[go: up one dir, main page]

CN108064129A - 玉米和大豆中复合性状基因座的位点特异性整合位点的产生和使用方法 - Google Patents

玉米和大豆中复合性状基因座的位点特异性整合位点的产生和使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108064129A
CN108064129A CN201580048807.5A CN201580048807A CN108064129A CN 108064129 A CN108064129 A CN 108064129A CN 201580048807 A CN201580048807 A CN 201580048807A CN 108064129 A CN108064129 A CN 108064129A
Authority
CN
China
Prior art keywords
site
target site
sites
corn plant
corn
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201580048807.5A
Other languages
English (en)
Inventor
A.M.吉干
郜会荣
Z-B.刘
J.穆蒂
D.波里奇
C.斯塞龙格
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pioneer Hi Bred International Inc
EIDP Inc
Original Assignee
Pioneer Hi Bred International Inc
EI Du Pont de Nemours and Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pioneer Hi Bred International Inc, EI Du Pont de Nemours and Co filed Critical Pioneer Hi Bred International Inc
Publication of CN108064129A publication Critical patent/CN108064129A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/46—Gramineae or Poaceae, e.g. ryegrass, rice, wheat or maize
    • A01H6/4684—Zea mays [maize]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
    • C12N15/8289—Male sterility
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPR]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measurement And Recording Of Electrical Phenomena And Electrical Characteristics Of The Living Body (AREA)
  • Inks, Pencil-Leads, Or Crayons (AREA)

Abstract

本发明提供了将位点特异性整合(SSI)的转基因靶位点和/或目的多核苷酸导入到植物基因组的基因组窗口中的双链断裂诱导剂的至少一个双链断裂靶位点中的组合物和方法。本发明还提供了在植物的基因组窗口中产生复合性状基因座的方法和组合物，该植物基因组窗口包含整合进至少双链断裂靶位点中的至少一个位点特异性整合的转基因靶位点。双链断裂靶位点可为但不限于锌指内切核酸酶、工程化内切核酸酶、大范围核酸酶、TALEN和/或Cas内切核酸酶的靶位点。所述植物的基因组窗口可包含至少一个目的基因座，诸如性状盒、转基因、突变基因、天然基因、编辑基因或位点特异性整合(SSI)靶位点。

