肺炎球菌多糖－蛋白质缀合物组合物”，公开了一种制备13价肺炎球菌结合疫苗的方法，其所用的载体蛋白为CRM197，并采用还原胺化工艺进行结合物制备。中国专利申请CN200780051661.5“多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物组合物”公开了一种利用酸水解后在二价阳离子存在下用氧化剂反应活化多糖制备3型肺炎球菌多糖结合物的方法。
2000-2004年，安万特-巴斯德(现赛诺菲-巴斯德)在菲律宾开展的以破伤风类毒素、白喉类毒素为载体蛋白的11价肺炎球菌多糖结合疫苗3期临床研究，因未达到主要临床终点而失败(Marilla G.Lucero et.al Efficacy of an 11-Valent PneumococcalConjugate Vaccine Against Radiologically Confirmed Pneumonia Among ChildrenLess Than 2Years of Age in the Philippines:ARandomized,Double-Blind,Placebo-Controlled Trial，The Pediatric Infectious Disease Journal.28(6):455-462,JUN2009)。葛兰素史克研发的11价肺炎球菌多糖结合疫苗，分别采用白喉类毒素、不可分型流感嗜血杆菌蛋白D、破伤风类毒素作为载体蛋白，但其在临床试验中，对肺炎3型未达到保护效果，最终上市的Synflorix为不含有肺炎球菌3型的10价肺炎球菌结合疫苗。这都充分说明多价肺炎球菌多糖结合疫苗研发的技术难度非常高，截至目前，全球仅有辉瑞的13价肺炎球菌结合疫苗Prevenar 13与葛兰素史克的10价肺炎球菌结合疫苗Synflorix获批上市销售。
由于肺炎球菌引起疾病的主要致病血清型较多，需要在疫苗中含有足够的肺炎球菌多糖型别，疫苗才有足够的临床保护效果，根据已上市的7价肺炎球菌多糖结合疫苗和13价肺炎球菌多糖结合疫苗的免疫原性数据文献资料，13价肺炎球菌多糖结合疫苗中由于所含的血清型别较多，由于肺炎球菌多糖结合物抗原竞争抗原提呈细胞(antigen-presenting cell，APC)的因素，总体13价肺炎球菌多糖结合疫苗中的免疫原性比7价肺炎球菌多糖结合疫苗的免疫原性稍低。惠氏将13价肺炎球菌多糖结合疫苗中的肺炎球菌多糖含量与7价肺炎球菌多糖结合疫苗中相应血清型的多糖含量提高了10％，但仍然在临床研究中呈现13价肺炎球菌多糖结合疫苗免疫原性稍低于7价肺炎球菌多糖结合疫苗。
根据WHO发布的肺炎球菌结合疫苗制造和检定规程，根据7价肺炎球菌多糖结合疫苗的3项独立3期临床试验的临床保护数据，得到血清型特异IgG抗体0.35μg/ml的阈值，≥0.35μg/ml的血清型特异IgG浓度表示接种者对该血清型有免疫力。疫苗接种后血清型特异IgG浓度≥0.35μg/ml的比例(反应率)是评价肺炎球菌多糖结合疫苗免疫原性的关键指标。
惠氏公司的13价肺炎球菌多糖结合疫苗(Prevenar13)先将肺炎球菌多糖用高碘酸盐氧化产生末端醛基，然后采用还原胺化方法将肺炎球菌寡糖与CRM197结合制备，在其提交FDA生物制品审评中心的材料显示，在其6096A1-004号关键三期临床研究中，对于2-6月龄婴儿，每剂间隔2个月完成3剂初免疫后，有三个血清型(分别为6A型、9V型、3型)特异IgG≥0.35μg/ml的反应率未达到与7价肺炎球菌结合疫苗的非劣效，三个血清型的反应率差的95％置信区间下限分别为-10.9％，-12.4％，-36.2％，其中对肺炎球菌3型多糖特异IgG≥0.35μg/ml的反应率仅为63.5％。
惠氏13价肺炎球菌结合疫苗与7价肺炎球菌结合疫苗3针免疫后血清型IgG≥0.35μg/mL的反应率比较如表I所示。
表I
Figure BDA0001553085370000031
Figure BDA0001553085370000041
N：该血清型有IgG浓度测定值的数量
n：该血清型IgG≥0.35μg/mL的数量
反应率＝n/N×100％
率差＝13价结合疫苗反应率–PCV7对应血清型反应率，对于新增血清型，采用PCV7中反应率最低的6B计算
惠氏13价肺炎球菌结合疫苗与7价肺炎球菌结合疫苗4针免疫后血清型IgG≥0.35μg/mL的反应率比较如表II所示。
表II
Figure BDA0001553085370000042
N：该血清型有IgG浓度测定值的数量
n：该血清型IgG≥0.35μg/mL的数量
反应率＝n/N×100％
率差＝13价结合疫苗反应率–PCV7对应血清型反应率，对于新增血清型，采用PCV7中反应率最低的19F的98.7％计算。
由表I和表II可知，2-6月龄婴儿，在按照2，4，6的免疫程序接种三剂惠氏13价肺炎球菌多糖结合疫苗后，其对肺炎球菌3型的IgG≥0.35μg/ml的反应率差的95％置信区间下限为-36.2％；在12-15月龄进行1剂加强免疫(共4剂)后，对肺炎球菌3型的IgG≥0.35μg/ml的比例仍未达到与7价肺炎球菌结合疫苗的非劣效，其IgG≥0.35μg/ml的反应率差的95％置信区间下限为--12.8％。