Description

玉米和大豆中复合性状基因座的位点特异性整合位点的产生 和使用方法
本申请要求2014年9月12日提交的美国临时申请62/049465的权益，将所述文献全文以引用方式并入本文。
技术领域
本公开涉及植物分子生物学领域。具体地，本发明提供了用于改变植物基因组的方法和组合物。
通过EFS-WEB作为文本文件提交的序列表参考
所述序列表的正式文本经由EFS-Web以电子方式提交，它是ASCII格式的序列表，文件名为20150811_BB2355PCT_ST25.txt，创建于2015年8月11日，并且大小为879KB，与所述说明书同时提交。在这一ASCII格式的文件中包含的序列表为所述说明书的部分并且全文以引用方式并入本文。
背景技术
重组DNA技术已经使其能够将外来DNA序列插入到生物体的基因组中并改变生物体的内源性基因，因此改变生物体的表型。最常使用的植物转化方法是农杆菌(Agrobacterium)感染和粒子枪轰击(biolistic particle bombardment)，其中转基因以随机方式并以不可预测的拷贝数整合进植物基因组中。
已使用采用位点特异性重组系统的位点特异性整合技术以及其它类型的重组技术产生靶向插入多种生物体中的目的基因。用于插入或者修饰DNA序列的其它方法涉及通过导入侧接有与基因组靶标同源的序列的转基因DNA序列来进行的同源DNA重组。美国专利5,527,695描述了用靶向真核生物DNA的预定序列的DNA序列转化真核生物细胞。转化的细胞通过使用选择性标记来鉴定，该选择性标记作为所导入的DNA序列的一部分而被包含。当此类系统为目的序列的靶向插入提供可用的技术时，仍然需要改善这些系统并允许目的序列靶向插入到期望的基因组位置中的方法和组合物，从而在期望的整合位点附近堆积附加的目的多核苷酸，并且产生具有改变的基因组的能育植物，该改变的基因组包含位于植物基因组限定区域中的一个或多个位点特异性整合的转基因靶位点。
发明内容
本发明提供了将位点特异性整合(SSI)的转基因靶位点导入到植物基因组的基因组窗口中的双链断裂诱导剂的至少一个靶位点(称之为双链断裂靶位点或DSB靶位点)中的方法和组合物。本发明还提供了将目的多核苷酸导入到植物的基因组窗口中的双链断裂诱导剂的靶位点(诸如但不限于Cas9内切核酸酶)中的组合物和方法。本发明还提供了在植物的基因组窗口中产生复合性状基因座的方法和组合物，所述植物包含整合进至少一个双链断裂靶位点中的至少一个SSI的转基因靶位点。双链断裂靶位点可为但不限于锌指内切核酸酶靶位点、工程化内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点和Cas内切核酸酶靶位点。所述植物的基因组窗口可任选地包含至少一个目的基因座，诸如性状盒、转基因、突变基因、天然基因、编辑基因或位点特异性整合(SSI)靶位点。
组合物提供了在其基因组中具有基因组窗口的植物、植物部分、植物细胞或种子，该基因组窗口包含整合进至少一个双链断裂靶位点中的至少一个位点特异性整合(SSI)的转基因靶位点，其中所述基因组窗口侧接有(遗传上连接于)至少第一标记和至少第二标记。组合物还提供了在其基因组中具有基因组窗口的植物、植物部分或种子，该基因组窗口包含整合进至少一个双链断裂靶位点中的至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，其中所述至少一个转基因靶位点遗传上连接于至少第一遗传标记和第二遗传标记，其中所述第一遗传标记位于植物物理图谱上的第一位置与第二位置之间。组合物还提供了在其基因组中具有基因组窗口的植物、植物部分或种子，该基因组窗口包含至少一个双链断裂靶位点，其中所述基因组窗口侧接有(遗传上连接于)至少第一标记和至少第二标记，并且其中所述基因组窗口包含转基因。组合物还提供了在其基因组中具有基因组窗口的植物、植物部分或种子，该基因组窗口包含至少一个改变的双链断裂靶位点，其中所述基因组窗口侧接有(遗传上连接于)至少第一标记和至少第二标记，并且其中所述改变的双链断裂靶位点包含目的多核苷酸。
本发明还提供了在其基因组中具有整合进至少一个Cas内切核酸酶靶位点中的至少一个位点特异性整合(SSI)的转基因靶位点的植物、植物部分或种子。
本发明还提供了将位点特异性整合的转基因靶位点导入到植物细胞的基因组中的方法。在一个实施方案中，所述方法包括：(a)提供在其基因组中包含Cas内切核酸酶的内源性靶位点的植物细胞；(b)提供Cas内切核酸酶和向导多核苷酸，其中Cas内切核酸酶能够与向导多核苷酸形成复合物，其中所述复合物能够在所述内源性靶位点处诱导双链断裂，并且其中内源性靶位点位于能够将(a)的Cas内切核酸酶引导到所述内源性靶位点的第一和第二基因组区域之间；(c)提供供体DNA，该供体DNA包含位于与所述第一基因组区域同源的第一区域和与所述第二基因组区域同源的第二区域之间的位点特异性整合的转基因靶位点，其中转基因靶位点包含第一重组位点和第二重组位点，其中第一重组位点和第二重组位点相对于彼此是相异的；(d)使植物细胞与向导多核苷酸、供体DNA和Cas内切核酸酶接触；以及(e)鉴定来自(d)的至少一个植物细胞，该植物细胞在其基因组中包含在所述内源性靶位点处整合的转基因靶位点。
在另一个实施方案中，所述方法包括将目的多核苷酸整合进植物细胞的基因组中的转基因靶位点中的方法，所述方法包括：(a)提供在其基因组中包含位点特异性整合的转基因靶位点的至少一种植物细胞，其中转基因靶位点被整合进Cas内切核酸酶的内源性靶位点中，并且其中转基因靶位点是(i)包含第一重组位点和第二重组位点的靶位点；或者(ii)在第一重组位点与第二重组位点之间还包含第三重组位点的(i)的靶位点，其中第一重组位点、第二重组位点和第三重组位点相对于彼此是相异的；(b)将转移盒导入到(a)的植物细胞中，该转移盒包含(iii)第一重组位点、第一目的多核苷酸和第二重组位点，(iv)第二重组位点、第二目的多核苷酸和第三重组位点，或者(v)第一重组位点、第三目的多核苷酸、和第三重组位点；(c)提供在第一重组位点和第二重组位点处、在第二重组位点和第三重组位点处、或在第一重组位点和第三重组位点处识别并实现重组的重组酶；以及(d)选择至少一个植物细胞，该植物细胞在靶位点处包含整合的转移盒。
组合物还提供了包含选自SEQ ID NO：267-307、441-480、以及它们的任一组合的RNA序列的核酸分子。在一个实施方案中，DSB靶位点是选自以下的Cas9内切核酸酶靶位点：SEQ ID NO：3-5、7-11、13-19、21-23、25-28、30-34、36-39、43-47、49-52、54-58、60、63-66、68-72、74-78、80-83、87-90、92-93、95-98、100-104、317-320、323-324、327-328、331-332、334-337、342-343、346-347、350-351、354-355、358-359、365-366、370-371、376-377、380-381、384-385、388-389、392-393和396-397。
本发明还提供了在植物的基因组窗口中产生复合性状基因座的方法和组合物，所述植物包含整合进至少双链断裂靶位点中的至少一个位点特异性整合的转基因靶位点。双链断裂靶位点可为但不限于锌指内切核酸酶靶位点、工程化内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点和Cas内切核酸酶靶位点。所述植物的基因组窗口可任选地包含至少一个目的基因座，诸如性状盒、转基因、突变基因、天然基因、编辑基因或位点特异性整合(SSI)靶位点。可采用植物育种技术，使得可共同培育SSI的转基因靶位点和目的基因座。按此方式，可在基因组窗口内发生多个独立的性状整合以创建复合性状基因座。复合性状基因座被设计成使得其包含目的性状和/或目的基因座的靶位点可彼此独立地分离，因而通过育种加入或育种除掉特异性元件来提供改变复合性状基因座的益处。还可采用多种方法修饰靶位点以使得其包含多种目的多核苷酸。本发明还提供了在植物基因组中产生复合性状基因座的方法，所述方法包括将植物育种技术应用于在其基因组中具有约10cM的基因组窗口的第一植物，该基因组窗口具有整合进至少第一双链断裂靶位点(诸如但不限于Cas9内切核酸酶靶位点)中的至少第一位点特异性整合(SSI)的转基因靶位点。所述方法包括将在基因组窗口中包含第一目的基因座(例如，性状盒、转基因、突变基因、天然基因、编辑基因或位点特异性整合(SSI)靶位点)的第二植物配种(breeding)于所述第一植物，并且选择包含整合进所述第一双链断裂靶位点中的所述第一位点特异性整合(SSI)的转基因靶位点和所述第一目的基因座的子代，其中所述第一转基因靶位点和所述第一基因座在所述子代植物中具有不同的基因组插入位点。使用此类方法，可将各种转基因靶位点和/或目的多核苷酸导入到基因组窗口的双链断裂靶位点中。本发明还提供了通过利用各种育种技术或通过采用位点特异性重组技术改变复合性状基因座以添加、移除、或置换双链断裂靶位点、目的基因座或目的多核苷酸的方法。
附图说明
图1.用于产生复合性状基因座(CTL)的基因组窗口的示意图。基因组窗口的长度可为约10cM(基因组距离)并且包含至少一个双链断裂靶位点。双链断裂靶位点可为但不限于Cas内切核酸酶靶位点、锌指内切核酸酶靶位点、工程化内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点和TALEN靶位点。所述植物的基因组窗口可任选地包含至少一个目的基因座，诸如性状盒、转基因、突变基因、天然基因、编辑基因或位点特异性整合(SSI)靶位点。
图2A-2D位点特异性整合(SSI)的转基因靶位点插入到位于基因组窗口中的双链断裂靶位点中的示意图。图2A示出用于产生长度为约10cM的复合性状基因座(CTL)的基因组窗口，所述基因组窗口包含侧接有DNA1和DNA2内源性DNA序列的至少一个双链断裂靶位点(DSB靶位点)。图2B示出用于整合SSI的转基因靶位点的供体(修复)DNA。图2C示出位于一个分子上或位于单独分子上的向导RNA和Cas9内切核酸酶表达盒的示意图。图2D示出在基因组窗口中整合的SSI的转基因靶位点的示意图。该种整合导致改变的DSB靶位点(称之为aDSB)。FRT1和FRT87(或FRT6)示出为SSI的转基因靶位点旁侧的重组位点的非限制性示例。可使用其它重组位点。
图3A-3C示出性状盒插入到位于基因组窗口中的DSB靶位点中的示意图。图3A示出用于产生CTL的基因组窗口。图3B示出用于整合性状盒的供体(修复)DNA的示意图。图3C示出在基因组窗口中整合的性状盒的示意图。
图4示出1号染色体上玉米基因组窗口(CTL1)的示意图。基因组窗口的长度为约5cM并且包含位于性状A(由椭圆形表示)附近的31个Cas内切核酸酶靶位点(列于代表基因组窗口的条形图上方，例如49-CR1)。各个Cas内切核酸酶靶位点的遗传定位(cM)示于条形图下方(例如，靶位点49-CR2位于1号染色体上的50.87cM处)。
图5示出1号染色体上玉米基因组窗口(CTL2)的示意图。基因组窗口的长度为约4cM并且包含位于性状B(由椭圆形表示)附近的15个Cas内切核酸酶靶位点(列于代表基因组窗口的条形图上方，例如62-CR1)。各个Cas内切核酸酶靶位点的遗传定位(cM)示于条形图下方(例如，靶位点62-CR1位于1号染色体上的230.55cM处)。
图6示出3号染色体上玉米基因组窗口(CTL3)的示意图。基因组窗口的长度为约3cM并且包含15个Cas内切核酸酶靶位点(列于代表基因组窗口的条形图上方，例如TS1)。各个Cas内切核酸酶靶位点的遗传定位(cM)示于条形图下方(例如，靶位点TS1位于3号染色体上的4.04cM处)。
图7示出10号染色体上玉米基因组窗口(CTL4)的示意图。基因组窗口的长度为约4cM并且包含15个Cas内切核酸酶靶位点(列于代表基因组窗口的条形图上方，例如TS1)。各个Cas内切核酸酶靶位点的遗传定位(cM)示于条形图下方(例如，靶位点TS1位于10号染色体上的120.09cM处)。
图8示出用于鉴定玉米1号染色体上的一个基因座处插入事件的连接区PCR筛选。凝胶图像显示在Cas内切核酸酶41-CR靶位点处存在插入事件(参见泳道D1和D10中的白色条带)。将HR1和HR2连接区的PCR反应产物上样到相邻的泳道(白色标记和泳道灰色标记)，白色标记代表HR1连接区的PCR产物，灰色标记代表HR2连接区的PCR产物。
图9示出4号染色体上的大豆基因组窗口(CTL-D)的示意图。基因组窗口的长度为约4cM并且示出14个Cas内切核酸酶靶位点(由灰色框表示)。基因组位置以cM指示。
图10示出6号染色体上的大豆基因组窗口(CTL-X)的示意图。基因组窗口的长度为约5cM并且示出10个Cas内切核酸酶靶位点(由灰色框表示)。基因组位置以cM指示。
图11示出6号染色体上的大豆基因组窗口(CTL-R)的示意图。基因组窗口的长度为约4cM并且示出16个Cas内切核酸酶靶位点(由灰色框表示)。基因组位置以cM指示。
序列
SEQ ID NO：1-41是位于玉米1号染色体上基因组窗口(CTL1)中的Cas内切核酸酶靶位点或SNP标记的核苷酸序列(另参见表1)。
SEQ ID NO：42-61是位于玉米1号染色体上基因组窗口(CTL2)中的Cas内切核酸酶靶位点或SNP标记的核苷酸序列(另参见表2)。
SEQ ID NO：62-84是位于玉米3号染色体上基因组窗口(CTL3)中的Cas内切核酸酶靶位点或SNP标记的核苷酸序列(另参见表3)。
SEQ ID NO：85-105是位于玉米10号染色体上基因组窗口(CTL4)中的Cas内切核酸酶靶位点或SNP标记的核苷酸序列(另参见表4)。
SEQ ID NO：106-135和136-146是玉米中所用的向导RNA/Cas9DNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：267-296和297-307是玉米中所用的向导RNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：147-266是引物/探针的核苷酸序列。
SEQ ID NO：308是来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)M1GAS(SF370)的Cas9基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO：309为SV40氨基N末端的氨基酸序列。
SEQ ID NO：310为根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)双分型VirD2T-DNA边界内切核酸酶羧基末端的氨基酸序列。
SEQ ID NO：311是玉米优化的Cas9表达盒的核苷酸序列。
SEQ ID NO：312是玉米U6聚合酶III启动子的核苷酸序列。
SEQ ID NO：313是大豆密码子优化的Cas9基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO：314是具有SRAD接头的SV40氨基N末端的氨基酸序列。
SEQ ID NO：315是GM-U6-13.1启动子的核苷酸序列。
SEQ ID NO：316-339是位于大豆4号染色体上的基因组窗口(CTL-D)中的Cas内切核酸酶靶位点或SNP标记的核苷酸序列(另参见表12)。
SEQ ID NO：340-362是位于大豆6号染色体上的基因组窗口(CTL-X)中的Cas内切核酸酶靶位点或SNP标记的核苷酸序列(另参见表13)。
SEQ ID NO：363-399是位于大豆1号染色体上的基因组窗口(CTL-R)中的Cas内切核酸酶靶位点或SNP标记的核苷酸序列(另参见表14)。
SEQ ID NO：400-413、415-424和425-440是大豆中所用的向导RNA/Cas 9 DNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：414是大豆U6小核RNA启动子GM-U6-9.1的核苷酸序列。
SEQ ID NO：441-480是大豆中所用的向导RNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：481-570是引物/探针的核苷酸序列。
SEQ ID NO：571是来自嗜热链球菌(S.thermophilus)的Cas9内切核酸酶(genbankCS571758.1)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：572是来自嗜热链球菌(S.thermophilus)的Cas9内切核酸酶(genbankCS571770.1)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：573是来自无乳链球菌(S.agalactiae)的Cas9内切核酸酶(genbankCS571785.1)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：574是来自无乳链球菌(S.agalactiae)的Cas9内切核酸酶(genbankCS571790.1)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：575是来自变异链球菌(S.mutans)的Cas9内切核酸酶(genbankCS571790.1)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：576是FRT1重组位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：577是FRT5重组位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：578是FRT6重组位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：579是FRT12重组位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：580是FRT87重组位点的核苷酸序列。
具体实施方式
本公开所属领域的技术人员应当理解，本文所示公开的许多修改形式和其它实施方案具有前述说明和相关附图中所示教导的有益效果。因此，应当了解，本公开不受所公开的具体实施方案的限制，并且修改形式和其它实施方案也旨在包括在所附权利要求的范围内。虽然本文采用了具体术语，但是这些术语仅以一般性和描述性意义使用而不是为了进行限制。
本文提供了在其基因组中具有基因组窗口的植物、植物部分、植物细胞或种子。基因组窗口可指植物基因组中的染色体片段，该植物基因组对于产生复合性状基因座或包含由本文提供的方法所产生的复合性状基因座的染色体片段是合乎需要的。基因组窗口可在其中产生复合转基因性状基因座之前包括例如一种或多种性状(参见例如图1)。如本文所用，“性状”是指由特定基因或基因分组赋予的表型。
基因组窗口的长度可为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多厘摩(cM)。另选地，基因组窗口的长度可为约1-10cM、约2-8cM、约2-5cM、约3-10cM、约3-6cM、约4-10cM、约4-7cM、约5-10cM、约5-8cM、约6-10cM、约6-9cM、约7-10cM、约8-10cM或约9-10cM。在一个实施方案中，基因组窗口的长度为约3厘摩(cM)或长度为约4cM、或长度为约5cM、或长度为约6cM、或长度为约10cM。“厘摩”(cM)或“图距单位(map unit)”是两个连接的基因、标记、靶位点、目的基因座、基因座或它们的任何配对之间的距离，其中1％的减数分裂产物是重组的。因此，一厘摩与等于两个连接的基因、标记、靶位点、基因座、目的基因座或它们的任何配对之间的1％平均重组频率的距离相当。
基因组窗口可包含各种组分。此类组分可包括例如但不限于双链断裂靶位点、目的基因座、天然基因、SSI的转基因靶位点(位点特异性整合重组位点)、突变基因、编辑基因、性状盒和目的多核苷酸。基因组窗口可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31个或更多个双链断裂靶位点，由此使得各个双链断裂靶位点在基因组窗口内具有不同的基因组插入位点。此外，基因组窗口可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31个或更多个各自具有不同的基因组插入位点的目的基因座。“不同的基因组插入位点”意指将基因组窗口的各个组分(诸如，例如双链断裂靶位点和目的基因座)插入到基因组中的不同位置处，并因此各个组分可彼此独立地分离。例如，基因组窗口可包含双链断裂靶位点和/或目的基因座的组合，由此使得各个靶位点或目的基因座在基因组窗口内具有不同的基因组插入位点。
本文提供的基因组窗口的组分具有不同的基因组插入位点，因此可彼此独立地分离。如本文所用，“独立地分离”用于指任两种或更多种基因、转基因、天然基因、突变基因、靶位点、目的基因座、标记等在减数分裂期间彼此遗传分离。用于测量两种遗传因子是否独立分离的测定法在本领域中是已知的。因此，本文所提供的基因组窗口内的任两种或更多种基因、转基因、天然基因、突变基因、靶位点、目的基因座、标记等具有彼此以适当的距离定位的基因组插入位点，使得它们通常以约10％或更小的比率独立地分离。因此，本文所提供的基因组窗口的组分可彼此以约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的比率独立地分离。另选地，本文所提供的基因组窗口的组分可彼此以约10-0.1％、约10-0.5％、约10-1％、约10-5％、约9-0.1％、约9-0.5％、约9-1％、约9-5％、约8-0.1％、约8-0.5％、约8-1％、约8-4％、约7-0.1％、约7-0.5％、约7-1％、约7-4％、约6-0.1％、约6-1％、约6-0.5％、约6-3％、约5-0.1％、约5-1％、约5-0.5％、约4-0.1％、约4-1％、约4-0.5％、约3-0.1％、约3-1％、约3-0.5％、约2-0.1％、约2-0.5％、约1-0.1％或约1-0.5％的比率独立地分离。例如，如果基因组窗口包含彼此相隔约5cM的双链断裂靶位点和目的基因座，则双链断裂靶位点和目的基因座将以约5％的比率独立地分离。
在一个实施方案中，基因组窗口包含至少五个不同的双链断裂靶位点(诸如至少五个Cas9内切核酸酶靶位点)和至少一个位点特异性整合的转基因靶位点(也称之为转基因SSI靶位点)，其中各个Cas内切核酸酶靶位点和转基因SSI靶位点具有不同的基因组插入位点并且彼此以约10％至约0.1％的比率独立地分离。
在具体的实施方案中，基因组窗口侧接有至少第一标记和第二标记。玉米1号染色体上的此类标记的非限制性示例包括，例如SYN12545、SYN12536、SYN14645、PZE-101023852、PZE-101024424、SYN25022、SYN31156、SYN31166、SYN22238或SYN20196、以及PZE-101205031、PUT-163A-148951459-517、PZE-101205904、PZE-101206569或SYN24492。玉米3号染色体上的此类标记的其它非限制性示例包括，例如PZE-103000166、PZE-103000238、PZE-103000307、SYN6355或PZE-103001421，以及玉米10号染色体上的标记例如PZE-110099037、PZE-110099048、PZE-110100195、PZE-110100685或PZE-110101412。大豆4号染色体上的此类标记的非限制性示例包括，例如BARC_1.01_Gm04_45591011_C_T、BARC_1.01_Gm04_45613405_T_C、BARC_1.01_Gm04_45697256_G_A、BARC_1.01_Gm04_45739051_A_C、BARC_1.01_Gm04_45800267_T_C、BARC_1.01_Gm04_45857325_T_C、BARC_1.01_Gm04_45857325_T_C、BARC_1.01_Gm04_45883080_A_G、BARC_1.01_Gm04_45903617_T_C、BARC_1.01_Gm04_46000185_C_A或BARC_1.01_Gm04_46113406_T_G。大豆6号染色体上的此类标记的非限制性示例包括，例如BARC_1.01_Gm0646915875_T_C、BARC_1.01_Gm06_47524452_G_T、BARC_1.01_Gm06_47561262_C_T、BARC_1.01_Gm06_47625670_C_T、BARC_1.01_Gm06_47631544_T_C、BARC_1.01_Gm06_47789229_C_T、BARC_1.01_Gm06_47821576_T_G、BARC_1.01_Gm06_47829363_A_C、BARC_1.01_Gm06_47833095_A_G、BARC_1.01_Gm06_47847021_G_T、BARC_1.01_Gm06_47895876_G_A、BARC_1.01_Gm06_48221293_T_C或BARC_1.01_Gm06_48528885_G_T。
大豆1号染色体上的此类标记的非限制性示例包括，例如BARC_1.01_Gm01_9984873_T_C、BARC_1.01_Gm01_7775299_G_A、BARC_1.01_Gm01_7856395_A_C、BARC_1.01_Gm01_8569887_A_G、BARC_1.01_Gm01_8601858_C_T、BARC_1.01_Gm01_8641430_C_T、BARC_1.01_Gm01_8674202_A_C、BARC_1.01_Gm01_8933345_C_T、BARC_1.01_Gm01_8964201_T_C、BARC_1.01_Gm01_9014216_T_G、BARC_1.01_Gm01_28179606_A_G、BARC_1.01_Gm01_28364595_A_G、BARC_1.01_Gm01_28536363_G_A、BARC_1.01_Gm01_28599526_G_A、BARC_1.01_Gm01_28913996_A_G、BARC_1.01_Gm01_29284158_A_G、BARC_1.01_Gm01_31202345_C_T、BARC_1.01_Gm01_31770743_C_T、BARC_1.01_Gm01_32683433_G_A、BARC_1.01_Gm01_34327255_C_T或BARC_1.01_Gm01_36994849_A_G。
如本文所用，“目的基因座”(多个目的基因座)包括被一同遗传的特定多态性的集合。给定的基因座可包括但不限于修饰或编辑的天然基因、转基因、改变的双链断裂靶位点、天然基因、或转基因SSI靶位点，它们可包含重组位点的相异的对或者相对于彼此相异并且相容性减小的重组位点的对。
目的基因座可为例如赋予性状(诸如转基因或天然性状)的任何修饰。在一个实施方案中，目的基因座包括天然性状。如本文所用，“天然性状”是指天然存在的性状。在一个实施方案中，目的基因座包含转基因。
可交叉到植物基因组窗口中的目的基因座的数目为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13个或更多个。可将任何期望的性状导入到基因组中给定的目的基因座处。此类性状包括但不限于赋予以下的性状：昆虫抗性、病害抗性、除草剂耐受性、雄性不育、非生物胁迫耐受性、磷的改变、抗氧化剂的改变、脂肪酸的改变、必需氨基酸的改变、碳水化合物的改变、或参与位点特异性重组的序列。
在具体的实施方案中，给定的目的基因座与植物中期望的和/或有利的表型相关联。例如，赋予昆虫抗性、病害抗性或除草剂耐受性的性状在植物中将是期望的。在其它实施方案中，基因座不与影响植物农学特性的性状相关联。
给定的目的基因座在基因组窗口内具有其自身的基因组插入位点。例如，基因组窗口内的目的基因座和双链断裂靶位点将在基因组内具有不同的基因组插入位点。给定的双链断裂靶位点可见于距离目的基因座约10cM、9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM、0.9cM、0.8cM、0.7cM、0.6cM、0.5cM、0.4cM、0.3cM、0.2cM、0.1cM或0.05cM之内，使得双链断裂靶位点和目的基因座具有不同的基因组插入位点。另选地，给定的双链断裂靶位点可见于距离目的基因座约0.5-10cM、约1-10cM、约2-10cM、约2-5cM、约3-10cM、约3-6cM、约4-10cM、约4-7cM、约5-10cM、约5-8cM、约6-10cM、约6-9cM、约7-10cM、约8-10cM、约9-10cM、约0.1-0.5cM、约0.1-1cM、约0.1-2cM、约0.1-3cM、约0.1-4cM、约0.1-5cM、约0.1-6cM、约0.1-7cM、约0.1-8cM、约0.1-9cM或约0.1-10eM之内，使得双链断裂靶位点和目的基因座具有不同的基因组插入位点。
如本文所用，术语“双链断裂靶位点”、“DSB靶位点”“DSB靶序列”和“双链断裂诱导剂的靶位点”可互换使用，并且是指植物细胞基因组(包括叶绿体和线粒体DNA)中的多核苷酸序列，其包含双链断裂诱导剂的识别序列，在该处通过双链断裂诱导剂在细胞基因组中诱导双链断裂。
如本文所用，术语“改变的双链断裂靶位点”、“改变的DSB靶位点”、“aDSB靶位点”和“双链断裂诱导剂的改变的靶位点”可互换使用，并且是指相比于未改变的DSB靶序列包括至少一种改变的DSB靶序列。“改变”可包括例如：(i)置换至少一个核苷酸，(ii)删除至少一个核苷酸，(iii)插入至少一个核苷酸，或(iv)(i)-(iii)中的任意组合。
DSB靶位点可为植物基因组中的内源位点，或者作为另外一种选择，DSB靶位点可与植物是异源的，从而不天然存在于基因组中，或者DSB靶位点与其天然出现的位置相比可存在于异源基因组位置中。如本文所用，术语“内源性DSB靶位点”是指对植物基因组为内源性或天然的DSB靶位点，并且位于该DSB靶位点在植物基因组中的内源或天然位置处。
DSB靶位点的长度可变化，并且包括例如长度为至少4、6、8、10、12、14、16、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70个或更多个核苷酸的DSB靶位点。DSB靶位点还有可能是回文的，即一条链上的序列在互补链上从相反方向读起来是一样的。切口/裂解位点可在识别序列之内或者切口/裂解位点可在识别序列之外。在另一个变型中，裂解可在彼此直接相对的核苷酸位置处进行以产生平端切口，或者在其它情况下，切口可以错开以产生单链悬端，也被称为“粘末端”，其可以为5′悬端或3′悬端。
“双链断裂诱导剂”(也称之为“DSB诱导剂”)是指在靶序列中产生双链断裂的任何核酸酶。双链断裂靶位点可为但不限于锌指内切核酸酶靶位点、工程化内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点和Cas内切核酸酶靶位点。
在期望的DSB靶位点中诱导双链断裂的任何核酸酶可用于本文公开的方法和组合物中。可采用天然存在或天然的内切核酸酶，只要内切核酸酶在期望的DSB靶位点中诱导双链断裂。另选地，可采用修饰或工程化的内切核酸酶。“工程化内切核酸酶”是指由其原生形式进行工程化(修饰或由其得到)以在期望的DSB靶位点处特异性识别并诱导双链断裂的内切核酸酶。因此，工程化内切核酸酶可来源于天然、天然存在的内切核酸酶或者其可人工创建或合成。内切核酸酶的修饰可以少至一个核苷酸。在DSB靶位点或其它DNA中产生双链断裂在本文中可被称为“切割”或“裂解”DSB靶位点或其它DNA。
DSB靶位点的活性变体和片段(即，SEQ ID NO：3-5、7-11、13-19、21-23、25-28、30-34、36-39、43-47、49-52、54-58、60、63-66、68-72、74-78、80-83、87-90、92-93、95-98、100-104、317-320、323-324、327-328、331-332、334-337、342-343、346-347、350-351、354-355、358-359、365-366、370-371、376-377、380-381、384-385、388-389、392-393和396-397)可与给定的DSB靶位点具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，其中活性变体保留生物活性并因而能够由DSB诱导剂识别和裂解。通过内切核酸酶测量DSB靶位点的双链断裂的测定法是本领域中已知的，并且通常测量内切核酸酶切割DSB靶位点的能力。
内切核酸酶是裂解多核苷酸链内的磷酸二酯键的酶，并且包括在特定位点处裂解DNA而不损伤碱基的限制性内切核酸酶。限制性内切核酸酶包括I型、II型、III型和IV型内切核酸酶，其还包括亚型。在I型和III型体系中，甲基化酶和限制性活性两者均包含在单个复合物内。限制性酶还描述并分类在例如REBASE数据库中(网页为：rebase.neb.com；Roberts等人，(2003)Nucleic Acids Res 31：418-20)，Roberts等人，(2003)NucleicAcids Res 31：1805-12，以及Belfort等人，(2002)，Mobile DNA II，第761-783页，Craigie等人编辑，(ASM出版社，Washington，DC)。
内切核酸酶还包括大范围核酸酶(也称为指归巢内切酶(HEases))，其类似于限制性内切核酸酶，在特定DSB靶位点处结合和切割，然而，大范围核酸酶的DSB靶位点通常较长，约18bp或更多。大范围核酸酶结构域、结构和功能是已知的，参见例如，Guhan和Muniyappa(2003)Crit Rev Biochem Mol Biol 38：199-248：Lucas等人，(2001)NucleicAcids Res 29：960-9；Jurica和Stoddard，(1999)Cell Mol Life Sci55：1304-26；Stoddard，(2006)Q Rev Biophys 38：49-95；以及Moure等人，(2002)Nat Struct Biol 9：764。在一些示例中，使用大范围核酸酶的天然存在的变体和/或工程化衍生物。本文中可使用任何大范围核酸酶，包括但不限于I-SceI、I-SceII、I-SceIII、I-SceIV、I-SceV、I-SceVI、I-SceVII、I-CeuI、I-CeuAIIP、I-CreI、I-CrepsbIP、I-CrepsbIIP、I-CrepsbIIIP、I-CrepsbIVP、I-TliT、I-PpoI、PI-PspI、F-SceI、F-SceII、F-SuvI、F-TevI、F-TevII、I-AmaI、I-AniI、I-ChuI、I-CmoeI、I-CpaI、I-CpaII、I-CsmI、I-CvuI、I-CvuAIP、I-DdiI、I-DdiII、I-DirI、I-DmoI、I-HmuI、I-HmuII、I-HsNIP、I-LlaI、I-MsoI、I-NaaI、I-NanI、I-NcIIP、I-NgrIP、I-NitI、I-NjaI、I-Nsp236IP、I-PakI、I-PboIP、I-PcuIP、I-PcuAI、I-PcuVI、I-PgrIP、I-PobIP、I-PorI、I-P或IIP、I-PbpIP、I-SpBetaIP、I-ScaI、I-SexIP、I-SneIP、I-SpomI、I-SpomCP、I-SpomIP、I-SpomIIP、I-SquIP、I-Ssp6803I、I-SthPhiJP、I-SthPhiST3P、I-SthPhiSTe3bP、I-TdeIP、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、I-UarAP、I-UarHGPAIP、I-UarHGPA13P、I-VinIP、I-ZbiIP、PI-MtuI、PI-MtuHIP PI-MtuHIIP、PI-PfuI、PI-PfuII、PI-PkoI、PI-PkoII、PI-Rma43812IP、PI-SpBetaIP、PI-SceI、PI-TfuI、PI-TfuII、PI-ThyI、PI-TliI、PI-TliII、或者它们中任何的活性变体或片段。
TAL效应物核酸酶可用来在植物或者其它生物体的基因组中的特定靶序列处产生双链断裂。TAL效应物核酸酶可通过将天然或者经工程改造的转录激活因子样(TAL)效应物或其功能部分与内切核酸酶的催化结构域(例如FokI)融合来产生。独特的模块化TAL效应物DNA结合结构域允许具有潜在的任何给定DNA识别特异性的蛋白质设计。因此，可将TAL效应物核酸酶的DNA结合域工程化以识别特定DNA靶位点，并因此用于在期望的靶序列处形成双链断裂。参见，WO 2010/079430；Morbitzer等人(2010)PNAS 10.1073/pnas.1013133107；Scholze&Boch(2010)Virulence 1：428-432；Christian等人Genetics(2010)186：757-761；Li等人(2010)Nuc.Acids Res.(2010)doi：10.1093/nar/gkq704；以及Miller等人(2011)Nature Biotechnology 29：143-148；这些专利均以引用方式并入本文。
CRISPR基因座(规律成簇间隔短回文重复序列)(也称为SPIDRs--间隔区散在同向重复序列)构成目前描述的DNA基因座的家族。CRISPR基因座由短且高度保守的DNA重复序列(通常24至40bp，重复1至140次，也称CRISPR重复序列)组成，所述DNA重复序列是部分回文的。重复的序列(通常是物种特异性的)被恒定长度的可变序列(通常20至58bp，取决于CRISPR基因座(2007年3月1日公布的WO2007/025097))间隔。CRISPR基因座首先在大肠杆菌(E.coli)中识别(Ishino等人，(1987)J.Bacterial.169：5429-5433；Nakata等人(1989)J.Bacterial.171：3553-3556)。类似的插入短重复序列已经在地中海富盐菌(Haloferaxmediterranei)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、项圈藻(Anabaena)和肺结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)中鉴定(Groenen等人，(1993)Mol.Microbiol.10：1057-1065；Hoe等人(1999)Emerg.Infect.Dis.5：254-263；Masepohl等人(1996)Biochim.Biophys.Acta 1307：26-30；Mojica等人(1995)Mol.Microbiol.17：85-93)。CRISPR基因座与其它SSR的不同之处在于重复序列的结构，其被称为短规则间隔的重复序列(SRSR)(Janssen等人(2002)OMICS J.Integ.Biol6：23-33；Mojica等人(2000)Mol.Microbiol.36：244-246)。所述重复序列是成簇出现的短元件，其通常被恒定长度的可变序列规则地间隔(Mojica等人(2000)Mol.Microbiol.36：244-246)。
“Cas基因”涉及这样的基因，该基因通常与旁侧CRISPR基因座偶联、相关联或接近或在邻近旁侧CRISPR基因座的位置。术语“Cas基因”、“CRISPR-相关联的(Cas)基因”在本文中可互换使用。Cas蛋白质家族的全面综述在Haft等人，(2005)Computational Biology，PLoS Comput Biol 1(6)：e60.doi：10.1371/journal.pcbi.0010060中提出。如本文所述，除了四种先前已知的基因家族之外，还描述了41种CRISPR-相关联的(Cas)基因家族。其示出CRISPR体系属于不同的类，具有不同的重复图案、基因组和物种范围。在给定CRISPR基因座处的Cas基因数在物种之间可以不同。
Cas内切核酸酶与由Cas基因编码的Cas蛋白质相关，其中所述Cas蛋白质能够将双链断裂导入到DNA靶序列中。Cas内切核酸酶由向导多核苷酸引导来识别并任选地将双链断裂导入到细胞的基因组中的特定靶位点处(美国临时申请62/023239，该专利申请提交于2014年7月11日)。向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统包括能够将双链断裂导入到DNA靶序列中的Cas内切核酸酶和向导多核苷酸的复合物。在由向导RNA识别靶序列时，Cas内切核酸酶退绕紧密靠近基因组靶位点的DNA双链体，并且裂解两个DNA链，如果在正确的前间区序列邻近基序(PAM)在靶序列的3′末端处大致取向的话。
Cas内切核酸酶基因可为Cas9内切核酸酶，或其功能片段，诸如但不限于在2007年3月1日公开的WO2007/025097的SEQ ID NO：462、474、489、494、499、505和518中所列的Cas9基因。Cas内切核酸酶基因可为酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)或变异链球菌(Streptococcus mutans)的任何Cas9内切核酸酶，诸如但不限于SEQ ID No571-575。Cas内切核酸酶基因可为植物、玉米或大豆优化的Cas9内切核酸酶，诸如但不限于植物密码子优化的酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)Cas9基因，其可识别任何N(12-30)NGG形式的基因序列。Cas内切核酸酶可通过本领域已知的任何方法直接导入到细胞中，例如但不限于瞬时导入方法、转染和/或局部应用。
在一个实施方案中，DSB靶位点是选自以下的Cas9内切核酸酶靶位点：SEQ ID NO：3-5、7-11、13-19、21-23、25-28、30-34、36-39、43-47、49-52、54-58、60、63-66、68-72、74-78、80-83、87-90、92-93、95-98、100-104、317-320、323-324、327-328、331-332、334-337、342-343、346-347、350-351、354-355、358-359、365-366、370-371、376-377、380-381、384-385、388-389、392-393和396-397。
在一个实施方案中，组合物为在其基因组中具有基因组窗口的植物、植物部分或种子，该基因组窗口包含整合进至少一个Cas9内切核酸酶靶位点中的至少一个位点特异性整合(SSI)的转基因靶位点，其中所述基因组窗口侧接有至少第一标记和第二标记。植物可为但不限于具有本文所述的任何基因组窗口的大豆或玉米植物。
在一个实施方案中，植物为在其基因组中具有基因组窗口的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，该基因组窗口包含整合进至少一个Cas9内切核酸酶靶位点中的至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，其中所述至少一个转基因靶位点遗传上连接于至少第一遗传标记和第二遗传标记，其中所述第一遗传标记选自BARC_1.01_Gm01_6984873_T_C、BARC_1.01_Gm01_7775299_G_A、BARC_1.01_Gm01_7856395_A_C、BARC_1.01_Gm01_8569887_A_G、BARC_1.01_Gm01_8601858_C_T、BARC_1.01_Gm01_8641430_C_T、BARC_1.01_Gm01_8674202_A_C、BARC_1.01_Gm01_8933345_C_T、BARC_1.01_Gm01_8964201_T_C、BARC_1.01_Gm01_9014216_T_G、BARC_1.01_Gm01_28179606_A_G、BARC_1.01_Gm01_28364595_A_G、BARC_1.01_Gm01_28536363_G_A、BARC_1.01_Gm01_28599526_G_A、BARC_1.01_Gm01_28913996_A_G、BARC_1.01_Gm01_29284158_A_G、BARC_1.01_Gm01_31202345_C_T、BARC_1.01_Gm01_31770743_C_T、BARC_1.01_Gm01_32683433_G_A、或BARC_1.01_Gm01_34327255_C_T；并且所述第二遗传标记选自BARC_1.01_Gm01_7775299_G_A、BARC_1.01_Gm01_7856395_A_C、BARC_1.01_Gm01_8569887_A_G、BARC_1.01_Gm01_8601858_C_T、BARC_1.01_Gm01_8641430_C_T、BARC_1.01_Gm01_8674202_A_C、BARC_1.01_Gm01_8933345_C_T、BARC_1.01_Gm01_8964201_T_C、BARC_1.01_Gm01_9014216_T_G、BARC_1.01_Gm01_28179606_A_G、BARC_1.01_Gm01_28364595_A_G、BARC_1.01_Gm01_28536363_G_A、BARC_1.01_Gm01_28599526_G_A、BARC_1.01_Gm01_28913996_A_G、BARC_1.01_Gm01_29284158_A_G、BARC_1.01_Gm01_31202345_C_T、BARC_1.01_Gm01_31770743_C_T、BARC_1.01_Gm01_32683433_G_A、BARC_1.01_Gm01_34327255_C_T、或BARC_1.01_Gm01_36994849_A_G。
在一个实施方案中，植物为在其基因组中具有基因组窗口的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，该基因组窗口包含整合进至少一个Cas9内切核酸酶靶位点中的至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，其中所述至少一个转基因靶位点遗传上连接于至少第一遗传标记和第二遗传标记，其中所述第一遗传标记位于大豆物理图谱上的Gm01：6984873与Gm01：34327255之间，其中所述第二遗传标记位于大豆物理图谱上的Gm01：7775299与Gm01：36994849之间。
在一个实施方案中，植物为在其基因组中具有基因组窗口的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，该基因组窗口包含整合进至少一个Cas9内切核酸酶靶位点中的至少一个位点特异性整合(SSI)的转基因靶位点，其中所述基因组窗口侧接有选自以下的至少第一标记和第二标记：SYN12545、SYN12536、SYN14645、PZE-101023852、PZE-101024424、SYN25022、SYN31156、SYN31166、SYN22238或SYN20196、PZE-101205031、PUT-163A-148951459-517、PZE-101205904、PZE-101206569或SYN24492、PZE-103000166、PZE-103000238、PZE-103000307、SYN6355或PZE-103001421、PZE-110099037、PZE-110099048、PZE-110100195、PZE-110100685和PZE-110101412、
在一个实施方案中，植物为在其基因组中具有基因组窗口的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，该基因组窗口包含整合进至少一个Cas9内切核酸酶靶位点中的至少一个位点特异性整合(SSI)的转基因靶位点，其中所述基因组窗口侧接有选自以下的至少第一标记和第二标记：BARC_1.01_Gm04_45591011_C_T、BARC_1.01_Gm04_45613405_T_C、BARC_1.01_Gm04_45697256_G_A、BARC_1.01_Gm04_45739051_A_C、BARC_1.01_Gm04_45800267_T_C、BARC_1.01_Gm04_45857325_T_C、BARC_1.01_Gm04_45857325_T_C、BARC_1.01_Gm04_45883080_A_G、BARC_1.01_Gm04_45903617_T_C、BARC_1.01_Gm04_46000185_C_A或BARC_1.01_Gm04_46113406_T_G、BARC_1.01_Gm06_46915875_T_C、BARC_1.01_Gm06_47524452_G_T、BARC_1.01_Gm06_47561262_C_T、BARC_1.01_Gm06_47625670_C_T、BARC_1.01_Gm06_47631544_T_C、BARC_1.01_Gm06_47789229_C_T、BARC_1.01_Gm06_47821576_T_G、BARC_1.01_Gm06_47829363_A_C、BARC_1.01_Gm06_47833095_A_G、BARC_1.01_Gm06_47847021_G_T、BARC_1.01_Gm06_47895876_G_A、BARC_1.01_Gm06_48221293_T_C或BARC_1.01_Gm06_48528885_G_T、BARC_1.01_Gm01_6984873_T_C、BARC_1.01_Gm01_7775299_G_A、BARC_1.01_Gm01_7856395_A_C、BARC_1.01_Gm01_8569887_A_G、BARC_1.01_Gm01_8601858_C_T、BARC_1.01_Gm01_8641430_C_T、BARC_1.01_Gm01_8674202_A_C、BARC_1.01_Gm01_8933345_C_T、BARC_1.01_Gm01_8964201_T_C、BARC_1.01_Gm01_9014216_T_G、BARC_1.01_Gm01_28179606_A_G、BARC_1.01_Gm01_28364595_A_G、BARC_1.01_Gm01_28536363_G_A、BARC_1.01_Gm01_28599526_G_A、BARC_1.01_Gm01_28913996_A_G、BARC_1.01_Gm01_29284158_A_G、BARC_1.01_Gm01_31202345_C_T、BARC_1.01_Gm01_31770743_C_T、BARC_1.01_Gm01_32683433_G_A、BARC_1.01_Gm01_34327255_C_T和BARC_1.01_Gm01_36994849_A_G。
在一个实施方案中，植物为大豆或玉米植物，其中本文所述的基因组窗口的长度不超过0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、5、10cM。
在一个实施方案中，植物为大豆或玉米植物，其中基因组窗口包含转基因，其中转基因赋予选自以下的性状：除草剂耐受性、昆虫抗性、病害抗性、雄性不育、位点特异性重组、非生物胁迫耐受性、磷的改变、抗氧化剂的改变、脂肪酸的改变、必需氨基酸的改变、碳水化合物的改变、除草剂耐受性、昆虫抗性和病害抗性。
在一个实施方案中，植物为大豆或玉米植物，其中基因组窗口还包含整合进至少第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五或第十六个双链断裂靶位点中的至少第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五或第十六个位点特异性整合的转基因靶位点。
在一个实施方案中，植物为大豆或玉米植物，其中基因组窗口包含整合进Cas9内切核酸酶位点中的至少一个转基因SSI靶位点，其中所述至少一个位点特异性整合的转基因靶位点包含第一重组位点和第二重组位点，其中所述第一重组位点和第二重组位点相对于彼此是相异的。
在一个实施方案中，植物为大豆或玉米植物，其中基因组窗口包含整合进Cas9内切核酸酶位点中的至少一个转基因SSI靶位点，其中所述至少一个位点特异性整合的转基因靶位点还包含侧接有所述第一重组位点和所述第二重组位点的目的多核苷酸。
如本文所用，术语“向导多核苷酸”涉及如下多核苷酸序列，该多核苷酸序列可与Cas内切核酸酶(诸如但不限于Cas9内切核酸酶)形成复合物并且使Cas内切核酸酶能够识别并且任选地裂解DNA靶位点(美国临时申请62/023239，该申请提交于2014年7月11日)。向导多核苷酸可为单分子或双分子。向导多核苷酸序列可为RNA序列、DNA序列、或它们的组合(RNA-DNA组合序列)。任选地，向导多核苷酸可包含至少一个核苷酸、磷酸二酯键或键修饰，诸如但不限于锁定核酸(LNA)、5-甲基dC、2，6-二氨基嘌呤、2’-氟A、2’-氟U、2′-O-甲基RNA、硫代磷酸酯键(键合到胆固醇分子、键合到聚乙二醇分子、键合到间隔区18(六乙二醇链)分子)，或导致环化的5’至3’共价键。仅仅包含核糖核酸的向导多核苷酸也称为“向导RNA”。向导RNA可包括两个RNA分子、包含可变靶向结构域的crRNA(CRISPR RNA)以及tracrRNA的融合物。在一个实施方案中，向导RNA包含12至30个核苷酸序列的可变靶向结构域以及可与Cas内切核酸酶相互作用的RNA片段。
向导多核苷酸可为双分子(也称为双链体向导多核苷酸)，其包含与靶DNA中的核苷酸序列互补的第一核苷酸序列结构域(称为可变靶向结构域或VT结构域)以及与Cas内切核酸酶多肽相互作用的第二核苷酸序列结构域(称为Cas内切核酸酶识别结构域或CER结构域)。双分子向导多核苷酸的CER结构域包含沿着互补区域杂交的两个单独分子。这两个单独分子可为RNA、DNA和/或RNA-DNA组合序列。在一些实施方案中，包含连接到CER结构域的VT结构域的双链体向导多核苷酸的第一分子被称为″crDNA″(当由DNA核苷酸的连续片段构成时)或“crRNA”(当由RNA核苷酸的连续片段构成时)，或“crDNA-RNA”(当由DNA核苷酸和RNA核苷酸的组合构成时)。cr核苷酸可包括细菌和古细菌中天然存在的cRNA的片段。在一个实施方案中，细菌和古细菌中天然存在的cRNA的片段以本文所公开的cr核苷酸形式存在，其大小范围可为，但不限于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个核苷酸。在一些实施方案中，包含CER结构域的双链体向导多核苷酸的第二分子被称为“tracrRNA”(当由RNA核苷酸的连续片段构成时)或“tracrDNA”(当由DNA核苷酸的连续片段构成时)，或“tracrDNA-RNA”(当由DNA核苷酸和RNA核苷酸的组合构成时)。在一个实施方案中，引导RNA/Cas9内切核酸酶复合物的RNA为包含双链体crRNA-tracrRNA的双工RNA。
向导多核苷酸也可为单分子，其包含与靶DNA中的核苷酸序列互补的第一核苷酸序列结构域(称为可变靶向结构域或VT结构域)以及与Cas内切核酸酶多肽相互作用的第二核苷酸结构域(称为Cas内切核酸酶识别结构域或CER结构域)。所谓“结构域”，意指核苷酸的连续片段，该连续片段可为RNA、DNA和/或RNA-DNA组合序列。单向导多核苷酸的VT结构域和/或CER结构域可包含RNA序列、DNA序列或RNA-DNA组合序列。在一些实施方案中，单向导多核苷酸包括连接到tracr核苷酸(包含CER结构域)的cr核苷酸(包含连接到CER结构域的VT结构域)，其中所述键为包含RNA序列、DNA序列或RNA-DNA组合序列的核苷酸序列。由来自cr核苷酸和tracr核苷酸的序列构成的单向导多核苷酸可被称为“单向导RNA”(当由RNA核苷酸的连续片段构成时)或“单向导DNA”(当由DNA核苷酸的连续片段构成时)或“单向导RNA-DNA”(当由RNA核苷酸和DNA核苷酸的组合构成时)。在本发明的一个实施方案中，单向导RNA包括cRNA或cRNA片段以及可与II型Cas内切核酸酶形成复合物的II型CRISPR/Cas系统的tracrRNA或tracrRNA片段，其中所述向导RNA/Cas内切核酸酶复合物可引导Cas内切核酸酶至植物基因组靶位点，使得Cas内切核酸酶能够将双链断裂导入到基因组靶位点中。使用单向导多核苷酸与双链体向导多核苷酸相比的一个方面是仅需要形成一个表达盒即可表达单向导多核苷酸。
术语“可变靶向结构域”或“VT结构域”在本文中可互换使用并且包括与双链DNA靶位点的一条链(核苷酸序列)互补的核苷酸序列。第一核苷酸序列结构域(VT结构域)和靶序列之间的互补性％可为至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、63％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。可变靶结构域的长度可为至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方案中，可变靶向结构域包含12至30个核苷酸的连续片段。可变靶向结构域可由DNA序列、RNA序列、修饰的DNA序列、修饰的RNA序列、或它们的任意组合构成。
术语向导多核苷酸的“Cas内切核酸酶识别结构域”或“CER结构域”在本文中可互换使用并且包括与Cas内切核酸酶多肽相互作用的核苷酸序列(诸如向导多核苷酸的第二核苷酸序列结构域)。CER结构域可由DNA序列、RNA序列、修饰的DNA序列、修饰的RNA序列(参见例如本文所述的修饰)，或它们的任何组合组成。
连接单向导多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列可包含RNA序列、DNA序列或RNA-DNA组合序列。在一个实施方案中，连接单向导多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列的长度可为至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个核苷酸。在另一个实施方案中，连接单向导多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列可包含四环序列，诸如但不限于GAAA四环序列。
向导多核苷酸、VT结构域和/或CER结构域的核苷酸序列修饰可选自但不限于5′帽、3′聚腺苷酸化尾、核糖开关序列、稳定性控制序列、形成dsRNA双链体的序列、将向导多核苷酸靶向到亚细胞位置的修饰或序列、提供追踪的修饰或序列、提供用于蛋白质的结合位点的修饰或序列、锁定核酸(LNA)、5-甲基dC核苷酸、2，6-二氨基嘌呤核苷酸、2’-氟A核苷酸、2’-氟U核苷酸、2′-O-甲基RNA核苷酸、硫代磷酸酯键(键合到胆固醇分子、键合到聚乙二醇分子、键合到间隔区18分子)、5’至3’共价键、或它们的任意组合。这些修饰可产生至少一种附加的有益特征，其中所述附加的有益特征选自经修饰或调控的稳定性，亚细胞靶向，跟踪，荧光标记，蛋白或蛋白复合物的结合位点，与互补靶序列的经修饰的结合亲和力，经修饰的对细胞降解的抗性，以及增加的细胞渗透性。
DSB-诱导剂可经由编码核酸酶的多核苷酸来提供。此类编码核酸酶的多核苷酸可被修饰以替换在植物中具有较高使用频率的密码子，如与天然存在的多核苷酸序列相比。例如，编码DSB诱导剂的多核苷酸可被修饰以替换在玉米或大豆植物中具有较高使用频率的密码子，如与天然存在的多核苷酸序列相比。
DSB诱导剂的活性变体和片段(即工程化内切核酸酶)可与天然内切核酸酶具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，其中活性变体保留在期望的DSB靶位点处切割的能力并因而保留双链断裂诱导活性。
测定双链断裂诱导活性的测定法是已知的，一般是测量该内切核酸酶对含有DSB靶位点的DNA底物的总体活性和特异性。
可通过任何本领域已知的手段导入DSB诱导剂。例如，提供在其基因组中具有DSB靶位点的植物。DSB诱导剂可瞬时表达或多肽本身可以被直接提供给细胞。另选地，能够表达DSB诱导剂的核苷酸序列可稳定地整合进植物的基因组中。在对应的DSB靶位点和DSB诱导剂的存在下，供体DNA被插入到转化的植物基因组中。另选地，可通过有性杂交转基因植物将系统的组分聚集在一起。因此编码DSB诱导剂和/或靶位点的序列可彼此有性杂交以使得体系中的每个组分存在于单一植物中。DSB诱导剂可在组成型或诱导型启动子的控制下。此类所关注的启动子在本文其它地方进一步详细讨论。
本文提供了如下方法和组合物：建立和使用具有稳定掺入到其基因组中的位点特异性整合的转基因靶位点(也称之为转基因SSI靶位点)的植物、植物部分、植物细胞和种子，其中转基因SSI靶位点被整合进DSB诱导剂的靶位点中。如本文所用，当DSB诱导剂在DSB靶位点处诱导双链断裂和同源重组事件时，转基因SSI靶位点被“整合”进DSB靶位点，从而在初始DSB靶位点的边界内插入转基因SSI靶位点(参见例如2A-2D)。应当认识到，转基因SSI靶标在其中整合的给定DSB靶位点内的位置将根据DSB诱导剂诱导双链断裂的位置而变化。DSB靶位点的序列不需要立即侧接转基因SSI靶标的边界。例如，也可将在供体DNA上发现的转基因SSI靶标的序列5′和3′整合进DSB靶位点中。
如上文概述，本发明提供了具有在DSB靶位点处整合的转基因SSI靶位点的植物、植物细胞和种子。
在一个实施方案中，组合物为在其基因组中具有整合进至少一个Cas内切核酸酶靶位点中的至少一个位点特异性整合(SSI)的转基因靶位点的植物、植物部分或种子。在一个实施方案中，Cas内切核酸酶靶位点为Cas9内切核酸酶靶位点。在一个实施方案中，植物为单子叶植物或双子叶植物。
可使用各种方法在DSB靶位点处整合转基因SSI靶位点。此类方法采用同源重组来提供内切核酸酶DSB靶位点处转基因SSI靶位点的整合。在本文提供的方法中，将供体DNA构建体中的转基因SSI靶位点提供给植物细胞。“供体DNA”(也称之为修复DNA)可包括包含位点特异性整合的转基因SSI靶位点的DNA构建体。供体DNA构建体还可包含转基因SSI靶位点序列旁侧的第一同源性区域和第二同源性区域(参见例如图2B)。供体DNA的第一同源性区域和第二同源性区域分别与存在于植物基因组的DSB靶位点中或旁侧的第一基因组区域和第二基因组区域共享同源性。所谓“同源性”是指类似的DNA序列。例如，存在于供体DNA上的“基因组区域的同源性区域”是与植物基因组中的给定“基因组区域”具有类似序列的DNA区域。同源性区域可具有任何长度，该长度足以促进裂解DSB靶位点处的同源重组。例如，同源性区域的长度可为至少5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-55、5-60、5-65、5-70、5-75、5-80、5-85、5-90、5-95、5-100、5-200、5-300、5-400、5-500、5-600、5-700、5-800、5-900、5-1000、5-1100、5-1200、5-1300、5-1400、5-1500、5-1600、5-1700、5-1800、5-1900、5-2000、5-2100、5-2200、5-2300、5-2400、5-2500、5-2600、5-2700、5-2800、5-2900、5-3000、5-3100或更多个碱基，使得同源性区域具有充分的同源性以与相应的基因组区域发生同源重组。“充分的同源性”表明两个多核苷酸序列具有充分的结构相似性以充当同源重组反应的底物。
如本文所用，“基因组区域”是植物细胞的基因组中的染色体的区段，该区段存在于DSB靶位点的任一侧上，或者作为另外一种选择，还包含DSB靶位点的一部分。基因组区域可包含至少5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-55、5-60、5-65、5-70、5-75、5-80、5-85、5-90、5-95、5-100、5-200、5-300、5-400、5-500、5-600、5-700、5-800、5-900、5-1000、5-1100、5-1200、5-1300、5-1400、5-1500、5-1600、5-1700、5-1800、5-1900、5-2000、5-2100、5-2200、5-2300、5-2400、5-2500、5-2600、5-2700、5-2800、5-2900、5-3000、5-3100或更多个碱基，使得基因组区域具有充分的同源性以与相应的同源性区域发生同源重组。
给定基因组区域和存在于供体DNA上的对应的同源性区域之间的结构相似性可为任何程度的序列同一性，其允许发生同源重组。例如，供体DNA的“同源性区域”和植物基因组的“基因组区域”共享的同源性或者序列同一性的量可为至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，使得序列发生同源重组。
供体DNA上的同源性区域可与DSB靶位点旁侧的任何序列具有同源性。虽然在一些实施方案中，同源性区域与紧邻靶位点旁侧的基因组序列共享显著的序列同源性，但应当认识到，同源性区域可被设计为与如下区域具有充分的同源性，该区域还可位于DSB靶位点的5′或3′处。在另外的实施方案中，同源性区域还可与DSB靶位点的片段连同下游基因组区域具有同源性。在一个实施方案中，第一同源性区域还包含DSB靶位点的第一片段并且第二同源性区域包含DSB靶位点的第二片段，其中第一片段和第二片段是相异的。
同源重组包括两个DNA分子之间在同源性位点处的DNA片段的交换。同源重组的频率受多个因素影响。不同的生物体在同源重组的量以及同源重组与非同源重组的相对比例方面不同。一般地讲，同源性区域的长度影响同源重组事件的频率，同源性区域越长，频率越高。为观察到同源重组而需要的同源性区域的长度也是随物种而异的。在许多情况下，至少5kb的同源性已被利用，但在少至25-50bp的同源性的情况下就已观察到同源重组。参见例如Singer等人，(1982)Cell 31：25-33；Shen和Huang，(1986)Genetics 112：441-57；Watt等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：4768-72；Sugawara和Haber，(1992)Mol CellBiol 12：563-75；Rubnitz和Subramani，(1984)Mol Cell Biol 4：2253-8；Ayares等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5199-203；Liskay等人，(1987)Genetics115：161-7。
一旦在DNA中诱导产生双链断裂，细胞的DNA修复机制就被激活以修复断裂。易错DNA修复机制可在双链断裂位点处产生突变。将断裂端连到一起的最常用修复机制是非同源末端连接(NHEJ)途径(Bleuyard等人，(2006)DNA Repair 5：1-12)。染色体的结构完整性通常通过修复来保持，但缺失、插入或其它重排都是可能的(Siebert和Puchta，(2002)Plant Cell 14：1121-31；Pacher等人，(2007)Genetics 175：21-9)。
另选地，双链断裂可通过同源DNA序列之间的同源重组来修复。一旦双链断裂周围的序列被改变，例如被参与双链断裂成熟的外切核酸酶活性改变，如果同源序列可用，如非分裂的体细胞中的同源染色体，或者DNA复制后的姐妹染色单体(Molinier等人，(2004)Plant Cell 16：342-52)，则基因转换途径可恢复初始结构。异位的和/或表成的DNA序列也可充当DNA修复模板用于同源重组(Puchta，(1999)Genetics 152：1173-81)。
DNA双链断裂似乎是刺激同源重组途径的有效因子(Puchta等人，(1995)PlantMol Biol 28：281-92；Tzfira和White，(2005)Trends Biotechnol 23：567-9；Puchta，(2005)J Exp Bot 56：1-14)。使用DNA断裂剂，在植物中人工构建的同源DNA重复序列之间观察到同源重组提高两倍至九倍(Puchta等人，(1995)Plant Mol Biol 28：281-92)。在玉米原生质体中，用线状DNA分子进行实验证明了质粒之间的同源重组增强(Lyznik等人，(1991)Mol Gen Genet 230：209-18)。
一旦通过DSB诱导剂(例如Cas9内切核酸酶)将双链断裂导入DSB靶位点中，则供体DNA的第一同源性区域和第二同源性区域可经历与其相应的同源性基因组区域的同源重组，从而在供体和基因组之间进行DNA交换。因此，所提供的方法导致：供体DNA的靶位点整合进植物基因组中的DSB靶位点中的双链断裂(参见例如图2D)中。
可通过本领域已知的任何方式导入供体DNA。例如，提供具有DSB靶位点的植物。供体DNA可通过本领域中已知的任何转化方法来提供，所述转化方法包括例如农杆菌介导的转化或基因枪粒子轰击。供体DNA可瞬时地存在于细胞中或其可通过病毒复制子导入。在DBS诱导剂和DBS靶位点的存在下，供体DNA被插入到转化的植物基因组中。
在一个实施方案中，所述方法是用于将位点特异性整合的转基因靶位点导入到植物细胞的基因组中的方法，所述方法包括：(a)提供在其基因组中包含Cas内切核酸酶的内源性靶位点的植物细胞；(b)提供Cas内切核酸酶和向导多核苷酸，其中Cas内切核酸酶能够与所述向导多核苷酸形成复合物，其中所述复合物能够在所述内源性靶位点处诱导双链断裂，并且其中内源性靶位点位于第一基因组区域与第二基因组区域之间；(c)提供供体DNA，该供体DNA包含位于与所述第一基因组区域同源的第一区域和与所述第二基因组区域同源的第二区域之间的位点特异性整合的转基因靶位点，其中转基因靶位点包含第一重组位点和第二重组位点，其中第一重组位点和第二重组位点相对于彼此是相异的；(d)使植物细胞与向导多核苷酸、供体DNA和Cas内切核酸酶接触；以及(e)鉴定来自(d)的至少一个植物细胞，该细胞在其基因组中包含在所述内源性靶位点处整合的转基因靶位点。
在一个实施方案中，Cas内切核酸酶的内源性靶位点选自SEQ ID NO：3-5、7-11、13-19、21-23、25-28、30-34、36-39、43-47、49-52、54-58、60、63-66、68-72、74-78、80-83、87-90、92-93、95-98、100-104、436-439、442-443、446-447、450-451、453-456、461-462、465-466、469-470、473-474、477-478、484-485、489-490、495-496、499-500、503-504、507-508、511-512和515-516或其功能性片段。
如先前部分所述，转基因SSI靶位点可以以在裂解的DSB靶位点处与基因组DNA经历同源重组的供体DNA提供，从而导致转基因SSI靶位点整合进植物细胞的基因组中。
转基因SSI靶位点可包含各种组分。术语“转基因SSI靶位点”、“位点特异性整合(SSI)的转基因靶位点”和“SSI的转基因靶位点”在本文可互换使用并且是指包含侧接有至少两个重组位点的核苷酸序列的多核苷酸。在一些实施方案中，转基因SSI靶位点的重组位点相对于彼此是相异的和不引起重组的。一个或多个间插序列可存在于转基因SSI靶位点的重组位点之间。特定目的间插序列将包括接头、衔接子、选择性标记、目的多核苷酸、启动子和/或有助于载体构建或分析的其它位点。此外，转基因SSI靶位点的重组位点可位于各种位置，包括例如内含子序列、编码序列、或非翻译区之内。
转基因SSI靶位点可包含1、2、3、4、5、6个或更多个重组位点。在一个实施方案中，转基因SSI靶位点包含第一重组位点和第二重组位点，其中第一重组位点和第二重组位点彼此是相异的和不引起重组的(参见，例如图2B中所示的转基因SSI靶位点)。在另一个实施方案中，转基因SSI靶位点在第一重组位点和第二重组位点之间包含第三重组位点。在此类实施方案中，第一重组位点、第二重组位点和第三重组位点可相对于彼此是相异的和不引起重组的。当提供有适当的重组酶时，此类第一重组位点、第二重组位点和第三重组位点能够与其对应或相同的重组位点重组。方法和组合物所涵盖的各种重组位点和重组酶在本文其它地方进行了详细描述。
本文所提供的方法和组合物中采用的重组位点可为“对应的”位点或“相异的”位点。“对应的重组位点”或“一组对应的重组位点”意味着重组位点具有相同或对应的核苷酸序列。一组对应的重组位点在适当重组酶的存在下将彼此有效地重组(即，对应的重组位点是引起重组的)。
在其它实施方案中，重组位点是相异的。“相异的重组位点”或“一组相异的重组位点”意味着重组位点是不同的(即，具有至少一个核苷酸差异)。
“一组相异的重组位点”内的重组位点可相对于彼此是引起重组或不引起重组的。“引起重组的”意味着能够彼此重组的重组位点的组。因此，用于本文提供的方法和组合物中的“引起重组的”重组位点的合适的组包括如下那些位点：在引起重组的位点之间重组的相对切除效率高于切除测定中标准条件下的检出限，通常超过2％、5％、10％、20％、50％、100％或更大。
“不引起重组的”意味着重组位点的组在适当重组酶的存在下将彼此不重组或者位点之间的重组是最小限度的。因此，用于本文提供的方法和组合物中的合适的“不引起重组的”的重组位点包括如下那些位点：以低于切除测定中标准条件下的检出限的频率彼此重组(或切除)，通常低2％、1.5％、1％、0.75％、0.5％、0.25％、0.1％、0.075、0.005％、0.001％。
“不引起重组的位点的组”内的各个重组位点呈生物活性并因而可与相同的位点重组。因此，应当认识到，可利用任何合适的不引起重组的重组位点，包括FRT位点或其活性变体、LOX位点或其活性变体、它们的任何组合、或本领域已知的不引起重组的重组位点的任何其它组合。可用于本文所公开的方法和组合物中的FRT位点可见于例如US公布2011-0047655，其以引用方式并入本文。
在一个具体的实施方案中，第一重组位点、第二重组位点和第三重组位点中的至少一者包括FRT1(SEQ ID NO：576)、FRT5(SEQ ID NO：577)、FRT6(SEQ ID NO：578)、FRT12(SEQ ID NO：579)或FRT87(SEQ ID NO：580)。在一个具体的实施方案中，第一重组位点是FRT1，第二重组位点是FRT12，并第三重组位点是FRT87。
所述方法还包括将转移盒导入到包含经整合的转基因SSI靶位点的植物细胞中。转移盒包含用于将目的多核苷酸掺入到植物基因组的各种组分。如本文所定义，“转移盒”至少包含第一重组位点、目的多核苷酸以及第二重组位点，其中第一重组位点和第二重组位点是相异的和不引起重组的并且对应于转基因SSI靶位点中的重组位点。转移盒还两侧紧邻重组位点。应当认识到，可在转移盒中采用限制性位点的任何组合以提供目的多核苷酸。
在一个实施方案中，转移盒包含第一重组位点、第一目的多核苷酸、以及第二重组位点。在此类方法中，转移盒的第一重组位点和第二重组位点分别与(即，相同或对应的)转基因SSI靶位点的第一重组位点和第二重组位点发生重组。
转移盒的重组位点可直接与目的多核苷酸接续或者可能有一个或多个间插序列存在于目的多核苷酸和重组位点的一端或两端之间。特定目的间插序列将包括接头、衔接子、附加的目的多核苷酸、标记、启动子和/或有助于载体构建或分析的其它位点。应当进一步认识到，重组位点可包含于目的多核苷酸之内(即，诸如内含子、编码序列、或非翻译区之内)。
在一个具体的实施方案中，转移盒还包含至少一个可操作地连接至启动子的编码区，该启动子在植物细胞中驱动表达。如本文别处所述，提供了在转基因SSI靶位点和转移盒的重组位点处识别并实现重组的重组酶。可通过任何本领域已知的手段提供重组酶并且在本文其它地方进行了详细描述。在一个具体的实施方案中，转移盒的编码区编码有利于在转移盒和转基因SSI靶位点的第一重组位点和第二重组位点、转移盒和转基因SSI靶位点的第二重组位点和第三重组位点、或转移盒和转基因SSI靶位点的第一重组位点和第三重组位点之间的重组的重组酶。
本领域中已知用于选择在转基因SSI靶位点处具有整合的植物细胞的方法，例如选择表达选择性标记的细胞。因此，所述方法还包括从植物细胞再生出能育植物，该植物细胞在其基因组中的转基因SSI靶位点处包含转移盒。
可将在本文所公开的方法的转移盒、转基因SSI靶位点中或直接在DSB靶位点中的任何目的多核苷酸(即，“目的多肽”)提供给植物细胞。应当认识到，可通过位点特异性整合将任何目的多核苷酸均提供、整合进植物基因组中的转基因SSI靶位点处，或者直接提供、整合进如本文所述的DSB靶位点并且在植物中表达。本文所公开的方法提供待整合进植物基因组中的特定位点中的至少1、2、3、4、5、6个或更多个目的多核苷酸。
在一个实施方案中，所述方法是将目的多核苷酸整合进植物细胞基因组中的转基因靶位点的方法，所述方法包括：(a)提供至少一种在其基因组中包含位点特异性整合的转基因靶位点的植物细胞，其中转基因靶位点被整合进Cas内切核酸酶的内源性靶位点，并且其中转基因靶位点是(i)包含第一重组位点和第二重组位点的靶位点；或者(ii)在第一重组位点与第二重组位点之间还包含第三重组位点的(i)的靶位点，其中Cas内切核酸酶能够在内源性的靶位点中诱导双链断裂，其中第一重组位点、第二重组位点和第三重组位点相对于彼此是相异的；(b)将转移盒导入到(a)的植物细胞中，该转移盒包含(iii)第一重组位点、第一目的多核苷酸和第二重组位点，(iv)第二重组位点、第二目的多核苷酸和第三重组位点，或者(v)第一重组位点、第三目的多核苷酸、和第三重组位点；(c)提供在第一重组位点和第二重组位点处、在第二重组位点和第三重组位点处、或在第一重组位点和第三重组位点处识别并实现重组的重组酶；以及(d)选择至少一个植物细胞，该细胞在靶位点处包含整合的转移盒。
在一个实施方案中，方法是将目的多核苷酸整合进在其基因组中具有基因组窗口的植物中的方法，所述基因组窗口包含至少一个Cas9内切核酸酶靶位点，所述方法包括：(a)提供至少一种植物细胞，该植物细胞包含位于所述基因组窗口中的Cas内切核酸酶的靶位点；(b)提供Cas内切核酸酶和向导多核苷酸，其中Cas内切核酸酶能够与所述向导多核苷酸形成复合物，其中所述复合物能够在所述Cas9内切核酸酶靶位点处诱导双链断裂，并且其中Cas9内切核酸酶靶位点位于第一基因组区域与第二基因组区域之间；(c)提供供体DNA，该供体DNA包含位于与所述第一基因组区域同源的第一区域和与所述第二基因组区域同源的第二区域之间的目的多核苷酸；(d)使植物细胞与向导多核苷酸、供体DNA和Cas内切核酸酶接触；以及(e)鉴定来自(d)的至少一个植物细胞，该细胞在其基因组中包含在所述Cas9内切核酸酶靶位点处整合的目的多核苷酸。
表型上的多种变化是所关注的，包括植物中脂肪酸(油)组合物的修饰、植物氨基酸含量的变化、植物的病原体抵御机制的变化等等。可通过提供植物中异源的产物(即目的多核苷酸)的表达或内源性产物提高的表达来实现这些结果。作为另外一种选择，可以通过提供减少一种或多种内源性产物(特别是植物中的酶或辅因子)的表达来实现其结果。这些变化导致转化的植物的表型变化。
在一个实施方案中，第一目的多核苷酸、第二目的多核苷酸、以及第三目的多核苷酸中的至少一者包含用于基因沉默的核苷酸序列、编码表型标记的核苷酸序列、或编码提供农学优势的蛋白质的核苷酸序列。
目的多核苷酸反映出作物开发参与者的商业市场和利益。目的作物和市场在变化，随着发展中国家开放了世界市场，也将出现新的作物和技术。另外，随着我们对农学性状和特性诸如产量和杂种优势的理解逐渐深入，选择进行转化的基因会相应变化。目的多核苷酸/多肽包括但不限于除草剂耐受性编码序列、杀昆虫编码序列、杀线虫编码序列、抗微生物编码序列、抗真菌编码序列、抗病毒编码序列、非生物和生物胁迫耐受性编码序列、或修饰植物性状例如产量、籽粒质量、营养成分、淀粉质量和数量、固氮和/或氮利用、以及含油脂含量和/或油组成的序列。更具体的目的多核苷酸包括但不限于改善作物收率的基因，改善作物合意性的多肽，编码赋予对非生物胁迫(诸如干旱、氮、温度、盐度、有毒金属或微量元素)的抗性的蛋白或者赋予对毒素(诸如杀虫剂和除草剂)的抗性的那些蛋白或者赋予对生物胁迫(诸如真菌、病毒、细菌、昆虫和线虫入侵)的抗性及对与这些生物体相关联疾病的发展的抗性的那些蛋白的基因。
“除草剂抗性蛋白”或由“除草剂抗性编码核酸分子”表达生成的蛋白质包括这样的蛋白质，其赋予细胞与未表达该蛋白质的细胞相比耐受更高浓度除草剂的能力，或赋予细胞与未表达该蛋白质的细胞相比对某种浓度除草剂耐受更长时间的能力。除草剂抗性性状可通过如下基因导入到植物中：编码对乙酰乳酸合酶(ALS)起到抑制作用的除草剂(特别是磺酰脲类除草剂)的抗性的基因、编码对谷氨酰胺合酶起到抑制作用的除草剂例如膦丝菌素或basta的抗性的基因(如，bar基因)、对草甘膦的抗性的基因(如，EPSP合酶基因和GAT基因)、对HPPD抑制剂的抗性的基因(如，HPPD基因)或本领域已知的其它这类基因。参见例如美国专利7,626,077、5,310,667、5,866,775、6,225,114、6,248,876、7,169,970、6,867,293和美国临时申请61/401,456，将所述专利每一者以引用的方式并入本文。
除了使用传统的育种方法外，还可通过遗传方式改变农学上重要的性状，诸如油含量、淀粉含量和蛋白质含量。修饰包括增加油酸、饱和及不饱和油的含量，提升赖氨酸和硫的水平，提供必需氨基酸，以及修饰淀粉。在美国专利5,703,049、5,885,801、5,885,802和5,990,389中描述了Hordothionin蛋白修饰，这些专利都以引用方式并入本文。另一个示例是美国专利5,850,016中所述的由大豆2S白蛋白基因编码的富含赖氨酸和/或富含硫的种子蛋白，以及Williamson等人(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106中描述的来自大麦的胰凝乳蛋白酶抑制剂，这些文献的公开内容都以引用方式并入本文。
商业性状也能被编码在目的多核苷酸上，其能够增加例如，用于乙醇生产的淀粉，或提供蛋白的表达。转化的植物的另一个重要商业用途是生产聚合物和生物塑料诸如美国专利5,602,321中所述的。基因诸如β-酮硫酶、PHBase(聚羟基丁酸酯合酶)、以及乙酰乙酰辅酶A还原酶(参见Schubert等人(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)有利于聚羟基链烷酸酯(PHA)的表达。
可通过定点诱变产生编码序列的衍生物，以增加预选氨基酸在所编码的多肽中的水平。例如，编码大麦高赖氨酸多肽(BHL)的基因源自大麦胰凝乳蛋白酶抑制剂(1996年11月1日提交的美国申请序列号08/740,682，以及WO 98/20133，这些专利的公开内容以引用方式并入本文)。其它蛋白包括富含甲硫氨酸的植物蛋白，诸如来自向日葵种子的蛋白(Lilley等人(1989)Proceedings of the World Congress on Vegetable ProteinUtilization in Human Foods and Animal Feedstuffs，Applewhite编辑(American OilChemists Society，Champaign，Illinois)，第497-502页)；将该文献以引用方式并入本文)；来自玉米的蛋白(Pedersen等人(1986)J.Biol.Chem.261：6279)；Kirihara等人(1988)Gene 71：359；这些文献都以引用方式并入本文)；以及来自稻的蛋白(Musumura等人(1989)Plant Mol.Biol12：123，该文献以引用方式并入本文)。其它农学上重要的基因编码胶乳、Floury 2、生长因子、种子贮藏因子和转录因子。改善作物收率的多核苷酸包括矮化基因，诸如Rht1和Rht2(Peng等人(1999)Nature 400：256-261)，以及增加植物生长的那些，诸如铵诱导型谷氨酸脱氢酶。改善作物合意性的多核苷酸包括例如允许植物具有减少的饱和脂肪含量的那些多核苷酸、提高植物营养价值的那些多核苷酸、以及增加谷粒蛋白的那些多核苷酸。改善耐盐性的多核苷酸是增加或允许植物在与已导入耐盐基因的该植物的天然环境相比更高盐度的环境中生长的那些多核苷酸。
影响氨基酸生物合成的多核苷酸/多肽包括例如邻氨基苯甲酸盐合酶(AS；EC4.1.3.27)，该酶催化植物、真菌和细菌中从芳族氨基酸途径分支到色氨酸生物合成的第一反应。在植物中，色氨酸的生物合成的化学过程是区室化于叶绿体中的。参见例如美国公布20080050506，这篇文献以引用方式并入本文。另外的目的序列包括分支酸丙酮酸裂解酶(CPL)，其是指编码催化分支酸转化为丙酮酸和pHBA的酶的基因。表征最充分的CPL基因已从大肠杆菌(E.coli)中分离并具有GenBank登录号M96268。参见美国专利7,361,811，其以引用方式并入本文。
这些目的多核苷酸序列可编码涉及提供病害或害虫抗性的蛋白。所谓“病害抗性”或“害虫抗性”意指植物避开作为植物-病原体相互作用的后果的有害症状。害虫抗性基因可编码对严重导致收率下降的害虫诸如根虫、切根虫、欧洲玉米螟等的抗性。病害抗性基因和昆虫抗性基因，诸如用于抗细菌保护的溶菌酶或天蚕抗菌肽(cecropin)，或者用于抗真菌保护的蛋白质诸如防御素、葡聚糖酶或几丁质酶，或者用于防治线虫或昆虫的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)内毒素、蛋白酶抑制剂、胶原酶、凝集素或糖苷酶，都是可用的基因产物的示例。编码病害抗性性状的基因包括解毒基因，诸如针对伏马毒素(fumonisin)的解毒基因(美国专利5,792,931)；无毒性(avr)和病害抗性(R)基因(Jones等人(1994)Science266：789；Martin等人(1993)Science 262：1432；和Mindrinos等人(1994)Cell78：1089)；等等。
此外，已经认识到目的多核苷酸可还包含与所靶向的目的基因序列的信使RNA(mRNA)的至少一部分互补的反义序列。构建反义核苷酸以与对应的mRNA杂交。可对反义序列作出修饰，只要该序列能与对应的mRNA杂交并干扰其表达。以此方式，可使用与对应的反义序列具有70％、80％或85％序列同一性的反义构建体。此外，反义核苷酸的部分可用来破坏靶基因的表达。一般而言，可使用至少50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸或更多个核苷酸的序列。
另外，目的多核苷酸还可以有义取向使用来抑制植物中的内源性基因的表达。用有义取向的多核苷酸抑制植物中的基因表达的方法是本领域已知的。该方法通常涉及用包含这样的启动子的DNA构建体转化植物，该启动子可操作地连接至对应于该内源性基因的转录物的核苷酸序列的至少一部分，能驱动在植物中的表达。通常，这种核苷酸序列与内源性基因的转录物的序列具有实质的序列同一性，通常高于约65％的序列同一性、约85％的序列同一性或高于约95％的序列同一性。参见美国专利5,283,184和5,034,323；将这些专利以引用方式并入本文。
目的多核苷酸还可以是表型标记。表型标记是可筛选或可选择的标记，其包括可视标记和选择性标记，无论它是阳性还是阴性选择性标记。可使用任何表型标记。具体地讲，可选择的或可筛选的标记包含这样的DNA区段，该DNA区段使得可以常常在特定条件下鉴定或选取或者不选取含有它的分子或细胞。这些标记可编码活性，诸如但不限于RNA、肽或蛋白质的产生，或者可为RNA、肽、蛋白质、无机和有机化合物或组合物等提供结合位点。
选择性标记的示例包括但不限于包含限制性酶位点的DNA区段；编码提供对于有毒化合物的抗性的产物的DNA区段，所述有毒化合物包括抗生素，诸如壮观霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、Basta、新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)；编码另外缺乏受体细胞的产物的DNA区段(例如，tRNA基因、营养缺陷标记)；编码可易于鉴定的产物的DNA区段(例如，表型标记，诸如β-半乳糖苷酶、GUS；荧光蛋白，诸如绿色荧光蛋白(GFP)，青色荧光蛋白(CFP)，黄色荧光蛋白(YFP)，红色荧光蛋白(RFP)，以及细胞表面蛋白)；生成用于PCR的新引物位点(例如，之前尚未并置的两个DNA序列的并置)的DNA区段；包含未受限制性内切核酸酶或其它DNA修饰酶、化学品等作用或受其作用的DNA序列的DNA区段；以及包含特异性修饰(例如，甲基化)所需的DNA序列的DNA区段，该特异性修饰使得可以鉴别该DNA序列。
另外的选择性标记包括能赋予对除草化合物如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的抗性的基因。
可以以多种方式采用位点特异性重组系统来操纵已在DSB转基因SSI靶位点处整合的转基因SSI靶位点。位点特异性重组系统采用在下文和美国专利6187994、6262341、6331661和6300545中详细描述的各种组分，这些专利中的每一者都以引用方式并入本文。
各种重组位点可用于本文提供的方法和组合物中(即，本文所公开的各种转基因SSI靶位点或转移盒中)。“重组位点”意指天然存在的重组位点及其活性变体。许多重组系统在本领域中是已知的，并且技术人员将认识到将适当的重组位点与目的重组系统一起使用。如本文所讨论，可采用重组位点的各种组合，包括可用于本文提供的各种方法中的相异的位点和对应的重组位点和/或相异的和不引起重组的位点的组。因此，本文可利用任何合适的重组位点或重组位点的组，包括FRT位点、FRT位点的生物活性变体(即突变FRT位点)、LOX位点、LOX位点的生物活性变体(即突变LOX位点)、它们的任何组合、或本领域已知的重组位点的任何其它组合。FRT位点的示例包括但不限于例如野生型FRT位点(FRT1，SEQ IDNO：576)以及各种突变FRT位点，包括但不限于FRT5(SEQ ID NO：577)、FRT6(SEQ ID NO：578)、FRT12(SEQ ID NO：579)和FRT87(SEQ ID NO：580)。参见例如美国专利6,187,994以及在美国专利8,318493中描述的FRT62。
还可使用来自Cre/Lox位点特异性重组系统的重组位点。此类重组位点包括例如野生型LOX位点和突变LOX位点。突变LOX位点的重组活性的分析示出于Lee等人(1998)Gene216：55-65，以引用方式并入本文。另外参见例如Schlake和Bode(1994)Biochemistry 33：12746-12751；Huang等人，(1991)Nucleic Acids Research 19：443-448；Sadowski(1995)In Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology，第51卷，第53-91页；Cox(1989)In Mobile DNA，Berg和Howe(编辑)American Society of Microbiology，Washington D.C.，第116-670页；Dixon等人，(1995)Mol.Microbiol.18：449-458；Umlauf和Cox(1988)EMBO 7：1845-1852；Buchholz等人(1996)Nucleic Acids Research 24：3118-3119；Kilby等人(1993)Trends Genet.9：413-421；Rossant和Geagy(1995)Nat.Med.1：592-594；Albert等人(1995)The Plant J.7：649-659；Bayley等人(1992)Plant Mol.Biol18：353-361；Odell等人(1990)Mol.Gen.Genet.223：369-378；Dale和Ow(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10558-10562；Qui等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：1706-1710；Stuurman等人(1996)Plant Mol.Biol32：901-913；Dale等人(1990)Gene 91：79-85；Albert等人(1995)The Plant J.7：649-659和WO 01/00158；这些文献均以引用方式并入本文。
本文提供的组合物和方法还涵盖重组位点的活性变体和片段(即，SEQ ID NO：576-580)。重组位点的片段保留重组位点的生物活性并从而有利于适当重组酶存在下的重组事件。因此，重组位点的片段可在至少约5、10、15、20、25、30、35、40个核苷酸以及至多全长重组位点的范围内。活性变体可与天然重组位点具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，其中该活性变体保留生物活性并因而有利于适当重组酶存在下的重组事件。用于测量重组位点的生物活性的测定法在本领域中是已知的。参见例如Senecoll等人(1988)J.Mol.Biol201：406-421；Voziyanov等人(2002)Nucleic Acid Research 30：7，美国专利6,187,994，WO/01/00158，以及Albert等人(1995)The Plant Journal 7：649-659。
重组酶也可用于本文提供的方法和组合物中。“重组酶”意指催化相容重组位点之间进行位点特异性重组的天然多肽。对于位点特异性重组酶的综述，参见Sauer(1994)Current Opinion in Biotechnology 5：521-527；以及Sadowski(1993)FASEB 7：760-767；其内容以引用方式并入本文。在方法中所用的重组酶可为天然存在的重组酶或重组酶的生物活性片段或变体。在方法和组合物中可用的重组酶包括来自整合酶和解离酶家族的重组酶、它们的生物活性变体和片段、以及催化指定的DNA重组位点之间保守位点特异性重组的任何其它天然存在或重组产生的酶或其变体。
重组酶的整合酶家族具有超过一百个成员并且包括例如FLP、Cre、Int和R。对于整合酶家族的其它成员，参见例如Esposito等人(1997)Nucleic Acid Research 25：3605-3614以及Abremski等人(1992)Protein Engineering5：87-91，这两者均以引用方式并入本文。其它重组系统包括例如，链霉菌属噬菌体phi C31(Kuhstoss等人(1991)J.Mol.Biol.20：897-908)；来自于希氏硫化叶菌(Sulfolobus shibatae)的SSV1位点特异性重组系统(Maskhelishvili等人(1993)Mol.Gen.Genet.237：334-342)；以及基于逆转录病毒整合酶的整合系统(Tanaka等人(1998)Gene 17：67-76)。在其它实施方案中，重组酶不需要辅因子或超螺旋底物。此类重组酶包括Cre、FLP、或它们的活性变体或片段。
FLP重组酶是催化位点特异性反应的蛋白质，其在DNA复制期间参与扩增酿酒酵母(cerevisiae)2μ质粒的拷贝数。如本文所用，FLP重组酶是指催化两个FRT位点之间位点特异性重组的重组酶。FLP蛋白质已被克隆和表达。参见例如Cox(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.US.A.80：4223-4227。在方法中使用以及与组合物一起使用的FLP重组酶来源于酵母属(Saccharomyces)。还可使用植物优选的密码子来合成包括重组酶的多核苷酸以在从所关注的植物中优化表达。催化位点特异性重组事件的由包含玉米优选的密码子(FLPm)的核苷酸序列编码的重组FLP酶是已知的。参见例如美国专利5,929,301，该专利以引用方式并入本文。FLP的附加功能性变体和片段是已知的。参见例如Buchholz等人(1998)Nat.Biotechnol.16：617-618，Hartung等人(1998)J.Biol.Chem.273：22884-22891，Saxena等人(1997)Biochim Biophys Acta 1340(2)：187-204，以及Hartley等人(1980)Nature 286：860-864，这些文献均以引用方式并入本文。
噬菌体重组酶Cre催化两个lox位点之间的位点特异性重组。Cre重组酶是本领域已知的。参见例如Guo等人(1997)Nature 389：40-46；Abremski等人(1984)J.Biol.Chem.259：1509-1514；Chen等人(1996)Somat.Cell Mol.Genet.22：477-488；Shaikh等人(1977)J.Biol.Chem.272：5695-5702；以及Buchholz等人(1998)Nat.Biotechnol.16：617-618，这些文献均以引用方式并入本文。Cre多核苷酸序列也可使用植物优选的密码子合成。此类序列(moCre)在WO 99/25840中有所描述，其以引用方式并入本文。
还应当认识到，可在方法中使用嵌合重组酶。所谓“嵌合重组酶”意指能够在来源于不同重组系统的重组位点之间催化位点特异性重组的重组融合蛋白。换言之，如果一组功能性重组位点(被描述为相对于彼此是相异的和不引起重组的)用于方法和组合物中并且包括FRT位点和LoxP位点，则将需要嵌合FLP/Cre重组酶或其活性变体或片段，或者另选地可分别提供这两种重组酶。用于制备和使用此类嵌合重组酶或其活性变体或片段的方法在WO 99/25840中有所描述，其以引用方式并入本文。
通过利用本文所提供的转基因SSI靶位点和转移盒中的重组位点的各种组合，方法提供了将目的多核苷酸位点特异性整合进植物基因组的特异性位点中的机制。方法还使得另外的目的多核苷酸能够随后插入到特异性基因组位点中。
在一个实施方案中，提供重组酶包括将编码重组酶的核苷酸序列整合进植物细胞的基因组中。在一个具体的实施方案中，重组酶是FLP。在另一个实施方案中，FLP重组酶使用玉米优选的密码子或大豆优选的密码子合成。
如本文所用，“提供”可包括允许将氨基酸序列和/或多核苷酸连同所述的组分聚集在一起的任何方法。将核苷酸序列导入植物中的各种方法在本领域中是已知的。可用于将重组系统(即，转基因SSI靶位点，转移盒和合适的重组酶)的各种组分聚集在一起的任何方式包括例如转化和有性杂交。另参见WO99/25884，其以引用方式并入本文。此外，如本文别处所述，重组酶还可通过将多肽或mRNA导入到细胞中来提供。
本文提供的组合物和方法还涵盖重组酶(即FLP或Cre)的活性变体和片段。这类活性变体可与天然重组酶具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，其中所述活性变体保留生物活性并因而实现重组事件。重组酶活性的测定法是已知的，通常是测量该酶对含有重组位点的DNA底物的总体活性。
如本文所讨论，可使用各种方法来将目的多核苷酸插入到植物或植物细胞中的转基因SSI靶位点中。可用于将目的多核苷酸插入到植物或植物细胞中的各种DNA构建体、转基因SSI靶位点和转移盒的非限制性示例在2012年7月18日提交的PCT/US12/47202申请中有所描述，该申请全文以引用方式并入本文。简而言之，一旦转基因SSI靶位点已整合进DSB靶位点中或者一旦转移盒已整合进转基因SSI靶位点中，就可采用适当的选择剂来鉴定具有期望的DNA构建体的植物细胞。一旦在基因组内建立转基因SSI靶位点，就可通过将此类位点掺入转移盒的核苷酸序列之内来导入附加的重组位点。因此，一旦建立转基因SSI靶位点，就可随后通过重组添加或改变位点。此类方法详细描述于WO 99/25821，其以引用方式并入本文。
在一个实施方案中，可使多个基因或目的多核苷酸叠堆在植物基因组中的转基因SSI靶位点处。例如，如表1方案D所示，在DSB靶位点处整合的转基因SSI靶位点可包括以下组分：RSF1：：P1：：R1：：S1：：T1-P2：：NT1：：T2-P3：：R2-R3：：RSF2，其中RSF是DSB靶位点的片段，P是植物中有活性的启动子，R是重组位点，S是选择标记，T是终止区，并且NT是目的多核苷酸。可导入包含以下组分的以下转移盒：R2：：S2：：T3-P4：：NT2：：T4-R3(RSF＝DSB靶位点片段；P＝植物中有活性的启动子；R＝重组位点；S＝选择标记；T＝终止区；NT＝目的多核苷酸；符号：：意味着相邻元件之间的融合并且意味着序列被放在一起以产生导致适当表达和功能性基因产物的框内融合)。然后，基于第二选择标记，可选择具有该种整合于转基因SSI靶位点处的转移盒的植物。这样，多个序列可叠堆于转基因SSI靶位点的预定位置处。可对上述叠堆方法作出各种改变，并且这仍实现在植物基因组中具有堆叠的目的多核苷酸的期望结果。
本文提供了如下方法和组合物：结合DSB-诱导剂系统例如向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统(如描述于2014年8月20日提交的美国专利申请14/463687，该申请全文以引用方式并入本文，以及2014年8月20日提交的美国专利申请14/463691，该申请全文以引用方式并入本文)与位点特异性重组酶系统，这允许例如用于将目的序列靶向插入植物基因组中的方法和组合物得到改善。本文提供的方法包括将转基因SSI靶位点导入到植物细胞的基因组的DSB靶位点中，其中转基因SSI靶位点可任选地包含目的多核苷酸。
“导入”是指将转基因SSI靶位点以此类方式给予植物：使序列进入植物细胞内部。将序列导入植物中的方法是现有技术已知的并且包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法、病毒介导的方法、以及有性繁殖。因此，在将核酸片段(例如，本文提供的位点特异性整合系统的各种组分)插入细胞中的语境中，“导入”意指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括指代将核酸片段掺入到真核或原核细胞中，其中该核酸片段可掺入到细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转化成自主复制子或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。
在一些实施方案中，方法和组合物中所用的植物细胞、植物和种子具有稳定掺入其基因组中的DNA构建体。“稳定掺入”或“稳定导入”意指将多核苷酸导入到植物中，使得核苷酸序列整合进植物基因组中并且能够被其子代继承。任何规程均可用于稳定掺入DNA构建体或本文所用的位点特异性整合系统的各种组分。
转化规程以及用于将多肽或多核苷酸序列导入植物内的规程可以根据被作为转化目标的植物或植物细胞的类型，例如单子叶植物或双子叶植物而改变。将多肽和多核苷酸导入植物细胞中的合适方法包括显微注射(Crossway等人，(1986)Biotechniques 4：320-334)、电穿孔(Riggs等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606)、农杆菌介导转化(美国专利5,563,055和美国专利5,981,840)、直接基因转移(Paszkowski等人(1984)EMBO J.3：2717-2722)，以及弹道粒子加速(参见，例如，美国专利4,945,050；美国专利5,879,918；美国专利5,886,244以及5,932,782；Tomes等人(1995)，Plant Cell，Tissueand Organ Culture：Fundamental Methods，Gamborg和Phillips编辑(Springer-Verlag，Berlin)；McCabe等人(1988)Biotechnology 6：923-926)；以及Lecl转化(WO 00/28058)。也参见Weissinger等人，(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477；Sanford等人(1987)Particulate Science and Technology 5：27-37(洋葱)；Christou等人，(1988)PlantPhysiol.87：671-674(大豆)；McCabe等人(1988)Bio/Technology 6：923-926(大豆)；Finer和McMullen(1991)，Vitro Cell Dev.Biol27P：175-182(大豆)；Singh等人(1998)Theor.Appl.Genet.96：319-324(大豆)；Datta等人(1990)Biotechnology 8：736-740(稻)；Klein等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：4305-4309(玉米)；Klein等人(1988)Biotechnology 6：559-563(玉米)；美国专利5,240,855；5,322,783；和5,324,646；Klein等人(1988)Plant Physiol.91：440-444(玉米)；Fromm等人(1990)Biotechnology 8：833-839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren等人(1984)Nature(London)311：763-764；美国专利5,736,369(谷类)；Bytebier等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349(百合科)；De Wet等人(1985)，The Experimental Manipulation of Ovule Tissues，Chapman等人编辑，(Longman，New York)，第197-209页(花粉)；Kaeppler等人(1990)Plant Cell Reports9：415-418和Kaeppler等人(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(颈须介导的转化)；D′Halluin等人(1992)Plant Cell 4：1495-1505(电穿孔)；Li等人(1993)Plant CellReports 12：250-255以及Christou和Ford(1995)Annals of Botany 75：407-413(稻)；Osjoda等人(1996)Nature Biotechnology 14：745-750(通过农杆菌介导的玉米)；这些专利均以引用方式并入本文。
在其它实施方案中，也可通过使植物与病毒或病毒核酸接触来将本文所用的任何多核苷酸导入到植物中。一般地讲，这种方法涉及将期望的多核苷酸掺入在病毒DNA或RNA分子内。应当认识到，本文提供的方法或组合物中所用的序列可最初作为病毒多聚蛋白的一部分被合成，它们随后可通过体内或体外蛋白质水解进行加工以产生期望的重组蛋白质。此外，应当认识到本文所用的启动子也包括用于病毒RNA聚合酶转录的启动子。涉及病毒DNA或RNA分子的用于将多核苷酸导入植物中并且表达其中编码的蛋白的方法是本领域已知的。参见例如美国专利5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367、5,316,931以及Porta等人(1996)Molecular Biotechnology 5：209-221；以引用方式并入本文。
在其它实施方案中，可使用各种瞬时转化方法将位点特异性整合系统的各种组分提供给植物。“瞬时转化”旨在表示将多核苷酸导入宿主(即植物)中并暂时表达。此类瞬时转化方法包括但不限于将位点特异性整合系统的任何组分或其活性片段或变体直接导入到植物中或者将转录物导入到植物中。此类方法包括例如显微注射法或粒子轰击法。参见例如，Crossway等人(1986)Mol Gen.Genet.202：179-185；Nomura等人(1986)PlantSci.44：53-58；Hepler等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91：2176-2180，以及Hush等人(1994)The Journal of Cell Science 107：775-784，所有文献以引用方式并入本文。作为另外一种选择，可使用本领域已知的技术将多核苷酸瞬时转化至植物中。此类技术包括病毒载体系统和以排除后续DNA释放的方式沉淀多核苷酸。因此，来自粒子结合的DNA的转录可以进行，但其被释放以整合至基因组中的频率大大降低了。此类方法包括使用涂覆有聚乙基亚胺(PEI；Sigma#P3143)的粒子。
已经被转化的细胞可根据常规方法生长为植物。参见例如，McCormick等人(1986)McCormick 5：81-84。然后可培养这些植物，并用相同的或不同的转化过的植株进行授粉，具有所期望表型特征的组成型表达的所得到的子代被鉴定。可以生长两代或更多代以保证所期望的表型特征的表达稳定地保持和遗传，然后收获种子以保证所期望的表型特征的表达已经实现。这样，提供具有稳定掺入其基因组中的所述DNA构建体的转化的种子。
在一个实施方案中，具有在DSB靶位点处整合的转基因SSI靶位点的植物细胞、植物、植物部分和种子包含转基因SSI靶位点，所述转基因SSI靶位点以下列次序包含第一重组位点、第二重组位点，并且其中第一重组位点和第二重组位点相对于彼此是相异的和不引起重组的。转基因SSI靶位点还可包含在第一重组位点和第二重组位点之间的目的多核苷酸。重组位点可为本领域已知的重组位点的任何组合。例如，重组位点可为FRT位点、突变的FRT位点、LOX位点或突变的LOX位点。
在一个具体的实施方案中，植物细胞、植物、植物部分和种子的转基因SSI靶位点还包含在第一重组位点和第二重组位点之间的第三重组位点，其中第三重组位点对于第一重组位点和第二重组位点是相异的和不引起重组的。第一重组位点、第二重组位点和第三重组位点可包括例如FRT1、FRT5、FRT6、FRT12、FRT62(描述于2012年11月27日提交的美国专利US8318493，以引用方式并入本文)、或FRT87。另外，本发明提供植物细胞、植物、或种子，其中第一重组位点是FRT1，第二重组位点是FRT12，并且第三重组位点是FRT87。
如本文所用，术语植物包括植物细胞、植物原生质体、植物可由此再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物，植物丛生物、以及在植物或植物部分中完整的植物细胞如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、仁、穗、芯、壳、茎、根、根尖、花药等。谷物旨在表示商业化种植者出于栽培或繁殖物种之外的目的生产的成熟种子。再生植物的子代、变体和突变体也包括在本文内，前提条件是这些部分包含所述的DNA构建体。
转基因植物包括例如这样的植物，该植物在其基因组内包含通过转化步骤导入的异源多核苷酸。异源多核苷酸能被稳定地整合进基因组中，使得该多核苷酸传递至连续的世代。异源多核苷酸可单独地或作为重组DNA构建体的一部分而被整合进基因组中。转基因植物还可在其基因组内包含不止一个异源多核苷酸。每个异源多核苷酸可赋予转基因植物不同性状。异源多核苷酸可包括源自外来物种的序列，或者，如果源自相同物种，则可为对其天然形式进行了实质性修饰的序列。“转基因”可包括其基因型已因异源核酸的存在而改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初经如此改变的转基因植物以及通过有性杂交或无性繁殖从最初的转基因植物产生的那些。通过常规植物育种方法，通过本文所述的不导致外来多核苷酸插入的基因组编辑程序，或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)改变不旨在被认为是转基因的。
在本公开的某些实施方案中，能育植物是能产生活的雄配子和雌配子并且自身能育的植物。这种自身能育植物可在没有任何其它植物贡献配子及其中所含的遗传物质的情况下产生子代植物。本公开的其它实施方案可涉及使用不是自身能育的植物，因为该植物不产生活的或者能够授受精的雄配子或雌配子，或者两者。如本文所用，“雄性不育植物”是不产生活的或者能够授精的雄配子的植物。如本文所用，“雌性不育植物”是不产生活的或者能够受精的雌配子的植物。应当认识到，雄性不育植物和雌性不育植物可以分别是雌性能育和雄性能育的。还应认识到，雄性能育(但雌性不育)植物当与雌性能育植物杂交时可产生活的子代，而雌性能育(但雄性不育)植物当与雄性能育植物杂交时可产生活的子代。
本文所提供的位点特异性整合系统的组分可用于转化任何植物物类，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。所关注的植物物类的示例包括但不限于玉米(玉蜀黍)(Zeamays)、芸苔属物种(例如，B.napus、B.rapa、B.juncea)，具体地讲可用作种子油来源的那些云苔属物种、苜蓿(Medicago sativa)、稻(Oryza sativa)、黑麦(Secale cereale)、高粱(Sorghum bicolor、Sorghum vulgare)、粟(例如，珍珠粟(Pennisetum glaucum)、黍(Panicum miliaceum)、谷子(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、红花(Carthamus tinctorius)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、土豆(Solanum tuberosum)、花生(Arachishypogaea)、棉花(Gossypium barbadense、Gossypium hirsutum)、甘薯(Ipomoeabatatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Coffea属物种)、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Ananas comosus)、柑橘树(Citrus属物种)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camelliasinensis)、香蕉(Musa属物种)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(Olea europaea)、番木瓜(Caricapapaya)、腰果(Anacardium occidentale)、夏威夷果(Macadamia integrifolia)、杏仁(Prunus amygdalus)、甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(Saccharum属物种)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。
蔬菜包括西红柿(Lycopersicon esculentum)、莴苣(例如叶用莴苣(Lactucasativa))、菜豆(Phaseolus vulgaris)、利马豆(Phaseolus limensis)、豌豆(香豌豆属物种(Lathyrus spp.))、和黄瓜属物种如黄瓜(C.sativus)、香瓜(C.cantalupensis)和甜瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹃花(Rhododendron属物种)、八仙花(Macrophyllahydrangea)、木槿(Hibiscus rosasanensis)、蔷薇(Rosa属物种)、郁金香(Tulipa属物种)、水仙花(Narcissus属物种)、矮牵牛花(Petunia hybrida)、康乃馨(Dianthuscaryophyllus)、一品红(Euphorbia pulcherrima)和菊花。
可采用的针叶树包括例如，松树如火炬松(Pinus taeda)、湿地松(Pinuselliotii)、西黄松(Pinus ponderosa)、黑松(Pinus contorta)以及辐射松(Pinusradiata)；花旗松(Pseudotsuga menziesii)；西部铁杉(Tsuga canadensis)；西加云杉(Picea glauca)；红杉(Sequoia sempervirens)；冷杉诸如银杉(Abies amabilis)和香脂冷杉(Abies balsamea)；以及雪松如西部红柏(Thuja plicata)以及阿拉斯加黄杉木(Chamaecyparis nootkatensis)。在具体的实施方案中，植物为作物植物(例如，玉米、苜蓿、向日葵、芸苔属植物、大豆、棉、红花、豌豆、高粱、小麦、粟、烟草属植物等)。在其它实施方案中，玉米和大豆植物是最佳的，在另外的实施方案中玉米植物是最佳的。
其它所关注的植物包括提供所关注种子的谷物植物、油料种子植物和豆科植物。所关注的种子包括谷物种子，诸如玉米、小麦、大麦、稻、高粱、黑麦等。油料种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔属植物、玉米、苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括菜豆和豌豆。菜豆包括瓜尔胶、刺槐豆胶、胡芦巴、大豆、花园豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、扁豆、鹰嘴豆等。
应当认识到，已稳定掺入DNA构建体的植物的特征还可在于位点特异性整合的潜能、农学潜能和拷贝数。参见美国专利6,187,994。
根据掺入转基因SSI靶位点中的目的多核苷酸，包含具有本文提供的目的多核苷酸的转基因SSI靶位点的转基因植物、植物细胞或种子可具有表型变化，包括但不限于改性的病原体或昆虫防御机制、对一种或多种除草剂抗性的增加、耐受胁迫环境条件能力的增加、改性的生产淀粉能力、改性的淀粉生产水平、改性的油含量和/或组成、改性的碳水化合物含量和/或组成、改性的脂肪酸含量和/或组成、改性的利用、分配和/或储存氮的能力等。
本文提供包含以下的各种组分的多核苷酸或核酸分子：DSB诱导剂系统例如向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统(如描述于2014年8月20日提交的美国专利申请14/463687和2014年8月20日提交的美国专利申请14/463691)和位点特异性重组酶系统(转基因SSI靶位点、供体DNA、转移盒、各种位点特异性重组位点、位点特异性重组酶、目的多核苷酸或它们的任何活性变体或片段)。还提供了包含在植物基因组中的DSB靶位点处整合的本文提供的各种转基因SSI靶位点中的任一种的核酸分子。
术语“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核酸序列”和“核酸片段”在本文中可互换使用。这些术语涵盖核苷酸序列等的范围。多核苷酸可为RNA或DNA的聚合物，它们可为单链或双链，任选地包含合成的、非天然的或改性的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的多核苷酸可由cDNA、基因组DNA、合成DNA、或它们的混合物的一个或多个片段构成。术语“多核苷酸”的使用并非旨在将本发明限制为包含DNA的多核苷酸。本领域的一般技术人员将认识到，多核苷酸可包括核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。此类脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成类似物。本文提供的多核苷酸也涵盖所有形式的序列，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹结构、茎环结构等。
本文提供的组合物可包含分离的或基本上经纯化的多核苷酸。“分离的”或“经纯化的”多核苷酸，是大体上或基本上不含那些存在于其天然存在环境中正常伴随多核苷酸或与其相互作用的组分。因此，分离的或经纯化的多核苷酸大体上不含当通过重组技术生产时的其它细胞物质、或培养基、或大体上不含当通过化学合成时的化学前体或其它化学物质。最理想地，“分离的”多核苷酸不含所述多核苷酸所来源于的生物体的基因组DNA中天然地存在于所述多核苷酸(即，位于所述多核苷酸的5′和3′端的序列)两翼的序列(最理想地蛋白编码序列)。例如，在各种实施方案中，所述分离的多核苷酸可包含所述多核苷酸所来源于的细胞的基因组DNA中天然地存在于所述多核苷酸两翼的少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb、或0.1kb的核苷酸序列。
本文可互换使用术语“重组多核苷酸”和“重组DNA构建体”。重组构建体可包含人工的或异源的核酸序列的组合例如非天然共存的调控和编码序列。例如，转移盒可包含限制性位点和目的异源多核苷酸。在其它实施方案中，重组构建体可包含来源于不同来源的调控序列和编码序列，或来源于相同来源但以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。此类构建体可独自使用或与载体结合使用。如果使用载体，则载体的选择取决于将被用来转化宿主细胞的方法，这是本领域技术人员熟知的。例如可使用质粒载体。技术人员熟知为了成功地转化、选择和繁殖包含本文所提供的任何分离的核酸片段的宿主细胞，必须存在于载体上的遗传因子。技术人员还将认识到，不同的独立转化事件将引起不同水平和模式的表达(Jones等人，EMBO J.，4：2411-2418(1985)；De Almeida等人，Mol.Gen.Genetics，218：78-86(1989))，因此，必须筛选多次事件以获得显示期望表达水平和模式的品系。这种筛选可通过DNA的Southern印迹分析、mRNA表达的Northern印迹分析、蛋白表达的免疫印迹分析或表型分析等完成。
在具体的实施方案中，本文所述的位点特异性整合系统的一个或多个组分可以表达盒形式提供以在植物或其它生物体或所关注的细胞类型中表达。所述盒可包括5′和3′调控序列，该调控序列可操作地连接至本文提供的多核苷酸。“可操作地连接”旨在表示两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，目的多核苷酸和调控序列(即启动子)之间的可操作的连接为允许该所关注的多核苷酸的表达的功能性连接。可操作地连接的元件可以是连续的或不连续的。当用于指两个蛋白质编码区的连接时，“可操作地连接”意指所述编码区处于同一阅读框中。所述盒可附加地包含至少一个将被共转化到生物体中的附加基因。另选地，能通过多个表达盒提供附加基因。这样的表达盒具有多个限制性位点和/或重组位点，用以将重组多核苷酸插入至使其处于所述调控区的转录调控之下的位置。所述表达盒可附加地包含选择性标记基因。
所述表达盒可包括在转录的5′-3′方向中，转录和翻译起始区(即启动子)、本文所提供的重组多核苷酸、以及在植物中起作用的转录和翻译终止区(即终止区)。所述调控区(即，启动子、转录调控区和翻译终止区)和/或本文所提供的多核苷酸对宿主细胞而言或对彼此而言可以是天然的/类似的。作为另外一种选择，本文所提供的调控区和/或多核苷酸对宿主细胞而言或对彼此而言可以是异源的。本文在序列方面所用的“异源”是指，源自外来物种的序列，或者，如果源自相同物种，则为通过蓄意的人为干预而从其天然形式在组成和/或基因座方面受到充分修饰的序列。例如，可操作地连接至异源多核苷酸的启动子所来自的物种，不同于所述多核苷酸所来源于的物种；或如果二者来自相同的/类似的物种，则二者之一或二者均为从其原始形式和/或基因座经过充分修饰的，或所述启动子并非针对可操作地连接的多核苷酸的天然启动子。作为另外一种选择，本文所提供的调控区和/或重组多核苷酸可以是全部合成的。
所述终止区就转录起始区而言可以是天然的，就可操作地连接的重组多核苷酸而言可以是天然的，就植物宿主而言可以是天然的，或就启动子、重组多核苷酸、植物宿主或它们的任意组合而言，可以是源自其它来源的(即，外来的或异源的)。使用方便的终止区得自根癌农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒，诸如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。也参见Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell64：671-674；Sanfacon等人(1991)Genes Dev.5：141-149；Mogen等人(1990)Plant Cell 2：1261-1272；Munroe等人(1990)Gene 91：151-158；Ballas等人，(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903；以及Joshi等人(1987)Nucleic Acids Res.15：9627-9639。
在制备表达盒的过程中，可操纵多个DNA片段以在正确取向上提供DNA序列。为了这一目的，可使用接头或连接子以接合DNA片段，或可使用其它操纵方法提供方便的限制性位点以移除冗余DNA、移除限制性位点等。为了这一目的，可使用体外诱变、引物修复、限制性酶切、退火、再替换，例如转换和颠换。
许多启动子可用于本文提供的表达盒。可基于期望结果选择启动子。应当认识到，可通过在表达盒中使用不同启动子来提高不同应用，以调节目的多核苷酸表达的时间、位置和/或水平。如果需要，此类表达构建体还可含有启动子调节区(例如赋予诱导型、组成型、环境或发育调节的、或细胞或组织特异性/选择性表达的调节区)，转录起始开始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或聚腺苷酸化信号。
在一些实施方案中，本文提供的表达盒可与组成型、组织优选的或其它启动子组合以在植物中表达。组成型启动子的示例包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录初始区、来源于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的T-DNA的1′-或2′-启动子、遍在蛋白1启动子、Smas启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(美国专利5,683,439)、Nos启动子、pEmu启动子、核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子、GRP1-8启动子以及来自技术人员已知的多种植物基因的其它转录初始区。如果期望低水平的表达，可以使用弱启动子。弱组成型启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子(WO 99/43838和美国专利6,072,050)、35S CaMV核心启动子等等。其它组成型启动子包括例如美国专利5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463和5,608,142。还可参见美国专利6,177,611，该专利以引用方式并入本文。
诱导型启动子的示例是可通过低氧或寒冷胁迫诱导的Adh1启动子，可通过热胁迫诱导的Hsp70启动子，PPDK启动子和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(pepcarboxylase)启动子，二者都是可光诱导的。另外可用的是化学诱导型启动子，例如安全剂诱导的In2-2启动子(美国专利5,364,780)、雌激素诱导的ERE启动子，以及Axig1启动子(生长素诱导的并且是绒毡层特异性的但在愈伤组织中也呈活性(PCT US01/22169)。
处于发育控制下的启动子的示例包括优先在某些组织，诸如叶、根、果实、种子或花中起始转录的启动子。示例性启动子是花药特异性启动子5126(美国专利5,689,049和5,689,051)。种子优选的启动子的示例包括但不限于27kDγ玉米蛋白启动子和蜡状启动子，Boronat，A.等人(1986)Plant Sci.47：95-102；Reina，M.等人Nucl.Acids Res.18(21)：6426；和Kloesgen，R.B.等人(1986)Mol.Gen.Genet.203：237-244。在胚、果皮和胚乳中表达的启动子公开在美国专利6,225,529和PCT公开WO 00/12733中。这些专利的每一个的公开内容以引用的方式全文并入本文。
可将化学调控启动子用于通过施用外源化学调控剂来调节基因在植物中的表达。根据这一目标，启动子可以是化学诱导型启动子，其中施用化学物质来诱导基因表达，或化学抑制型启动子，其中施用化学物质来抑制基因表达。化学诱导型启动子是本领域已知的，并且包括但不限于玉米In2-2启动子，其是通过苯磺酰胺除草剂安全剂来激活的，玉米GST启动子，其是通过用作芽前除草剂的疏水亲电性化合物而激活的，以及烟草PR-1a启动子，其是通过水杨酸激活的。所关注的其它化学调节的启动子包括甾类化合物反应性启动子(参见例如，Schena等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10421-10425和McNellis等人(1998)PlantJ.14(2)：247-257)，以及四环素诱导型和四环素抑制型启动子(参见例如Gatz等人(1991)Mol.Gen.Genet.227：229-237和美国专利5,814,618和5,789,156)，它们以引用方式并入本文。
组织优选的启动子可用于定向提高特定植物组织内的目的多核苷酸的表达。组织优选的启动子是本领域已知的。参见例如Yamamoto等人(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kawamata等人(1997)Plant Cell Physiol.38(7)：792-803；Hansen等人(1997)Mol.GenGenet.254(3)：337-343；Russell等人(1997)Transgenic Res.6(2)：157-168；Rinehart等人(1996)Plant Physiol.112(3)：1331-1341；Van Camp等人(1996)Plant Physiol.112(2)：525-535；Canevascini等人(1996)Plant Physiol.112(2)：513-524；Yamamoto等人(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20：181-196；Orozco等人(1993)Plant Mol Biol.23(6)：1129-1138；Matsuoka等人(1993)ProcNatl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590；和Guevara-Garcia等人(1993)Plant J.4(3)：495-505。如果需要的话，可修饰这样的启动子以进行弱表达。
叶优选的启动子是本领域已知的。参见例如Yamamoto等人(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kwon等人(1994)Plant Physiol.105：357-67；Yamamoto等人(1994)Plant CellPhysiol.35(5)：773-778；Gotor等人(1993)Plant J.3：509-18；Orozco等人(1993)PlantMol.Biol.23(6)：1129-1138；以及Matsuoka等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(20)：9586-9590。此外，可以使用cab和rubisco的启动子。参见例如Simpson等人(1958)EMBO J4：2723-2729和Timko等人(1988)Nature 318：57-58。
根优选的启动子是已知的，并且可以选自文献中记载的很多启动子或从不同相容物种中从头分离的启动子。参见例如Hire等人(1992)Plant Mol.Biol.20(2)：207-218(大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller和Baumgartner(1991)Plant Cell 3(10)：1051-1061(法国菜豆的GRP 1.8基因的根特异性控制元件)；Sanger等人(1990)PlantMol.Biol.14(3)：433-443(根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的甘露氨酸合酶(MAS)基因的根特异性启动子)；以及Miao等人(1991)Plant Cell 3(1)：11-22(编码胞质谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表达)。也参见Bogusz等人(1990)Plant Cell 2(7)：633-641，其中描述了两种根特异性启动子，它们是从来自固氮非豆科Parasponia andersonii以及相关非固氮非豆科山麻黄(Trema tomentosa)的血红蛋白基因分离的。将这些基因的启动子与β-葡糖醛酸酶报告基因连接，并且导入非豆科的烟草(Nicotiana tabacum)和豆科的百脉根(Lotus corniculatus)内，在这两种情况下，都保持了根特异性启动子活性。Leach和Aoyagi(1991)描述了他们对于发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的高表达的roIC和roID根诱导基因的启动子的分析(参见Plant Science(Limerick)79(1)：69-76)。他们推断，在这些启动子中增强子和组织优选的DNA决定子是解离的。Teeri等人(1989)使用与lacZ的基因融合以表明编码章鱼碱合酶的农杆菌(Agrobacterium)T-DNA基因在根尖的表皮中特别具有活性，以及TR2′基因在完整植物中是根特异性的，并且受叶组织中的伤害的刺激，这是用来与杀虫或杀幼虫基因一起使用的特别期望的特征组合(参见EMBO J.8(2)：343-350)。与nptII(新霉素磷酸转移酶II)融合的TR1′基因表现出类似特征。其它根优选的启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子(Kuster等人(1995)Plant Mol.Biol29(4)：759-772)；和roIB启动子(Capana等人(1994)PlantMol.Biol.25(4)：681-691.还可参见美国专利5,837,876；5,750,386；5,633,363；5,459,252；5,401,836；5,110,732和5,023,179。菜豆蛋白基因(Murai等人(1983)Science 23：476-482和Sengopta-Gopalen等人(1988)PNAS 82：3320-3324。
包含本文提供的多核苷酸的表达盒也可包含选择性标记基因，用于选择转化过的细胞。利用选择性标记基因以选择转化过的细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，诸如那些编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予对除草化合物的抗性的基因，除草化合物诸如草胺磷铵、溴苯腈、咪唑啉酮类、和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)以及磺脲类药物。其它选择性标记包括表型标记诸如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白诸如绿色荧光蛋白(GFP)(Su等人(2004)Biotechnol.Bioeng.85：610-9和Fetter等人(2004)Plant Cell 16：215-28)，青色荧光蛋白(CYP)(Bolte等人(2004)J.CellScience 117：943-54和Kato等人(2002)Plant Physiol.129：913-42)，以及黄色荧光蛋白(来自Evrogen的PhiYFP.TM.；参见Bolte等人(2004)J.Cell Science 117：943-54)。此类公开以引用方式并入本文。上文的选择性标记基因列表并不意味是限制性的。任何选择性标记基因可用于本文介绍的组合物中。
在适当的情况下，方法和组合物(即，目的多核苷酸、重组酶、内切核酸酶等)中所用的序列可经过优化以提高在转化的植物中的表达。即，能够使用植物优选的密码子合成基因用于改善表达。对于宿主优选的密码子使用的讨论，参见例如Campbell和Gowri(1990)Plant Physiol.92：1-11。在本领域中用于合成植物优选的基因的方法是可用的。参见例如美国专利5,380,831和5,436,391，以及Murray等人(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498，这些专利和文献以引用方式并入本文。
本文还涵盖了DSB诱导剂系统例如向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统和位点特异性整合系统(转基因SSI靶位点、供体DNA、转移盒、各种位点特异性重组位点、位点特异性重组酶、目的多核苷酸或它们的任何活性变体或片段)的各种组分的片段和变体。“片段”是指多核苷酸的部分或氨基酸序列以及由此编码的蛋白质的部分。多核苷酸的片段可编码保持所述天然蛋白的生物活性的蛋白片段(即，重组酶的片段实现重组事件)。如本文所用，“天然”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。因此，多核苷酸的片段的范围可为至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸和至多全长多核苷酸。编码在所述方法或组合物中使用的蛋白的生物活性部分的多核苷酸的片段将编码存在于全长蛋白中的至少15、25、30、50、100、150、200、或250个邻接的氨基酸，或至多全部数量的氨基酸。作为另外一种选择，可用作杂交探针的多核苷酸的片段一般来讲不编码保持生物活性的片段蛋白。因此，核酸序列的片段范围可为至少约10、20、30、40、50、60、70、80个核苷酸或至多全长序列。
可通过分离编码目的多肽的部分的多核苷酸之一的部分、并表达所编码的蛋白的部分(例如通过体外重组表达)、并评估所述多肽的部分的活性来制备多肽的生物活性部分。例如，编码重组多肽片段的多核苷酸可包含核苷酸序列，其包含至少16、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、或1,400个核苷酸，或至多为存在于本文提供的方法和组合物中使用的核苷酸序列中的核苷酸数量。
“变体”旨在表示基本上类似的序列。就多核苷酸而言，变体包括在5′和/或3′端具有缺失(即截短)的多核苷酸；在天然多核苷酸的一个或多个内部位点处具有一个或多个核苷酸的缺失和/或添加；和/或在天然多核苷酸的一个或多个位点处具有一个或多个核苷酸的替换。就多核苷酸而言，保守的变体包括那些由于遗传密码的简并性，编码本文提供的组合物和方法中所用的多肽之一的氨基酸序列的序列。天然存在的等位变体诸如这些，或者天然存在的多核苷酸的等位变体可使用熟知的分子生物学技术鉴定，所述技术例如下文所列出的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术。变体多核苷酸还包括合成来源的多核苷酸，诸如那些例如通过使用定点诱变生成的。一般来讲，本文提供的方法和组合物中所用的特定多核苷酸的变体与由序列比对程序和本文其它地方所述参数确定的特定多核苷酸具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。
用于本文提供的方法和组合物的特定多核苷酸的变体(即，Cas 9内切核酸酶、DSB靶位点、转基因SSI靶位点、重组酶、重组位点以及目的多核苷酸)还可通过比较由变体多核苷酸编码的多肽与由参考多核苷酸编码的多肽之间的序列同一性百分比来评估。因此，例如，本文公开了所编码的多肽与所述多肽具有给定的序列同一性百分比的分离的多核苷酸。任何两种多肽之间的序列同一性百分比可利用序列比对程序和本文其它地方所述的参数计算出。当通过比较本文提供的任何一对给定的多核苷酸所编码的两种多肽之间的序列同一性百分比，来评估所述任何一对给定的多核苷酸时，上述两种编码的多肽之间的序列同一性百分比为至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。