另外，肺炎球菌疫苗采用的载体蛋白破伤风类毒素(TT)为破伤风梭状芽孢杆菌经发酵后，经提取、精制、脱毒制备而得，根据《中国药典》2015版，制备疫苗的破伤风类毒素的纯度要求为≥1500Lf/mg蛋白氮，根据文献及生产破伤风类毒素的经验，生产获得的破伤风类毒素纯度一般在1500-3000Lf/mg蛋白氮，由此数据可以看出：不同批次的破伤风类毒素纯度有较大的差别，其中含有比例不小的杂蛋白。根据文献资料，现行药典工艺制备的破伤风类毒素其中的单体纯度仅在约55-70％。而如果采用含有较多杂蛋白的破伤风类毒素用于与肺炎球菌多糖结合，势必影响载体蛋白的效果和结合物中游离蛋白的含量，并进而影响肺炎球菌多糖结合物的免疫原性和安全性。
发明内容
本发明克服了现有13价肺炎球菌结合疫苗在2-6月龄婴儿中对肺炎球菌3型的特异IgG浓度≥0.35μg/ml反应率低的弱点以及惠氏公司13价肺炎球菌结合疫苗在我国仅批准用于2月龄-6月龄婴儿的局限，提供了一种13价肺炎球菌多糖-蛋白结合物组合物及其制备方法和应用，适合用于2月龄-5周岁婴幼儿预防肺炎球菌疾病。
本发明研制了包含肺炎球菌1型、3型、4型、5型、6A型、6B型、7F型、9V型、14型、18C型、19A型、19F型和23F型多糖的以破伤风类毒素为载体蛋白的13价肺炎球菌结合疫苗，并经随机双盲对照的3期临床试验证明可在2月龄-5岁诱导血清型特异性IgG抗体，按照免疫程序接种后对疫苗包含全部肺炎球菌血清型的特异IgG浓度≥0.35μg/ml的比例均≥85％，可用于2月龄-5周岁婴幼儿预防肺炎球菌疾病。
本发明的技术方案如下：一种13价肺炎球菌多糖-蛋白结合物组合物，所述组合物包括13种不同的肺炎球菌多糖-蛋白结合物，每种肺炎球菌多糖-蛋白结合物包含来自不同肺炎球菌血清型的荚膜多糖和载体蛋白，所述荚膜多糖分别来源于1型、3型、4型、5型、6A型、6B型、7F型、9V型、14型、18C型、19A型、19F型和23F型肺炎球菌，所述载体蛋白是单体纯度≥90％的破伤风类毒素载体蛋白。
进一步地，对于分子大小在Sepharose CL-4B柱上检测KD值＜0.20的肺炎球菌荚膜多糖，在活化、衍生前采用超声波降解或70-85℃高温水解工艺将多糖分子大小降低到在Sepharose CL-4B柱上检测KD值为0.20-0.50之间。
进一步地，所述荚膜多糖中3型、5型、9V型、14型采用溴化氰活化；1型、4型、6A型、6B型、7F型、18C型、19A型、19F型和23F型采用CDAP活化，活化后用己二酸二酰肼(ADH)进行衍生。
进一步地，所述组合物中球菌多糖-蛋白结合物的质量比如下：1型肺炎球菌多糖蛋白结合物0.15-0.60：3型肺炎球菌多糖蛋白结合物0.40-0.90：4型肺炎球菌多糖蛋白结合物0.30-1.10：5型肺炎球菌多糖蛋白结合物0.10-0.30：6A型肺炎球菌多糖蛋白结合物0.10-0.50：6B型肺炎球菌多糖蛋白结合物0.20-0.65：7F型肺炎球菌多糖蛋白结合物0.15-0.45：9V型肺炎球菌多糖蛋白结合物0.10-0.50：14型肺炎球菌多糖蛋白结合物0.15-0.70：18C型肺炎球菌多糖蛋白结合物0.30-0.60：19A型肺炎球菌多糖蛋白结合物0.10-0.65：19F型肺炎球菌多糖蛋白结合物0.10-0.40：23F型肺炎球菌多糖蛋白结合物0.25-0.65。
进一步地，所述组合物中各型肺炎球菌多糖-蛋白结合物游离多糖含量均≤35％，游离蛋白含量均≤5％。
本发明第二方面，还提供所述13价肺炎球菌多糖-蛋白结合物组合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)采用脱氧胆酸钠杀灭肺炎球菌，离心，去除菌体，经乙醇分级沉淀法提取肺炎球菌粗糖；
(2)肺炎球菌粗糖用饱和醋酸钠溶液溶解后，用苯酚提取，经超滤及分级乙醇沉淀后，收集沉淀，用无水乙醇、乙醚、丙酮洗涤后，真空抽干，即为肺炎球菌荚膜多糖；
(3)对Sepharose CL-4B上检测KD值＜0.2的各型肺炎球菌荚膜多糖，用氯化钠溶解后，用超声波或70-85℃高温水解至在Sepharose CL-4B上检测主峰KD值为0.20-0.50之间，获得降解的肺炎球菌多糖；
(4)分子量在Sepharose CL-4B上检测KD值在0.20-0.50的肺炎球菌多糖采用溴化氰或CDAP活化后，加入ADH衍生，超滤后浓缩为肺炎球菌多糖衍生物；
(5)采用Sephacryl S-300HR柱层析对破伤风类毒素进行纯化，浓缩后除菌过滤为破伤风类毒素载体蛋白；
(6)在EDAC(碳二亚胺)存在下，将肺炎球菌多糖衍生物与破伤风类毒素载体蛋白结合，透析过夜后，上Sepharose 4FF柱纯化，收集从V0到KD 0.2之间的结合物组分，除菌过滤后为肺炎球菌多糖-蛋白结合物原液；