“变体”蛋白质旨在表示通过在天然蛋白质的N-末端和/或C-末端处具有一个或多个氨基酸的缺失(所谓的截短)；在天然蛋白质中的一个或多个内部位点处具有一个或多个氨基酸的缺失和/或添加；或在天然蛋白质中的一个或多个位点处具有一个或多个氨基酸的替换而源自于所述天然蛋白质的蛋白质。用于本文提供的方法和组合物的变体蛋白质呈生物活性，即它们继续具有所期望的天然蛋白质的生物活性。此类突变体可得自例如遗传多态性或得自人工操纵。如通过序列比对程序和本文其它地方所述的参数所测定的，本文提供的天然蛋白质的生物活性变体与该天然蛋白质的氨基酸序列之间将具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。本文提供的蛋白质的生物活性变体可与蛋白质相差仅仅1-15个氨基酸残基，仅仅1-10个，如6-10个，仅仅5个，仅仅4个，3个，2个或甚至1个氨基酸残基。
蛋白质可以各种方式进行改变，包括氨基酸替换、缺失、截短和插入。此类操纵方法是本领域一般已知的。例如，可通过在DNA中的突变来制备重组酶蛋白质的氨基酸序列变体。用于诱变和核苷酸序列改变的方法是本领域熟知的。参见例如Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492；Kunkel等人(1987)Methods in Enzymol.154：367-382；美国专利公开4,873,192；Walker和Gaastra，eds.(1983)Techniques in MolecularBiology(MacMillan Publishing Company，New York)以及其中引证的参考文献。关于不影响目的蛋白质的生物活性的适当氨基酸替换的指导可参见Dayhoff等人的模型，(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)，该参考文献以引用方式并入本文。保守置换，诸如将一个氨基酸用另一具有相似性质的氨基酸进行交换，可以是优选的。
因此，本文所用的多核苷酸可包括天然存在的序列即“天然”序列以及突变体形式。同样的，本文提供的方法中所用的蛋白质既包括天然存在的蛋白质也包括其变体和修饰形式。显然，在编码变体多肽的多核苷酸中制造的突变不应将所述序列置于阅读框之外，并且优选地将不产生能产生mRNA二级结构的互补区域。参见EP专利申请公布75,444。
不期望本文包括的蛋白质序列的删除、插入、和替换导致所述蛋白质的特性产生巨大的改变。然而，当在行动之前预测替换、删除、或插入的确切效应比较困难时，本领域的技术人员将会知道该效应将通过常规筛选测定法进行评估。
变体多核苷酸和蛋白质也包括来源于诱变或重组方法如DNA改组的序列和蛋白质。通过此类过程，例如一种或多种不同的重组酶编码序列可被操纵，以产生拥有所期望的性质的新重组酶蛋白质。如此，从一组包含具有基本的序列同一性、并且能在体外或体内进行同源重组的序列区域的相关多核苷酸序列，产生了重组多核苷酸文库。此类DNA改组方法是本领域已知的。参见例如Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751；Stemmer(1994)Nature 370：389-391；Crameri等人(1997)Nature Biotech.15：436-438；Moore等人(1997)J.Mol.Biol272：336-347；Zhang等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：4504-4509；Crameri等人(1998)Nature391：288-291；以及美国专利5,605,793和5,837,458。
使用以下术语描述在两个或更多个核酸或多核苷酸之间的序列关系：如本文所用，“参考序列”是用作序列比对基准的定义序列。参考序列可以为指定序列的子集或整体；例如，以全长cDNA或基因序列的片段，或者完整cDNA或基因序列的形式。如本文所用，“比对窗口”比较参考序列和多核苷酸序列的邻接指定片段，其中在所述比对窗口中的多核苷酸序列与参考序列(不包含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(即空位)，以获得两段序列之间的最佳匹配。一般来讲，比对窗口的长度为至少20个邻接核苷酸，任选地可以是30，40，50，100种核苷酸，或者更长。本领域的技术人员懂得为了避免由于在多核苷酸序列中包含空位而导致的它与参考序列的高度相似，通常导入空位罚分并从匹配数目中减去空位罚分。
可使用计算机实施的算法分析和描述序列关系。两个或更多个多核苷酸或者两个或更多个多肽之间的序列关系可通过测定序列的最佳比对并给比对的匹配和空位评分来确定，这产生序列同一性百分比和序列相似性百分比。多核苷酸关系也可基于比较每个编码的多核苷酸的进行描述。用于比较和分析序列的许多程序和算法在本领域中是熟知的。
在核酸或多肽序列的情形中，“序列同一性”或“同一性”是指在指定的比较窗范围为获得最大对应而比对时两条序列中相同的核酸碱基或氨基酸残基。
术语“序列同一性百分比”意指通过在比较窗上比较两个最佳比对的序列所确定的值，其中多核苷酸或多肽序列在比较窗中的部分与参考序列(其不包含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即空位)，以便两个序列的最佳比对。通过以下方式计算这种百分比：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗中位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分比。序列同一性百分比的有用示例包括但不限于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，或50％至100％的任何整数百分数。这些同一性可用本文描述的任何程序确定。
序列比对和同一性百分比或者相似性计算可用多种被设计用于检测同源序列的比较方法来确定，包括但不限于LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.，Madison，WI)的MegAlignTM程序。在本申请的上下文中，应理解，在使用序列分析软件进行分析的情况中，除非另有指明，否则分析的结果将基于所提到的程序的“默认值”。如本文所用，“默认值”将意指软件第一次初始化时原始装载在该软件中的任何数值或者参数组。
“Clustal V比对方法”对应于标记为Clustal V的比对方法(通过以下文献描述：Higgins和Sharp，(1989)CABIOS 5：151-153；Higgins等人，(1992)Comput Appl Biosci 8：189-191)并且可见于LASERGENE生物信息学计算软件包的MegAlignTM程序(DNASTAR Inc.，Madison，WI)。对于多重比对，默认值对应于空位罚分＝10，并且空位长度罚分＝10。使用Clustal方法进行蛋白质序列的逐对比对和同一性百分比计算的默认参数是KTUPLE＝1、空位罚分＝3，窗口＝5，并且对角线保存(DIAGONALS SAVED)＝5。对于核酸，这些参数是KTUPLE＝2、空位罚分＝5，WINDOW＝4，并且对角线保存＝4。在用Clustal V程序进行序列比对后，可以通过观察同一程序中的“序列距离”表来获得“同一性百分比”。
“Clustal W比对方法”对应于标记为Clustal W的比对方法(通过以下文献描述：Higgins和Sharp，(1989)CABIOS 5：151-153；Higgins等人，(1992)Comput Appl Biosci 8：189-191)并且可见于LASERGENE生物信息学计算软件包的MegAlignTMv6.1程序(DNASTARInc.，Madison，WI)。用于多序列比对的默认参数(空位罚分＝10、空位长度罚分＝0.2、延迟发散序列(Delay Divergen Seqs)(％)＝30，DNA转换权重(DNA Transition Weight)＝0.5、蛋白质权重矩阵＝Gonnet系列，DNA权重矩阵＝IUB)。在用Clustal W程序进行序列比对后，可以通过观察同一程序中的“序列距离”表来获得“同一性百分比”。
“BLAST”是由美国国家生物技术信息中心(NCBI)提供的用于寻找生物序列之间的相似性区域的搜索算法。该程序将核苷酸或蛋白质序列与序列数据库比较，并计算各匹配的统计学显著性以鉴定出与查询序列具有足够的相似性的序列，使得相似性不会被预测为随机发生。BLAST报告所鉴定的序列以及它们与查询序列的局部比对。
本领域的技术人员熟知，许多序列同一性水平可用于鉴定来自其它物种的或者经天然修饰或合成来源的多肽，其中这种多肽具有相同或相似的功能或活性。同一性百分比的可用示例包括但不限于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，或者50％至100％的任何整数百分数。实际上，50％至100％的任何整数氨基酸同一性可用于描述本公开，诸如51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
序列同一性/相似性值还可使用GAP版本10(GCG，Accelrys，San Diego，CA)用以下参数获得：使用GAP权重50和长度权重3以及nwsgapdna.cmp计分矩阵获得的核苷酸序列的同一性％和相似性％；使用GAP权重8和长度权重2以及BLOSUM62计分矩阵获得的氨基酸序列的同一性％和相似性％(Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci USA 89：10915)；或其任何等同形式的程序。“等效程序”是指满足下列条件的任何序列比对程序：就任何正被讨论的两个序列而言，与由GAP版本10生成的对应比对相比，所述序列比对程序生成具有相同核苷酸或氨基酸残基匹配和相同序列同一性百分比的比对。
GAP使用Needleman和Wunsch算法(1970)J.Mol.Biol48：443-453，以发现最大化匹配数和最小化空位数的两个完整序列的比对结果。GAP考虑所有可能的比对和空位位置，并形成具有最大数目的匹配碱基和最少的空位的比对。它允许以匹配碱基单位提供空位形成罚分和空位延伸罚分。GAP必须对它插入的每个空位产生空位形成罚分匹配数。如果选择空位延伸罚分大于零，GAP必须另外形成对每个空位延伸罚分的空位次数的插入长度的空位罚分。蛋白质序列的GCG Wisconsin Genetics Software Package版本10默认的空位形成罚分值和空位延伸罚分值分别是8和2。核苷酸序列的默认空位形成罚分是50，而默认空位延伸罚分是3。空位形成罚分和空位延伸罚分能够表示为选自由0至200组成的整数的整数。因此例如空位形成罚分和空位延伸罚分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更大。
GAP提供了最佳比对家族中的一个成员。此家族中可能有很多成员，但是其它成员没有更好的质量。GAP显示了用于比对的四个质量因数：质量、比率、同一性、和相似性。质量是比对序列的最大量度。比率是质量除以较短片段中的碱基数。同一性百分比是实际匹配的符号的百分比。相似性百分比是相似符号的百分比。忽略来自空位对面的符号。当一对符号的得分矩阵值大于或等于0.50时(相似性阈值)，对相似性打分。
可通过各种方法将基因组窗口的组分(即，双链断裂靶位点、整合进DSB靶位点中的转基因SSI靶位点、随机插入的转基因SSI靶位点、和/或目的基因座)聚集在一起以形成复合性状基因座。
一种此类方法是通过使包含在给定的基因组窗口中具有不同基因组插入位点的整合进一个或多个DSB靶位点中的各种转基因SSI靶位点和/或目的基因座的植物杂交，并且选择已经历重组事件的植物，使得所期望的靶位点和/或目的基因座的组合存在于同一植物中。此类育种技术可从而用于在植物中形成复合性状基因座。通过使随机整合的SSI靶位点的SSI文库的成员杂交而产生的基因组窗口中的包含转基因SSI靶位点和/或目的基因座的复合性状基因座的示例描述于2014年1月24日提交的美国专利申请13/748704中，其以引用方式并入本文。通过育种产生的基因组窗口中的包含工程化大范围核酸酶靶位点和/或目的基因座的复合性状基因座的示例描述于2013年3月22日提交的美国专利申请13/427138。本文描述了通过将转基因SSI位点导入到DSB靶位点中来产生复合性状基因座的方法，所述DSB靶位点诸如但不限于紧密靠近基因组窗口中的目的基因座(天然基因、突变或编辑基因、植物染色体上的目的区域、转基因)定位的Cas内切核酸酶靶位点。
在一个实施方案中，方法包括在植物基因组中产生复合性状基因座的方法，所述方法包括：(a)提供第一植物，该第一植物在基因组窗口内具有整合进第一Cas9内切核酸酶靶位点中的至少第一位点特异性整合的转基因靶位点，并且其中所述基因组窗口的长度为约10cM，并且所述第一植物不包含第一目的基因座；(b)将第二植物配种于所述第一植物，其中所述第二植物在所述基因组窗口中包含第一目的基因座，并且所述第二植物不包含所述第一转基因靶位点；以及(c)从步骤(b)选择出子代植物，该子代植物包含所述第一转基因靶位点和所述目的基因座；其中所述第一转基因靶位点和所述第一目的基因座在所述子代植物中具有不同的基因组插入位点。
在一个实施方案中，方法包括在植物基因组中产生复合性状基因座的方法，所述方法包括：(a)提供第一植物，该第一植物在基因组窗口内具有整合进第一Cas9内切核酸酶靶位点中的至少第一位点特异性整合的转基因靶位点和整合进第二Cas9内切核酸酶靶位点中的第二位点特异性整合的转基因靶位点，其中所述基因组窗口的长度为约10cM，并且其中所述第一转基因靶位点和所述第二转基因靶位点具有不同的基因组插入位点，其中所述第一植物不包含第一目的基因座；(b)将第二植物配种于所述第一植物，其中所述第二植物在所述基因组窗口中包含第一目的基因座，其中所述第二植物在所述基因组窗口中不包含所述第一转基因靶位点或所述第二转基因靶位点；以及(c)从步骤(b)选择出子代植物，该子代植物包含所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点和所述第一目的基因座；其中所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点和所述第一目的基因座中的每一者在所述子代植物中具有不同的基因组插入位点。基因组窗口的长度可为约5cM，并且其中所述子代植物中的所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点和所述目的基因座中的每一者以约5％至0.1％的比率彼此独立地分离。
在一个实施方案中，产生本文所述的复合性状基因座的方法还包括：(a)将包含第二目的基因座的第三植物配种于所述子代植物，其中所述第三植物在所述基因组窗口中包含所述第二目的基因座，其中所述第三植物在所述基因组窗口中不包含所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点或所述第一目的基因座；以及(b)从步骤(a)选择出第二子代植物，该第二子代植物包含所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点、所述第一目的基因座、以及所述第二目的基因座；其中所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点、所述第一目的基因座、以及所述第二目的基因座中的每一者在所述第二子代植物中具有不同的基因组插入位点；并且，其中所述第二子代植物中的所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点、所述第一目的基因座、或所述第二目的基因座中的每一者以约10％至约0.1％的比率彼此独立地分离。
在一个实施方案中，方法包括在植物基因组中产生复合性状基因座的方法，所述方法包括：
(a)提供第一植物，该第一植物在基因组窗口内具有整合进第一Cas9内切核酸酶靶位点中的至少第一位点特异性整合的转基因靶位点，其中所述第一植物不包含第一目的基因座，并且其中所述基因组窗口：(i)侧接有包括SYN12545、SYN12536、SYN14645、PZE-101023852、PZE-101024424、SYN25022、SYN31156、SYN31166或SYN22238的至少第一标记以及包括SYN12536、SYN14645、PZE-101023852、PZE-101024424、SYN25022、SYN31156、SYN31166、SYN22238或SYN20196的至少第二标记；或者(ii)侧接有包括PZE-101205031、PUT-163A-148951459-517、PZE-101205904或PZE-101206569的至少第一标记以及包括PUT-163A-148951459-517、PZE-101205904、PZE-101206569或SYN24492的至少第二标记；或者(iii)侧接有包括PZE-103000166、PZE-103000238、PZE-103000307或SYN6355的至少第一标记以及包括PZE-103000238、PZE-103000307、SYN6355或PZE-103001421的至少第二标记；或者(iv)侧接有包括PZE-110099037、PZE-110099048、PZE-110100195或PZE-110100685的至少第一标记以及包括PZE-110099048、PZE-110100195、PZE-110100685或PZE-110101412的至少第二标记；(b)将第二植物配种于所述第一植物，其中所述第二植物在所述基因组窗口中包含第一目的基因座，并且所述第二植物不包含所述第一转基因靶位点；以及(c)从步骤(b)选择出子代植物，该子代植物包含所述第一转基因靶位点和所述目的基因座；其中所述第一转基因靶位点和所述第一目的基因座在所述子代植物中具有不同的基因组插入位点。
如本文所用，“育种”是活生物体的遗传操纵。通过利用植株的授粉方法的技术繁育了植物。如果花粉从一朵花传递到同一植株的同一朵花或另一朵花，则植物是自花授粉的。当使用相同家族或品系之内的个体进行授粉时，植物是近缘授粉的。如果花粉来自于不同家族或品系的不同植株上的花时，植物是异花授粉的。在育种应用中，育种者初始选择并杂交两种或更多种亲本植物。如本文所用，根据语境，“杂交”可指简单的X与Y杂交，或者回交过程。
本文提供使用育种技术建立复合性状基因座或分离复合性状基因座的方法。例如，可将在基因组窗口内包含整合进DSB靶位点中的第一转基因SSI靶位点的第一植物(或者包含改变的DSB靶位点的植物，并且第一植物不包含第一目的基因座)与在相同基因组窗口内包含第一目的基因座的第二植物杂交，并且第二植物在基因组窗口内不包含所述第一转基因SSI靶位点(或含改变的DSB靶位点)。然后，选择出在基因组窗口内包含第一转基因SSI靶位点(或改变的DSB靶位点)和第一目的基因座两者的子代植物。选择包含基因SSI靶位点和目的基因座两者的子代植物可通过各种方法进行。例如，可进行表型分析，由此在子代植物中检测出标记的活性或导入的序列。测定对于目的基因座和转基因SSI靶位点有特异性的标记的另选方法包括技术诸如PCR、杂交、同功酶电泳、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态DNA(RAPD)、任意引物PCR(AP-PCR)、DNA扩增指纹(DAF)、序列特异扩增区域(SCAR)、扩增片段长度多态性(AFLP)、简单序列重复(SSR)和单核苷酸多态性(SNP)。
在非限制性实施方案中，复合性状基因座可包括(1)在所述基因组窗口中具有不同的基因组插入位点的整合进一个DSB靶位点中的一个转基因SSI靶位点和一个目的基因座；(2)在所述基因组窗口中具有不同的基因组插入位点的整合进两个DSB靶位点中的2个转基因SSI靶位点和一个目的基因座；(3)在所述基因组窗口中具有不同的基因组插入位点的整合进两个DSB靶位点中的2个转基因SSI靶位点和2个目的基因座；(4)目的基因座和包含一个或多个目的多核苷酸的整合进DSB靶位点中的转基因SSI靶位点，其中所述目的基因座和转基因靶位点具有不同的基因组插入位点；(5)整合进DSB靶位点中的转基因靶位点和包含转基因的目的基因座，其各自具有不同的基因组插入位点；(6)整合进DSB靶位点中的转基因靶位点和包含天然性状的目的基因座，其各自具有不同的基因组插入位点；(7)整合进DSB靶位点中的转基因靶位点(包含第一和第二相异的重组位点)和目的基因座，其各自具有不同的基因组插入位点；(8)目的基因座、整合进第一DSB靶位点中的第一转基因靶位点(包含第一和第二相异的重组位点)和整合进第二DSB靶位点中的第二转基因靶位点(包含第三和第四相异的重组位点)，其中所述目的基因座、第一转基因靶位点和第二转基因靶位点中的每一者具有不同的基因组插入位点；(9)目的基因座、整合进DSB靶位点中的第一转基因靶位点(包含第一和第二相异的重组位点)、第二转基因靶位点(包含第三和第四相异的重组位点)以及整合进第三DSB靶位点中的第三转基因靶位点(包含第五和第六相异的重组位点)，其中所述目的基因座、第一转基因靶位点、第二转基因靶位点和第三转基因靶位点中的每一者具有不同的基因组插入位点；(10)整合进第一DSB靶位点中的第一转基因靶位点和整合进第二DSB靶位点中的第二转基因靶位点以及目的基因座，其中第二转基因靶位点包含与第一转基因靶位点不同的相异重组位点，其各自具有不同的基因组插入位点；(11)整合进第一DSB靶位点中的第一转基因靶位点、整合进第二DSB靶位点中的第二转基因靶位点、以及目的基因座，其中第二转基因靶位点包含与第一转基因靶位点相同的相异重组位点，其各自具有不同的基因组插入位点；(12)整合进第一DSB靶位点中的第一转基因靶位点、整合进第二DSB靶位点中的第二转基因靶位点、以及目的基因座，其中相异的重组位点包括FRT位点或突变的FRT位点，其各自具有不同的基因组插入位点；(13)整合进第一DSB靶位点的第一转基因靶位点和整合进第二DSB靶位点的第二转基因靶位点、以及目的基因座，其中相异的重组位点包括FRT1、FRT5、FRT6、FRT7、FRT12或FRT87位点，其各自具有不同的基因组插入位点；或者(14)整合进第一DSB靶位点中的第一转基因靶位点和整合进第二DSB靶位点中的第二转基因靶位点、以及目的基因座，其中相异的重组位点包括FRT1和FRT87位点，其各自具有不同的基因组插入位点。
包含整合进多个DSB靶位点中的多个转基因SSI靶位点、目的基因座和/或目的多核苷酸的复合性状基因座可在植物基因组的基因组窗口内产生。
两种性状能够如何以彼此例如5cM的遗传距离叠堆到基因组中的非限制性示例如下所述：可将在基因组窗口内包含整合进第一DSB靶位点中的第一转基因SSI靶位点并且不具有第一目的基因座的第一植物与第二转基因植物杂交，该第二转基因植物在基因组窗口内不同的基因组插入位点处包含目的基因座，并且第二植物不包含第一转基因靶位点。约5％的来自该杂交的子代植物将具有在基因组窗口内的不同基因组插入位点处整合的整合进第一DSB靶位点中的第一转基因靶位点和的第一目的基因座两者。可将在限定的基因组窗口中具有以上两种位点的子代植物进一步与第三转基因植物杂交，该第三转基因植物在限定的基因组窗口内包含整合进第二DSB靶位点中的第二转基因靶位点和/或第二目的基因座并且缺乏第一转基因靶位点和第一目的基因座。然后选择具有在基因组窗口内的不同基因组插入位点处整合的第一转基因靶位点、第一目的基因座和第二目的基因座的子代。此类方法可用于产生包括复合性状基因座的子代植物，该复合性状基因座具有在基因组窗口内的不同位点处整合的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或更多个整合进DSB靶位点中的转基因靶位点和/或目的基因座。这样，可产生各种复合性状基因座。
在一个非限制性实施方案中，在植物基因组中产生复合性状基因座的方法包括提供第一植物，该第一植物在约10cM长的基因组窗口内具有整合进第一DSB靶位点中的至少第一转基因靶位点并且不包含第一目的基因组区域。如本文其它地方所述，基因组窗口可为任何期望的长度。方法包括将第一植物配种于第二植物，该第二植物在相同基因组窗口内的不同基因组插入位点中包含第一目的基因座并且不包含整合进第一DSB靶位点中的第一转基因靶位点，并且选择包含第一转基因靶位点和目的基因座的子代植物。在另一个实施方案中，方法还包括提供第一植物，该第一植物在基因组窗口内具有整合进第一DSB靶位点中的第一转基因靶位点和整合进第二DSB靶位点中的第二转基因靶位点，它们具有不同的基因组插入位点，其中第一植物不包含目的基因座。使第一植物与第二植物配种，其中第二植物在基因组窗口内包含目的基因座并且不包含第一转基因靶位点和第二转基因靶位点，并且选择包含第一转基因靶位点、第二转基因靶位点和目的基因座的子代植物，它们全部在基因组窗口内具有不同的基因组插入位点。子代植物的第一转基因靶位点、第二转基因靶位点和目的基因座能以约10-0.1％、约10-0.5％、约10-1％、约10-5％、约9-0.1％、约9-0.5％、约9-1％、约9-5％、约8-0.1％、约8-0.5％、约8-1％、约8-4％、约7-0.1％、约7-0.5％、约7-1％、约7-4％、约6-0.1％、约6-0.5％、约6-1％、约6--3％、约5-0.1％、约5-0.5％、约5-1％、约4-0.1％、约4-0.5％、约4-1％、约3-0.1％、约3-0.5％、约3-1％、约2-0.1％、约2-0.5％、约1-0.1％或约1-0.5％的比率彼此独立地分离。
这样，应当认识到，可将本文提供的植物杂交以产生包含以下项的任何组合的复合性状基因座：本文所述的各种基因组窗口、双链断裂靶位点、转基因SSI靶位点、目的基因座和/或目的多核苷酸。
先前部分描述了通过将整合进DSB靶位点中的转基因SSI靶位点和/或目的基因座添加到基因组窗口来产生复合性状基因座的各种方法，由此形成复合性状基因座。应当认识到，复合性状基因座还可通过移除或育种除掉某些靶位点(双链断裂靶位点和/或转基因SSI靶位点)和/或目的基因座来改变。本文提供的复合性状基因座被设计成使得各个改变的双链断裂靶位点和/或目的基因座具有不同的基因组插入位点并且可独立地分离。此类设计使得性状能杂交到基因组窗口之中并且也能使性状杂交到基因组窗口之外。
还可采用将性状结合到基因组窗口中的上述育种方法，以通过育种除掉性状从基因组窗口中移除性状。
通过育种除掉而改变复合性状基因座的方法包括提供第一植物，该第一植物包含待移除的双链断裂靶位点和/或转基因SSI靶位点和/或目的基因座，并且将第一植物与在基因组窗口中不具有特定双链断裂靶位点和/或转基因SSI靶位点和/或目的基因座的第二植物杂交。然后，将对所得的子代进行选择，该子代缺乏双链断裂靶位点和/或转基因SSI靶位点和/或目的基因座。
如本文其它地方所述，本文提供的整合进DSB靶位点中的转基因靶位点包含至少一个重组位点，所述重组位点可用于将一个或多个目的多核苷酸直接插入到靶位点中。因此，包含各种靶位点的复合性状基因座可通过位点特异性整合方法进行操纵。此类方法详细描述于WO 99/25821，其以引用方式并入本文。该方法允许通过采用位点特异性重组在所建立的复合性状基因座的转基因靶位点内移除、添加和/或替换各种目的多核苷酸。另选地，在植物用于育种方法以产生复合性状基因座之前，可对植物中的转基因靶位点进行改变。
本文所公开的组合物和方法的非限制性示例如下所述：
1.一种在其基因组中具有基因组窗口的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，所述基因组窗口包含整合进至少一个双链断裂靶位点中的至少一个位点特异性整合(SSI)的转基因靶位点，其中所述基因组窗口侧接有
a.至少第一标记，其包括BARC_1.01_Gm01_6984873_T_C、BARC_1.01_Gm01_7775299_G_A、BARC_1.01_Gm01_7856395_A_C、BARC_1.01_Gm01_8569887_A_G、BARC_1.01_Gm01_8601858_C_T、BARC_1.01_Gm01_8641430_C_T、BARC_1.01_Gm01_8674202_A_C、BARC_1.01_Gm01_8933345_C_T、BARC_1.01_Gm01_8964201_T_C、BARC_1.01_Gm01_9014216_T_G、BARC_1.01_Gm01_28179606_A_G、BARC_1.01_Gm01_28364595_A_G、BARC_1.01_Gm01_28536363_G_A、BARC_1.01_Gm01_28599526_G_A、BARC_1.01_Gm01_28913996_A_G、BARC_1.01_Gm01_29284158_A_G、BARC_1.01_Gm01_31202345_C_T、BARC_1.01_Gm01_31770743_C_T、BARC_1.01_Gm01_32683433_G_A、或BARC_1.01_Gm01_34327255_C_T；以及
b.至少第二标记，其包括BARC_1.01_Gm01_7775299_G_A、BARC_1.01_Gm01_7856395_A_C、BARC_1.01_Gm01_8569887_A_G、BARC_1.01_Gm01_8601858_C_T、BARC_1.01_Gm01_8641430_C_T、BARC_1.01_Gm01_8674202_A_C、BARC_1.01_Gm01_8933345_C_T、BARC_1.01_Gm01_8964201_T_C、BARC_1.01_Gm01_9014216_T_G、BARC_1.01_Gm01_28179606_A_G、BARC_1.01_Gm01_28364595_A_G、BARC_1.01_Gm01_28536363_G_A、BARC_1.01_Gm01_28599526_G_A、BARC_1.01_Gm01_28913996_A_G、BARC_1.01_Gm01_29284158_A_G、BARC_1.01_Gm01_31202345_C_T、BARC_1.01_Gm01_31770743_C_T、BARC_1.01_Gm01_32683433_G_A、BARC_1.01_Gm01_34327255_C_T或BARC_1.01_Gm01_36994849_A_G。
2.根据实施方案1所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述至少一个双链断裂靶位点选自：锌指内切核酸酶靶位点、工程化内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点和Cas9内切核酸酶靶位点。
3.根据实施方案1所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述基因组窗口的长度不超过0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、5、10cM。
4.根据实施方案1所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述基因组窗口还包含转基因。
5.根据实施方案4所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中该转基因赋予选自以下的性状：除草剂耐受性、昆虫抗性、病害抗性、雄性不育、位点特异性重组、非生物胁迫耐受性、磷的改变、抗氧化剂的改变、脂肪酸的改变、必需氨基酸的改变、碳水化合物的改变、除草剂耐受性、昆虫抗性和病害抗性。
6.根据实施方案1所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述基因组窗口还包含整合进至少第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五或第十六个双链断裂靶位点中的至少第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五或第十六个位点特异性整合的转基因靶位点。
7.根据实施方案6所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述至少第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五或第十六个双链断裂靶位点选自锌指靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点、Cas9内切核酸酶靶位点、以及它们的任一种组合。
8.根据实施方案1所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述至少一个位点特异性整合的转基因靶位点包含第一重组位点和第二重组位点，其中所述第一和第二重组位点相对于彼此是相异的。
9.根据实施方案8所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述至少一个位点特异性整合的转基因靶位点还包含侧接有所述第一重组位点和所述第二重组位点的目的多核苷酸。
10.根据实施方案8所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述位点特异性整合的转基因靶位点的相异重组位点包括LOX位点、突变的LOX位点、FRT位点或突变的FRT位点。
11.根据实施方案8所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述第一重组位点和所述第二重组位点选自FRT1位点、FRT5位点、FRT6位点、FRT12位点和FRT87位点。
12.根据实施方案1所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述基因组窗口还包含位于Cas9内切核酸酶靶位点之外的位点特异性整合的转基因靶位点。
13.一种在其基因组中具有基因组窗口的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，所述基因组窗口包含至少一个双链断裂靶位点，其中所述基因组窗口侧接有：
a.至少第一标记，其包括BARC_1.01_Gm01_6984873_T_C、BARC_1.01_Gm01_7775299_G_A、BARC_1.01_Gm01_7856395_A_C、BARC_1.01_Gm01_8569887_A_G、BARC_1.01_Gm01_8601858_C_T、BARC_1.01_Gm01_8641430_C_T、BARC_1.01_Gm01_8674202_A_C、BARC_1.01_Gm01_8933345_C_T、BARC_1.01_Gm01_8964201_T_C、BARC_1.01_Gm01_9014216_T_G、BARC_1.01_Gm01_28179606_A_G、BARC_1.01_Gm01_28364595_A_G、BARC_1.01_Gm01_28536363_G_A、BARC_1.01_Gm01_28599526_G_A、BARC_1.01_Gm01_28913996_A_G、BARC_1.01_Gm01_29284158_A_G、BARC_1.01_Gm01_31202345_C_T、BARC_1.01_Gm01_31770743_C_T、BARC_1.01_Gm01_32683433_G_A、或BARC_1.01_Gm01_34327255_C_T；以及
b.至少第二标记，其包括BARC_1.01_Gm01_7775299_G_A、BARC_1.01_Gm01_7856395_A_C、BARC_1.01_Gm01_8569887_A_G、BARC_1.01_Gm01_8601858_C_T、BARC_1.01_Gm01_8641430_C_T、BARC_1.01_Gm01_8674202_A_C、BARC_1.01_Gm01_8933345_C_T、BARC_1.01_Gm01_8964201_T_C、BARC_1.01_Gm01_9014216_T_G、BARC_1.01_Gm01_28179606_A_G、BARC_1.01_Gm01_28364595_A_G、BARC_1.01_Gm01_28536363_G_A、BARC_1.01_Gm01_28599526_G_A、BARC_1.01_Gm01_28913996_A_G、BARC_1.01_Gm01_29284158_A_G、BARC_1.01_Gm01_31202345_C_T、BARC_1.01_Gm01_31770743_C_T、BARC_1.01_Gm01_32683433_G_A、BARC_1.01_Gm01_34327255_C_T或BARC_1.01_Gm01_36994849_A_G，其中所述基因组窗口包含转基因。
14.根据实施方案13所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中该转基因赋予选自以下的性状：除草剂耐受性、昆虫抗性、病害抗性、雄性不育、位点特异性重组、非生物胁迫耐受性、磷的改变、抗氧化剂的改变、脂肪酸的改变、必需氨基酸的改变、碳水化合物的改变、除草剂耐受性、昆虫抗性和病害抗性。
15.根据实施方案13所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述基因组窗口的长度不超过0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、5、10cM。
16.根据实施方案13所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述基因组窗口还包含至少第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五或第十六个双链断裂靶位点。
17.根据实施方案13所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述至少一个双链断裂靶位点选自锌指内切核酸酶靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点和Cas9内切核酸酶靶位点。
18.根据实施方案16所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述至少第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五或第十六个双链断裂靶位点选自锌指靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点、Cas9内切核酸酶靶位点、以及它们的任一种组合。
19.根据实施方案13所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述基因组窗口还包含至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，其中所述转基因靶位点包含第一重组位点和第二重组位点，其中所述第一重组位点和第二重组位点相对于彼此是相异的。
20.根据实施方案19所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述至少一个位点特异性整合的转基因靶位点的相异重组位点包括LOX位点、突变的LOX位点、FRT位点或突变的FRT位点。
21.根据实施方案20所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述第一重组位点和所述第二重组位点选自FRT1位点、FRT5位点、FRT6位点、FRT12位点和FRT87位点。
22.一种在其基因组中具有基因组窗口的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，所述基因组窗口包含至少一个改变的双链断裂靶位点，其中所述基因组窗口侧接有：
a.至少第一标记，其包括BARC_1.01_Gm01_6984873_T_C、BARC_1.01_Gm01_7775299_G_A、BARC_1.01_Gm01_7856395_A_C、BARC_1.01_Gm01_8569887_A_G、BARC_1.01_Gm01_8601858_C_T、BARC_1.01_Gm01_8641430_C_T、BARC_1.01_Gm01_8674202_A_C、BARC_1.01_Gm01_8933345_C_T、BARC_1.01_Gm01_8964201_T_C、BARC_1.01_Gm01_9014216_T_G、BARC_1.01_Gm01_28179606_A_G、BARC_1.01_Gm01_28364595_A_G、BARC_1.01_Gm01_28536363_G_A、BARC_1.01_Gm01_28599526_G_A、BARC_1.01_Gm01_28913996_A_G、BARC_1.01_Gm01_29284158_A_G、BARC_1.01_Gm01_31202345_C_T、BARC_1.01_Gm01_31770743_C_T、BARC_1.01_Gm01_32683433_G_A、或BARC_1.01_Gm01_34327255_C_T；以及
b.至少第二标记，其包括BARC_1.01_Gm01_7775299_G_A、BARC_1.01_Gm01_7856395_A_C、BARC_1.01_Gm01_8569887_A_G、BARC_1.01_Gm01_8601858_C_T、BARC_1.01_Gm01_8641430_C_T、BARC_1.01_Gm01_8674202_A_C、BARC_1.01_Gm01_8933345_C_T、BARC_1.01_Gm01_8964201_T_C、BARC_1.01_Gm01_9014216_T_G、BARC_1.01_Gm01_28179606_A_G、BARC_1.01_Gm01_28364595_A_G、BARC_1.01_Gm01_28536363_G_A、BARC_1.01_Gm01_28599526_G_A、BARC_1.01_Gm01_28913996_A_G、BARC_1.01_Gm01_29284158_A_G、BARC_1.01_Gm01_31202345_C_T、BARC_1.01_Gm01_31770743_C_T、BARC_1.01_Gm01_32683433_G_A、BARC_1.01_Gm01_34327255_C_T或BARC_1.01_Gm01_36994849_A_G。
23.根据实施方案22所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述基因组窗口的长度不超过0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、5、10cM。
24.根据实施方案22所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述改变的双链断裂靶位点来源于选自以下的双链断裂位点：靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点、Cas9内切核酸酶靶位点。
25.根据实施方案22所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述改变的双链断裂靶位点包含目的多核苷酸。
26.根据实施方案25所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述目的多核苷酸包括转基因、天然基因、编辑基因、或它们的任何组合。
27.根据实施方案22所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述基因组窗口还包含至少第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五或第十六个双链断裂靶位点。
28.根据实施方案27所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述至少第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五或第十六个双链断裂靶位点选自锌指靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点、Cas9内切核酸酶靶位点或它们的任一种组合。
29.根据实施方案25所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中目的多核苷酸赋予包括以下的性状：雄性不育、位点特异性重组、非生物胁迫耐受性、磷的改变、抗氧化剂的改变、脂肪酸的改变、必需氨基酸的改变、碳水化合物的改变、除草剂耐受性、昆虫抗性或病害抗性。
30.根据实施方案22所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述基因组窗口还包含至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，所述转基因靶位点包含第一重组位点和第二重组位点，其中所述第一和第二重组位点相对于彼此是相异的。
31.根据实施方案30所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述至少一个位点特异性整合的转基因靶位点的相异重组位点包括LOX位点、突变的LOX位点、FRT位点或突变的FRT位点。
32.根据实施方案30所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中第一重组位点和第二重组位点选自FRT1位点、FRT5位点、FRT6位点、FRT12位点和FRT87位点。
33.一种在其基因组中具有基因组窗口的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，所述基因组窗口包含整合进至少一个双链断裂靶位点中的至少一个位点特异性整合(SSI)的转基因靶位点，其中所述基因组窗口侧接有
a.至少第一标记，其包括BARC_1.01_Gm06_46915875_T_C、BARC_1.01_Gm06_47524452_G_T、BARC_1.01_Gm06_47561262_C_T、BARC_1.01_Gm06_47625670_C_T、BARC_1.01_Gm06_47631544_T_C、BARC_1.01_Gm06_47789229_C_T、BARC_1.01_Gm06_47821576_T_G、BARC_1.01_Gm06_47829363_A_C、BARC_1.01_Gm06_47833095_A_G、BARC_1.01_Gm06_47847021_G_T、BARC_1.01_Gm06_47895876_G_A或BARC_1.01_Gm06_48221293_T_C；以及
b.至少第二标记，其包括BARC_1.01_Gm06_47524452_G_T、BARC_1.01_Gm06_47561262_C_T、BARC_1.01_Gm06_47625670_C_T、BARC_1.01_Gm06_47631544_T_C、BARC_1.01_Gm06_47789229_C_T、BARC_1.01_Gm06_47821576_T_G、BARC_1.01_Gm06_47829363_A_C、BARC_1.01_Gm06_47833095_A_G、BARC_1.01_Gm06_47847021_G_T、BARC_1.01_Gm06_47895876_G_A、BARC_1.01_Gm06_48221293_T_C或BARC_1.01_Gm06_48528885_G_T。
34.根据实施方案33所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述至少一个双链断裂靶位点选自：锌指内切核酸酶靶位点、工程化内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点和Cas9内切核酸酶靶位点。
35.根据实施方案33所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述基因组窗口的长度不超过0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、5、10cM。
36.根据实施方案33所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述基因组窗口还包含转基因。
37.根据实施方案36所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中该转基因赋予选自以下的性状：除草剂耐受性、昆虫抗性、病害抗性、雄性不育、位点特异性重组、非生物胁迫耐受性、磷的改变、抗氧化剂的改变、脂肪酸的改变、必需氨基酸的改变、碳水化合物的改变、除草剂耐受性、昆虫抗性和病害抗性。
38.根据实施方案33所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述基因组窗口还包含整合进至少第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十个双链断裂靶位点中的至少第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十个位点特异性整合的转基因靶位点。
39.根据实施方案38所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述至少第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十个双链断裂靶位点选自锌指靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点、Cas9内切核酸酶靶位点、以及它们的任一种组合。
40.根据实施方案33所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述至少一个位点特异性整合的转基因靶位点包含第一重组位点和第二重组位点，其中所述第一和第二重组位点相对于彼此是相异的。
41.根据实施方案40所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述至少一个位点特异性整合的转基因靶位点还包含侧接有所述第一重组位点和所述第二重组位点的目的多核苷酸。
42.根据实施方案40所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述位点特异性整合的转基因靶位点的相异重组位点包括LOX位点、突变的LOX位点、FRT位点或突变的FRT位点。
43.根据实施方案40所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述第一重组位点和所述第二重组位点选自FRT1位点、FRT5位点、FRT6位点、FRT12位点和FRT87位点。
44.根据实施方案33所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述基因组窗口还包含位于Cas9内切核酸酶靶位点之外的位点特异性整合的转基因靶位点。
45.一种在其基因组中具有基因组窗口的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，所述基因组窗口包含至少一个双链断裂靶位点，其中所述基因组窗口侧接有：
a.至少第一标记，其包括BARC_1.01_Gm06_46915875_T_C、BARC_1.01_Gm06_47524452_G_T、BARC_1.01_Gm06_47561262_C_T、BARC_1.01_Gm06_47625670_C_T、BARC_1.01_Gm06_47631544_T_C、BARC_1.01_Gm06_47789229_C_T、BARC_1.01_Gm06_47821576_T_G、BARC_1.01_Gm06_47829363_A_C、BARC_1.01_Gm06_47833095_A_G、BARC_1.01_Gm06_47847021_G_T、BARC_1.01_Gm06_47895876_G_A或BARC_1.01_Gm06_48221293_T_C；以及
b.至少第二标记，其包括BARC_1.01_Gm06_47524452_G_T、BARC_1.01_Gm06_47561262_C_T、BARC_1.01_Gm06_47625670_C_T、BARC_1.01_Gm06_47631544_T_C、BARC_1.01_Gm06_47789229_C_T、BARC_1.01_Gm06_47821576_T_G、BARC_1.01_Gm06_47829363_A_C、BARC_1.01_Gm06_47833095_A_G、BARC_1.01_Gm06_47847021_G_T、BARC_1.01_Gm06_47895876_G_A、BARC_1.01_Gm06_48221293_T_C或BARC_1.01_Gm06_48528885_G_T，
其中所述基因组窗口包含转基因。
46.根据实施方案45所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中转基因赋予选自以下的性状：除草剂耐受性、昆虫抗性、病害抗性、雄性不育、位点特异性重组、非生物胁迫耐受性、磷的改变、抗氧化剂的改变、脂肪酸的改变、必需氨基酸的改变、碳水化合物的改变、除草剂耐受性、昆虫抗性和病害抗性。
47.根据实施方案45所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述基因组窗口的长度不超过0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、5、10cM。
48.根据实施方案45所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述基因组窗口还包含至少第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十个双链断裂靶位点。
49.根据实施方案45所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述至少一个双链断裂靶位点选自锌指内切核酸酶靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点和Cas9内切核酸酶靶位点。
50.根据实施方案48所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述至少第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十个双链断裂靶位点选自锌指靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点、Cas9内切核酸酶靶位点、以及它们的任一种组合。
51.根据实施方案45所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述基因组窗口还包含至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，其中所述转基因靶位点包含第一重组位点和第二重组位点，其中所述第一重组位点和第二重组位点相对于彼此是相异的。
52.根据实施方案51所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述至少一个位点特异性整合的转基因靶位点的相异重组位点包括LOX位点、突变的LOX位点、FRT位点或突变的FRT位点。
53.根据实施方案52所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述第一重组位点和所述第二重组位点选自FRT1位点、FRT5位点、FRT6位点、FRT12位点和FRT87位点。
54.一种在其基因组中具有基因组窗口的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，所述基因组窗口包含至少一个改变的双链断裂靶位点，其中所述基因组窗口侧接有：
a.至少第一标记，其包括BARC_1.01_Gm06_46915875_T_C、BARC_1.01_Gm06_47524452_G_T、BARC_1.01_Gm06_47561262_C_T、BARC_1.01_Gm06_47625670_C_T、BARC_1.01_Gm06_47631544_T_C、BARC_1.01_Gm06_47789229_C_T、BARC_1.01_Gm06_47821576_T_G、BARC_1.01_Gm06_47829363_A_C、BARC_1.01_Gm06_47833095_A_G、BARC_1.01_Gm06_47847021_G_T、BARC_1.01_Gm06_47895876_G_A或BARC_1.01_Gm06_48221293_T_C；以及
b.至少第二标记，其包括BARC_1.01_Gm06_47524452_G_T、BARC_1.01_Gm06_47561262_C_T、BARC_1.01_Gm06_47625670_C_T、BARC_1.01_Gm06_47631544_T_C、BARC_1.01_Gm06_47789229_C_T、BARC_1.01_Gm06_47821576_T_G、BARC_1.01_Gm06_47829363_A_C、BARC_1.01_Gm06_47833095_A_G、BARC_1.01_Gm06_47847021_G_T、BARC_1.01_Gm06_47895876_G_A、BARC_1.01_Gm06_48221293_T_C或BARC_1.01_Gm06_48528885_G_T。
55.根据实施方案54所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述基因组窗口的长度不超过0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、5、10cM。
56.根据实施方案54所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述改变的双链断裂靶位点来源于选自以下的双链断裂位点：锌指靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点、Cas9内切核酸酶靶位点。
57.根据实施方案54所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述改变的双链断裂靶位点包含目的多核苷酸。
58.根据实施方案57所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述目的多核苷酸包括转基因、天然基因、编辑基因、或它们的任何组合。
59.根据实施方案54所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述基因组窗口还包含至少第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十个双链断裂靶位点。
60.根据实施方案59所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述至少第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十个双链断裂靶位点选自锌指靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点、Cas9内切核酸酶靶位点或它们的任一种组合。
61.根据实施方案57所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中该目的多核苷酸赋予包括以下的性状：雄性不育、位点特异性重组、非生物胁迫耐受性、磷的改变、抗氧化剂的改变、脂肪酸的改变、必需氨基酸的改变、碳水化合物的改变、除草剂耐受性、昆虫抗性或病害抗性。
62.根据实施方案54所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述基因组窗口还包含至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，所述转基因靶位点包含第一重组位点和第二重组位点，其中所述第一和第二重组位点相对于彼此是相异的。
63.根据实施方案62所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述至少一个位点特异性整合的转基因靶位点的相异重组位点包括LOX位点、突变的LOX位点、FRT位点或突变的FRT位点。
64.根据实施方案62所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中第一重组位点和第二重组位点选自FRT1位点、FRT5位点、FRT6位点、FRT12位点和FRT87位点。
65.一种在其基因组中具有基因组窗口的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，所述基因组窗口包含整合进至少一个双链断裂靶位点中的至少一个位点特异性整合(SSI)的转基因靶位点，其中所述基因组窗口侧接有
a.至少第一标记，其包括BARC_1.01_Gm04_45591011_C_T、BARC_1.01_Gm04_45613405_T_C、BARC_1.01_Gm04_45697256_G_A、BARC_1.01_Gm04_45739051_A_C、BARC_1.01_Gm04_45800267_T_C、BARC_1.01_Gm04_45857325_T_C、BARC_1.01_Gm04_45857325_T_C、BARC_1.01_Gm04_45883080_A_G、BARC_1.01_Gm04_45903617_T_C或BARC_1.01_Gm04_46000185_C_A；以及
b.至少第二标记，其包括BARC_1.01_Gm04_45613405_T_C、BARC_1.01_Gm04_45697256_G_A、BARC_1.01_Gm04_45739051_A_C、BARC_1.01_Gm04_45800267_T_C、BARC_1.01_Gm04_45857325_T_C、BARC_1.01_Gm04_45857325_T_C、BARC_1.01_Gm04_45883080_A_G、BARC_1.01_Gm04_45903617_T_C、BARC_1.01_Gm04_46000185_C_A或BARC_1.01_Gm04_46113406_T_G。
66.根据实施方案65所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述至少一个双链断裂靶位点选自：锌指内切核酸酶靶位点、工程化内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点和Cas9内切核酸酶靶位点。
67.根据实施方案65所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述基因组窗口的长度不超过0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、5、10cM。
68.根据实施方案1所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述基因组窗口还包含转基因。
69.根据实施方案68所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中该转基因赋予选自以下的性状：除草剂耐受性、昆虫抗性、病害抗性、雄性不育、位点特异性重组、非生物胁迫耐受性、磷的改变、抗氧化剂的改变、脂肪酸的改变、必需氨基酸的改变、碳水化合物的改变、除草剂耐受性、昆虫抗性和病害抗性。
70.根据实施方案65所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述基因组窗口还包含整合进至少第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三或第十四个双链断裂靶位点中的至少第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三或第十四个位点特异性整合的转基因靶位点。
71.根据实施方案70所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述至少第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三或第十四个双链断裂靶位点选自锌指靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点、Cas9内切核酸酶靶位点、以及它们的任一种组合。
72.根据实施方案65所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述至少一个位点特异性整合的转基因靶位点包含第一重组位点和第二重组位点，其中所述第一和第二重组位点相对于彼此是相异的。
73.根据实施方案72所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述至少一个位点特异性整合的转基因靶位点还包含侧接有所述第一重组位点和所述第二重组位点的目的多核苷酸。
74.根据实施方案72所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述位点特异性整合的转基因靶位点的相异重组位点包括LOX位点、突变的LOX位点、FRT位点或突变的FRT位点。
75.根据实施方案72所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述第一重组位点和所述第二重组位点选自FRT1位点、FRT5位点、FRT6位点、FRT12位点和FRT87位点。
76.根据实施方案65所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述基因组窗口还包含位于Cas9内切核酸酶靶位点之外的位点特异性整合的转基因靶位点。
77.一种在其基因组中具有基因组窗口的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，所述基因组窗口包含至少一个双链断裂靶位点，其中所述基因组窗口侧接有：
a.至少第一标记，其包括BARC_1.01_Gm04_45591011_C_T、BARC_1.01_Gm04_45613405_T_C、BARC_1.01_Gm04_45697256_G_A、BARC_1.01_Gm04_45739051_A_C、BARC_1.01_Gm04_45800267_T_C、BARC_1.01_Gm04_45857325_T_C、BARC_1.01_Gm04_45857325_T_C、BARC_1.01_Gm04_45883080_A_G、BARC_1.01_Gm04_45903617_T_C或BARC_1.01_Gm04_46000185_C_A；以及
b.至少第二标记，其包括BARC_1.01_Gm04_45613405_T_C、BARC_1.01_Gm04_45697256_G_A、BARC_1.01_Gm04_45739051_A_C、BARC_1.01_Gm04_45800267_T_C、BARC_1.01_Gm04_45857325_T_C、BARC_1.01_Gm04_45857325_T_C、BARC_1.01_Gm04_45883080_A_G、BARC_1.01_Gm04_45903617_T_C、BARC_1.01_Gm04_46000185_C_A或BARC_1.01_Gm04_46113406_T_G，
其中所述基因组窗口包含转基因。
78.根据实施方案77所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中该转基因赋予选自以下的性状：除草剂耐受性、昆虫抗性、病害抗性、雄性不育、位点特异性重组、非生物胁迫耐受性、磷的改变、抗氧化剂的改变、脂肪酸的改变、必需氨基酸的改变、碳水化合物的改变、除草剂耐受性、昆虫抗性和病害抗性。
79.根据实施方案77所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述基因组窗口的长度不超过0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、5、10cM。
80.根据实施方案77所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述基因组窗口还包含至少第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三或第十四个双链断裂靶位点。
81.根据实施方案77所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述至少一个双链断裂靶位点选自锌指内切核酸酶靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点和Cas9内切核酸酶靶位点。
82.根据实施方案80所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述至少第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三或第十四个双链断裂靶位点选自锌指靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点、Cas9内切核酸酶靶位点、以及它们的任一种组合。
83.根据实施方案77所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述基因组窗口还包含至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，其中所述转基因靶位点包含第一重组位点和第二重组位点，其中所述第一重组位点和第二重组位点相对于彼此是相异的。
84.根据实施方案83所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述至少一个位点特异性整合的转基因靶位点的相异重组位点包括LOX位点、突变的LOX位点、FRT位点或突变的FRT位点。
85.根据实施方案84所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述第一重组位点和所述第二重组位点选自FRT1位点、FRT5位点、FRT6位点、FRT12位点和FRT87位点。
86.一种在其基因组中具有基因组窗口的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，所述基因组窗口包含至少一个改变的双链断裂靶位点，其中所述基因组窗口侧接有：
a.至少第一标记，其包括BARC_1.01_Gm04_45591011_C_T、BARC_1.01_Gm04_45613405_T_C、BARC_1.01_Gm04_45697256_G_A、BARC_1.01_Gm04_45739051_A_C、BARC_1.01_Gm04_45800267_T_C、BARC_1.01_Gm04_45857325_T_C、BARC_1.01_Gm04_45857325_T_C、BARC_1.01_Gm04_45883080_A_G、BARC_1.01_Gm04_45903617_T_C或BARC_1.01_Gm04_46000185_C_A；以及
b.至少第二标记，其包括BARC_1.01_Gm04_45613405_T_C、BARC_1.01_Gm04_45697256_G_A、BARC_1.01_Gm04_45739051_A_C、BARC_1.01_Gm04_45800267_T_C、BARC_1.01_Gm04_45857325_T_C、BARC_1.01_Gm04_45857325_T_C、BARC_1.01_Gm04_45883080_A_G、BARC_1.01_Gm04_45903617_T_C、BARC_1.01_Gm04_46000185_C_A或BARC_1.01_Gm04_46113406_T_G。
87.根据实施方案86所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述基因组窗口的长度不超过0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、5、10cM。
88.根据实施方案86所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述改变的双链断裂靶位点来源于选自以下的双链断裂位点：锌指靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点、Cas9内切核酸酶靶位点。
89.根据实施方案86所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述改变的双链断裂靶位点包含目的多核苷酸。
90.根据实施方案89所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述目的多核苷酸包括转基因、天然基因、编辑基因、或它们的任何组合。
91.根据实施方案86所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述基因组窗口还包含至少第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三或第十四个双链断裂靶位点。
92.根据实施方案91所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述至少第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三或第十四个双链断裂靶位点选自锌指靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点、Cas9内切核酸酶靶位点或它们的任一种组合。
93.根据实施方案89所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中该目的多核苷酸赋予包括以下的性状：雄性不育、位点特异性重组、非生物胁迫耐受性、磷的改变、抗氧化剂的改变、脂肪酸的改变、必需氨基酸的改变、碳水化合物的改变、除草剂耐受性、昆虫抗性或病害抗性。
94.根据实施方案86所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述基因组窗口还包含至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，所述转基因靶位点包含第一重组位点和第二重组位点，其中所述第一和第二重组位点相对于彼此是相异的。
95.根据实施方案94所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中所述至少一个位点特异性整合的转基因靶位点的相异重组位点包括LOX位点、突变的LOX位点、FRT位点或突变的FRT位点。
96.根据实施方案94所述的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，其中第一重组位点和第二重组位点选自FRT1位点、FRT5位点、FRT6位点、FRT12位点和FRT87位点。
97.一种在其基因组中具有基因组窗口的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，所述基因组窗口包含整合进至少一个双链断裂靶位点中的至少一个位点特异性整合(SSI)的转基因靶位点，其中所述基因组窗口侧接有
a.至少第一标记，其包括SYN12545、SYN12536、SYN14645、PZE-101023852、PZE-101024424、SYN25022、SYN31156、SYN31166或SYN22238：以及
b.至少第二标记，其包括SYN12536、SYN14645、PZE-101023852、PZE-101024424、SYN25022、SYN31156、SYN31166、SYN22238或SYN20196。
98.根据实施方案97所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少一个双链断裂靶位点选自锌指内切核酸酶靶位点、工程化内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点和Cas9内切核酸酶靶位点。
99.根据实施方案97所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口的长度不超过0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、5、10cM。
100.根据实施方案97所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口还包含转基因。
101.根据实施方案100所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中该转基因赋予选自以下的性状：除草剂耐受性、昆虫抗性、病害抗性、雄性不育、位点特异性重组、非生物胁迫耐受性、磷改变、抗氧化剂改变、脂肪酸改变、必需氨基酸改变、碳水化合物改变、除草剂耐受性、昆虫抗性和病害抗性。
102.根据实施方案97所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口还包含整合进至少第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31个双链断裂靶位点中的至少第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31个位点特异性整合的转基因靶位点。
103.根据实施方案102所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31个双链断裂靶位点选自锌指靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点、Cas9内切核酸酶靶位点、以及它们的任一种组合。
104.根据实施方案97所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少一个位点特异性整合的转基因靶位点包含第一重组位点和第二重组位点，其中所述第一重组位点和第二重组位点相对于彼此是相异的。
105.根据实施方案104所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少一个位点特异性整合的转基因靶位点还包含侧接有所述第一重组位点和所述第二重组位点的目的多核苷酸。
106.根据实施方案104所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述位点特异性整合的转基因靶位点的相异重组位点包括LOX位点、突变的LOX位点、FRT位点或突变的FRT位点。
107.根据实施方案104所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述第一重组位点和所述第二重组位点选自FRT1位点、FRT5位点、FRT6位点、FRT12位点和FRT87位点。
108.根据实施方案97所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口还包含位于Cas9内切核酸酶靶位点之外的位点特异性整合的转基因靶位点。
109.一种在其基因组中具有基因组窗口的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，所述基因组窗口包含至少一个双链断裂靶位点，其中所述基因组窗口侧接有：
a.至少第一标记，其包括SYN12545、SYN12536、SYN14645、PZE-101023852、PZE-101024424、SYN25022、SYN31156、SYN31166或SYN22238；以及
b.至少第二标记，其包括SYN12536、SYN14645、PZE-101023852、PZE-101024424、SYN25022、SYN31156、SYN31166、SYN22238或SYN20196，
其中所述基因组窗口包含转基因。
110.根据实施方案109所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中该转基因赋予选自以下的性状：除草剂耐受性、昆虫抗性、病害抗性、雄性不育、位点特异性重组、非生物胁迫耐受性、磷的改变、抗氧化剂的改变、脂肪酸的改变、必需氨基酸的改变、碳水化合物的改变、除草剂耐受性、昆虫抗性和病害抗性。
111.根据实施方案109所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口的长度不超过0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、5、10cM。
112.根据实施方案109所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口还包含至少第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31个双链断裂靶位点。
113.根据实施方案109所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少一个双链断裂靶位点选自锌指内切核酸酶靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点和Cas9内切核酸酶靶位点。
114.根据实施方案112所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31个双链断裂靶位点选自锌指靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点、Cas9内切核酸酶靶位点、以及它们的任一种组合。
115.根据实施方案109所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口还包含至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，其中所述转基因靶位点包含第一重组位点和第二重组位点，其中所述第一重组位点和第二重组位点相对于彼此是相异的。
116.根据实施方案115所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少一个位点特异性整合的转基因靶位点的相异重组位点包括LOX位点、突变的LOX位点、FRT位点或突变的FRT位点。
117.根据实施方案116所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述第一重组位点和所述第二重组位点选自FRT1位点、FRT5位点、FRT6位点、FRT12位点和FRT87位点。
118.一种在其基因组中具有基因组窗口的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，所述基因组窗口包含至少一个改变的双链断裂靶位点，其中所述基因组窗口侧接有：
a.至少第一标记，其包括SYN12545、SYN12536、SYN14645、PZE-101023852、PZE-101024424、SYN25022、SYN31156、SYN31166或SYN22238；以及
b.至少第二标记，其包括SYN12536、SYN14645、PZE-101023852、PZE-101024424、SYN25022、SYN31156、SYN31166、SYN22238或SYN20196。
119.根据实施方案118所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口的长度不超过0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、5、10cM。
120.根据实施方案118所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述改变的双链断裂靶位点来源于选自以下的双链断裂位点：锌指靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点、Cas9内切核酸酶靶位点。
121.根据实施方案118所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述改变的双链断裂靶位点包含目的多核苷酸。
122.根据实施方案121所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述目的多核苷酸包括转基因、天然基因、编辑基因、或它们的任何组合。
123.根据实施方案118所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口还包含至少第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31个双链断裂靶位点。
124.根据实施方案123所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31个双链断裂靶位点选自锌指靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点、Cas9内切核酸酶靶位点或它们的任一种组合。
125.根据实施方案121所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述目的多核苷酸赋予包括以下的性状：雄性不育、位点特异性重组、非生物胁迫耐受性、磷的改变、抗氧化剂的改变、脂肪酸的改变、必需氨基酸的改变、碳水化合物的改变、除草剂耐受性、昆虫抗性或病害抗性。
126.根据实施方案118所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口还包含至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，所述转基因靶位点包含第一重组位点和第二重组位点，其中所述第一和第二重组位点相对于彼此是相异的。
127.根据实施方案126所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少一个位点特异性整合的转基因靶位点的相异重组位点包括LOX位点、突变的LOX位点、FRT位点或突变的FRT位点。
128.根据实施方案126所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述第一重组位点和所述第二重组位点选自FRT1位点、FRT5位点、FRT6位点、FRT12位点和FRT87位点。
129.一种在其基因组中具有基因组窗口的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，所述基因组窗口包含整合进至少一个双链断裂靶位点中的至少一个位点特异性整合(SSI)的转基因靶位点，其中所述基因组窗口侧接有
a.至少第一标记，其包括PZE-101205031、PUT-163A-148951459-517、PZE-101205904或PZE-101206569；以及
b.至少第二标记，其包括PUT-163A-148951459-517、PZE-101205904、PZE-101206569或SYN24492。
130.根据实施方案129所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少一个双链断裂靶位点选自锌指内切核酸酶靶位点、工程化内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点和Cas9内切核酸酶靶位点。
131.根据实施方案129所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口的长度不超过0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、5、10cM。
132.根据实施方案129所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口还包含转基因。
133.根据实施方案132所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中该转基因赋予选自以下的性状：除草剂耐受性、昆虫抗性、病害抗性、雄性不育、位点特异性重组、非生物胁迫耐受性、磷的改变、抗氧化剂的改变、脂肪酸的改变、必需氨基酸的改变、碳水化合物的改变、除草剂耐受性、昆虫抗性和病害抗性。
134.根据实施方案129所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口还包含整合进至少第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个双链断裂靶位点中的至少第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个位点特异性整合的转基因靶位点。
135.根据实施方案134所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个双链断裂靶位点选自锌指靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点、Cas9内切核酸酶靶位点、以及它们的任一种组合。
136.根据实施方案129所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少一个位点特异性整合的转基因靶位点包含第一重组位点和第二重组位点，其中所述第一重组位点和第二重组位点相对于彼此是相异的。
137.根据实施方案136所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少一个位点特异性整合的转基因靶位点还包含侧接有所述第一重组位点和所述第二重组位点的目的多核苷酸。
138.根据实施方案136所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述位点特异性整合的转基因靶位点的相异重组位点包括LOX位点、突变的LOX位点、FRT位点或突变的FRT位点。
139.根据实施方案136所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述第一重组位点和所述第二重组位点选自FRT1位点、FRT5位点、FRT6位点、FRT12位点和FRT87位点。
140.根据实施方案129所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口还包含位于Cas9内切核酸酶靶位点之外的位点特异性整合的转基因靶位点。
141.一种在其基因组中具有基因组窗口的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，所述基因组窗口包含至少一个双链断裂靶位点，其中所述基因组窗口侧接有：
a.至少第一标记，其包括PZE-101205031、PUT-163A-148951459-517、PZE-101205904或PZE-101206569；以及
b.至少第二标记，其包括PUT-163A-148951459-517、PZE-101205904、PZE-101206569或SYN24492，
其中所述基因组窗口包含转基因。
142.根据实施方案141所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中该转基因赋予选自以下的性状：除草剂耐受性、昆虫抗性、病害抗性、雄性不育、位点特异性重组、非生物胁迫耐受性、磷的改变、抗氧化剂的改变、脂肪酸的改变、必需氨基酸的改变、碳水化合物的改变、除草剂耐受性、昆虫抗性和病害抗性。
143.根据实施方案141所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口的长度不超过0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、5、10cM。
144.根据实施方案141所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口还包含至少第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个双链断裂靶位点。
145.根据实施方案141所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少一个双链断裂靶位点选自锌指内切核酸酶靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点和Cas9内切核酸酶靶位点。
146.根据实施方案144所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个双链断裂靶位点选自锌指靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点、Cas9内切核酸酶靶位点、以及它们的任一种组合。
147.根据实施方案141所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口还包含至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，其中所述转基因靶位点包含第一重组位点和第二重组位点，其中所述第一重组位点和第二重组位点相对于彼此是相异的。
148.根据实施方案147所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少一个位点特异性整合的转基因靶位点的相异重组位点包括LOX位点、突变的LOX位点、FRT位点或突变的FRT位点。
149.根据实施方案148所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述第一重组位点和所述第二重组位点选自FRT1位点、FRT5位点、FRT6位点、FRT12位点和FRT87位点。
150.一种在其基因组中具有基因组窗口的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，所述基因组窗口包含至少一个改变的双链断裂靶位点，其中所述基因组窗口侧接有：
a.至少第一标记，其包括PZE-101205031、PUT-163A-148951459-517、PZE-101205904或PZE-101206569；以及
b.至少第二标记，其包括PUT-163A-148951459-517、PZE-101205904、PZE-101206569或SYN24492。
151.根据实施方案150所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口的长度不超过0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、5、10cM。
152.根据实施方案150所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述改变的双链断裂靶位点来源于选自以下的双链断裂位点：锌指靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点、Cas9内切核酸酶靶位点。
153.根据实施方案150所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述改变的双链断裂靶位点包含目的多核苷酸。
154.根据实施方案152所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述目的多核苷酸包括转基因、天然基因、编辑基因、或它们的任何组合。
155.根据实施方案150所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口还包含至少第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个双链断裂靶位点。
156.根据实施方案155所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个双链断裂靶位点选自锌指靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点、Cas9内切核酸酶靶位点或它们的任一种组合。
157.根据实施方案152所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述目的多核苷酸赋予包括以下的性状：雄性不育、位点特异性重组、非生物胁迫耐受性、磷的改变、抗氧化剂的改变、脂肪酸的改变、必需氨基酸的改变、碳水化合物的改变、除草剂耐受性、昆虫抗性或病害抗性。
158.根据实施方案150所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口还包含至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，所述转基因靶位点包含第一重组位点和第二重组位点，其中所述第一和第二重组位点相对于彼此是相异的。
159.根据实施方案158所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少一个位点特异性整合的转基因靶位点的相异重组位点包括LOX位点、突变的LOX位点、FRT位点或突变的FRT位点。
160.根据实施方案158所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述第一重组位点和所述第二重组位点选自FRT1位点、FRT5位点、FRT6位点、FRT12位点和FRT87位点。
161.一种在其基因组中具有基因组窗口的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，所述基因组窗口包含整合进至少一个双链断裂靶位点中的至少一个位点特异性整合(SSI)的转基因靶位点，其中所述基因组窗口侧接有
a.至少第一标记，其包括PZE-103000166、PZE-103000238、PZE-103000307或SYN6355；以及
b.至少第二标记，其包括PZE-103000238、PZE-103000307、SYN6355或PZE-103001421。
162.根据实施方案161所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少一个双链断裂靶位点选自锌指内切核酸酶靶位点、工程化内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点和Cas9内切核酸酶靶位点。
163.根据实施方案161所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口的长度不超过0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、5、10cM。
164.根据实施方案161所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口还包含转基因。
165.根据实施方案164所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中转基因赋予选自以下的性状：除草剂耐受性、昆虫抗性、病害抗性、雄性不育、位点特异性重组、非生物胁迫耐受性、磷的改变、抗氧化剂的改变、脂肪酸的改变、必需氨基酸的改变、碳水化合物的改变、除草剂耐受性、昆虫抗性和病害抗性。
166.根据实施方案161所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口还包含整合进至少第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个双链断裂靶位点中的至少第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个位点特异性整合的转基因靶位点。
167.根据实施方案164所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个双链断裂靶位点选自锌指靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点、Cas9内切核酸酶靶位点、以及它们的任一种组合。
168.根据实施方案161所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少一个位点特异性整合的转基因靶位点包含第一重组位点和第二重组位点，其中所述第一重组位点和第二重组位点相对于彼此是相异的。
169.根据实施方案168所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少一个位点特异性整合的转基因靶位点还包含侧接有所述第一重组位点和所述第二重组位点的目的多核苷酸。
170.根据实施方案168所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述位点特异性整合的转基因靶位点的相异重组位点包括LOX位点、突变的LOX位点、FRT位点或突变的FRT位点。
171.根据实施方案168所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述第一重组位点和所述第二重组位点选自FRT1位点、FRT5位点、FRT6位点、FRT12位点和FRT87位点。
172.根据实施方案161所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口还包含位于Cas9内切核酸酶靶位点之外的位点特异性整合的转基因靶位点。
173.一种在其基因组中具有基因组窗口的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，所述基因组窗口包含至少一个双链断裂靶位点，其中所述基因组窗口侧接有：
a.至少第一标记，其包括PZE-103000166、PZE-103000238、PZE-103000307或SYN6355；以及
b.至少第二标记，其包括PZE-103000238、PZE-103000307、SYN6355或PZE-103001421，
其中所述基因组窗口包含转基因。
174.根据实施方案173所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中该转基因赋予选自以下的性状：除草剂耐受性、昆虫抗性、病害抗性、雄性不育、位点特异性重组、非生物胁迫耐受性、磷的改变、抗氧化剂的改变、脂肪酸的改变、必需氨基酸的改变、碳水化合物的改变、除草剂耐受性、昆虫抗性和病害抗性。
175.根据实施方案173所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口的长度不超过0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、5、10cM。
176.根据实施方案173所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口还包含至少第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个双链断裂靶位点。
177.根据实施方案173所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少一个双链断裂靶位点选自锌指内切核酸酶靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点和Cas9内切核酸酶靶位点。
178.根据实施方案176所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个双链断裂靶位点选自锌指靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点、Cas9内切核酸酶靶位点、以及它们的任一种组合。
179.根据实施方案173所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口还包含至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，其中所述转基因靶位点包含第一重组位点和第二重组位点，其中所述第一重组位点和第二重组位点相对于彼此是相异的。
180.根据实施方案179所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少一个位点特异性整合的转基因靶位点的相异重组位点包括LOX位点、突变的LOX位点、FRT位点或突变的FRT位点。
181.根据实施方案179所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述第一重组位点和所述第二重组位点选自FRT1位点、FRT5位点、FRT6位点、FRT12位点和FRT87位点。
182.一种在其基因组中具有基因组窗口的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，所述基因组窗口包含至少一个改变的双链断裂靶位点，其中所述基因组窗口侧接有：
a.至少第一标记，其包括PZE-103000166、PZE-103000238、PZE-103000307或SYN6355；以及
b.至少第二标记，其包括PZE-103000238、PZE-103000307、SYN6355或PZE-103001421。
183.根据实施方案182所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口的长度不超过0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、5、10cM。
184.根据实施方案182所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述改变的双链断裂靶位点来源于选自以下的双链断裂位点：锌指靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点、Cas9内切核酸酶靶位点。
185.根据实施方案182所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述改变的双链断裂靶位点包含目的多核苷酸。
186.根据实施方案184所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述目的多核苷酸包括转基因、天然基因、编辑基因、或它们的任何组合。
187.根据实施方案182所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口还包含至少第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个双链断裂靶位点。
188.根据实施方案187所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个双链断裂靶位点选自锌指靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点、Cas9内切核酸酶靶位点或它们的任一种组合。
189.根据实施方案184所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述目的多核苷酸赋予包括以下的性状：雄性不育、位点特异性重组、非生物胁迫耐受性、磷的改变、抗氧化剂的改变、脂肪酸的改变、必需氨基酸的改变、碳水化合物的改变、除草剂耐受性、昆虫抗性或病害抗性。
190.根据实施方案182所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口还包含至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，所述转基因靶位点包含第一重组位点和第二重组位点，其中所述第一和第二重组位点相对于彼此是相异的。
191.根据实施方案190所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少一个位点特异性整合的转基因靶位点的相异重组位点包括LOX位点、突变的LOX位点、FRT位点或突变的FRT位点。
192.根据实施方案190所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述第一重组位点和所述第二重组位点选自FRT1位点、FRT5位点、FRT6位点、FRT12位点和FRT87位点。
193.一种在其基因组中具有基因组窗口的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，所述基因组窗口包含整合进至少一个双链断裂靶位点中的至少一个位点特异性整合(SSI)的转基因靶位点，其中所述基因组窗口侧接有
a.至少第一标记，其包括PZE-110099037、PZE-110099048、PZE-110100195或PZE-110100685；以及
b.至少第二标记，其包括PZE-110099048、PZE-110100195、PZE-110100685或PZE-110101412。
194.根据实施方案193所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少一个双链断裂靶位点选自锌指内切核酸酶靶位点、工程化内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点和Cas9内切核酸酶靶位点。
195.根据实施方案193所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口的长度不超过0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、5、10cM。
196.根据实施方案193所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口还包含转基因。
197.根据实施方案194所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中该转基因赋予选自以下的性状：除草剂耐受性、昆虫抗性、病害抗性、雄性不育、位点特异性重组、非生物胁迫耐受性、磷的改变、抗氧化剂的改变、脂肪酸的改变、必需氨基酸的改变、碳水化合物的改变、除草剂耐受性、昆虫抗性和病害抗性。
198.根据实施方案193所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口还包含整合进至少第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个双链断裂靶位点中的至少第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个位点特异性整合的转基因靶位点。
199.根据实施方案198所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个双链断裂靶位点选自锌指靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点、Cas9内切核酸酶靶位点、以及它们的任一种组合。
200.根据实施方案193所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少一个位点特异性整合的转基因靶位点包含第一重组位点和第二重组位点，其中所述第一重组位点和第二重组位点相对于彼此是相异的。
201.根据实施方案200所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少一个位点特异性整合的转基因靶位点还包含侧接有所述第一重组位点和所述第二重组位点的目的多核苷酸。
202.根据实施方案200所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述位点特异性整合的转基因靶位点的相异重组位点包括LOX位点、突变的LOX位点、FRT位点或突变的FRT位点。
203.根据实施方案200所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述第一重组位点和所述第二重组位点选自FRT1位点、FRT5位点、FRT6位点、FRT12位点和FRT87位点。
204.根据实施方案193所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口还包含位点特异性的转基因靶位点。
205.一种在其基因组中具有基因组窗口的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，所述基因组窗口包含至少一个双链断裂靶位点，其中所述基因组窗口侧接有：
a.至少第一标记，其包括PZE-110099037、PZE-110099048、PZE-110100195或PZE-110100685；以及
b.至少第二标记，其包括PZE-110099048、PZE-110100195、PZE-110100685或PZE-110101412，
其中所述基因组窗口包含转基因。
206.根据实施方案205所述的植物、玉米植物部分或玉米种子，其中转基因赋予选自以下的性状：除草剂耐受性、昆虫抗性、病害抗性、雄性不育、位点特异性重组、非生物胁迫耐受性、磷的改变、抗氧化剂的改变、脂肪酸的改变、必需氨基酸的改变、碳水化合物的改变、除草剂耐受性、昆虫抗性和病害抗性。
207.根据实施方案205所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口的长度不超过0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、5、10cM。
208.根据实施方案205所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口还包含至少第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个双链断裂靶位点。
209.根据实施方案205所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少一个双链断裂靶位点选自锌指内切核酸酶靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点和Cas9内切核酸酶靶位点。
210.根据实施方案208所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个双链断裂靶位点选自锌指靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点、Cas9内切核酸酶靶位点、以及它们的任一种组合。
211.根据实施方案205所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口还包含至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，其中所述转基因靶位点包含第一重组位点和第二重组位点，其中所述第一重组位点和第二重组位点相对于彼此是相异的。
212.根据实施方案211所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少一个位点特异性整合的转基因靶位点的相异重组位点包括LOX位点、突变的LOX位点、FRT位点或突变的FRT位点。
213.根据实施方案211所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述第一重组位点和所述第二重组位点选自FRT1位点、FRT5位点、FRT6位点、FRT12位点和FRT87位点。
214.一种在其基因组中具有基因组窗口的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，所述基因组窗口包含至少一个改变的双链断裂靶位点，其中所述基因组窗口侧接有：
a.至少第一标记，其包括PZE-110099037、PZE-110099048、PZE-110100195或PZE-110100685；以及
b.至少第二标记，其包括PZE-110099048、PZE-110100195、PZE-110100685或PZE-110101412。
215.根据实施方案214所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口的长度不超过0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、5、10cM。
216.根据实施方案214所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述改变的双链断裂靶位点来源于选自以下的双链断裂位点：锌指靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点、Cas9内切核酸酶靶位点。
217.根据实施方案214所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述改变的双链断裂靶位点包含目的多核苷酸。
218.根据实施方案217所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述目的多核苷酸包括转基因、天然基因、编辑基因、或它们的任何组合。
219.根据实施方案214所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口还包含至少第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个双链断裂靶位点。
220.根据实施方案219所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个双链断裂靶位点选自锌指靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点、Cas9内切核酸酶靶位点或它们的任一种组合。
221.根据实施方案217所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述目的多核苷酸赋予包括以下的性状：雄性不育、位点特异性重组、非生物胁迫耐受性、磷的改变、抗氧化剂的改变、脂肪酸的改变、必需氨基酸的改变、碳水化合物的改变、除草剂耐受性、昆虫抗性或病害抗性。
222.根据实施方案214所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口还包含至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，所述转基因靶位点包含第一重组位点和第二重组位点，其中所述第一和第二重组位点相对于彼此是相异的。
223.根据实施方案222所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少一个位点特异性整合的转基因靶位点的相异重组位点包括LOX位点、突变的LOX位点、FRT位点或突变的FRT位点。
224.根据实施方案222所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述第一重组位点和所述第二重组位点选自FRT1位点、FRT5位点、FRT6位点、FRT12位点和FRT87位点。
225.一种在其基因组中具有整合进至少一个Cas内切核酸酶靶位点中的至少一个位点特异性整合(SSI)的转基因靶位点的植物、植物部分或种子。
226.根据实施方案225所述的植物、植物部分或种子，其中Cas内切核酸酶靶位点为Cas9内切核酸酶靶位点。
227.根据实施方案225所述的植物，其中植物是单子叶植物或双子叶植物。
228.根据实施方案227所述的植物，其中单子叶植物选自玉米、稻、高粱、黑麦、大麦、小麦、粟、燕麦、甘蔗、草坪草、或柳枝稷。
229.根据实施方案227所述的植物，其中双子叶植物选自大豆、卡诺拉、苜蓿、向日葵、棉花、烟草、花生、马铃薯、烟草、拟南芥、或红花。
230.用于将位点特异性整合的转基因靶位点导入到植物细胞的基因组中的方法，所述方法包括：
(a)提供植物细胞，该植物细胞在其基因组中包含Cas内切核酸酶的内源性靶位点；
(b)提供Cas内切核酸酶和向导多核苷酸，其中Cas内切核酸酶能够与所述向导多核苷酸形成复合物，其中所述复合物能够在所述内源性靶位点处诱导双链断裂，并且其中内源性靶位点位于第一基因组区域与第二基因组区域之间；
(c)提供供体DNA，该供体DNA包含位于与所述第一基因组区域同源的第一区域和与所述第二基因组区域同源的第二区域之间的位点特异性整合的转基因靶位点，其中转基因靶位点包含第一重组位点和第二重组位点，其中第一重组位点和第二重组位点相对于彼此是相异的；
(d)使植物细胞与向导多核苷酸、供体DNA和Cas内切核酸酶接触；以及
(e)鉴定来自(d)的至少一个植物细胞，该细胞在其基因组中包含在所述内源性靶位点处整合的转基因靶位点。
231.根据实施方案230所述的方法，其中第一同源性区域还包含(a)的所述内源性靶位点的第一片段，并且其中第二同源性区域包含(a)的所述内源性靶位点的第二片段，其中第一片段和第二片段是相异的。
232.根据实施方案230所述的方法，所述方法还包括从(d)的细胞再生出能育植物，所述能育植物在其基因组中包含整合进内源性靶位点中的位点特异性整合的转基因靶位点。
233.根据实施方案230所述的方法，其中内源性靶位点为位于包含至少一个目的基因座的基因组窗口中的邻近前间区序列邻近基序(PAM)的12至20个核苷酸序列，其中基因组窗口的长度为约10cM。
234.根据实施方案233所述的方法，其中所述基因组窗口：
(a)侧接有包括SYN12545、SYN12536、SYN14645、PZE-101023852、PZE-101024424、SYN25022、SYN31156、SYN31166或SYN22238的至少第一标记以及包括SYN12536、SYN14645、PZE-101023852、PZE-101024424、SYN25022、SYN31156、SYN31166、SYN22238或SYN20196的至少第二标记；或者
(b)侧接有包括PZE-101205031、PUT-163A-148951459-517、PZE-101205904或PZE-101206569的至少第一标记以及包括PUT-163A-148951459-517、PZE-101205904、PZE-101206569或SYN24492的至少第二标记；或者
(c)侧接有包括PZE-103000166、PZE-103000238、PZE-103000307或SYN6355的至少第一标记以及包括PZE-103000238、PZE-103000307、SYN6355或PZE-103001421的至少第二标记；或者
(d)侧接有包括PZE-110099037、PZE-110099048、PZE-110100195或PZE-110100685的至少第一标记以及包括PZE-110099048、PZE-110100195、PZE-110100685或PZE-110101412的至少第二标记。
235.根据实施方案230所述的方法，其中Cas内切核酸酶的内源性靶位点选自SEQID NO：3-5、7-11、13-19、21-23、25-28、30-34、36-39、43-47、49-52、54-58、60、63-66、68-72、74-78、80-83、87-90、92-93、95-98、100-104、317-320、323-324、327-328、331-332、334-337、342-343、346-347、350-351、354-355、358-359、365-366、370-371、376-377、380-381、384-385、388-389、392-393和396-397、或它们的功能性片段。
236.根据实施方案230所述的方法，其中转基因靶位点还包含在第一重组位点与第二重组位点之间的目的多核苷酸。
237.根据实施方案230所述的方法，其中第一重组位点和第二重组位点中的至少一者包括FRT位点、突变FRT、LOX位点和突变LOX位点。
238.根据实施方案230所述的方法，其中转基因靶位点还包含在第一重组位点与第二重组位点之间的第三重组位点，其中第三重组位点相对于第一重组位点和第二重组位点是相异的。
239.根据实施方案238所述的方法，其中第一重组位点、第二重组位点和第三重组位点中的至少一者选自FRT1(SEQ ID NO：576)、FRT 5(SEQ ID NO：577)、FRT6(SEQ ID NO：579)、FRT12(SEQ ID NO：579)和FRT87(SEQ ID NO：580)。
240.根据实施方案230所述的方法，其中Cas内切核酸酶是Cas9内切核酸酶或来源于cas9内切核酸酶。
241.根据实施方案230所述的方法，其中所述植物细胞来自于单子叶植物或双子叶植物。
242.一种由实施方案230的植物细胞产生的植物。
243.一种将目的多核苷酸整合进植物细胞的基因组中的转基因靶位点中的方法，所述方法包括：
(a)提供至少一种植物细胞，该植物细胞在其基因组中包含位点特异性整合的转基因靶位点，其中转基因靶位点被整合进Cas内切核酸酶的内源性靶位点中，并且其中转基因靶位点是
(i)包含第一重组位点和第二重组位点的靶位点；或者
(ii)在第一重组位点与第二重组位点之间还包含第三重组位点的(i)的靶位点，
其中Cas内切核酸酶能够在内源性靶位点中诱导双链断裂，其中第一重组位点、第二重组位点和第三重组位点相对于彼此是相异的；
(b)将转移盒导入到(a)的植物细胞中，该转移盒包含
(iii)第一重组位点、第一目的多核苷酸、以及第二重组位点，
(iv)第二重组位点、第二目的多核苷酸、以及第三重组位点，
或者
(v)第一重组位点、第三目的多核苷酸、以及第三重组位点；
(c)提供在第一重组位点和第二重组位点处、在第二重组位点和第三重组位点处、或在第一重组位点和第三重组位点处识别并实现重组的重组酶，以及
(d)选择至少一个植物细胞，该植物细胞在靶位点处包含整合的转移盒。
244.一种核酸分子，包含选自以下的RNA序列：SEQ ID NO：267-307、441-480、以及它们的任一种组合。
245.一种在植物基因组中产生复合性状基因座的方法，所述方法包括：
(a)提供第一植物，该第一植物在基因组窗口内具有整合进第一Cas9内切核酸酶靶位点中的至少第一位点特异性整合的转基因靶位点，并且其中所述基因组窗口的长度为约10cM并且所述第一植物不包含第一目的基因座；
(b)将第二植物配种于所述第一植物，其中所述第二植物在所述基因组窗口中包含第一目的基因座，并且所述第二植物不包含所述第一转基因靶位点；以及
(c)从步骤(b)选择出包含所述第一转基因靶位点和所述目的基因座的子代植物；其中所述第一转基因靶位点和所述第一目的基因座在所述子代植物中具有不同的基因组插入位点。
246.一种在植物基因组中产生复合性状基因座的方法，所述方法包括：
(a)提供第一植物，该第一植物在基因组窗口内具有整合进第一Cas9内切核酸酶靶位点中的至少第一位点特异性整合的转基因靶位点和整合进第二Cas9内切核酸酶靶位点中的第二位点特异性整合的转基因靶位点，其中所述基因组窗口的长度为约10cM，并且其中所述第一转基因靶位点和第二转基因靶位点具有不同的基因组插入位点，其中所述第一植物不包含第一目的基因座；
(b)将第二植物配种于所述第一植物，其中所述第二植物在所述基因组窗口中包含第一目的基因座，其中所述第二植物在基因组窗口中不包含所述第一转基因靶位点或所述第二转基因靶位点；以及
(c)从步骤(b)选择出子代植物，该子代植物包含所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点和所述第一目的基因座；
其中所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点和所述第一目的基因座中的每一者在所述子代植物中具有不同的基因组插入位点。
247.根据实施方案246所述的方法，其中所述基因组窗口的长度为约5cM，并且其中所述子代植物中的所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点、以及所述目的基因座中的每一者以约5％至0.1％的比率彼此独立地分离。
248.根据实施方案246所述的方法，其中所述方法还包括：
(a)将包含第二目的基因座的第三植物配种于所述子代植物，其中所述第三植物在所述基因组窗口中包含所述第二目的基因座，其中所述第三植物在所述基因组窗口中不包含所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点或所述第一目的基因座；以及
(b)从步骤(a)选择出第二子代植物，该第二子代植物包含所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点、所述第一目的基因座、以及所述第二目的基因座；
其中所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点、所述第一目的基因座和所述第二目的基因座中的每一者在所述第二子代植物中具有不同的基因组插入位点；并且，其中所述第二子代植物中的所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点、所述第一目的基因座、或所述第二目的基因座中的每一者以约10％至约0.1％的比率彼此独立地分离。
249.一种在植物基因组中产生复合性状基因座的方法，所述方法包括：
(a)提供第一植物，该第一植物在基因组窗口内具有整合进第一Cas9内切核酸酶靶位点中的至少第一位点特异性整合的转基因靶位点，其中所述第一植物不包含第一目的基因座，并且其中所述基因组窗口：
(i)侧接有包括SYN12545、SYN12536、SYN14645、PZE-101023852、PZE-101024424、SYN25022、SYN31156、SYN31166或SYN22238的至少第一标记以及包括SYN12536、SYN14645、PZE-101023852、PZE-101024424、SYN25022、SYN31156、SYN31166、SYN22238或SYN20196的至少第二标记；或者
(ii)侧接有包括PZE-101205031、PUT-163A-148951459-517、PZE-101205904或PZE-101206569的至少第一标记以及包括PUT-163A-148951459-517、PZE-101205904、PZE-101206569或SYN24492的至少第二标记；或者
(iii)侧接有包括PZE-103000166、PZE-103000238、PZE-103000307或SYN6355的至少第一标记以及包括PZE-103000238、PZE-103000307、SYN6355或PZE-103001421的至少第二标记；或者
(iv)侧接有包括PZE-110099037、PZE-110099048、PZE-110100195或PZE-110100685的至少第一标记以及包括PZE-110099048、PZE-110100195、PZE-110100685或PZE-110101412的至少第二标记。
(b)将第二植物配种于所述第一植物，其中所述第二植物在所述基因组窗口中包含第一目的基因座，并且所述第二植物不包含所述第一转基因靶位点；以及
(c)从步骤(b)选择出包含所述第一转基因靶位点和所述目的基因座的子代植物；其中所述第一转基因靶位点和所述第一目的基因座在所述子代植物中具有不同的基因组插入位点。
250.一种在植物基因组中改变复合性状基因座的方法，所述方法包括：
(a)提供第一植物，该第一植物在基因组窗口内具有整合进第一Cas9内切核酸酶靶位点中的至少第一位点特异性整合的转基因靶位点、整合进第一Cas9内切核酸酶靶位点中的第二位点特异性整合的转基因靶位点、以及第一目的基因座，其中所述基因组窗口的长度为约10cM，并且其中所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点、所述第一目的基因座具有不同的基因组插入位点；
其中所述第一植物中的所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点、或所述第一目的基因座中的每一者以约10％至约0.1％的比率彼此独立地分离；
(b)将第二植物配种于所述第一植物；以及
(c)从步骤(b)选择出子代植物，其中来自所述子代植物的所述基因组窗口不包含所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点、或所述第一目的基因座中的任一者或任两者。
251.一种在其基因组中具有基因组窗口的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，所述基因组窗口包含整合进至少一个双链断裂靶位点中的至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，其中所述至少一个转基因靶位点遗传上连接于至少第一遗传标记和第二遗传标记，其中所述第一遗传标记选自BARC_1.01_Gm01_6984873_T_C、BARC_1.01_Gm01_7775299_G_A、BARC_1.01_Gm01_7856395_A_C、BARC_1.01_Gm01_8569887_A_G、BARC_1.01_Gm01_8601_858_C_T、BARC_1.01_Gm01_8641430_C_T、BARC_1.01_Gm01_8674202_A_C、BARC_1.01_Gm01_8933345_C_T、BARC_1.01_Gm01_8964201_T_C、BARC_1.01_Gm01_901421_6_T_G、BARC_1.01_Gm01_281_79606_A_G、BARC_1.01_Gm01_28364595_A_G、BARC_1.01_Gm01_28536363_G_A、BARC_1.01_Gm01_28599526_G_A、BARC_1.01_Gm01_2891_3996_A_G、BARC_1.01_Gm01_29284158_A_G、BARC_1.01_Gm01_31_202345_C_T、BARC_1.01_Gm01_31_770743_C_T、BARC_1.01_Gm01_32683433_G_A、或BARC_1.01_Gm01_34327255_C_T；并且所述第二遗传标记选自BARC_1.01_Gm01_7775299_G_A、BARC_1.01_Gm01_7856395_A_C、BARC_1.01_Gm01_8569887_A_G、BARC_1.01_Gm01_8601_858_C_T、BARC_1.01_Gm01_8641430_C_T、BARC_1.01_Gm01_8674202_A_C、BARC_1.01_Gm01_8933345_C_T、BARC_1.01_Gm01_8964201_T_C、BARC_1.01_Gm01_9014216_T_G、BARC_1.01_Gm01_28179606_A_G、BARC_1.01_Gm01_28364595_A_G、BARC_1.01_Gm01_28536363_G_A、BARC_1.01_Gm01_28599526_G_A、BARC_1.01_Gm01_2891_3996_A_G、BARC_1.01_Gm01_29284158_A_G、BARC_1.01_Gm01_31_202345_C_T、BARC_1.01_Gm01_31770743_C_T、BARC_1.01_Gm01_32683433_G_A、BARC_1.01_Gm01_34327255_C_T、或BARC_1.01_Gm01_36994849_A_G。
252.一种在其基因组中具有基因组窗口的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，所述基因组窗口包含整合进至少一个双链断裂靶位点中的至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，其中所述至少一个转基因靶位点遗传上连接于至少第一遗传标记和第二遗传标记，其中所述第一遗传标记位于大豆物理图谱上的Gm01：6984873与Gm01：34327255之间，其中所述第二遗传标记位于大豆物理图谱上的Gm01：7775299与Gm01：36994849之间。
253.一种在其基因组中具有基因组窗口的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，所述基因组窗口包含转基因和遗传上连接于至少第一遗传标记和第二遗传标记的至少一个双链断裂靶位点，其中所述第一遗传标记选自BARC_1.01_Gm01_6984873_T_C、BARC_1.01_Gm01_7775299_G_A、BARC_1.01_Gm01_7856395_A_C、BARC_1.01_Gm01_8569887_A_G、BARC_1.01_Gm01_8601_858_C_T、BARC_1.01_Gm01_8641430_C_T、BARC_1.01_Gm01_8674202_A_C、BARC_1.01_Gm01_8933345_C_T、BARC_1.01_Gm01_8964201_T_C、BARC_1.01_Gm01_9014216_T_G、BARC_1.01_Gm01_28179606_A_G、BARC_1.01_Gm01_28364595_A_G、BARC_1.01_Gm01_28536363_G_A、BARC_1.01_Gm01_28599526_G_A、BARC_1.01_Gm01_2891_3996_A_G、BARC_1.01_Gm01_29284158_A_G、BARC_1.01_Gm01_31_202345_C_T、BARC_1.01_Gm01_31770743_C_T、BARC_1.01_Gm01_32683433_G_A、或BARC_1.01_Gm01_34327255_C_T；并且所述第二遗传标记选自BARC_1.01_Gm01_7775299_G_A、BARC_1.01_Gm01_7856395_A_C、BARC_1.01_Gm01_8569887_A_G、BARC_1.01_Gm01_8601_858_C_T、BARC_1.01_Gm01_8641430_C_T、BARC_1.01_Gm01_8674202_A_C、BARC_1.01_Gm01_8933345_C_T、BARC_1.01_Gm01_8964201_T_C、BARC_1.01_Gm01_9014216_T_G、BARC_1.01_Gm01_28179606_A_G、BARC_1.01_Gm01_28364595_A_G、BARC_1.01_Gm01_28536363_G_A、BARC_1.01_Gm01_28599526_G_A、BARC_1.01_Gm01_2891_3996_A_G、BARC_1.01_Gm01_29284158_A_G、BARC_1.01_Gm01_31202345_C_T、BARC_1.01_Gm01_31770743_C_T、BARC_1.01_Gm01_32683433_G_A、BARC_1.01_Gm01_34327255_C_T、或BARC_1.01_Gm01_36994849_A_G。