(7)将13个型肺炎球菌多糖-蛋白结合物原液混匀后加入磷酸铝佐剂至终浓度1.0mg/ml，加入磷酸氢二钠、磷酸二氢钠及氯化钠溶液，加入灭菌注射用水至所需目标体积，混匀后分装。
本发明第三方面，还提供一种13价肺炎球菌多糖-蛋白结合物组合物在制备诱导对肺炎球菌多糖的体液免疫应答的药物或疫苗中的用途。
进一步地，所述药物或疫苗适用于2月龄-5周岁人群。
进一步地，其中肺炎球菌多糖-蛋白结合物组合物是单次0.5ml剂量，其经配制成每毫升含有：除了肺炎球菌6B型多糖为8.8-13.2μg外，其余血清型肺炎球菌多糖均为4.4-6.6μg；并且组合物中每毫升含有0.25mg铝元素的磷酸铝佐剂、8.5mg氯化钠、88.7μg磷酸二氢钠和38.0μg磷酸氢二钠。
进一步地，所述组合物中各型肺炎球菌多糖-蛋白结合物在磷酸铝佐剂上的吸附率在20-85％。
各型肺炎球菌荚膜多糖为重复单元组成的长链分子，其分子量较大，使得肺炎球菌多糖与载体蛋白的结合形成可制备疫苗的肺炎球菌多糖-蛋白结合物面临极大的技术挑战。细菌多糖与载体蛋白共价结合之后，由T细胞非依赖性抗原转化为T细胞依赖性抗原，而细菌多糖-蛋白结合物的免疫原性取决于细菌多糖的分子量大小、衍生结合工艺、载体蛋白、结合物纯化方法、结合物的质量控制标准以及佐剂等多重因素的影响。而这些因素之间是相互关联的，同时13个血清型肺炎球菌多糖具有完全不同的多糖重复单元，多糖重复单元上的取代基团也有较大的差异，这使得13价肺炎球菌多糖结合疫苗的工艺研究与质量标准研究的技术难度远远不只是13个型研究工作的相加。
细菌荚膜多糖是由多糖重复单元通过糖苷键链接的长链分子，研究表明细菌荚膜多糖的免疫原性与其分子大小直接相关，对于脑膜炎球菌多糖疫苗、伤寒Vi多糖疫苗、肺炎球菌多糖疫苗均将多糖分子大小作为关键控制指标，且制定了分子大小的下限以确保多糖疫苗的免疫原性。在世界卫生组织《肺炎球菌多糖疫苗规程》以及欧洲药典《肺炎球菌多糖疫苗》中均规定了肺炎球菌多糖的分子大小标准，其中1型、3型、4型、18C型、23F型均要求在Sepharose CL-4B上检测的KD值≤0.15，7F型、19F型要求在Sepharose CL-4B上检测的KD值均≤0.20，14型、19A型的KD值分别不高于0.30和0.45，另外5型、6B、9V需采用SepharoseCL-2B上检测的KD值分别不高于0.60、0.50、0.45。同时由于肺炎球菌的发酵及荚膜多糖产生受pH、温度、培养基、搅拌等条件的影响，每批次之间发酵纯化获得的肺炎球菌多糖分子量也存在一定的区别。
而本发明通过大量的工艺研究及动物免疫原性试验证明采用超声降解或70-85℃高温热水解将肺炎球菌多糖部分降解到在Sepharose CL-4B上检测的Kd值在0.20-0.50之后，再进行多糖的活化衍生，不但提高了工艺重复稳定性和结合物的过滤特性，并降低了柱层析纯化后的肺炎球菌多糖蛋白结合物中的游离多糖含量，同时提高了肺炎球菌多糖蛋白结合物在动物体内的免疫原性。
在本发明研制初期，进行了肺炎球菌多糖与多种载体蛋白的结合工艺比较，分别采用破伤风类毒素、单体纯度90％的破伤风类毒素、白喉类毒素、重组CRM197和重组乙肝表面抗原(rHBsAg)与各型肺炎球菌进行了结合，并在动物体内(新西兰大耳白)进行了免疫原性评价，结果表明：采用破伤风类毒素、单体纯度90％破伤风类毒素、白喉类毒素、重组CRM197作为载体蛋白均可以产生血清型特异的体液免疫应答，但以采用单体纯度90％破伤风类毒素为载体蛋白的抗体滴度GMT(几何平均滴度)最高，所以筛选单体纯度90％的破伤风类毒素作为13价肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗的载体蛋白。
但在本发明制备的疫苗经三期临床试验验证获得结果之前，国内外细菌多糖结合疫苗专家普遍认为采用破伤风类毒素作为多价肺炎球菌多糖结合疫苗的唯一载体蛋白难以取得成功，专家们普遍担心在3-5月龄(国外2-6月龄)纳入儿童免疫规划的吸附无细胞百白破疫苗中含有的破伤风类毒素成分以及接种吸附无细胞百白破疫苗后产生的抗破伤风类毒素抗体将对以破伤风类毒素为载体蛋白的多价肺炎球菌多糖结合疫苗的免疫原性产生较大的免疫干扰和抑制，从而难以达到预期效果。
在国际疫苗厂家的肺炎球菌多糖结合疫苗研究中，惠氏采用白喉毒素无毒性突变体CRM197作为载体蛋白，赛诺菲-巴斯德采用破伤风类毒素、白喉类毒素作为载体蛋白(3期临床试验未获成功)，GSK采用破伤风类毒素、白喉类毒素、不可分型流感嗜血杆菌蛋白D作为载体蛋白(其中3型在临床试验中未获成功，推出不含3型的10价肺炎球菌多糖结合疫苗)。在惠氏的13价肺炎球菌结合疫苗在2-6月龄进行的关键临床研究中表明，接种3剂、4剂后，对肺炎球菌3型特异的IgG≥0.35μg/ml的反应率均没有达到对惠氏7价肺炎球菌结合疫苗的非劣效。