254.一种在其基因组中具有基因组窗口的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，所述基因组窗口包含转基因和整合进至少一个双链断裂靶位点中的至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，其中所述至少一个转基因靶位点遗传上连接于至少第一遗传标记和第二遗传标记，其中所述第一遗传标记位于大豆物理图谱上的Gm01：6984873与Gm01：34327255之间，其中所述第二遗传标记位于大豆物理图谱上的Gm01：7775299与Gm01：36994849之间。
255.一种在其基因组中具有基因组窗口的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，所述基因组窗口包含整合进至少一个双链断裂靶位点中的至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，其中所述至少一个转基因靶位点遗传上连接于至少第一遗传标记和第二遗传标记，其中所述第一遗传标记选自BARC_1.01_Gm06_16915875_T_C、BARC_1.01_Gm06_17524452_G_T、BARC_1.01_Gm06_17561262_C_T、BARC_1.01_Gm06_17625670_C_T、BARC_1.01_Gm06_17631544_T_C、BARC_1.01_Gm06_17789229_C_T、BARC_1.01_Gm06_17821576_T_G、BARC_1.01_Gm06_17829363_A_C、BARC_1.01_Gm06_17833095_A_G、BARC_1.01_Gm06_17847021_G_T、BARC_1.01_Gm06_17895876_G_A或BARC_1.01_Gm06_18221293_T_C，并且所述第二遗传标记选自BARC_1.01_Gm06_17524452_G_T、BARC_1.01_Gm06_17561262_C_T、BARC_1.01_Gm06_47625670_C_T、BARC_1.01_Gm06_47631544_T_C、BARC_1.01_Gm06_47789229_C_T、BARC_1.01_Gm06_47821576_T_G、BARC_1.01_Gm06_47829363_A_C、BARC_1.01_Gm06_47833095_A_G、BARC_1.01_Gm06_47847021_G_T、BARC_1.01_Gm06_47895876_G_A、BARC_1.01_Gm06_48221293_T_C或BARC_1.01_Gm06_48528885_G_T。
256.一种在其基因组中具有基因组窗口的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，所述基因组窗口包含整合进至少一个双链断裂靶位点中的至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，其中所述至少一个转基因靶位点遗传上连接于至少第一遗传标记和第二遗传标记，其中所述第一遗传标记位于大豆物理图谱上的Gm06：46915875与Gm06：48221293之间，其中所述第二遗传标记位于大豆物理图谱上的Gm06：47524452与Gm06：48528885之间。
257.一种在其基因组中具有基因组窗口的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，所述基因组窗口包含转基因和遗传上连接于至少第一遗传标记和第二遗传标记的至少一个双链断裂靶位点，其中所述第一遗传标记选自BARC_1.01_Gm06_46915875_T_C、BARC_1.01_Gm06_47524452_G_T、BARC_1.01_Gm06_47561262_C_T、BARC_1.01_Gm06_47625670_C_T、BARC_1.01_Gm06_47631544_T_C、BARC_1.01_Gm06_47789229_C_T、BARC_1.01_Gm06_47821576_T_G、BARC_1.01_Gm06_47829363_A_C、BARC_1.01_Gm06_47833095_A_G、BARC_1.01_Gm06_47847021_G_T、BARC_1.01_Gm06_47895876_G_A或BARC_1.01_Gm06_48221293_T_C，并且所述第二遗传标记选自BARC_1.01_Gm06_47524_452_G_T、BARC_1.01_Gm06_47561262_C_T、BARC_1.01_Gm06_47625670_C_T、BARC_1.01_Gm06_4763154_4_T_C、BARC_1.01_Gm06_47789229_C_T、BARC_1.01_Gm06_47821576_T_G、BARC_1.01_Gm06_47829363_A_C、BARC_1.01_Gm06_47833095_A_G、BARC_1.01_Gm06_47847021_G_T、BARC_1.01_Gm06_47895876_G_A、BARC_1.01_Gm06_48221293_T_C或BARC_1.01_Gm06_48528885_G_T。
258.一种在其基因组中具有基因组窗口的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，所述基因组窗口包含转基因和整合进至少一个双链断裂靶位点中的至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，其中所述至少一个转基因靶位点遗传上连接于至少第一遗传标记和第二遗传标记，其中所述第一遗传标记位于大豆物理图谱上的Gm06：46915875与Gm06：48221293之间，其中所述第二遗传标记位于大豆物理图谱上的Gm06：47524_452与Gm06：48528885之间。
259.一种在其基因组中具有基因组窗口的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，所述基因组窗口包含整合进至少一个双链断裂靶位点中的至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，其中所述至少一个转基因靶位点遗传上连接于至少第一遗传标记和第二遗传标记，其中所述第一遗传标记选自BARC_1.01_Gm04_45591011_C_T、BARC_1.01_Gm04_45613405_T_C、BARC_1.01_Gm04_45697256_G_A、BARC_1.01_Gm04_45739051_A_C、BARC_1.01_Gm04_45800267_T_C、BARC_1.01_Gm04_45857325_T_C、BARC_1.01_Gm04_45857325_T_C、BARC_1.01_Gm04_45883080_A_G、BARC_1.01_Gm04_45903617_T_C或BARC_1.01_Gm04_46000185_C_A，并且所述第二遗传标记选自BARC_1.01_Gm04_45613405_T_C、BARC_1.01_Gm04_45697256_G_A、BARC_1.01_Gm04_45739051_A_C、BARC_1.01_Gm04_45800267_T_C、BARC_1.01_Gm04_45857325_T_C、BARC_1.01_Gm04_45857325_T_C、BARC_1.01_Gm04_45883080_A_G、BARC_1.01_Gm04_45903617_T_C、BARC_1.01_Gm04_46000185_C_A或BARC_1.01_Gm04_46113406_T_G。
260.一种在其基因组中具有基因组窗口的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，所述基因组窗口包含整合进至少一个双链断裂靶位点中的至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，其中所述至少一个转基因靶位点遗传上连接于至少第一遗传标记和第二遗传标记，其中所述第一遗传标记位于大豆物理图谱上的Gm04：45591011与Gm04：46000185之间，其中所述第二遗传标记位于大豆物理图谱上的Gm04：45593558与Gm04：46113406之间。
261.一种在其基因组中具有基因组窗口的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，所述基因组窗口包含转基因和遗传上连接于至少第一遗传标记和第二遗传标记的至少一个双链断裂靶位点，其中所述第一遗传标记选自BARC_1.01_Gm04_45591011_C_T、BARC_1.01_Gm04_45613405_T_C、BARC_1.01_Gm04_45697256_G_A、BARC_1.01_Gm04_45739051_A_C、BARC_1.01_Gm04_45800267_T_C、BARC_1.01_Gm04_45857325_T_C、BARC_1.01_Gm04_45857325_T_C、BARC_1.01_Gm04_45883080_A_G、BARC_1.01_Gm04_45903617_T_C或BARC_1.01_Gm04_46000185_C_A，并且所述第二遗传标记选自BARC_1.01_Gm04_45613405_T_C、BARC_1.01_Gm04_45697256_G_A、BARC_1.01_Gm04_45739051_A_C、BARC_1.01_Gm04_45800267_T_C、BARC_1.01_Gm04_45857325_T_C、BARC_1.01_Gm04_45857325_T_C、BARC_1.01_Gm04_45883080_A_G、BARC_1.01_Gm04_45903617_T_C、BARC_1.01_Gm04_46000185_C_A或BARC_1.01_Gm04_46113406_T_G。
262.一种在其基因组中具有基因组窗口的大豆植物、大豆植物部分或大豆种子，所述基因组窗口包含转基因和整合进至少一个双链断裂靶位点中的至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，其中所述至少一个转基因靶位点遗传上连接于至少第一遗传标记和第二遗传标记，其中所述第一遗传标记位于大豆物理图谱上的Gm04：45591011与Gm04：46000185之间，其中所述第二遗传标记位于大豆物理图谱上的Gm04：45593558与Gm04：46113406之间。
263.一种在其基因组中具有基因组窗口的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，所述基因组窗口包含整合进至少一个双链断裂靶位点中的至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，其中所述至少一个转基因靶位点遗传上连接于至少第一遗传标记和第二遗传标记，其中所述第一遗传标记选自SYN12545，SYN12536、SYN14645、PZE-101023852、PZE-101024424、SYN25022、SYN31156、SYN31166或SYN22238，并且所述第二遗传标记选自SYN12536、SYN14645、PZE-101023852、PZE-101024424、SYN25022、SYN31156、SYN31166、SYN22238或SYN2019。
264.一种在其基因组中具有基因组窗口的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，所述基因组窗口包含整合进至少一个双链断裂靶位点中的至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，其中所述至少一个转基因靶位点遗传上连接于至少第一遗传标记和第二遗传标记，其中所述第一遗传标记位于玉米PUB-B73v3物理图谱上的位置12987435与15491134之间，其中所述第二遗传标记位于玉米PUB-B73v3物理图谱上的位置12988556与15512479之间。
265.一种在其基因组中具有基因组窗口的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，所述基因组窗口包含转基因和遗传上连接于至少第一遗传标记和第二遗传标记的至少一个双链断裂靶位点，其中所述第一遗传标记选自SYN12545、SYN12536、SYN14645、PZE-101023852、PZE-101024424、SYN25022、SYN31156、SYN31166或SYN22238，并且所述第二遗传标记选自SYN12536、SYN14645、PZE-101023852、PZE-101024424、SYN25022、SYN31156、SYN31166、SYN22238或SYN20196。
266.一种在其基因组中具有基因组窗口的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，所述基因组窗口包含转基因和整合进至少一个双链断裂靶位点中的至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，其中所述至少一个转基因靶位点遗传上连接于至少第一遗传标记和第二遗传标记，其中所述第一遗传标记位于玉米PUB-B73v3物理图谱上的位置12987435与15491134之间，其中所述第二遗传标记位于玉米PUB-B73v3物理图谱上的位置12988556与15512479之间。
267.一种在其基因组中具有基因组窗口的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，所述基因组窗口包含整合进至少一个双链断裂靶位点中的至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，其中所述至少一个转基因靶位点遗传上连接于至少第一遗传标记和第二遗传标记，其中所述第一遗传标记选自PZE-101205031、PUT-163A-148951459-517、PZE-101205904或PZE-101206569，并且所述第二遗传标记选自PUT-163A-148951459-517、PZE-101205904、PZE-101206569或SYN24492。
268.一种在其基因组中具有基因组窗口的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，所述基因组窗口包含整合进至少一个双链断裂靶位点中的至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，其中所述至少一个转基因靶位点遗传上连接于至少第一遗传标记和第二遗传标记，其中所述第一遗传标记位于玉米PUB-B73v3物理图谱上的位置253779529与255783594之间，其中所述第二遗传标记位于玉米PUB-B73v3物理图谱上的位置253823089与256998852之间。
269.一种在其基因组中具有基因组窗口的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，所述基因组窗口包含转基因和遗传上连接于至少第一遗传标记和第二遗传标记的至少一个双链断裂靶位点，其中所述第一遗传标记选自PZE-101205031、PUT-163A-148951459-517、PZE-101205904或PZE-101206569，并且所述第二遗传标记选自PUT-163A-148951459-517、PZE-101205904、PZE-101206569或SYN24492。
270.一种在其基因组中具有基因组窗口的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，所述基因组窗口包含转基因和整合进至少一个双链断裂靶位点中的至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，其中所述至少一个转基因靶位点遗传上连接于至少第一遗传标记和第二遗传标记，其中所述第一遗传标记位于玉米PUB-B73v3物理图谱上的位置253779529与255783594之间，其中所述第二遗传标记位于玉米PUB-B73v3物理图谱上的位置253823089与256998852之间。
271.一种在其基因组中具有基因组窗口的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，所述基因组窗口包含整合进至少一个双链断裂靶位点中的至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，其中所述至少一个转基因靶位点遗传上连接于至少第一遗传标记和第二遗传标记，其中所述第一遗传标记选自PZE-103000166、PZE-103000238、PZE-103000307或SYN6355，并且所述第二遗传标记选自PZE-103000238、PZE-103000307、SYN6355或PZE-103001421。
272.一种在其基因组中具有基因组窗口的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，所述基因组窗口包含整合进至少一个双链断裂靶位点中的至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，其中所述至少一个转基因靶位点遗传上连接于至少第一遗传标记和第二遗传标记，其中所述第一遗传标记位于玉米PUB-B73v3物理图谱上的位置742991与1577833之间，其中所述第二遗传标记位于玉米PUB-B73v3物理图谱上的位置899135与1614189之间。
273.一种在其基因组中具有基因组窗口的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，所述基因组窗口包含转基因和遗传上连接于至少第一遗传标记和第二遗传标记的至少一个双链断裂靶位点，其中所述第一遗传标记选自PZE-103000166、PZE-103000238、PZE-101205904或SYN6355，并且所述第二遗传标记选自PZE-103000238、PZE-103000307、SYN6355或PZE-103001421。
274.一种在其基因组中具有基因组窗口的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，所述基因组窗口包含转基因和整合进至少一个双链断裂靶位点中的至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，其中所述至少一个转基因靶位点遗传上连接于至少第一遗传标记和第二遗传标记，其中所述第一遗传标记位于玉米PUB-B73v3物理图谱上的位置742991与1577833之间，其中所述第二遗传标记位于玉米PUB-B73v3物理图谱上的位置899135与1614189之间。
275.一种在其基因组中具有基因组窗口的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，所述基因组窗口包含整合进至少一个双链断裂靶位点中的至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，其中所述至少一个转基因靶位点遗传上连接于至少第一遗传标记和第二遗传标记，其中所述第一遗传标记选自PZE-110099037、PZE-110099048、PZE-110100195或PZE-110100685，并且所述第二遗传标记选自PZE-110099110099048、PZE-110100195、PZE-110100685或PZE-110101412。
276.一种在其基因组中具有基因组窗口的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，所述基因组窗口包含整合进至少一个双链断裂靶位点中的至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，其中所述至少一个转基因靶位点遗传上连接于至少第一遗传标记和第二遗传标记，其中所述第一遗传标记位于玉米PUB-B73v3物理图谱上的位置143748355与144438619之间，其中所述第二遗传标记位于玉米PUB-B73v3物理图谱上的位置143749018与144620418之间。
277.一种在其基因组中具有基因组窗口的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，所述基因组窗口包含转基因和遗传上连接于至少第一遗传标记和第二遗传标记的至少一个双链断裂靶位点，其中所述第一遗传标记选自PZE-110099037、PZE-110099048、PZE-110100195或PZE-110100685，并且所述第二遗传标记选自PZE-110099048、PZE-110100195、PZE-110100685或PZE-110101412。
278.一种在其基因组中具有基因组窗口的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，所述基因组窗口包含转基因和整合进至少一个双链断裂靶位点中的至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，其中所述至少一个转基因靶位点遗传上连接于至少第一遗传标记和第二遗传标记，其中所述第一遗传标记位于玉米PUB-B73v3物理图谱上的位置143748355与144438619之间，其中所述第二遗传标记位于玉米PUB-B73v3物理图谱上的位置143749018与144620418之间。
实施例
在以下实施例中，除非另行指出，否则份数和百分比均按重量计，并且度数的单位都是摄氏度。应当理解，尽管以下实施例讲述了本公开的实施方案，但仅用于举例说明。根据上文的论述内容和下文的实施例，本领域技术人员能够对本公开做出各种变化和修改，使其适用于各种用途和条件。这些修改都旨在落入所附权利要求的范围内。
实施例1
用于玉米基因组修饰的向导RNA/Cas内切核酸酶系统的DNA构建体
为了测试玉米中的向导RNA/Cas内切核酸酶系统，步骤如下：根据本领域中已知的标准技术将来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)M1GAS(SF370)的Cas9基因(SEQ IDNO：308)玉米密码子优化并导入马铃薯ST-LS1内含子，从而消除其在大肠杆菌(E.coli)和农杆菌属中的表达。为了有利于Cas9蛋白在玉米细胞中核定位，我们分别在Cas9开放阅读框的氨基和羧基末端处掺入了猿猴病毒40(Simian virus 40)(SV40)单分型氨基末端核定位信号(MAPKKKRKV，SEQ ID NO：309)和根癌农杆菌双分型VirD2T-DNA边界内切核酸酶羧基末端核定位信号(KRPRDRHDGELGGRKRAR，SEQ ID NO：310)。通过标准分子生物学技术将玉米优化的Cas9基因可操作地连接至玉米遍在蛋白启动子。玉米优化的Cas9表达盒以SEQ IDNO：311列出。
玉米U6聚合酶III启动子(SEQ ID NO：312)用于表达向导RNA，其引导Cas9核酸酶至指定的基因组位点(如2014年8月20日提交的美国专利申请14/463687中所述，以引用方式并入)。向导RNA编码序列长77bp，并且在5’端的玉米U6聚合酶III终止子上包含来自选择的玉米基因组靶位点的12-30bp可变靶向结构域(如于2014年8月20日提交的美国专利申请14/463687中所述)。
为了改善Cas9内切核酸酶和向导RNA的共表达和存在以形成蛋白质/RNA复合物，将Cas9内切核酸酶和向导RNA表达盒连接到单个DNA构建体中。合成包含向导RNA编码序列(包含来自选择的玉米基因组靶位点的12-30bp可变靶向结构域)和U6启动子的一部分的450-470bp序列(Integrated DNA Technologies，Inc.1710 Commercial Park，Coralville，Iowa52241，USA)。然后通过限制位点BstBI/HindIII将序列克隆到已具有Cas9表达盒和gRNA表达盒的U6启动子其余部分(例如，来自SEQ ID NO：106的bp 6741-7405)的主链，然后使用其来转化玉米细胞以测试玉米优化的向导RNA/Cas系统是否在基因组中导入修饰。使用包含不同靶序列的向导RNA制备类似的DNA构建体，来靶向不同的基因组位点(如实施例3所述)。
实施例2
选择由向导RNA/Cas内切核酸酶系统导入的位点特异性整合(SSI)转基因靶位点 的玉米基因组窗口和复合性状基因座的发展
针对产生的复合性状基因座来鉴定四种玉米基因组区域(也称之为基因组窗口，图1)，该复合性状基因座包含通过本文所述的玉米优化的向导RNA/Cas9内切核酸酶系统导入到该基因组窗口中的SSI转基因靶位点的组合(图2A-2D)。
针对发展的复合性状基因座(CTL)鉴定的第一玉米基因组窗口从1号染色体上的ZM01：12987435(侧接有公共SNP标记SYN12545)跨越到Zm01：15512479(侧接有公共SNP标记SYN20196)(图4)。表1示出玉米1号染色体上的目的基因组窗口内的多个玉米SNP标记(Ganal，M.等人，A Large Maize(Zea mays L.)SNP Genotyping Array：Development andGermplasm Genotyping，and Genetic Mapping to Compare with the B73ReferenceGenome.PloS one，2011年12月08日，DOI：10.1371)和Cas内切核酸酶靶位点(31个位点)的物理和基因图谱位置(如果可用)。
表1.玉米1号染色体上的包含复合性状基因座(CTL 1)的基因组窗口
针对发展的复合性状基因座(CTL)鉴定的第二玉米基因组窗口从1号染色体上的Zm01：253.78MM(侧接有公共SNP标记PZE-101205031)跨越到Zm01：257MM(侧接有公共SNP标记SYN24492)(图5)。表2示出玉米1号染色体上的该目的基因组窗口内的多个玉米SNP标记(Ganal，M.等人(2011)PloS one，DOI：10.1371)和Cas内切核酸酶靶位点(15个位点)的物理和基因图谱位置(如果可用)。
表2.玉米1号染色体上的包含复合性状基因座2(CTL2)的基因组窗口
针对发展的复合性状基因座(CTL)鉴定的第三玉米基因组窗口从3号染色体上的Zm03：742991(侧接有公共SNP标记PZE-103000166)跨越到Zm03：1614189(侧接有公共SNP标记PZE-103001421)(图6)。表3示出玉米3号染色体上的该目的基因组窗口内的多个玉米SNP标记(Ganal，M.等人(2011)PloS one，DOI：10.1371)和Cas内切核酸酶靶位点(18个位点)的物理和基因图谱位置(如果可用)。
表3.玉米3号染色体上的包含复合性状基因座3(CTL3)的基因组窗口
针对发展的复合性状基因座(CTL)鉴定的第四玉米基因组窗口从10号染色体上的Zm10：143.75MM(侧接有公共SNP标记PZE-110099037)跨越到Zm10：144.62MM(侧接有公共SNP标记PZE-110101412)(图7)。表4示出玉米10号染色体上的该目的基因组窗口内的多个玉米SNP标记(Ganal，M.等人(2011)PloS one，DOI：10.1371)和Cas内切核酸酶靶位点(15个位点)的物理和基因图谱位置(如果可用)。
对于该区域，内部和公共遗传位置并非都以相同的次序进行比对，这可能是由于公共或内部装配错误。
表4.玉米10号染色体上的包含复合性状基因座4(CTL4)的基因组窗口
实施例3
用于将SSI转基因靶位点导入玉米基因组窗口中的向导RNA表达盒、Cas9内切核酸 酶表达盒和供体DNA
玉米U6聚合酶III启动子(SEQ ID NO：312)用于表达向导RNA，以引导Cas9核酸酶至指定的基因组靶位点。在第一质粒中连接玉米密码子优化的Cas9内切核酸酶表达盒与向导RNA表达盒，该第一质粒与包含供体DNA(修复DNA)盒的第二质粒共递送(图2C)。供体DNA包含NPTII标记：终止子旁侧的FRT1/FRT87(6)重组位点(图2B)以进行位点特异性整合，其在通过利用向导RNA/Cas系统同源重组进行整合时创建用于SSI技术应用的FRT1/FRT87(6)靶系(图2D)。
被构建用于通过同源重组将转基因SSI靶位点导入到Cas内切核酸酶靶位点中的靶向各种玉米基因组位点的向导RNA(gRNA)/Cas9DNA构建体列于表5和表7中。表6和表8列出由向导RNA构建体表达的向导RNA。包含可变靶向结构域的向导RNA的碱基列于表6以及表8。例如，SEQ ID NO：267的前19个碱基(碱基1-19)包含向导RNA 49-CR2的可变靶向结构域(表6)。所有向导RNA/Cas9构建体的不同只在于靶向玉米基因组靶位点的17-25bp向导RNA可变靶向结构域。所有供体DNA构建体的不同只在于同源性区域，例如ZM-SEQX(HR1)和ZM-SEQY(HR2)。通过实施例4描述的稳定转化程序将这些向导RNA/Cas9 DNA构建体和供体DNA共递送到优质玉米基因组中。
表5.用于ZM01-CTL1上复合性状基因座的玉米稳定转化的向导RNA/Cas9
表6.用于ZM01-CTL1上复合性状基因座的玉米稳定转化的向导RNA
向导RNA名称 SEQ ID NO： 可变靶向结构域
49-CR2 267 Base 1-19
50--CR1 268 Base 1-19
51-CR1 269 Base 1-21
41-CR2 270 Base 1-21
72-CR1 271 Base 1-20
71-CR1 272 Base 1-22
81-CR1 273 Base 1-20
73-CR1 274 Base 1-19
14-CR4 275 Base 1-20
74-CR1 276 Base 1-19
75-CR1 277 Base 1-20
84-CR1 278 Base 1-20
76-CR1 279 Base 1-21
77-CR1 280 Base 1-22
78-CR1 281 Base 1-20
85-CR1 282 Base 1-19
19-CR1 283 Base 1-24
86-CR1 284 Base 1-21
8-CR1 285 Base 1-18
43-CR1 286 Base 1-21
11-CR1 287 Base 1-18
47-CR1 288 Base 1-22
80-CR1 289 Base 1-24
52-CR2 290 Base 1-19
87-CR1 291 Base 1-20
88-CR1 292 Base 1-23
45-CR1 293 Base 1-21
10-CR3 294 Base 1-18
44-CR2 295 Base 1-19
46-CR2 296 Base 1-20
表7.用于Zm01上复合性状基因座2(CTL2)的玉米稳定转化的向导RNA/Cas9
表8.用于ZM01-CTL2上复合性状基因的座(CTL-2)的玉米稳定转化的向导RNA
向导RNA名称 SEQ ID NO： 可变靶向结构域
62-CR1 297 Base 1-20
27-CR1 298 Base 1-22
63-CR1 299 Base 1-19
64-CR1 300 Base 1-22
30-CR1 301 Base 1-22
65-CR1 302 Base 1-22
66-CR1 303 Base 1-23
67-CR1 304 Base 1-19
68-CR1 305 Base 1-20
34-CR1 306 Base 1-20
69-CR1 307 Base 1-22
实施例4
通过稳定转化将向导RNA/Cas9内切核酸酶系统DNA递送到玉米
通过以下描述的稳定转化程序将实施例3中所述的向导RNA/Cas9DNA构建体和供体DNA共递送到优质玉米基因组。按以下步骤，利用粒子递送技术转化玉米未成熟胚。
给玉米穗去皮，用30％Clorox漂白剂加0.5％微洗涤剂表面消毒20分钟，再用无菌水漂洗两次。将未成熟胚分离，并以胚轴一侧朝下(盾片一侧朝上)放置，每板25个胚，在560Y培养基上放置4小时，然后在2.5cm靶区内排成一行准备进行轰击。另选地，将分离的胚放置在560L(初始培养基)上并在黑暗中在26℃至37℃范围内的温度下放置8至24小时，然后在26℃下放置在560Y上4小时，然后如上所述进行轰击。
使用标准分子生物学技术构建包含双链断裂诱导剂和供体DNA的质粒，然后与包含发育基因ODP2(AP2结构域转录因子ODP2(胚珠发育蛋白2)；US20090328252A1)和Wushel(US2011/0167516)的质粒共轰击。
使用水溶性阳离子脂质转染试剂的专有脂质-聚合物混合物，按下述步骤使质粒和目的DNA沉淀到0.6μm(平均直径)金粒料上。首先使用1μg质粒DNA，以及任选地其它共轰击用构建体诸如各50ng(0.5μ1)、包含发育基因ODP2(AP2结构域转录因子ODP2(胚珠发育蛋白2)；US20090328252 A1，公布于2009年12月31日)和Wushel的质粒，在冰上制备DNA溶液。为了得到预混的DNA，将20μl的制备的金粒子(15mg/ml)和1ul的水溶性阳离子脂质转染试剂添加在水中并且仔细混合。将金粒子在微量离心机中以10,000rpm丸粒化1分钟并且移除上清液。用100ml的100％EtOH在不使粒料重悬的情况下仔细清洗所得粒料，然后小心移除EtOH洗液。添加105μl的100％EtOH并且通过短暂超声处理使粒子重悬。然后，将10μl点滴到每个巨载体的中心上，让其干燥约2分钟后进行轰击。
将最终混合物简单超声波处理，并使其在恒定涡旋下温育10分钟。在沉淀过程之后，将管简单离心，除去液体，并且将粒子用500ml 100％乙醇洗涤，然后进行30秒离心。同样，除去液体，并且将105μl 100％乙醇加入最终的钨粒子粒料中。就粒子枪轰击而言，将钨/DNA粒子简单超声波处理。将10μl钨/DNA粒子点样到每个巨载体的中心上，此后将点样的粒子干燥约2分钟，然后进行轰击。
在level#4水平下，用Biorad Helium枪轰击样品板。所有样品在450PSI下接受单次射击，其中从每个管中获取制备的粒子/DNA的总共十个等分试样。
在轰击后，将胚在560P(维持培养基)上在26℃至37℃范围内的温度下温育12-48小时，然后置于26℃下。5至7天后，将胚转移到含150mg/L遗传霉素(G418)的选择培养基，并且在26℃下每2周继代一次。在选择的约10周之后，抗选择愈伤组织克隆体转移到288J培养基，以引发植物再生。在体细胞胚成熟(2-4周)之后，将发育良好的体细胞胚转移到培养基以用于发芽并转移到光照培养室。大约7-10天后，将发育的小植株转移到管中的272V无激素培养基7-10天，直到小植株完全长好。然后将植物转移到含有盆栽土的浅箱嵌块(inserts in flats)(相当于2.5英寸盆)，在生长室中生长1个星期，随后在温室中另外生长1-2个星期，然后转移到Classic 600盆(1.6加仑)并生长至成熟。对植物进行监测并进行转化效率的打分和/或进行再生能力的修饰的打分。
起始培养基(560L)包含4.0g/l N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0ml/l Eriksson维生素混合物(1000X SIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺、20.0g/l蔗糖、1.0mg/l 2，4-D和2.88g/l L-脯氨酸(用KOH调至pH 5.8后用去离子水定容)；2.0g/l结冷胶(在用去离子水定容后加入)和8.5mg/l硝酸银(在将培养基灭菌并冷却到室温后加入)。
维持培养基(560P)包含4.0g/l N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0ml/lEriksson维生素混合物(1000X SIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺、30.0g/l蔗糖、2.0mg/l 2，4-D和0.69g/lL-脯氨酸(用KOH调至pH 5.8后用去离子水定容)；3.0g/l结冷胶(在用去离子水定容后加入)和0.85mg/l硝酸银(在将培养基灭菌并冷却到室温后加入)。
轰击培养基(560Y)包含4.0g/l N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0ml/l Eriksson维生素混合物(1000X SIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺、120.0g/l蔗糖、1.0mg/l 2，4-D和2.88g/l L-脯氨酸(用KOH调至pH 5.8后用去离子水定容)；2.0g/l结冷胶(在用去离子水定容后加入)和8.5mg/l硝酸银(在将培养基灭菌并冷却到室温后加入)。
选择培养基(560R)包含4.0g/l N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0ml/l Eriksson维生素混合物(1000X SIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺、30.0g/l蔗糖、和2.0mg/l 2，4-D(用KOH调至pH 5.8后用去离子水定容)；3.0g/l结冷胶(在用D-I H2O定容之后添加)；以及0.85mg/l硝酸银和3.0mg/l遗传霉素(G418)(两者均在将培养基灭菌并冷却至室温之后添加)。
植物再生培养基(288J)包含4.3g/l MS盐(GIBCO 11117-074)、5.0ml/lMS维生素原液(0.100g烟酸、0.02g/l盐酸硫胺、0.10g/l盐酸吡哆醇、以及0.40g/l甘氨酸(用精制去离子水定容)(Murashige和Skoog(1962)Physiol.Plant.15：473)，100mg/l肌醇、0.5mg/l玉米素、60g/l蔗糖、以及1.0ml/l 0.1mM脱落酸(在调节至pH 5.6之后用精制去离子水定容)；3.0g/l结冷胶(用D-I H2O定容之后添加)；以及1.0mg/l吲哚乙酸和3.0mg/l遗传霉素(G418)(将培养基灭菌并冷却至60℃之后添加)。
无激素培养基(272V)包含4.3g/l MS盐(GIBCO 11117-074)、5.0ml/lMS维生素原液(0.100g/l烟酸、0.02g/l盐酸硫胺、0.10g/l盐酸吡哆醇和0.40g/l甘氨酸，用精制去离子水定容)、0.1g/l肌醇和40.0g/l蔗糖(在调至pH 5.6后用精制去离子水定容)和6g/l细菌培养用琼脂(在用精制去离子水定容后加入)，灭菌并冷却至60℃。
实施例5
检测稳定转化的玉米中的由向导RNA/Cas9系统介导的位点特异性非同源末端连 接(NHEJ)(靶位点突变的指示)
从成熟板上稳定的玉米苗(获自实施例3-4中所述的玉米事件)中提取基因组DNA，并且采用7900实时PCR系统(Applied Biosystems，Foster City，CA)通过使用靶位点特异性引物和FAM标记荧光探针进行定量PCR分析，以检查双链断裂靶位点的拷贝数变化。在双链体反应中进行qPCR分析，采用醇脱氢酶(ADH)作为内源性对照。用VIC标记内源性对照探针ADH，用FAM标记用于所有靶位点的基因特异性探针，以同时检测两根荧光探针(AppliedBiosystems)。捕集PCR反应数据，使用由7900实时PCR系统提供的序列检测软件进行分析，并使用相对定量方法(Applied Biosystems)计算基因拷贝数。在每个位点处使用qPCR用来获得靶位点拷贝数的引物和探针列于表9(SEQ ID NO：147-266)。
表9.用于转基因玉米事件的oPCR分析的引物/探针
将恢复事件数除以轰击的胚总数，计算出“事件恢复频率”，该频率可以指示内切核酸酶是否具有某种毒性效应。因此，如果轰击了1000个胚，其中200个胚得以恢复，则事件恢复频率为20％。表10和11指示对于目前为止所分析的所有靶位点，事件恢复频率的范围在14％和39％之间。事件恢复较低(14％)的靶标如74-CR1指示该向导RNA/Cas系统的一些毒性。总而言之，本文所用的向导RNA/Cas系统示出向导与向导之间较低的毒性变化。
还通过确定“靶位点突变频率”(表10-11)测量了Cas内切核酸酶在植物中的活性，其中“靶位点突变频率”被定义为：(具有靶位点修饰的事件数/恢复事件总数)*100％。因此，如果200个事件恢复，而160个事件显示出突变，则靶位点突变频率为80％。如2014年8月20日提交的美国专利申请14/463687(以引用方式并入本文)所述的实施例18中所述，使用靶位点等位基因拷贝数测量靶位点突变。简而言之，如果未观察到靶位点的修饰，则事件将被称为野生型(WT)，两个等位基因是完整的，靶位点拷贝数将为2。归因为双链断裂的一个等位基因被修饰的事件具有减小到1的靶位点拷贝数(一个等位基因)。靶位点的两个等位基因被修饰的事件具有0个拷贝数(无效事件)。被鉴定具有靶位点突变的事件包括一个等位基因和无效事件两者。
如表10和表11所示，靶位点突变频率(Cas9内切核酸酶活性)在靶位点与靶位点之间变化(范围为约32至约98％)，并且大多数靶位点的突变频率高于50％。总之，向导RNA/Cas系统是极有效的双链断裂系统。
表10.在玉米Zm01上称为复合性状基因座1(CTL1)的基因组窗口上通过向导RNA/ Cas9系统诱导的靶位点突变和位点特异性基因整合
表11.在玉米Zm01上称为CTL2的基因组窗口上通过向导RNA/Cas9系统诱导的靶位 点突变和位点特异性基因整合
实施例6
用向导RNA/Cas9内切核酸酶系统将转基因SSI靶位点导入玉米基因组窗口内
为了在玉米基因组的基因组窗口中发展复合性状基因座，开发出使用向导RNA/Cas9内切核酸酶系统紧密靠近玉米目的基因座导入转基因SSI(位点特异性整合)靶位点的方法。首先，鉴定紧密靠近的多个SSI靶位点可导入其中的基因组窗口(图2A、图4-7、以及实施例2)。然后，评估基因组窗口的DNA序列的任何双链断裂靶位点的存在，特别是任何Cas9内切核酸酶靶位点的存在。NGG型式后面的任何12-30bp基因组DNA序列均可被选择为向导RNA/Cas9内切核酸酶系统的靶位点。向导RNA和Cas内切核酸酶可通过使用表达盒导入(如实施例3和实施例4、图2C所述)，或者可直接提供给包含任一种Cas9内切核酸酶靶位点的玉米细胞，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成允许Cas内切核酸酶在Cas内切核酸酶靶位点处导入双链断裂的复合物。这些玉米细胞提供有包含转基因SSI靶位点的供体DNA，该转基因SSI靶位点包含侧接有第一同源性区域和第二同源性区域的两个重组位点(例如但不限于FRT1、FRT87、FRT6，图2B)(图2B)。任选地，供体DNA可在两个FRT位点之间包含目的多核苷酸。然后评估这些玉米细胞的靶位点突变，这指示向导RNA/Cas内切核酸酶系统是功能性的并且能够导入双链断裂(实施例5)。在Cas9内切核酸酶靶位点断裂时，将转基因SSI靶位点导入到DSB靶位点中，从而导致包含转基因SSI靶位点的修饰的双链断裂靶位点(aDSB，图2D)。
在不同的DSB靶位点处，在两个可能的转基因基因组DNA连接区通过边界特异性PCR分析测定经由向导RNA/Cas9系统介导的DNA同源重组整合的转基因SSI靶位点。例如，通过PCR采用引物使41-CR1事件的5’端边界(图8)扩增为660bp 41HR1PCR扩增子，而同一事件的3’边界被扩增为655bp HR2PCR扩增子。任何具有扩增的5’边界和3’边界特异性条带的事件都被视为位点特异性整合事件，这些事件都包含来自供体DNA片段的转基因靶位点。我们对所有的边界特异性PCR片段进行测序，结果证实这些片段都是重组序列。采用特异性边界引物使用相同的方法对其它DSB位点进行边界PCR分析。平均而言，向导RNA/Cas9介导的同源重组引起转基因靶位点整合的概率为恢复转基因事件总数的0.5％至7％(参见表10和11的插入频率)。在CTL1区域处30个位点的28个中获得整合事件，90％的成功率(无任何预筛选)指示，向导RNA/Cas内切核酸酶系统是用来在特定基因组位置处导入转基因靶位点的非常稳健和有效的系统。
这些Cas9内切核酸酶靶位点中的包含FRT1和FRT87(或FRT6)重组位点的转基因SSI靶位点的导入允许使用FLP/FRT技术来通过SSI技术进行基因叠堆并在基因组窗口内发展复合性状基因座。
实施例7
用DNA构建体测试向导RNA/Cas内切核酸酶系统是否在大豆基因组中导入修饰
采用强大豆组成型启动子GM-EF1A2表达来自酿脓链球菌M1GAS(SF370)的大豆密码子优化的Cas9(SO)基因(SEQ ID NO：313(描述于美国专利8697817，提交于2014年4月15日)。将具有接头SRAD的猿空泡病毒40(SV40)大T-抗原核定位信号PKKKRKV(SRADPKKKRKVSEQ ID NO：314)加入到密码子优化的Cas9的羧基末端以利于密码子优化的Cas9蛋白质转运到核。在一些其它构建体中，分别在Cas9开放阅读框的氨基末端掺入猿猴病毒40(SV40)单分型核定位信号(MAPKKKRKV，SEQ ID NO：309)，并且在Cas9开放阅读框的羧基末端掺入根癌农杆菌双分型VirD2 T-DNA边界内切核酸酶核定位信号(KRPRDRHDGELGGRKRAR；SEQ IDNO：310)。美国GenScript公司(Piscataway，NJ)将这种密码子优化的Cas9基因分两段合成，在框内克隆到GM-EF1A2启动子下游，以制出Cas9表达DNA构建体(如美国专利申请14/463687中所述，提交于2014年8月20日)。
大豆U6小核RNA(snRNA)基因的第一个G核苷酸的约0.5kb的基因组DNA序列上游被选择用作RNA聚合酶III启动子(如2014年8月20日提交的美国专利申请14/463687中所述)。例如，GM-U6-13.1启动子(SEQ ID NO：315)用于表达向导RNA，其引导Cas9核酸酶至指定的基因组位点(如2014年8月20日提交的美国专利申请14/463687中所述)。向导RNA编码序列长76bp，并且在5’端上包含来自选择的大豆基因组靶位点的19至20bp可变靶向结构域，在3’端上包含4个或更多个T残基片作为转录终止子。这种20bp可变靶向结构域的第一核苷酸是G残基，将被RNA聚合酶III用于转录起始。如果第一个碱基不是内源性G残基，则其可被向导RNA靶序列中的G残基替换，以适应RNA聚合酶III，不应牺牲靶位点被向导RNA特异性识别的程度。合成U6基因启动子和完整的向导RNA并然后克隆到适当的载体中。
将Cas9内切核酸酶和向导RNA表达盒连接到单个DNA构建体中(如2014年8月20日提交的美国专利申请14/463687中所述)，然后使用其来转化大豆细胞，以测试大豆优化的向导RNA/Cas系统是否在基因组中导入修饰。使用包含不同靶序列的向导RNA制备类似的DNA构建体，来靶向不同的基因组位点(如实施例9所述)。
实施例8
选择由向导RNA/Cas内切核酸酶系统导入的转基因SSI靶位点的大豆基因组窗口 和复合性状基因座的发展
针对产生的复合性状基因座来鉴定三种大豆基因组区域(也称之为基因组窗口)，该复合性状基因座包含通过本文所述的大豆优化的向导RNA/Cas9内切核酸酶系统导入到该基因组窗口中的转基因SSI位点的组合。
针对发展的复合性状基因座(CTL)鉴定的第一大豆基因组窗口从4号染色体上的Gm04：45593558(侧接有公共SNP标记BARC_1.01_Gm04_45591011_C_T)跨越到Gm04：45937320(侧接有公共SNP标记BARC_1.01_Gm04_46113406_T_G)(图9)。表12示出大豆4号染色体上该目的基因组窗口内的多个大豆SNP标记(Song，Q等人(2013)，Development andevaluation of SoySNP50K，a high-density genotyping array for soybean.PloS one，8(1)，e54985)和Cas内切核酸酶靶位点(D6-CR1、D6-CR3、DD49-CR2、DD49-CR3、DD43-CR1、DD43-CR2、DD38-CR1、DD38-CR2、DD52-CR1、DD52-CR3、DD20-CR1、DD20-CR2、DD51-CR1和DD51-CR2)的物理和基因图谱位置。公共4.0大豆基因图谱的基因图谱位置以及源自内部的DuPont-Pioneer图谱(PHB)的基因图谱位置如表12所示。
表12.大豆4号染色体上的包含复合性状基因座D(CTL-D)的基因组窗口
针对发展的复合性状基因座(CTL)鉴定的第二大豆基因组窗口从6号染色体上的Gm06：47537067(侧接有公共SNP标记BARC_1.01_Gm06_46915875_T_C)跨越到Gm06：47864578(侧接有公共SNP标记BARC_1.01_Gm06_48528885_G_T)(图10)。表13示出大豆6号染色体上该目的基因组窗口内的多个大豆SNP标记(Song，Q等人(2013)PloS one，8(1)，e54985)和Cas内切核酸酶靶位点(XA9-CR1、XA9-CR2、XA1-CR1、XA1-CR3、XB9-CR1、XB9-CR2、XB5-CR1、XB5-CR2、XB11-CR1、XB11-CR2)的物理和基因图谱位置。
表13.大豆6号染色体上的包含复合性状基因座X(CTL-X)的基因组窗口
针对发展的复合性状基因座(CTL)鉴定的第三大豆基因组窗口从1号染色体上的Gm01：7835614(侧接有公共SNP标记BARC_1.01_Gm01_6984873_T_C)跨越到Gm01：32717275(侧接有公共SNP标记BARC_1.01_Gm01_36994849_A_G)(图11)。表14示出大豆1号染色体上该目的基因组窗口内的多个大豆SNP标记(Song，Q等人(2013).Development andevaluation of SoySNP50K，a high-density genotyping array for soybean.PloS one，8(1)，e54985)和Cas内切核酸酶靶位点(RA1-CR1、RA1-CR2、RA3-CR1、RA3-CR2、RA13-CR1、RA13-CR2、RC9-CR1、RC9-CR2、RC19-CR1、RC19-CR2、RC1-CR1、RC1-CR2、RB1-CR1、RB1-CR2、RB7-CR1和RB7-CR2)的物理和基因图谱位置。
表14.大豆1号染色体上的包含复合性状基因座R(CTL-R)的基因组窗口
实施例9
将转基因SSI靶位点导入大豆基因组窗口中的向导RNA表达盒、Cas9内切核酸酶表 达盒和供体DNA
大豆U6小核RNA启动子GM-U6-9.1(SEQ ID.414)或GM-U6-13.1(SEQ ID.NO：315)用于表达向导RNA，以引导Cas9核酸酶至指定的基因组靶位点(表15)。在第一质粒中连接大豆密码子优化的Cas9内切核酸酶表达盒与向导RNA表达盒，该第一质粒与包含供体DNA(修复DNA)盒的第二质粒共递送。供体DNA包含选择性标记(诸如但不限于潮霉素选择性标记(HPT))和终止子(诸如但不限于胭脂碱合酶终止子，NOS)(图2B)旁侧的位点特异性整合的FRT1/FRT87重组位点，其在通过利用向导RNA/Cas9内切核酸酶系统同源重组进行整合时创建用于SSI技术应用的FRT1/FRT87靶系(图2D)。
被构建用于通过同源重组将转基因SSI靶位点导入到Cas内切核酸酶靶位点中的靶向各种大豆基因组位点的向导RNA(gRNA)/Cas9DNA构建体列于表15、表16和表17中。表18、19和20列出由向导RNA构建体表达的向导RNA以及包含可变靶向结构域的向导RNA的碱基。所有向导RNA/Cas9构建体的不同只在于靶向大豆基因组靶位点的19-20bp向导RNA可变靶向结构域。所有供体DNA构建体的不同只在于同源性区域，例如D6HR1和D6HR2。通过实施例10描述的稳定转化程序将这些向导RNA/Cas9DNA构建体和供体DNA共递送到优质(93B86)或非优质(Jack)大豆基因组。
表15.用于Gm04上复合性状基因座(CTL-D)的大豆稳定转化的向导RNA/Cas9
表16.用于Gm06上复合性状基因座(CTL-X)的大豆稳定转化的向导RNA/Cas9
实验 向导RNA/Cas9 SEQ ID NO：
U6-13.1XA9CR1 U6-13.1：XA9CR1+EF1A2：CAS9(RTW1116) 415
U6-13.1XA9CR2 U6-13.1：XA9CR2+EF1A2：CAS9(RTW1117) 416
U6-13.1XA1CR1 U6-9.1：XA1CR1+EF1A2：CAS9(RTW1114) 417
U6-13.1XA1CR3 U6-13.1：XA1CR3+EF1A2：CAS9(RTW1181) 418
U6-13.1XB9CR1 U6-13.1：XB9CR1+EF1A2：CAS9(RTW1120) 419
U6-13.1XB9CR2 U6-13.1：XB9CR2+EF1A2：CAS9(RTW1121) 420
U6-13.1XB5CR1 U6-13.1：XB5CR1+EF1A2：CAS9(RTW1118) 421
U6-13.1XB5CR2 U6-13.1：XB5CR2+EF1A2：CAS9(RTW1119) 422
U6-13.1XB11CR1 U6-13.1：XB11CR1+EF1A2：CAS9(RTW1122) 423
U6-13.1XB11CR2 U6-13.1：XB11CR2+EF1A2：CAS9(RTW1123) 424
表17.用于Gm01上复合性状基因座(CTL-R)的大豆稳定转化的向导RNA/Cas9
表18.用于CTL-D上复合性状基因座的大豆转化的向导RNA
向导RNA名称 SEQ ID NO： 可变靶向结构域
D6-CR1 441 碱基2-20
D6-CR3 442 碱基2-20
DD49-CR2 443 碱基1-20
DD49-CR3 444 碱基2-20
DD43-CR1 445 碱基1-20
DD43-CR2 446 碱基1-20
DD38-CR1 447 碱基2-20
DD38-CR2 448 碱基2-20
DD52-CR1 449 碱基2-20
DD52-CR3 450 碱基2-20
DD20-CR1 451 碱基1-20
DD20-CR2 452 碱基1-20
DD51-CR1 453 碱基2-20
DD51-CR2 454 碱基1-20
表19.用于CTL-X上复合性状基因座的大豆转化的向导RNA
表20.用于CTL-R上复合性状基因座的大豆转化的向导RNA
向导RNA名称 SEQ ID NO： 可变靶向结构域
RA1-CR1 465 碱基2-20
RA1-CR2 466 碱基2-20
RA3-CR1 467 碱基1-20
RA3-CR2 468 碱基1-20
RA13-CR1 469 碱基2-20
RA13-CR2 470 碱基2-20
RC9-CR1 471 碱基1-20
RC9-CR2 472 碱基2-20
RC19-CR1 473 碱基1-20
RC19-CR2 474 碱基1-20
RC1-CR1 475 碱基1-20
RC1-CR2 476 碱基2-20
RB1-CR1 477 碱基1-20
RB1-CR2 478 碱基1-20
RB7-CR1 479 碱基2-20
RB7-CR2 480 碱基1-20
实施例10
通过稳定转化将向导RNA/Cas9内切核酸酶系统DNA递送到大豆
采用下文描述的稳定转化程序将实施例9中所述的向导RNA/Cas9DNA构建体和供体DNA共递送到优质(93B86)和/或非优质(Jack)大豆基因组。
按下述步骤诱导DuPont Pioneer专有的优质品种93B86或非优质Jack，获得大豆体细胞胚发生悬浮培养物。从表面灭菌的未成熟种子中解剖出子叶(长约3mm)，在Murashige和Skoog(MS)培养基(含0.7％琼脂，补充有10mg/ml 2，4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸))上，在光照中于26℃培养6至10周。然后切下球形期体细胞胚(其产生次生胚)，并且置于含有液体MS培养基(补充有2，4-D(10mg/ml))的烧瓶中，并在旋转振荡器上光照培养。重复选择繁殖成球形期早期胚的成簇体细胞胚后，然后将大豆胚发生悬浮培养物保持在旋转振荡器上的35ml液体培养基中，150rpm，温度26℃，每天用荧光连续照射16小时白天/8小时夜晚。通过将约35mg组织接种到35ml相同的新鲜液体MS培养基中，每两周将培养物继代一次。
然后使用DuPont BiolisticTMPDS1000/HE仪器(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，采用粒子枪轰击方法转化大豆的胚发生悬浮培养物。向50μl 60mg/ml金粒子(1.0mm)悬浮液中依次添加下列物质：30μl的等量(30ng/μl)质粒DNA，包括例如U6-9.1：DD20CR1+EF1A2：CAS9，以及质粒DNA，包括例如DD20HR1-SAMS：HPT-DD20HR220μl的0.1M亚精胺，以及25μl的5M CaCl2。然后搅拌粒子制备物3分钟，放入离心机离心10秒，并且弃去上清液。然后用400μl无水乙醇洗涤DNA包被的粒子一次，然后重悬于45μl无水乙醇中。用超声波处理DNA/粒子悬浮液三次，每次1秒。将5μl这种DNA包被的金粒子装到每个巨载体盘上。
将大约300-400mg两周龄的悬浮培养物置于60×15mm空培养皿中，用移液管从组织移除残余的液体。对于每次转化实验，轰击大约5至10块板的组织。将膜破裂压力设定为1100psi，并且将腔室抽成28英寸汞柱的真空。将组织置于距阻挡网约3.5英寸的位置，轰击一次。轰击后，将组织分成两半，放回液体培养基，并且如上所述培养。
后轰击五至七天，用含有30mg/ml潮霉素(作为选择剂)的新鲜培养基替换上述液体培养基。每周更换一次这种选择性培养基。后轰击七至八周，观察到绿色的转化组织从未转化的坏死胚发生簇长出。移除分离的绿色组织，并且接种到各个烧瓶中，以产生新的无性繁殖转化胚发生悬浮培养物。将每份无性繁殖培养物作为独立的转化事件进行处理，在相同的液体MS培养基(补充有2，4-D(10mg/ml)和30ng/ml潮霉素选择剂)中继代培养，以增加质量。然后将胚发生悬浮培养物转移到不含2，4-D补充剂的琼脂固体MS培养基平板上，以允许体细胞胚发育。收集该阶段的每个事件的样品用于定量PCR分析。
使子叶期体细胞胚(通过将它们转移到安置于10cm培养皿(含有一些琼脂凝胶，以允许缓慢干燥)的顶部上的空的小培养皿中)干燥，从而模拟大豆种子发育的最后阶段。将干燥的胚置于发芽固体培养基上，再生出转基因大豆小植株。然后将转基因植株转移到生长室内的土壤，维持其生长，用于制种。在体细胞胚期或T0叶期对转基因事件取样用于分子分析。
实施例11
检测稳定转化大豆中的由向导RNA/Cas9系统介导的位点特异性NHEJ
从如实施例9-10中所述产生的大豆事件的体细胞胚样本中提取基因组DNA，并且采用7500实时PCR系统(Applied Biosystems，Foster City，CA)通过使用靶位点特异性引物和FAM标记荧光探针进行定量PCR分析，以检查双链断裂靶位点的拷贝数变化。以双重反应形式执行qPCR分析，采用syringolide诱导蛋白(SIP)作为内源性对照，采用包含靶位点(带2个等位基因)的一个拷贝的野生型93B86基因组DNA样品作为单拷贝校准品(calibrator)。还使用了gRNA/Cas9和PinII的qPCR引物/探针，分析转基因事件中向导RNA-Cas9表达盒的存在或不存在。所有DSB靶位点的qPCR引物/探针列于表21中。
表21.用于转基因大豆事件的qPCR分析的引物/探针
用VIC标记内源性对照探针SIP-T，用FAM标记用于所有靶位点的基因特异性探针，以同时检测两根荧光探针(Applied Biosystems)。捕集PCR反应数据，使用由7500实时PCR系统提供的序列检测软件进行分析，并使用相对定量方法(Applied Biosystems)计算基因拷贝数。
由于带双链断裂靶位点的两个等位基因的野生型Jack或93B86基因组DNA被用作单拷贝校准品，所以，靶位点没有任何变化的事件将作为一个拷贝被检测到，本文称为Wt-Homo(qPCR值>＝0.7)；一个等位基因变化的事件不再可被靶位点特异性qPCR检测到，将作为半个拷贝被检测到，本文称为NHEJ-Hemi(0.1＜qPCR值＜0.7)；两个等位基因都变化的事件将作为无效事件被检测到，本文称为NHEJ-Null(qPCR值＝＜0.1)。宽范围的qPCR值表明，大多数事件既包含靶位点的突变序列，又包含靶位点的野生型序列。如表23所示，双链断裂(DSB)效率在同一靶标上的位点与位点之间以及从一个到另一个向导RNA/Cas9内切核酸酶系统变化。例如，在Jack基因型中，D6 CR1提供19％NHEJ-Hemi和57％NHEJ-Null(非常有效的DSB试剂)，相比之下，D6 CR3仅提供22％NHEJ-Hemi和3％NHEJ-Null。D6 CR3另外表现出一些毒性，如由低事件生成数所证实的那样(D6 CR3的37个事件相对于D6 CR1的168个事件)。
DD49 CR2可为比DD49 CR3更好的DSB试剂，如由更高的NHEJ-Heni和插入频率所证实的那样(表22)。对于其它位点(DD43、DD38、DD52、DD20、DD51)，两种向导RNA/Cas9系统都提供良好的双链断裂(DSB)效率。另外，在优质93B86基因型中对各个靶标测试一组CR，如表23所示。DSB效率与来自Jack的数据极为类似。
我们在Jack或93B86基因型中检测到了NHEJ-Hemi和NHEJ-Null两者。NHEJ频率的差别可能是转化实验之间的变化引起的。通过PCR/TOPO克隆/测序确认向导RNA/Cas9系统在特定的Cas9靶位点处介导了NHEJ突变。
表22.在大豆(Jack)Gm04上称为CTL-D的基因组窗口上由向导RNA/Cas9系统诱导 的靶位点突变和位点特异性基因整合数字表示事件的数量(括号内的数字为百分比)。
表23.优质大豆种质93B86中Gm04的CTL-D上由向导RNA/Cas9系统诱导的靶位点突 变和位点特异性基因整合。数字表示事件的数量(括号内的数字是占分析事件总数的百分 比)。
实施例12
用向导RNA/Cas9内切核酸酶系统将转基因SSI靶位点导入大豆基因组窗口内
为了在大豆基因组的基因组窗口中发展复合性状基因座，开发出使用向导RNA/Cas9内切核酸酶系统紧密靠近大豆目的基因座导入转基因SSI(位点特异性整合)靶位点的方法。首先，鉴定紧密靠近的多个SSI靶位点可导入其中的基因组窗口(图2A、图4-7、以及图9-11、实施例8)。然后，评估基因组窗口的DNA序列的任何双链断裂靶位点的存在，特别是任何Cas9内切核酸酶靶位点的存在。N(20)NGG型式后面的任何23bp基因组DNA序列均可被选择为向导RNA/Cas9内切核酸酶系统的靶位点。向导RNA和Cas内切核酸酶可通过使用表达盒导入(如实施例9和实施例10所述)，或者可直接导入到包含任一种Cas9内切核酸酶靶位点的大豆细胞中，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成允许Cas内切核酸酶在Cas内切核酸酶靶位点处导入双链断裂的复合物。这些大豆细胞提供有包含转基因SSI靶位点的供体DNA，该转基因SSI靶位点包含侧接有第一同源性区域和第二同源性区域的两个重组位点(例如但不限于FRT1、FRT87、FRT6，图2B)(图2B)。任选地，供体DNA可在两个FRT位点之间包含目的多核苷酸。然后评估这些大豆细胞的NHEJ的存在，这指示向导RNA/Cas内切核酸酶系统是功能性的并且能够导入双链断裂(实施例11)。在Cas9内切核酸酶靶位点裂解时，将转基因SSI靶位点导入到DSB靶位点中，从而得到包含转基因SSI靶位点的修饰的双链断裂靶位点(aDSB，图2D)。
使用两个引物对，在不同的DSB靶位点处的两个可能的转基因基因组DNA连接区通过边界特异性PCR分析测定经由向导RNA/Cas9系统介导的DNA同源重组整合的转基因SSI位点。例如，通过PCR将DD38CR1事件的5’端边界扩增为1241bp PCR扩增子，而同一事件的3’边界被扩增为1210bp PCR扩增子。任何具有扩增的5’边界和3’边界特异性条带的事件都被视为通过同源重组的位点特异性整合事件，这些事件都包含来自供体DNA的转基因。我们对所有边界特异性PCR片段进行测序，结果证实，这些片段都是预期源自同源重组的重组序列。采用特异性边界引物使用相同的方法对其它DSB位点进行边界PCR分析。平均来说，在Jack或93B86基因型中，向导RNA/Cas9介导的同源重组引起基因整合的概率为转基因事件总数的0.6％至4％(参见表22和表23的插入频率)。
这些DSB位点中导入的FRT1和FRT87位点提供了使用FLP/FRT技术来通过SSI技术进行基因叠堆并在基因组窗口内发展复合性状基因座的能力。
实施例13
使用向导RNA/Cas内切核酸酶系统将性状基因直接导入到植物基因组的双链断裂 靶位点中
本文(实施例1-12)描述了如下方法：使用向导RNA/Cas9系统将SSI转基因靶位点(包含重组位点，诸如但不限于FRT1、FRT87、FRT6)导入到双链断裂靶位点(诸如Cas9内切核酸酶靶位点)中并允许使用FLP/FRT技术以通过SSI技术进行基因整合和基因叠堆并在基因组窗口内发展复合性状基因座。本领域的技术人员应当理解，转基因SSI靶位点还可通过其它双链断裂试剂导入到DSB位点中，所述其它双链断裂试剂诸如但不限于锌指、大范围核酸酶、TALENS等。这些DSB位点中的FRT1和FRT87(或FRT6)位点的导入允许使用FLP/FRT技术来进行利用SSI技术的基因叠堆。
特异性基因整合的另一种方法是将一个或多个性状(或基因表达盒)直接导入到植物基因组的DSB位点中，例如Cas9内切核酸酶靶位点，如图3A-3C中所示和以下所述。
植物细胞可提供有包含至少一种目的多核苷酸(诸如但不限于性状基因盒)的供体DNA，该目的多核苷酸通过第一同源性区域和第二同源性区域(分别为HR1、HR2，图3B)侧接到位于基因组窗口中的第一DNA序列和第二DNA序列(分别为DNA1、DNA2，图3A)(图3A)。供体DNA可包含一个或多个性状基因盒。
这些植物细胞还直接地或经由位于不同质粒上或连接于同一质粒上的如下表达盒提供有向导RNA和Cas内切核酸酶：诸如植物密码子优化的Cas9内切核酸酶表达盒(诸如但不限于，大豆密码子优化的Cas9内切核酸酶表达盒或玉米密码子优化的Cas9内切核酸酶表达盒)和向导RNA表达盒(如图2C所示)。
然后评估这些植物细胞的DSB靶位点的改变(例如Cas9内切核酸酶靶位点的改变)，这指示向导RNA/Cas内切核酸酶系统是功能性的并且能够导入双链断裂并且允许通过同源重组在这些预定义的双链断裂靶位点处进行性状整合(实施例3C)。所得的植物细胞
就性状基因直接整合进玉米细胞中而言，供体DNA可包含核苷酸序列如45HR1-选择性标记-性状基因表达盒-45HR2，或者其可包含侧接有围绕本文所述其它玉米靶位点的同源性区域的性状基因。就性状基因直接整合进大豆细胞中而言，供体DNA可包含DD38HR1-启动子：：选择性标记-性状基因表达盒-DD38HR2，或者其可包含侧接有围绕本文所述其它大豆靶位点的同源性区域的性状基因。
实施例14
玉米和大豆中复合性状基因座(CTL)的形成
如本文所述，针对在玉米基因组中形成的复合性状基因座(CTL)来鉴定四种基因组窗口。1号玉米染色体上的CTL1(表1，图4)、1号玉米染色体上的CTL2(表2，图5)、3号玉米染色体上的CTL3(表3，图6)以及10号玉米染色体上的CTL4(表4，图7)。另外，针对在大豆基因组中形成的复合性状基因座选择三种基因组窗口，即4号大豆染色体Gm04上的CTL-D(表12，图9)、6号大豆染色体Gm06上的CTL-X(表13，图10)和1号大豆染色体Gm01上的CTL-R(表14，图11)。
使用本文所述的向导RNA/Cas9内切核酸酶系统，将转多基因SSI靶位点紧密靠近玉米或大豆目的基因座(加减5cM)导入到各个所述基因组窗口中(实施例6，实施例7-13)。此外，还可使用向导RNA/Cas内切核酸酶系统将性状基因直接导入到位于所述基因组窗口内的双链断裂靶位点(诸如Cas9内切核酸酶位点)中(如实施例13所述)。可将包含一个或多个这些导入的转基因SSI靶位点和/或导入的性状基因的植物杂交，并且可筛选存在叠堆的转基因SSI靶位点和/或整合的性状基因的子代。例如，可将在基因组窗口中包含三个转基因SSI靶位点A、B、C的第一植物与在相同基因组窗口中包含三个转基因SSI靶位点D、E、F的第二植物杂交，并且可鉴别出包含六个转基因SSI靶位点A、B、C、D、E、F的子代。对在相同基因组窗口中具有其它靶位点的植物可再次重复该过程，以进一步在该基因组窗口中形成更多的靶位点。
不同的性状基因可特定地整合进野生型优质基因型(诸如玉米GR2HT或玉米HC69、大豆93B86)中的转基因SSI靶位点或不同的DSB位点中并且可在以后几代通过育种叠堆在一起(如在2013年3月22日提交的美国专利申请13/427138和2014年1月24日提交的美国专利申请13/748704中所述，这两个专利都以引用方式并入本文)。性状基因整合可通过SSI技术采用FRT1/FRT87(或FRT6)位点进行，或者通过利用双链断裂技术进行直接性状基因整合。
可针对相同基因座内存在的叠堆的性状基因筛选所得的子代植物，从而形成复合性状基因座。