在2-6月龄主要目标人群提高肺炎球菌3型结合物免疫原性是多价肺炎球菌结合疫苗成功研发的关键技术难点，本发明的肺炎球菌多糖结合物组合物的突出特点采用在Sepharose CL4B上KD0.2-0.5的多糖分别用溴化氰和CDAP进行活化、ADH衍生，然后与单体纯度大于90％的破伤风类毒素载体蛋白结合，经柱层析获得单价肺炎球菌多糖蛋白结合物，各型肺炎球菌多糖蛋白结合物采用合适配比混合后，加入磷酸铝佐剂以及辅料氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠后按照每剂0.55ml分装为13价肺炎球菌多糖结合疫苗成品。经3期临床试验证明，在2-6月龄婴儿，采用间隔1个月或间隔两个月的3针免疫程序后，肺炎球菌3型的免疫原性达到与其他血清型的同等水平，对肺炎球菌3型特异的IgG≥0.35μg/ml的反应率均≥90％，经加强免疫后全部血清型特异IgG≥0.35μg/ml的反应率均≥97％，全部13个血清型均达到与惠氏7价肺炎球菌结合疫苗的同样效果，与目前全球唯一获批上市的辉瑞13价肺炎球菌多糖结合疫苗相比具有极显著的临床优势。同时，本发明制备的疫苗经三期临床验证在7-11月龄，12-23月龄，2-5岁均可达到满意的体液免疫应答，可以克服惠氏公司13价肺炎球菌多糖疫苗在我国仅批准用于2月龄-6月龄婴儿的局限性。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明提供了使用Sephacryl S-300HR柱层析对符合《中国药典》2015版要求的破伤风类毒素进行进一步纯化，去除比目标蛋白分子量更大和更小的杂蛋白，获得HPLC单体纯度大于90％的破伤风类毒素载体蛋白，使用单体纯度大于90％的破伤风类毒素作为载体蛋白与肺炎球菌多糖结合，有利于提高肺炎球菌多糖蛋白结合物的免疫原性同时降低结合物中的游离蛋白、游离多糖含量。
本发明制备的13价肺炎球菌多糖结合物组合物，在3期临床试验中证明，对于2-6月龄婴儿，无论采用2、4、6的初免程序，还是3、4、5的初免程序，3针免疫后对所有血清型IgG≥0.35μg/ml的反应率均≥90％，在经12-15月龄加强免疫后，对所有血清型IgG≥0.35μg/ml的反应率均≥97％，且所有血清型均达到与7价肺炎球菌结合疫苗同样的效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明并不局限于以下技术方案。
实施例1破伤风类毒素载体蛋白的制备
菌种编号为CMCC 64008的破伤风梭状芽孢杆菌，来源于中国生物制品检定所医学细菌保藏管理中心。用上述菌种建立原始种子库、主代种子库和工作种子库。原始种子批为第0代，从原始种子批传2代为主代种子批，从主代种子批传2代为工作种子批。开启工作种子批菌种，接种于半固体培养基，35℃，48小时扩增培养，经传代3代制成生产用种子。按表1中配方配置破伤风产毒培养基，经高压蒸汽灭菌后使用。
表1破伤风产毒培养基配方
序号 物料名称 100mL配制量所需数量
1 牛肉胃酶消化液(总氮) 1克
2 乳酪消化液(总氮) 1克
3 醋酸钠 4克
4 磷酸氢二钠 1克
5 磷酸二氢钾 1克
6 甘油 60mL
7 葡萄糖 3克
8 酵母浸粉 5克
9 三氯化铁 0.3克
生产用种子接种于发酵罐中，于35℃条件下，在破伤风产毒培养基中培养65小时。培养液中加入甲醛溶液至终浓度为0.35％，于7000rpm、8℃条件下离心15min，收集上清液。
上清液用30kD超滤膜浓缩。浓缩液中加入硫酸铵至终浓度为16％，静置46小时。静置液在10000rpm、8℃条件下离心20min，收集上清。上清中加入硫酸铵至终浓度为12％，静置20小时。
静置液在10000rpm、8℃条件下离心15min收集沉淀。沉淀用注射用水溶解。沉淀溶解液在10000rpm、8℃条件下离心15min收集上清。上清液用30kD超滤膜、50倍体积的注射用水超滤浓缩。超滤浓缩液为破伤风毒素。
破伤风毒素中加入NaCl至终浓度为0.85％，加入甲醛溶液至终浓度为0.3％，于37℃条件下静置36天进行脱毒。脱毒后的破伤风毒素用30kD超滤膜、10倍体积的注射用水超滤浓缩，超滤浓缩液为破伤风类毒素。
经检定合格的破伤风类毒素，经30kD超滤膜浓缩后，上样于0.2mol/L NaCl平衡的Sephacryl S-300HR 50/100柱(柱高95厘米)，上样体积95ml，用0.2mol/L NaCl洗脱，在与静脉注射丙种球蛋白洗脱相同的洗脱体积处收集目标峰，经30kD超滤膜浓缩后，除菌过滤，经检定合格后即为破伤风类毒素载体蛋白原液。用TSK gel G3000SWXL柱在高效液相系统测定破伤风类毒素载体蛋白的单体纯度，流动相为0.2mol/L Na2HPO4-NaH2PO4，pH7.0，流速1.0ml/min，检测波长280nm，按峰面积积分法计算破伤风载体蛋白单体纯度，结果如表2所示。
表2破伤风载体蛋白原液检测结果
Figure BDA0001553085370000121
实施例2肺炎球菌1型、3型、4型、5型、6B型、7F型、18C型、19A型多糖的降解
肺炎球菌1型、3型、4型、5型、6B型、7F型、18C型、19A型多糖，分别用0.2mol/L的NaCl溶解为2-8mg/ml，配制为溶液；分别置于冰浴条件预冷；于冰浴条件下，进行超声波处理，超声波功率为350～400W，超声3秒，暂停5秒的条件下，超声2-20分钟。各型超声条件如表3所示。