Claims (32)

1.一种在其基因组中具有基因组窗口的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，所述基因组窗口包含整合进至少一个双链断裂靶位点中的至少一个位点特异性整合(SSI)的转基因靶位点，其中所述基因组窗口侧接有：
a)至少第一标记，其包括SYN12545、SYN12536、SYN14645、PZE-101023852、PZE-101024424、SYN25022、SYN31156、SYN31166或SYN22238；以及
b)至少第二标记，其包括SYN12536、SYN14645、PZE-101023852、PZE-101024424、SYN25022、SYN31156、SYN31166、SYN22238或SYN20196。
2.根据权利要求1所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少一个双链断裂靶位点选自锌指内切核酸酶靶位点、工程化内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点和Cas9内切核酸酶靶位点。
3.根据权利要求1所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口的长度不超过0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、5或10cM。
4.根据权利要求1所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口还包含转基因。
5.根据权利要求4所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述转基因赋予选自以下的性状：除草剂耐受性、昆虫抗性、病害抗性、雄性不育、位点特异性重组、非生物胁迫耐受性、磷的改变、抗氧化剂的改变、脂肪酸的改变、必需氨基酸的改变、碳水化合物的改变、除草剂耐受性、昆虫抗性和病害抗性。
6.根据权利要求1所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口还包含整合进至少第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31个双链断裂靶位点中的至少第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31个位点特异性整合的转基因靶位点。
7.根据权利要求6所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31个双链断裂靶位点选自锌指靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点、Cas9内切核酸酶靶位点、以及它们的任一种组合。
8.根据权利要求1所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少一个位点特异性整合的转基因靶位点包含第一重组位点和第二重组位点，其中所述第一重组位点和所述第二重组位点相对于彼此是相异的。
9.根据权利要求8所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少一个位点特异性整合的转基因靶位点还包含侧接有所述第一重组位点和所述第二重组位点的目的多核苷酸。
10.根据权利要求8所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述位点特异性整合的转基因靶位点的相异重组位点包括LOX位点、突变的LOX位点、FRT位点或突变的FRT位点。
11.根据权利要求8所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述第一重组位点和所述第二重组位点选自FRT1位点、FRT5位点、FRT6位点、FRT12位点和FRT87位点。
12.根据权利要求1所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口还包含位于Cas9内切核酸酶靶位点之外的位点特异性整合的转基因靶位点。
13.一种在其基因组中具有基因组窗口的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，所述基因组窗口包含至少一个双链断裂靶位点，其中所述基因组窗口侧接有：
a.至少第一标记，其包括SYN12545、SYN12536、SYN14645、PZE-101023852、PZE-101024424、SYN25022、SYN31156、SYN31166或SYN22238；以及
b.至少第二标记，其包括SYN12536、SYN14645、PZE-101023852、PZE-101024424、SYN25022、SYN31156、SYN31166、SYN22238或SYN20196，
其中所述基因组窗口包含转基因。
14.根据权利要求13所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述转基因赋予选自以下的性状：除草剂耐受性、昆虫抗性、病害抗性、雄性不育、位点特异性重组、非生物胁迫耐受性、磷的改变、抗氧化剂的改变、脂肪酸的改变、必需氨基酸的改变、碳水化合物的改变、除草剂耐受性、昆虫抗性和病害抗性。
15.根据权利要求13所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口的长度不超过0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、5、10cM。
16.根据权利要求13所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口还包含至少第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31个双链断裂靶位点。
17.根据权利要求13所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少一个双链断裂靶位点选自锌指内切核酸酶靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点和Cas9内切核酸酶靶位点。
18.根据权利要求16所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31个双链断裂靶位点选自锌指靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点、Cas9内切核酸酶靶位点、以及它们的任一种组合。
19.根据权利要求13所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口还包含至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，其中所述转基因靶位点包含第一重组位点和第二重组位点，其中所述第一重组位点和所述第二重组位点相对于彼此是相异的。
20.根据权利要求19所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少一个位点特异性整合的转基因靶位点的相异重组位点包括LOX位点、突变的LOX位点、FRT位点或突变的FRT位点。
21.根据权利要求20所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述第一重组位点和所述第二重组位点选自FRT1位点、FRT5位点、FRT6位点、FRT12位点和FRT87位点。
22.一种在其基因组中具有基因组窗口的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，所述基因组窗口包含至少一个改变的双链断裂靶位点，其中所述基因组窗口侧接有：
a)至少第一标记，其包括SYN12545、SYN12536、SYN14645、PZE-101023852、PZE-101024424、SYN25022、SYN31156、SYN31166或SYN22238；以及
b)至少第二标记，其包括SYN12536、SYN14645、PZE-101023852、PZE-101024424、SYN25022、SYN31156、SYN31166、SYN22238或SYN20196。
23.根据权利要求22所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口的长度不超过0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、5、10cM。
24.根据权利要求22所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述改变的双链断裂靶位点来源于选自以下的双链断裂位点：锌指靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点、Cas9内切核酸酶靶位点。
25.根据权利要求22所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述改变的双链断裂靶位点包含目的多核苷酸。
26.根据权利要求25所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述目的多核苷酸包括转基因、天然基因、编辑基因、或它们的任何组合。
27.根据权利要求22所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口还包含至少第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31个双链断裂靶位点。
28.根据权利要求27所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31个双链断裂靶位点选自锌指靶位点、内切核酸酶靶位点、大范围核酸酶靶位点、TALEN靶位点、Cas9内切核酸酶靶位点或它们的任一种组合。
29.根据权利要求28所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述目的多核苷酸赋予包括以下的性状：雄性不育、位点特异性重组、非生物胁迫耐受性、磷的改变、抗氧化剂的改变、脂肪酸的改变、必需氨基酸的改变、碳水化合物的改变、除草剂耐受性、昆虫抗性或病害抗性。
30.根据权利要求22所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述基因组窗口还包含至少一个位点特异性整合的转基因靶位点，所述转基因靶位点包含第一重组位点和第二重组位点，其中所述第一重组位点和所述第二重组位点相对于彼此是相异的。
31.根据权利要求30所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述至少一个位点特异性整合的转基因靶位点的相异重组位点包括LOX位点、突变的LOX位点、FRT位点或突变的FRT位点。
32.根据权利要求30所述的玉米植物、玉米植物部分或玉米种子，其中所述第一重组位点和第二重组位点选自FRT1位点、FRT5位点、FRT6位点、FRT12位点和FRT87位点。
CN201580048807.5A 2014-09-12 2015-08-31 玉米和大豆中复合性状基因座的位点特异性整合位点的产生和使用方法 Pending CN108064129A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462049465P 2014-09-12 2014-09-12
US62/049465 2014-09-12
PCT/US2015/047706 WO2016040030A1 (en) 2014-09-12 2015-08-31 Generation of site-specific-integration sites for complex trait loci in corn and soybean, and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108064129A true CN108064129A (zh) 2018-05-22