表3多糖超声工艺参数
超声时间
1型多糖 5
3型多糖 10
4型多糖 8
5型多糖 2
6B型多糖 6
7F型多糖 15
18C型多糖 20
19A型多糖 12
超声降解后的多糖采用Sepharose CL-4B XK16/100柱测定主峰KD值，流动相为0.9％氯化钠，流速0.3ml/min，收集4.5ml/15min/管。用相应血清型抗血清进行多糖鉴别试验，结果如表4所示。
表4肺炎球菌1型、3型、4型、5型、6B型、7F型、18C型、19A型多糖超声降解后检
测结果
Figure BDA0001553085370000131
实施例3肺炎球菌6A型、9V型、14型、19F型、23F型多糖的降解
肺炎球菌6A型、9V型、14型、19F型、23F型多糖，分别用0.2mol/L的NaCl溶解为2-8mg/ml，配制为溶液；分别置于恒温设备内，控制温度70℃-85℃，时间0.5-2h，取出自然冷却。每型水解条件表5所示。
表5多糖水解工艺参数
控制温度(℃) 水解时间(h)
6A型多糖 70 1.5
9V型多糖 80 1.0
14型多糖 85 0.5
19F型多糖 75 1.0
23F型多糖 70 2
高温降解后的多糖采用Sepharose CL-4B XK16/100柱测定主峰KD值，流动相为0.9％氯化钠，流速0.3ml/min，收集4.5ml/15min/管。用相应血清型抗血清进行多糖鉴别试验，结果如表6所示。
表6肺炎球菌6A型、9V型、14型、19F型、23F型多糖高温降解后检测结果
Figure BDA0001553085370000132
Figure BDA0001553085370000141
实施例4肺炎球菌多糖及部分降解的肺炎球菌多糖的Sepharose CL-4B分子大小测定
Sepharose CL-4B凝胶装填于XK16/100柱，柱高90厘米，采用0.9％氯化钠溶液作为洗脱液以0.30ml/min的流速进行平衡。
在充分平衡后，上样蓝色葡聚糖2000与细胞色素C配置的混合样品，同时启动分布收集器，收集4.5ml/15min/管，通过测定每管在260nm和370nm的光吸收值测定层析柱的V0与Vi，260nm的第一个峰对应V0，370nm的最高吸收峰对应Vi。
肺炎球菌多糖或部分降解的肺炎球菌多糖上样1.0ml，同时启动分布收集器，0.3ml/min洗脱，收集4.5ml/15min/管。采用蒽酮法测定每管中多糖浓度，绘制洗脱曲线，从洗脱曲线多糖浓度最高峰得到洗脱体积Ve。
根据公式计算分配系数KD；
KD＝(Ve-V0)/(Vi-V0)。
实施例5 3型、5型、9V型、14型降解多糖活化衍生(溴化氰活化)
分别取肺炎球菌3型、5型、9V型、14型降解多糖各150mg，分别按多糖：溴化氰为1:0.5～1:1的质量比加入溴化氰，控制pH10.5±0.5反应10～30min，然后再分别加入800mg的1,6-己二酰肼，维持pH8.5±0.5反应30～60min，用10KD的超滤膜超滤浓缩，即分别制得肺炎球菌3型、5型、9V型、14型多糖-己二酰肼衍生物，溴化氰活化衍生后的检测结果如表7所示。
表7溴化氰活化衍生后的检测结果
Figure BDA0001553085370000142
Figure BDA0001553085370000151
实施例6 1型、4型、6A型、6B型、7F型、18C型、19A型、19F型和23F型降解多糖的活化衍生(CDAP活化)
分别取肺炎球菌各150mg，分别按多糖：CDAP为1:0.2～1:1的质量比加入CDAP，控制pH9.5±0.5反应2～15min，然后再分别加入800mg的1,6-己二酰肼，维持pH8.5±0.5反应30～60min，用10KD的超滤膜超滤浓缩，即分别制得肺炎球菌型、4型、6A型、6B型、7F型、18C型、19A型、19F型和23F型多糖-己二酰肼衍生物，检测结果如表8所示。
表8CDAP活化衍生后的检测结果
项目 衍化率(％) 衍生物K<sub>D</sub>值
1型肺炎球菌多糖衍生物 4.85 0.24
4型肺炎球菌多糖衍生物 3.67 0.32
6A型肺炎球菌多糖衍生物 3.07 0.32
6B型肺炎球菌多糖衍生物 2.53 0.48
7F型肺炎球菌多糖衍生物 4.16 0.36
18C型肺炎球菌多糖衍生物 4.57 0.36
19A型肺炎球菌多糖衍生物 6.55 0.40
19F型肺炎球菌多糖衍生物 4.13 0.36
23F型肺炎球菌多糖衍生物 2.03 0.40
实施例7肺炎球菌多糖-蛋白结合物制备
在冰水浴下，分别取各型肺炎球菌多糖-AH衍生物，按多糖-AH衍生物：破伤风类毒素为1：0.8-1：1.2的质量比加入破伤风类毒素载体蛋白，加入0.2mol/L盐酸调节体系pH为5.5±0.5，加入EDAC至终浓度0.01～0.1mg/ml，反应2-4小时。反应结束后，透析过夜。上样于Sepharose 4FF BPG200/950柱，洗脱液为0.2mol/L氯化钠，收集Kd 0.2以前的组分，经0.22微米除菌过滤后，为肺炎球菌多糖-蛋白结合物原液，检测结果如表9所示。
表9各型肺炎球菌多糖-蛋白结合物原液检测结果
Figure BDA0001553085370000161
实施例8含6B型多糖4.4微克，其他各型多糖2.2微克的13价肺炎球菌多糖结合疫苗半成品配制、分装
1、组方
本组合物每0.5ml(剂)中除了肺炎球菌6B型多糖为4.4μg外，其余血清型肺炎球菌多糖均为2.2μg；0.125mg铝元素的磷酸铝佐剂；4.25mg氯化钠；44.35μg磷酸二氢钠；19.0μg磷酸氢二钠。
2、制备
⑴制备辅料储液按配方量称取药用级氯化钠于容器中，干烤灭菌去内毒素；按配方量称取药用级磷酸盐(磷酸二氢钠、磷酸氢二钠)于另一容器中，干烤灭菌去内毒素；向容器中加入配方量注射用水，混匀，高压灭菌，得辅料储液；放置2-8℃，待用；
⑵量取配方量各型结合物原液，混匀，得结合物混合液；
⑶将配方量磷酸铝佐剂、磷酸盐缓冲液储液(pH6.5)、氯化钠储液、注射用水，混合均匀，得辅料混合液；
⑷将结合物混合液搅拌中泵入到辅料混合液，混匀，即为半成品
3、分装
无菌条件下按每瓶(支)0.55ml体积分装至西林瓶或预灌封注射器。
实施例9含6B型多糖6.6微克，其他各型多糖3.3微克的的13价肺炎球菌多糖结合疫苗半成品配制、分装
1、组方
本组合物每0.5ml(剂)中除了肺炎球菌6B型多糖为6.6μg外，其余血清型肺炎球菌多糖均为3.3μg；0.125mg铝元素的磷酸铝佐剂；4.25mg氯化钠；44.35μg磷酸二氢钠；19.0μg磷酸氢二钠。
2、制备
⑴制备辅料储液按配方量称取药用级氯化钠于容器中，干烤灭菌去内毒素；按配方量称取药用级磷酸盐(磷酸二氢钠、磷酸氢二钠)于另一容器中，干烤灭菌去内毒素；向容器中加入配方量注射用水，混匀，高压灭菌，得辅料储液；放置2-8℃，待用；
⑵量取配方量各型结合物原液，混匀，得结合物混合液；
⑶将配方量磷酸铝佐剂、磷酸盐缓冲液储液(pH6.5)、氯化钠储液、注射用水，混合均匀，得辅料混合液；
⑷将结合物混合液搅拌中泵入到辅料混合液，混匀，即为半成品
3、分装
无菌条件下按每瓶(支)0.55ml体积分装至西林瓶或预灌封注射器。
实施例10含6B型多糖5.5微克，其他各型多糖2.75微克的的13价肺炎球菌多糖结合疫苗半成品配制、分装
1、组方
本组合物每0.5ml(剂)中除了肺炎球菌6B型多糖为5.5μg外，其余血清型肺炎球菌多糖均为2.75μg；0.125mg铝元素的磷酸铝佐剂；4.25mg氯化钠；44.35μg磷酸二氢钠；19.0μg磷酸氢二钠。
2、制备
⑴制备辅料储液按配方量称取药用级氯化钠于容器中，干烤灭菌去内毒素；按配方量称取药用级磷酸盐(磷酸二氢钠、磷酸氢二钠)于另一容器中，干烤灭菌去内毒素；向容器中加入配方量注射用水，混匀，高压灭菌，得辅料储液；放置2-8℃，待用；
⑵量取配方量各型结合物原液，混匀，得结合物混合液；
⑶将配方量磷酸铝佐剂、磷酸盐缓冲液储液(pH6.5)、氯化钠储液、注射用水，混合均匀，得辅料混合液；
⑷将结合物混合液搅拌中泵入到辅料混合液，混匀，即为半成品
3、分装
无菌条件下按每瓶(支)0.55ml体积分装至西林瓶或预灌封注射器。
实施例11 13价肺炎球菌多糖结合疫苗成品中各型肺炎球菌多糖结合物吸附率的测定
取13价肺炎球菌多糖结合疫苗成品12瓶，合并后，8000g离心5分钟，取上清，精密量取5.0ml，加入贝克曼库尔特公司稀释液6ml，稀释倍数2.2倍，为待测样品1。
取13价肺炎球菌多糖结合疫苗成品11瓶，合并后，精密量取5.0ml，加入0.25ml0.3mol/LNaOH溶液，混匀10秒钟后，加入0.25ml 0.1mol/L柠檬酸溶液，再加入贝克曼库尔特公司稀释液5.5ml，稀释倍数2.2倍，为待测样品2。
应用免疫化学分析系统使用速率比浊法测定待测样品1与待测样品2中各型多糖的含量，各重复测定3次，取平均值计算。所用肺炎球菌多糖标准血清购自丹麦血清研究所，所用肺炎球菌多糖标准品购自ATCC(美国典型培养物保藏中心)。
某型肺炎球菌多糖结合物的吸附率＝(待测样品2中的某型肺炎球菌多糖浓度–待测样品1中的某型肺炎球菌多糖浓度)/待测样品2中的某型肺炎球菌多糖浓度×100％，检测结果如表10所示。
表10 13价肺炎球菌多糖结合疫苗成品中各型肺炎球菌多糖结合物的吸附率检测结果
型别 吸附率(％)
1型肺炎球菌多糖结合物 37.4％
3型肺炎球菌多糖结合物 31.5％
4型肺炎球菌多糖结合物 22.4％
5型肺炎球菌多糖结合物 28.6％
6A型肺炎球菌多糖结合物 20.2％
6B型肺炎球菌多糖结合物 36.9％
7F型肺炎球菌多糖结合物 65.1％
9V型肺炎球菌多糖结合物 39.8％
14型肺炎球菌多糖结合物 83.2％
18C型肺炎球菌多糖结合物 33.5％
19A型肺炎球菌多糖结合物 34.1％
19F型肺炎球菌多糖结合物 25.0％
23F型肺炎球菌多糖结合物 38.2％
实施例12 13价肺炎球菌多糖结合疫苗在2月龄-5岁婴幼儿中免疫的免疫原性效果
以惠氏公司生产的7价肺炎球菌结合疫苗Prevenar作为对照疫苗，按随机、盲法、同类疫苗对照在2月龄-5岁婴幼儿考察本发明制备的13价肺炎球菌多糖结合疫苗的免疫原性与安全性(药物临床试验登记和信息公示平台临床登记号：CTR20160188)。
13价肺炎球菌多糖结合疫苗Ⅲ期临床试验总入组人数2760例，其中，2月龄(最小6周龄)-6月龄共1560例，试验组1040例，对照组520例；7-11月龄共400例，试验组与对照组分别为200例；12-23月龄共400例，试验组与对照组分别为200例；24月龄-5岁共400例，试验组与对照组分别为200例，免疫程序如表11所示。
表11临床试验分组、接种人数以及免疫程序
Figure BDA0001553085370000191
Figure BDA0001553085370000201
*其中试验组2不低于10％的受试者可于6周龄入组接种第1剂13价肺炎球菌多糖结合疫苗，于第14、22周龄完成基础免疫程序接种，并于12-15月龄完成加强免疫接种。
在第一剂免疫前和基础免疫后30天分别采集受试者静脉血不少于3.5ml；需加强免疫的受试者，还需在加强免疫后30天采集静脉血不少于3.5ml。通过检测13个肺炎球菌血清型特异性IgG抗体，比较试验疫苗和对照疫苗免疫后各血清型特异性IgG抗体浓度≥0.35μg/ml的受试者比例。
临床试验免疫原性结果如下：
(1)2-6月龄试验组1免疫原性比较结果如表12所示。
表12 3,4,5月龄免疫组3针免疫后(基础免疫)IgG抗体浓度≥0.35μg/ml的反应率比较
Figure BDA0001553085370000202
可以看出，本发明制备的13价肺炎球菌结合疫苗按3、4、5月龄免疫三针后，所有血清型的反应率均大于90％。
表13 3,4,5月龄免疫组4针免疫后(加强免疫)IgG抗体浓度≥0.35μg/ml的反应率比较
Figure BDA0001553085370000211
由表13可以看出，本发明制备的13价肺炎球菌结合疫苗按3、4、5月龄免疫三针，在12-15月龄加强一剂后，所有血清型的反应率均大于97％
(2)2-6月龄试验组2免疫原性比较结果如表14所示。
表14 2,4,6月龄免疫组3针免疫后(基础免疫)IgG抗体浓度≥0.35μg/ml的反应率比较
Figure BDA0001553085370000212
可以看出，本发明制备的13价肺炎球菌结合疫苗按2、4、6月龄免疫三针后，所有血清型的反应率均大于90％。
表15 2,4,6月龄免疫组4针免疫后(加强免疫)IgG抗体浓度≥0.35μg/ml的反应率比较
Figure BDA0001553085370000213
Figure BDA0001553085370000221
可以看出，本发明制备的13价肺炎球菌结合疫苗按2、4、6月龄免疫三针，在12-15月龄加强一剂后，所有血清型的反应率均大于97％。
(3)7-11月龄免疫原性比较结果
表16 7-11月龄2针免疫后(基础免疫)IgG抗体浓度≥0.35μg/ml的反应率比较
Figure BDA0001553085370000222
可以看出，本发明制备的13价肺炎球菌结合疫苗在7-11月龄婴儿免疫2针后，所有血清型的反应率均大于90％。
表17 7-11月龄3针免疫后(加强免疫)IgG抗体浓度≥0.35μg/ml的反应率比较
Figure BDA0001553085370000223
Figure BDA0001553085370000231
可以看出，本发明制备的13价肺炎球菌结合疫苗在7-11月龄婴儿免疫2针，12-15月龄加强一剂后，所有血清型的反应率均大于93％。
(4)12-23月龄免疫原性比较
表18 12-23月龄2针免疫后IgG抗体浓度≥0.35μg/ml的反应率比较
Figure BDA0001553085370000232
可以看出，本发明制备的13价肺炎球菌结合疫苗在12-23月龄幼儿免疫2针后，所有血清型的反应率均大于96％。
(5)24月龄-5岁免疫原性比较
表19 24月龄-5岁1针免疫后IgG抗体浓度≥0.35μg/ml的反应率比较
Figure BDA0001553085370000233
Figure BDA0001553085370000241
可以看出，本发明制备的13价肺炎球菌结合疫苗在24月龄-5周岁儿童免疫1针后，所有血清型的反应率均大于88％。

Claims (5)

1.一种13价肺炎球菌多糖-蛋白结合物组合物，其特征在于，所述组合物包括13种不同的肺炎球菌多糖-蛋白结合物，所述肺炎球菌多糖-蛋白结合物包含来自不同肺炎球菌血清型的荚膜多糖和载体蛋白，所述荚膜多糖分别来源于1型、3型、4型、5型、6A型、6B型、7F型、9V型、14型、18C型、19A型、19F型和23F型肺炎球菌，所述载体蛋白是单体纯度≥90%的破伤风类毒素载体蛋白；对于分子大小在Sepharose CL-4B柱上检测KD值＜0.2的各型肺炎球菌荚膜多糖在活化、衍生前采用超声波降解或70-85℃高温水解工艺将多糖分子大小降低到在Sepharose CL-4B柱上检测KD值为0.20-0.50；
所述荚膜多糖中3型、5型、9V型、14型采用溴化氰活化；1型、4型、6A型、6B型、7F型、18C型、19A型、19F型和23F型采用CDAP活化，活化后用己二酸二酰肼ADH进行衍生；衍生后将上述13种肺炎球菌多糖-蛋白结合物混匀后，加入磷酸铝佐剂、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠及氯化钠溶液；
所述组合物中球菌多糖-蛋白结合物的多糖与蛋白的质量比如下：
1型肺炎球菌多糖蛋白结合物0.15-0.60，
3型肺炎球菌多糖蛋白结合物0.40-0.90，
4型肺炎球菌多糖蛋白结合物0.30-1.10，
5型肺炎球菌多糖蛋白结合物0.10-0.30，
6A型肺炎球菌多糖蛋白结合物0.10-0.50，
6B型肺炎球菌多糖蛋白结合物0.20-0.65，
7F型肺炎球菌多糖蛋白结合物0.15-0.45，
9V型肺炎球菌多糖蛋白结合物0.10-0.50，
14型肺炎球菌多糖蛋白结合物0.15-0.70，
18C型肺炎球菌多糖蛋白结合物0.30-0.60，
19A型肺炎球菌多糖蛋白结合物0.10-0.65，
19F型肺炎球菌多糖蛋白结合物0.10-0.40，
23F型肺炎球菌多糖蛋白结合物0.25-0.65；
所述组合物中各型肺炎球菌多糖-蛋白结合物游离多糖含量均≤23%，游离蛋白含量均≤3%；
所述组合物中各型肺炎球菌多糖-蛋白结合物在磷酸铝佐剂上的吸附率在20-85%。
2.如权利要求1所述的13价肺炎球菌多糖-蛋白结合物组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
（1）采用脱氧胆酸钠杀灭肺炎球菌，离心，去除菌体，经乙醇分级沉淀法提取肺炎球菌粗糖；
（2）肺炎球菌粗糖用饱和醋酸钠溶液溶解后，用苯酚提取，经超滤及分级乙醇沉淀后，收集沉淀，用无水乙醇、乙醚、丙酮洗涤后，真空抽干，即为肺炎球菌荚膜多糖；
（3）对Sepharose CL-4B上检测KD值＜0.20的各型肺炎球菌荚膜多糖，用氯化钠溶解后，用超声波或70-85℃高温水解至在Sepharose CL-4B上检测主峰KD值为0.20-0.50之间，获得降解的肺炎球菌多糖；
（4）分子量在Sepharose CL-4B上检测KD值在0.20-0.50的肺炎球菌多糖采用溴化氰或CDAP活化后，加入ADH衍生，超滤后浓缩为肺炎球菌多糖衍生物；
（5）采用Sephacryl S-300 HR柱层析对破伤风类毒素进行纯化，浓缩后除菌过滤为破伤风类毒素载体蛋白；
（6）在EDAC存在下，将肺炎球菌多糖衍生物与破伤风类毒素载体蛋白结合，透析过夜后，上Sepharose 4FF 柱纯化，收集从V0到KD 0.2之间的结合物组分，除菌过滤后为肺炎球菌多糖-蛋白结合物原液；
（7）将13个型肺炎球菌多糖-蛋白结合物原液混匀后加入磷酸铝佐剂至终浓度1.0mg/ml，加入磷酸氢二钠、磷酸二氢钠及氯化钠溶液，加入灭菌注射用水至所需目标体积，混匀后分装。
3.如权利要求1所述的13价肺炎球菌多糖-蛋白结合物组合物在制备诱导对肺炎球菌多糖的体液免疫应答的疫苗中的用途。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述疫苗适用于2月龄-5周岁人群。
5.如权利要求3或4所述的用途，其特征在于，其中肺炎球菌多糖-蛋白结合物组合物是单次0.5ml剂量，其经配制成每毫升含有：除了肺炎球菌6B型多糖为8.8-13.2μg外，其余血清型肺炎球菌多糖均为4.4-6.6μg；并且组合物中每毫升含有0.25mg铝元素的磷酸铝佐剂、8.5mg氯化钠、88.7μg磷酸二氢钠和38.0μg磷酸氢二钠。
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Application publication date: 20180529

Assignee: Yuxi Walvax Biotechnology Co.,Ltd.

Assignor: WALVAX BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

Contract record no.: X2021530000001

Denomination of invention: The invention relates to a 13 valent pneumococcal polysaccharide protein conjugate composition, a preparation method and application thereof

Granted publication date: 20200731

License type: Common License

Record date: 20210309