Family

ID=54140668

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580048807.5A Pending CN108064129A (zh) 2014-09-12 2015-08-31 玉米和大豆中复合性状基因座的位点特异性整合位点的产生和使用方法

Country Status (11)

Country Link
US (3) US11560568B2 (zh)
EP (2) EP3628739B1 (zh)
CN (1) CN108064129A (zh)
AR (1) AR101847A1 (zh)
AU (1) AU2015315651A1 (zh)
BR (1) BR112017003757A2 (zh)
CA (1) CA2956487A1 (zh)
IL (1) IL250256A0 (zh)
MX (1) MX2017002930A (zh)
RU (1) RU2017112324A (zh)
WO (1) WO2016040030A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112481259A (zh) * 2020-11-24 2021-03-12 南昌大学 两种甘薯U6基因启动子IbU6的克隆与应用

Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX365030B (es) 2010-06-25 2019-05-21 Du Pont Composiciones y metodos para mejorar la resistencia al tizon norteño de las hojas en maiz.
BR112013024337A2 (pt) 2011-03-23 2017-09-26 Du Pont locus de traço transgênico complexo em uma planta, planta ou semente, método para produzir em uma planta um locus de traço transgênico complexo e construto de expressão
US10323236B2 (en) 2011-07-22 2019-06-18 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
MX2016002118A (es) 2013-08-22 2016-06-28 Du Pont Modificacion del genoma de plantas por medio del uso de sistemas de ácido ribonucléico (arn) guía/ endonucleasa cas y metodos de uso.
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US9340799B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College MRNA-sensing switchable gRNAs
US20150165054A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting caspase-9 point mutations
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
MX2017002930A (es) 2014-09-12 2017-06-06 Du Pont Generacion de sitios de integracion especifica de sitio para loci de rasgos complejos en maiz y soja, y metodos de uso.
US10450576B2 (en) 2015-03-27 2019-10-22 E I Du Pont De Nemours And Company Soybean U6 small nuclear RNA gene promoters and their use in constitutive expression of small RNA genes in plants
WO2018071362A1 (en) 2016-10-13 2018-04-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Generating northern leaf blight resistant maize
CN108137658A (zh) 2015-10-16 2018-06-08 先锋国际良种公司 产生对北方叶枯病具有增强的抗性的玉蜀黍植物
US10167457B2 (en) 2015-10-23 2019-01-01 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
US20180258438A1 (en) * 2015-11-06 2018-09-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Generation of complex trait loci in soybean and methods of use
CN106811479B (zh) * 2015-11-30 2019-10-25 中国农业科学院作物科学研究所 利用CRISPR/Cas9系统定点修饰ALS基因获得抗除草剂水稻的系统及其应用
KR20250103795A (ko) 2016-08-03 2025-07-07 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 아데노신 핵염기 편집제 및 그의 용도
EP3497214B1 (en) 2016-08-09 2023-06-28 President and Fellows of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
AU2017342543B2 (en) 2016-10-14 2024-06-27 President And Fellows Of Harvard College AAV delivery of nucleobase editors
WO2018093954A1 (en) * 2016-11-16 2018-05-24 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Stem loop rna mediated transport of mitochondria genome editing molecules (endonucleases) into the mitochondria
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
US12390514B2 (en) 2017-03-09 2025-08-19 President And Fellows Of Harvard College Cancer vaccine
EP3592853A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
BR112019019655A2 (pt) 2017-03-23 2020-04-22 Harvard College editores de nucleobase que compreendem proteínas de ligação a dna programáveis por ácido nucleico
WO2018209320A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation
EP3651796A4 (en) 2017-07-12 2021-06-30 The Brigham and Women's Hospital, Inc. LIVE ATTENUATED CHOLERA VACCINE WITH PROBIOTIC PROPERTIES
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
AU2018352592C1 (en) 2017-10-16 2025-09-25 Beam Therapeutics, Inc. Uses of adenosine base editors
US12406749B2 (en) 2017-12-15 2025-09-02 The Broad Institute, Inc. Systems and methods for predicting repair outcomes in genetic engineering
WO2019165168A1 (en) 2018-02-23 2019-08-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel cas9 orthologs
JP6614622B2 (ja) * 2018-04-17 2019-12-04 国立大学法人名古屋大学 植物ゲノム編集方法
CN112088018A (zh) 2018-05-07 2020-12-15 先锋国际良种公司 用于在植物细胞基因组中同源定向修复双链断裂的方法和组合物
US12157760B2 (en) 2018-05-23 2024-12-03 The Broad Institute, Inc. Base editors and uses thereof
US12522807B2 (en) 2018-07-09 2026-01-13 The Broad Institute, Inc. RNA programmable epigenetic RNA modifiers and uses thereof
WO2020092453A1 (en) 2018-10-29 2020-05-07 The Broad Institute, Inc. Nucleobase editors comprising geocas9 and uses thereof
WO2020123887A2 (en) 2018-12-14 2020-06-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel crispr-cas systems for genome editing
US12351837B2 (en) 2019-01-23 2025-07-08 The Broad Institute, Inc. Supernegatively charged proteins and uses thereof
CN114127285B (zh) 2019-03-19 2024-09-10 布罗德研究所股份有限公司 编辑核苷酸序列的方法和组合物
EP3956349A1 (en) 2019-04-17 2022-02-23 The Broad Institute, Inc. Adenine base editors with reduced off-target effects
US12435330B2 (en) 2019-10-10 2025-10-07 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing RNA
WO2021183807A1 (en) * 2020-03-11 2021-09-16 The Broad Institute, Inc. Novel cas enzymes and methods of profiling specificity and activity
DE112021002672T5 (de) 2020-05-08 2023-04-13 President And Fellows Of Harvard College Vefahren und zusammensetzungen zum gleichzeitigen editieren beider stränge einer doppelsträngigen nukleotid-zielsequenz
CN116134143A (zh) 2020-08-18 2023-05-16 先锋国际良种公司 多种抗病基因及其基因组堆叠件

Family Cites Families (203)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ201918A (en) 1981-09-18 1987-04-30 Genentech Inc N-terminal methionyl analogues of bovine growth hormone
US5380831A (en) 1986-04-04 1995-01-10 Mycogen Plant Science, Inc. Synthetic insecticidal crystal protein gene
US5036006A (en) 1984-11-13 1991-07-30 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5569597A (en) 1985-05-13 1996-10-29 Ciba Geigy Corp. Methods of inserting viral DNA into plant material
US5268463A (en) 1986-11-11 1993-12-07 Jefferson Richard A Plant promoter α-glucuronidase gene construct
US5608142A (en) 1986-12-03 1997-03-04 Agracetus, Inc. Insecticidal cotton plants
US4873192A (en) 1987-02-17 1989-10-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Process for site specific mutagenesis without phenotypic selection
US5316931A (en) 1988-02-26 1994-05-31 Biosource Genetics Corp. Plant viral vectors having heterologous subgenomic promoters for systemic expression of foreign genes
US5990387A (en) 1988-06-10 1999-11-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Stable transformation of plant cells
NZ230375A (en) 1988-09-09 1991-07-26 Lubrizol Genetics Inc Synthetic gene encoding b. thuringiensis insecticidal protein
US5023179A (en) 1988-11-14 1991-06-11 Eric Lam Promoter enhancer element for gene expression in plant roots
DE69033816T2 (de) 1989-02-24 2002-08-08 Monsanto Technology Llc., St. Louis Synthetische pflanzengene und verfahren zu ihrer herstellung
US5110732A (en) 1989-03-14 1992-05-05 The Rockefeller University Selective gene expression in plants
KR920701453A (ko) 1989-03-17 1992-08-11 미리엄 디. 멕코나헤이 유전자발현의 외부조절
US5231020A (en) 1989-03-30 1993-07-27 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5034323A (en) 1989-03-30 1991-07-23 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5879918A (en) 1989-05-12 1999-03-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Pretreatment of microprojectiles prior to using in a particle gun
US5240855A (en) 1989-05-12 1993-08-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Particle gun
US5310667A (en) 1989-07-17 1994-05-10 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthases
US5322783A (en) 1989-10-17 1994-06-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean transformation by microparticle bombardment
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
ES2187497T3 (es) 1990-04-12 2003-06-16 Syngenta Participations Ag Promotores preferentemente en tejidos.
CA2080584C (en) 1990-04-18 2000-09-05 Marc Cornelissen Modified bacillus thuringiensis insecticidal-crystal protein genes and their expression in plant cells
US5498830A (en) 1990-06-18 1996-03-12 Monsanto Company Decreased oil content in plant seeds
US5633435A (en) 1990-08-31 1997-05-27 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
US5866775A (en) 1990-09-28 1999-02-02 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthases
US5932782A (en) 1990-11-14 1999-08-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant transformation method using agrobacterium species adhered to microprojectiles
US5459252A (en) 1991-01-31 1995-10-17 North Carolina State University Root specific gene promoter
US5399680A (en) 1991-05-22 1995-03-21 The Salk Institute For Biological Studies Rice chitinase promoter
US5604121A (en) 1991-08-27 1997-02-18 Agricultural Genetics Company Limited Proteins with insecticidal properties against homopteran insects and their use in plant protection
ZA927576B (en) 1991-10-04 1993-04-16 Univ North Carolina State Pathogen-resistant transgenic plants.
TW261517B (zh) 1991-11-29 1995-11-01 Mitsubishi Shozi Kk
US5324646A (en) 1992-01-06 1994-06-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of regeneration of Medicago sativa and expressing foreign DNA in same
US5401836A (en) 1992-07-16 1995-03-28 Pioneer Hi-Bre International, Inc. Brassica regulatory sequence for root-specific or root-abundant gene expression
AU670316B2 (en) 1992-07-27 1996-07-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. An improved method of (agrobacterium)-mediated transformation of cultured soybean cells
AU5676394A (en) 1992-11-20 1994-06-22 Agracetus, Inc. Transgenic cotton plants producing heterologous bioplastic
IL108241A (en) 1992-12-30 2000-08-13 Biosource Genetics Corp Plant expression system comprising a defective tobamovirus replicon integrated into the plant chromosome and a helper virus
DE69428290T2 (de) 1993-01-13 2002-04-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Derivate von alpha-hordothionin mit höherem behalt an lysin
US5527695A (en) 1993-01-29 1996-06-18 Purdue Research Foundation Controlled modification of eukaryotic genomes
US5814618A (en) 1993-06-14 1998-09-29 Basf Aktiengesellschaft Methods for regulating gene expression
US5789156A (en) 1993-06-14 1998-08-04 Basf Ag Tetracycline-regulated transcriptional inhibitors
US5470353A (en) 1993-10-20 1995-11-28 Hollister Incorporated Post-operative thermal blanket
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US5633363A (en) 1994-06-03 1997-05-27 Iowa State University, Research Foundation In Root preferential promoter
US5736369A (en) 1994-07-29 1998-04-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method for producing transgenic cereal plants
US5792931A (en) 1994-08-12 1998-08-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Fumonisin detoxification compositions and methods
US5608144A (en) 1994-08-12 1997-03-04 Dna Plant Technology Corp. Plant group 2 promoters and uses thereof
US7262055B2 (en) 1998-08-25 2007-08-28 Gendaq Limited Regulated gene expression in plants
US5750868A (en) 1994-12-08 1998-05-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Reversible nuclear genetic system for male sterility in transgenic plants
CA2222615A1 (en) 1995-06-02 1996-12-05 Gururaj A. Rao High threonine derivatives of .alpha.-hordothionin
JPH11506329A (ja) 1995-06-02 1999-06-08 パイオニア ハイ−ブレッド インターナショナル，インコーポレイテッド α−ホルドチオニンの高メチオニン誘導体
US5837876A (en) 1995-07-28 1998-11-17 North Carolina State University Root cortex specific gene promoter
US5703049A (en) 1996-02-29 1997-12-30 Pioneer Hi-Bred Int'l, Inc. High methionine derivatives of α-hordothionin for pathogen-control
US5850016A (en) 1996-03-20 1998-12-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Alteration of amino acid compositions in seeds
US6072050A (en) 1996-06-11 2000-06-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Synthetic promoters
AU728086B2 (en) 1996-11-01 2001-01-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Proteins with enhanced levels of essential amino acids
US5981840A (en) 1997-01-24 1999-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for agrobacterium-mediated transformation
DE19750475C1 (de) 1997-11-14 1999-04-08 Treibacher Schleifmittel Ag Verfahren und Aggregat zur thermischen Behandlung von feinkörnigen Stoffen
US6262341B1 (en) 1997-11-18 2001-07-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method for the integration of foreign DNA into eukaryotic genomes
EP1032693A1 (en) 1997-11-18 2000-09-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. A method for directional stable transformation of eukaryotic cells
US5929301A (en) 1997-11-18 1999-07-27 Pioneer Hi-Bred International Nucleic acid sequence encoding FLP recombinase
EP1034286B1 (en) 1997-11-18 2010-01-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Mobilization of viral genomes from t-dna using site-specific recombination systems
FR2772787B1 (fr) 1997-12-24 2001-12-07 Rhone Poulenc Agrochimie Promoteur h3c4 de mais associe au premier intron de l'actine de riz, gene chimere le comprenant et plante transformee
ATE342985T1 (de) 1998-02-26 2006-11-15 Pioneer Hi Bred Int Mais alpha-tubulin 3-18 promoter
AU5898599A (en) 1998-08-19 2000-03-14 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for genomic modification
AU5489099A (en) 1998-08-20 2000-03-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Seed-preferred promoters
WO2000012733A1 (en) 1998-08-28 2000-03-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Seed-preferred promoters from end genes
EP1131454A2 (en) 1998-11-09 2001-09-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Transcriptional activator nucleic acids, polypeptides and methods of use thereof
HUP0300187A3 (en) 1999-04-29 2004-11-29 Syngenta Ltd Haslemere Herbicide resistant plants
AU5769700A (en) 1999-06-28 2001-01-31 Procter & Gamble Company, The Cosmetic compositions containing quaternary ammonium compounds
WO2001011058A1 (en) 1999-08-09 2001-02-15 Monsanto Technology Llc Novel cloning methods and vectors
US20070083945A1 (en) 2000-03-10 2007-04-12 Byrum Joseph R Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants
US6683231B2 (en) 2000-06-02 2004-01-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company High level production of p-hydroxybenzoic acid in green plants
US7612251B2 (en) * 2000-09-26 2009-11-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Nucleotide sequences mediating male fertility and method of using same
AU8786201A (en) 2000-09-29 2002-04-08 Syngenta Ltd Herbicide resistant plants
US7045684B1 (en) 2002-08-19 2006-05-16 Mertec, Llc Glyphosate-resistant plants
US6967263B2 (en) 2002-09-13 2005-11-22 Monsanto Technology, L.L.C. Soybean cultivar SN79525
US20040231016A1 (en) 2003-02-19 2004-11-18 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization Efficient gene silencing in plants using short dsRNA sequences
US8697817B2 (en) 2003-09-04 2014-04-15 Ticona Llc Manufacturing process for liquid crystalline polymer
DE602004018824D1 (de) 2003-11-18 2009-02-12 Bayer Bioscience Nv Verbesserte gezielte dna-insertion in pflanzen
US7935862B2 (en) 2003-12-02 2011-05-03 Syngenta Participations Ag Targeted integration and stacking of DNA through homologous recombination
CA2554644C (en) 2004-02-02 2015-06-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Ap2 domain transcription factor odp2 (ovule development protein 2) and methods of use
US7292055B2 (en) 2005-04-21 2007-11-06 Endicott Interconnect Technologies, Inc. Interposer for use with test apparatus
PT1885176T (pt) 2005-05-27 2016-11-28 Monsanto Technology Llc Evento mon89788 de soja e métodos para a sua deteção
US20070016985A1 (en) 2005-07-18 2007-01-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Particle Preparation for Direct-Delivery Transformation
BRPI0612862A2 (pt) * 2005-07-18 2010-11-30 Pioneer Hi Bred Int polinucleotìdeo isolado, método para obtenção de uma célula transformada, método para obtenção de uma planta transformada, método de produção de recombinação de dna de sìtio especìfico, biblioteca isolada, método de geração de biblioteca de moléculas e método para selecionar sìtio de recombinação frt modificado
DK2341149T3 (en) 2005-08-26 2017-02-27 Dupont Nutrition Biosci Aps Use of CRISPR-associated genes (Cas)
AU2006302969B2 (en) 2005-10-13 2011-09-22 Monsanto Technology, Llc Methods for producing hybrid seed
CA2651895C (en) 2006-05-09 2014-05-06 The Curators Of The University Of Missouri Plant artificial chromosome platforms via telomere truncation
CN101484581A (zh) 2006-05-09 2009-07-15 密苏里大学学监 通过端粒截短的植物人工染色体平台
KR101447300B1 (ko) 2006-08-11 2014-10-07 몬산토 테크놀로지 엘엘씨 안트라닐레이트 신타제의 엽록체를 표적으로 하는 발현에 의한 고-트립토판 옥수수의 생산
NZ578090A (en) 2006-12-29 2012-03-30 Dow Agrosciences Llc In vitro methods for the induction and maintenance of plant cell lines as single suspension cells with intact cell walls, and transformation thereof
CA2689345C (en) 2007-06-05 2017-07-11 Bayer Bioscience N.V. Methods and means for exact replacement of target dna in eukaryotic organisms
AU2008258254B2 (en) 2007-06-07 2014-07-03 Agriculture And Agri-Food Canada Nanocarrier based plant transfection and transduction
EP2568048A1 (en) 2007-06-29 2013-03-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for altering the genome of a monocot plant cell
SI2205749T1 (sl) 2007-09-27 2016-09-30 Dow Agrosciences, Llc Konstruirani proteini s cinkovim prstom, usmerjeni v 5-enolpiruvil-šikimat-3-fosfat-sintazne gene
JP5507459B2 (ja) 2007-10-05 2014-05-28 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー 植物細胞に分子性物質を移行させる方法
WO2009114321A2 (en) 2008-03-11 2009-09-17 Precision Biosciencs, Inc. Rationally-designed meganucleases for maize genome engineering
US8546553B2 (en) 2008-07-25 2013-10-01 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Prokaryotic RNAi-like system and methods of use
US20100076057A1 (en) 2008-09-23 2010-03-25 Northwestern University TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA
CA2747124C (en) 2008-12-17 2018-09-04 Dow Agrosciences Llc Targeted integration into the zp15 locus
US8293533B2 (en) 2008-12-19 2012-10-23 E.I. Du Pont De Nemours And Company Site-specific integration and stacking of transgenes in soybean via DNA recombinase mediated cassette exchange
EP2206723A1 (en) 2009-01-12 2010-07-14 Bonas, Ulla Modular DNA-binding domains
WO2010083178A1 (en) * 2009-01-16 2010-07-22 Monsanto Technology Llc Isolated novel nucleic acid and protein molecules from corn and methods of using those molecules to generate transgenic plants with enhanced agronomic traits
HRP20150564T1 (hr) 2009-04-07 2015-08-28 Dow Agrosciences Llc Nanoäśesticama posredovana sekvenca specifiäśnih nukleaza
IN2012DN04843A (zh) 2009-11-24 2015-09-25 Dow Agrosciences Llc
AU2010339404B2 (en) 2009-12-30 2016-01-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for the introduction and regulated expression of genes in plants
WO2011082310A2 (en) 2009-12-30 2011-07-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for targeted polynucleotide modification
US20110203012A1 (en) 2010-01-21 2011-08-18 Dotson Stanton B Methods and compositions for use of directed recombination in plant breeding
MX2012008486A (es) 2010-01-22 2012-08-17 Dow Agrosciences Llc Plataformas de aterrizaje diseñadas para el envio al objetivo del gen en las plantas.
AU2011207387B2 (en) 2010-01-22 2015-02-26 Corteva Agriscience Llc Excision of transgenes in genetically modified organisms
PH12012501491B1 (en) 2010-01-22 2019-06-28 Dow Agrosciences Llc Targeted genomic alteration
EP2550358A1 (en) 2010-03-22 2013-01-30 Philip Morris Products S.A. Modifying enzyme activity in plants
JP5922094B2 (ja) 2010-03-31 2016-05-24 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー 生体分子の植物細胞中への送達のための植物ペプチドγ−ゼイン
BR112012028805A2 (pt) 2010-05-10 2019-09-24 The Regents Of The Univ Of California E Nereus Pharmaceuticals Inc composições de endorribonuclease e métodos de uso das mesmas.
CA3065095C (en) 2010-07-07 2023-02-14 Dow Agrosciences Llc Method for introgressing a trait into a plant
WO2012006439A2 (en) 2010-07-07 2012-01-12 Dow Agrosciences Llc Production of functionalized linear dna cassette and quantum dot/nanoparticle mediated delivery in plants
BR112013024337A2 (pt) 2011-03-23 2017-09-26 Du Pont locus de traço transgênico complexo em uma planta, planta ou semente, método para produzir em uma planta um locus de traço transgênico complexo e construto de expressão
JP6067671B2 (ja) 2011-03-23 2017-01-25 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー 植物におけるイメージングおよび送達適用に適した量子ドット担体ペプチドコンジュゲート体
US20140113376A1 (en) 2011-06-01 2014-04-24 Rotem Sorek Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes
BR112013033176A2 (pt) 2011-06-21 2018-06-12 E I Du Pont De Nemouras And Company método para produzir uma modificação direcionada em um gene de fertilidade masculina, planta, molécula de ácido nucleio isolada, construto de expressão
CA2844101A1 (en) 2011-08-03 2013-02-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Methods and compositions for targeted integration in a plant
CN103981149A (zh) 2011-08-22 2014-08-13 拜尔作物科学公司 修饰植物基因组的方法和手段
US20130210151A1 (en) 2011-11-07 2013-08-15 University Of Western Ontario Endonuclease for genome editing
WO2013090734A1 (en) 2011-12-15 2013-06-20 Dow Agrosciences Llc Method for improved transformation using agrobacterium
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
AR089793A1 (es) 2012-01-27 2014-09-17 Du Pont Metodos y composiciones para generar locus de rasgos transgenicos complejos
WO2013141680A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Vilnius University RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
EP2847338B1 (en) * 2012-05-07 2018-09-19 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration of transgenes
CN104487577A (zh) 2012-05-18 2015-04-01 先锋国际良种公司 用于调控表达的诱导型启动子序列及使用方法
PT3241902T (pt) 2012-05-25 2018-05-28 Univ California Métodos e composições para modificação de adn alvo dirigida por arn e para modulação dirigida por arn de transcrição
KR102530118B1 (ko) 2012-07-25 2023-05-08 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 유도 ｄｎａ 결합 단백질 및 게놈 교란 도구 및 이의 적용
UA119135C2 (uk) 2012-09-07 2019-05-10 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб отримання трансгенної рослини
US20140096284A1 (en) 2012-10-01 2014-04-03 Iowa State University Research Foundation, Inc. Method for the delivery of molecules lyophilized onto microparticles to plant tissues
WO2014065596A1 (en) 2012-10-23 2014-05-01 Toolgen Incorporated Composition for cleaving a target dna comprising a guide rna specific for the target dna and cas protein-encoding nucleic acid or cas protein, and use thereof
CA2890160A1 (en) 2012-10-31 2014-05-08 Cellectis Coupling herbicide resistance with targeted insertion of transgenes in plants
CN108715602A (zh) 2012-12-06 2018-10-30 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 基于crispr的基因组修饰和调控
WO2014093479A1 (en) 2012-12-11 2014-06-19 Montana State University Crispr (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) rna-guided control of gene regulation
ES2553782T3 (es) 2012-12-12 2015-12-11 The Broad Institute, Inc. Ingeniería de sistemas, métodos y composiciones de guía optimizadas para manipulación de secuencias
WO2014093655A2 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
EP4234696A3 (en) 2012-12-12 2023-09-06 The Broad Institute Inc. Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
SG10201707569YA (en) 2012-12-12 2017-10-30 Broad Inst Inc Delivery, Engineering and Optimization of Systems, Methods and Compositions for Sequence Manipulation and Therapeutic Applications
EP2931899A1 (en) 2012-12-12 2015-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
KR20150105634A (ko) 2012-12-12 2015-09-17 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 서열 조작을 위한 개선된 시스템, 방법 및 효소 조성물의 유전자 조작 및 최적화
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
DK2784162T3 (en) 2012-12-12 2015-07-13 Broad Inst Inc Design of systems, methods and optimized control manipulations for sequence manipulation
WO2014093694A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation in eukaryotes
AR093980A1 (es) * 2012-12-13 2015-07-01 Dow Agrosciences Llc Genes de precision que tienen como objetivo un locus particular en el maiz
DK3553174T3 (da) 2012-12-17 2025-08-04 Harvard College Rna-guided modificering af humant genom
JP6491113B2 (ja) 2013-02-25 2019-03-27 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド ヌクレアーゼ媒介性遺伝子破壊を増強するための方法および組成物
WO2014164466A1 (en) 2013-03-12 2014-10-09 E. I. Du Pont De Nemours And Company Methods for the identification of variant recognition sites for rare-cutting engineered double-strand-break-inducing agents and compositions and uses thereof
NZ712727A (en) 2013-03-14 2017-05-26 Caribou Biosciences Inc Compositions and methods of nucleic acid-targeting nucleic acids
EP3744842A1 (en) 2013-03-15 2020-12-02 The General Hospital Corporation Using truncated guide rnas (tru-grnas) to increase specificity for rna-guided genome editing
HK1214306A1 (zh) 2013-03-15 2016-07-22 Regents Of The University Of Minnesota 采用crispr/cas系统的植物基因组的工程改造
US9234213B2 (en) 2013-03-15 2016-01-12 System Biosciences, Llc Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems
US10113162B2 (en) 2013-03-15 2018-10-30 Cellectis Modifying soybean oil composition through targeted knockout of the FAD2-1A/1B genes
CN115261411A (zh) 2013-04-04 2022-11-01 哈佛学院校长同事会 利用CRISPR/Cas系统的基因组编辑的治疗性用途
WO2014186686A2 (en) 2013-05-17 2014-11-20 Two Blades Foundation Targeted mutagenesis and genome engineering in plants using rna-guided cas nucleases
US20150067922A1 (en) 2013-05-30 2015-03-05 The Penn State Research Foundation Gene targeting and genetic modification of plants via rna-guided genome editing
CN110819658B (zh) 2013-07-10 2024-03-22 哈佛大学校长及研究员协会 用于RNA向导的基因调节和编辑的正交Cas9蛋白
WO2015021426A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 Sage Labs, Inc. A crispr/cas system-based novel fusion protein and its application in genome editing
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
MX2016002118A (es) * 2013-08-22 2016-06-28 Du Pont Modificacion del genoma de plantas por medio del uso de sistemas de ácido ribonucléico (arn) guía/ endonucleasa cas y metodos de uso.
CA2916060A1 (en) * 2013-08-27 2015-03-05 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides, and methods of using same for increasing plant yield and/or agricultural characteristics
CA2922823C (en) 2013-09-04 2023-01-17 Dow Agrosciences Llc Rapid targeting analysis in crops for determining donor insertion
AU2014341929B2 (en) 2013-11-04 2017-11-30 Corteva Agriscience Llc Optimal maize loci
JP6634022B2 (ja) 2013-11-04 2020-01-22 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー 最適なダイズ遺伝子座
BR102014027466B1 (pt) 2013-11-04 2022-09-27 Dow Agrosciences Llc Molécula de ácido nucleico recombinante, método para produzir uma célula vegetal transgênica e usos de uma planta de soja, parte de planta de soja ou célula de planta de soja transgênica
EP3066110B1 (en) 2013-11-04 2021-12-29 Corteva Agriscience LLC Optimal maize loci
CN105683357B (zh) 2013-11-04 2020-10-30 美国陶氏益农公司 用于基因打靶的通用供体系统
US20160298096A1 (en) 2013-11-18 2016-10-13 Crispr Therapeutics Ag Crispr-cas system materials and methods
US20150165054A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting caspase-9 point mutations
CA2936646C (en) 2014-01-24 2024-04-30 North Carolina State University Methods and compositions for sequences guiding cas9 targeting
US11186843B2 (en) 2014-02-27 2021-11-30 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for site directed genomic modification
WO2015189693A1 (en) 2014-06-12 2015-12-17 King Abdullah University Of Science And Technology Targeted viral-mediated plant genome editing using crispr/cas9
CA2954686A1 (en) 2014-07-11 2016-01-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Agronomic trait modification using guide rna/cas endonuclease systems and methods of use
BR112017000482A2 (pt) 2014-07-11 2017-11-07 Du Pont métodos para produzir uma planta mutante e para gerar uma planta, planta, semente, rna, métodos para produzir uma célula, para duplicar um fragmento gênico, para substituir uma primeira sequência promotora, para inserir um elemento regulador em uma sequência de nucleotídeos e para inserir um íntron em uma sequência de nucleotídeos, planta de milho e célula vegetal
EP3186375A4 (en) 2014-08-28 2019-03-13 North Carolina State University Novel CAS9 PROTEINS AND CHARACTERISTICS FOR DNA TARGETING AND GENOME EDITING
MX2017002930A (es) 2014-09-12 2017-06-06 Du Pont Generacion de sitios de integracion especifica de sitio para loci de rasgos complejos en maiz y soja, y metodos de uso.
PL3250691T3 (pl) 2015-01-28 2023-11-27 Caribou Biosciences, Inc. Hybrydowe polinukleotydy dna/rna crispr i przydatne sposoby
WO2016137774A1 (en) 2015-02-25 2016-09-01 Pioneer Hi-Bred International Inc Composition and methods for regulated expression of a guide rna/cas endonuclease complex
CN107429258A (zh) 2015-03-19 2017-12-01 先锋国际良种公司 用于加速的性状渐渗的方法和组合物
US10450576B2 (en) 2015-03-27 2019-10-22 E I Du Pont De Nemours And Company Soybean U6 small nuclear RNA gene promoters and their use in constitutive expression of small RNA genes in plants
WO2016186953A1 (en) 2015-05-15 2016-11-24 Pioneer Hi Bred International Inc Guide rna/cas endonuclease systems
DE102015006335A1 (de) 2015-05-19 2016-11-24 Kws Saat Se Verfahren und Konstrukte zur gezielten Nukleinsäure Editierung in Pflanzen
WO2016196738A1 (en) 2015-06-02 2016-12-08 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for delivery of a polynucleotide into a plant
WO2017015015A1 (en) 2015-07-17 2017-01-26 Emory University Crispr-associated protein from francisella and uses related thereto
AR105776A1 (es) 2015-08-21 2017-11-08 Monsanto Technology Llc Recombinación mejorada de loci genómicos
CA3000917A1 (en) 2015-10-09 2017-04-13 Monsanto Technology Llc Rna-guided nucleases and uses thereof
EP4089175A1 (en) 2015-10-13 2022-11-16 Duke University Genome engineering with type i crispr systems in eukaryotic cells
JP2018531024A (ja) 2015-10-20 2018-10-25 パイオニア ハイ−ブレッド インターナショナル， イン マーカーフリーゲノム改変のための方法および組成物
US20180258438A1 (en) 2015-11-06 2018-09-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Generation of complex trait loci in soybean and methods of use
EP3397757A4 (en) 2015-12-29 2019-08-28 Monsanto Technology LLC Novel CRISPR-ASSOCIATED TRANSPOSASES AND USES THEREOF
EP3426778A1 (en) 2016-03-11 2019-01-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel cas9 systems and methods of use
US20190161742A1 (en) 2016-03-11 2019-05-30 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel cas9 systems and methods of use
WO2017155715A1 (en) 2016-03-11 2017-09-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel cas9 systems and methods of use
GB201610041D0 (en) 2016-06-08 2016-07-20 Oxford Genetics Ltd Methods
CN109312317A (zh) 2016-06-14 2019-02-05 先锋国际良种公司 Cpf1内切核酸酶用于植物基因组修饰的用途
CA3018430A1 (en) 2016-06-20 2017-12-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel cas systems and methods of use
EP3601576A1 (en) 2017-03-24 2020-02-05 CureVac AG Nucleic acids encoding crispr-associated proteins and uses thereof

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112481259A (zh) * 2020-11-24 2021-03-12 南昌大学 两种甘薯U6基因启动子IbU6的克隆与应用
CN112481259B (zh) * 2020-11-24 2022-09-16 南昌大学 两种甘薯U6基因启动子IbU6的克隆与应用

Also Published As

Publication number Publication date
US20230212595A1 (en) 2023-07-06
US20180230476A1 (en) 2018-08-16
MX2017002930A (es) 2017-06-06
US20250122513A1 (en) 2025-04-17
WO2016040030A1 (en) 2016-03-17
EP3191595B1 (en) 2019-12-25
US11560568B2 (en) 2023-01-24
EP3191595A1 (en) 2017-07-19
BR112017003757A2 (pt) 2017-12-26
RU2017112324A (ru) 2018-10-15
US12173294B2 (en) 2024-12-24
CA2956487A1 (en) 2016-03-17
AR101847A1 (es) 2017-01-18
EP3628739A1 (en) 2020-04-01
EP3628739B1 (en) 2024-05-01
AU2015315651A1 (en) 2017-02-16
IL250256A0 (en) 2017-03-30
RU2017112324A3 (zh) 2019-03-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12173294B2 (en) Generation of site specific integration sites for complex trait loci in corn and soybean, and methods of use
US12378566B2 (en) Plant genome modification using guide RNA/Cas endonuclease systems and methods of use
US20220364107A1 (en) Agronomic trait modification using guide rna/cas endonuclease systems and methods of use
EP3270685B1 (en) Methods and compositions for accelerated trait introgression
CN107406858A (zh) 用于指导rna/cas内切核酸酶复合物的调节型表达的组合物和方法
US20180258438A1 (en) Generation of complex trait loci in soybean and methods of use
US12054725B2 (en) U6 polymerase III promoter and methods of use

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20180522

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication