CN108004308A - miRNA203在制备治疗糖尿病难愈创面药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体涉及miRNA203在制备治疗糖尿病难愈创面药物中的应用，本发明拟以DM创面在体模型及ESCs离体培养模型为基础，分别对miRNA203表达特点、ESCs功能改变、愈合相关信号通路及基因表达变化进行研究，进一步地研究干预miRNA203对ESCs功能、愈合相关信号通路及基因表达的影响，并研究miRNA203对DM大鼠创面愈合的作用，最后通过基因表达谱芯片技术初步分析并预测miRNA203的新靶基因及潜在信号通路，为临床探索通过靶向干预miRNA203调控ESCs增殖促进DM慢性创面愈合提供理论基础和新的治疗靶点。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及miRNA203在制备治疗糖尿病难愈创面药物中的应用。
背景技术
糖尿病（diabetes mellitus，DM）慢性难愈创面（俗称溃疡）是DM患者的严重并发症之一，发生率高，预后差，不仅给患者身心造成很大痛苦，也给家庭和社会带来沉重的负担。因此，深入研究DM创面难愈的机制和治疗措施具有重要意义。迄今为止，DM创面难愈的机制尚不完全清楚，临床也缺乏特别有效的治疗方法。DM难愈创面的治疗已成为目前临床非常棘手的难题。
近十几年来，国内外学者从多个角度对DM难愈创面的病因机制进行了很多探索，并提出DM创面难愈与糖代谢紊乱、晚期糖基化终末产物增多、微血管改变、EGF受体改变、基质金属蛋白酶（MMPs）表达异常，特别是表皮细胞增殖障碍致创面再上皮化延迟等因素有关。随着研究的深入，表皮干细胞（ESCs）在DM创面的愈合作用逐渐引起人们的关注。作为创面再上皮化的主要修复细胞，ESCs具有强大增殖和多向分化潜能，其增殖、黏附、迁移、细胞外基质合成等活动参与愈合过程的不同阶段。
已证实干细胞的增殖和分化是受众多基因时空上精准有序的表达调控。miRNA是一种真核细胞内非蛋白质编码的约22个核苷酸的单链小RNA，其作用机制是通过降解mRNA或抑制蛋白质翻译而负性调控基因表达。它作为一类小分子的基因表达的调节者, 几乎参与了人体一切重要生命活动和所有疾病发病过程的调节。 近年它在维持干细胞多能性和增殖分化方面的调控作用是最受关注的热点之一。
皮肤发育和创面愈合的每个特定阶段都需要在时空上有精准的基因表达调控。有关皮肤特异表达的小分子非编码RNA（miRNA）的研究进展为DM难愈创面的机制研究开拓了新思路。包括本课题组在内的研究结果证实，一些miRNA特别是miRNA203与ESCs的增殖、分化、功能和病理改变密切相关。而ESCs是创面修复的关键性功能细胞，参与愈合过程的每个阶段。因此，皮肤中特异的miRNA表达异常可能导致ESCs的增殖分化功能失调而在DM难愈创面的愈合中起重要作用。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明通过模拟动物试验建立miRNA203表达功能型和抑制型转基因DM鼠创伤模型，在体验证miRNA203对DM创面愈合的影响等方面，提出一种能够直接治疗DM创面愈合的方法，能有效促进DM创面的愈合。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
miRNA203在制备治疗糖尿病难愈创面药物中的应用，所述miRNA203的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
所述治疗糖尿病难愈创面药物包含miRNA203抑制剂。
所述miRNA203抑制剂能够抑制miRNA203的表达或者能够抑制miRNA203的功能。
所述miRNA203抑制剂是miRNA203的反义寡核苷酸或拮抗剂。
所述miRNA203抑制剂是miRNA203的反义寡核苷酸或拮抗剂。
所述药物包含权利要求2-5任一项所述miRNA203抑制剂。
所述药物还包括药学上可接受的载体。
对所述药物效果的检测方法包括检测抑制所述miRNA203表达量对大鼠创面愈合的时间和速度的影响。
对所述药物效果的检测方法包括检测抑制所述miRNA203表达量对ESCs表面标记物表达量的影响。
对所述药物效果的检测方法包括检测抑制所述miRNA203表达对愈合相关通路蛋白表达量的影响。
所述抑制miRNA203是对大鼠皮下注射antagomir，所述antagomir是经特殊标记和化学修饰的miRNA203 antagomir，通过细胞转染进入细胞起到抑制miRNA203表达的作用；
所述创面愈合的计算是指计算残余创面率，即：第n天创面面积百分比=第n天创面面积/第0天创面面积。
本发明的有益效果为：
本发明证实了作为皮肤特异性表达的miRNA，miRNA203与DM创面难愈存在密切联系，其可能机制是miRNA203高表达，导致ESCs增殖能力受到抑制，ESCs数量减少，进而促使了DM创面难愈的形成。从理论上探讨miRNA203调控ESCs增殖及在DM难愈创面愈合中的作用机制，实践上为DM难愈创面的防治提供新的思路，为临床探索通过靶向干预miRNA203调控ESCs增殖促进DM慢性创面愈合提供理论基础和新的治疗靶点。
附图说明
图1、各组miRNA203表达量对比；
图2、空质粒载体组与抑制miRNA203载体组大鼠创面愈合情况，STZ+NC：空质粒载体；miRNA203 antagomir：抑制miRNA203载体组；
图3、应用RT-PCR检测伤后第4d空质粒载体组与抑制miRNA203载体组大鼠创缘miRNA203表达情况，STZ+NC：空质粒载体；miRNA203 antagomir：抑制miRNA203载体组；
图4、应用RT-PCR检测伤后第4d空质粒载体组与抑制miRNA203载体组大鼠创缘ESCs增殖相关蛋白表达情况，STZ+NC：空质粒载体；miRNA203 antagomir：抑制miRNA203载体组；
图5、应用RT-PCR检测伤后第4d空质粒载体组与抑制miRNA203载体组大鼠创缘愈合相关通路蛋白表达情况,STZ+NC：空质粒载体；miRNA203 antagomir：抑制miRNA203载体组;
图6、应用IHC检测伤后第4d空质粒载体组与抑制miRNA203载体组大鼠创缘愈合相关蛋白P63表达情况，STZ+NC：空质粒载体；miRNA203 antagomir：抑制miRNA203载体组；
图7、应用IHC检测伤后第4d空质粒载体组与抑制miRNA203载体组大鼠创缘愈合相关蛋白Notch1表达情况，STZ+NC：空质粒载体；miRNA203 antagomir：抑制miRNA203载体组；
图8、应用IHC检测伤后第4d空质粒载体组与抑制miRNA203载体组大鼠创缘愈合相关蛋白Wnt5a表达情况，STZ+NC：空质粒载体；miRNA203 antagomir：抑制miRNA203载体组。
图9、应用IHC检测伤后第4d空质粒载体组与抑制miRNA203载体组大鼠创缘愈合相关蛋白β-catenin表达情况，STZ+NC：空质粒载体；miRNA203 antagomir：抑制miRNA203载体组；
图10、应用RT-PCR检测伤后第4d空质粒载体组与抑制miRNA203载体组大鼠创缘愈合相关基因表达情况，STZ+NC：空质粒载体；miRNA203 antagomir：抑制miRNA203载体组；
图11、应用HE检测伤后第4d空质粒载体组与抑制miRNA203载体组大鼠创面愈合质量，STZ+NC：空质粒载体；miRNA203 antagomir：抑制miRNA203载体组。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图。对本发明进一步详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。应当指出的是，对本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施本发明的过程、条件、试剂、试验方法等，除以下专门提及的内容外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1：不同皮肤组织中miRNA203相对表达量的分析
（1）样品采集及实验分组：
于手术中收集46例由创缘切除的全层皮肤组织标本，其中6例为男性，年龄2-21岁，取自非DM患者正常创面创缘皮肤；其余40例中男性32例，女性8例，年龄4岁-89岁，DM病程1-30年，DM足病病程1-24月，取自2型DM患者正常创面创缘皮肤。所有病人均由同一治疗小组诊断、分级及制定标准化的治疗方案，在参与此项研究之前，所有患者均已签署知情同意书，此项研究已通过中山大学伦理委员会批准。
将正常创面皮肤组织定义为对照组（Controlgroup，CG）6例；采用Strauss评分型分级系统对所有40份DM创面皮肤组织进行严重程度评分分级，根据总分值将DM创面皮肤组织分为三个组，即8-10分为“健康伤口（Healthywound，HW）”组（4例），4-7分为“问题伤口（Problemwound，PW）”组（22例），0-3分为“无效伤口（Futilewound，FW）”组（14例）。0分到10分的范围，10分代表最好，0分代表最差。即DM创面严重程度由轻到重依次是：健康伤口组、问题伤口组、无效伤口组。
（2）RNA的提取：
取组织标本40mg，4℃ PBS洗一次，加入1ml Trizol（25mg-50mg）后剪碎组织，玻璃匀浆器匀浆15次，收集到EP管内，室温静置5min，以保证充分裂解，将装有组织混悬液EP管置于离心机，12000rpm 4℃离心15min。然后吸取上清液，转移至新的EP管，按RNA提取试剂盒步骤提取RNA。所提取样品RNA的OD260／OD280。的比值应在1.8-2.0之间。
（3）miRNA逆转录
按反转录试剂盒，用逆转录缓冲液对2μg总RNA进行逆反录合成cDNA。在PCR管中分别加入以下组分：M-MLV Reverse Transcriptase 1 μl，RNA 2μg，Primer Mix 1 μl混匀后70℃变性5min，然后迅速放到冰水混合物中冷却，之后再加入5×buffer 5μl， 2mM dNTP 6.25μl，M-MLV 1 μl，RNase-free water 12.75 μl，42℃水浴60min，冰上放置5min，短暂离心，cDNA存放于-20℃冰箱备用。
（4）引物合成
引物序列由Promega试剂商提供并验证，引物分别如下
| hsa-U6-F | CTCGCTTCGGCAGCACA（SEQ ID NO:2） |
| hsa-U6-R | AACGCTTCACGAATTTGCGT（SEQ ID NO:3） |
| hsa-mir203-RT | GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTAGTG（SEQ ID NO:4） |
| hsa-mir203-F | GCGGTGAAATGTTTAGGAC（SEQ ID NO:5） |
（5）RT-PCR实验扩增
根据供应商的协议书通过应用MiniOpticon™ Real-Time PCR仪上面的凝胶成像系统并在Promega提供的GoTaq® qPCR Master Mix帮助下进行实时定量RT-PCR实验。最终的复合物是由0.5 μM的引物、10 μl的GoTaq® qPCR Master Mix以及1.5 μl的模板DNA组成。设置循环参数为95°C 30s下变性、95°C 15s下循环40次、60°C 60s下延伸。包括没有模板的对照试验在内的所有RT-PCR试验均独立重复三次完成。
（6）产物分析
目标基因的相对表达量计算公式为：2-△△Ct=2-【（△Ct）Test-（△Ct）Control】。Ct目的为目标基因Ct值，Ct管家为管家基因Ct值。△Ct=Ct目的-Ct管家，表示各样本目的基因相对管家基因的相对Ct值，△△Ct=（△Ct）Test-（△Ct）Control，表示处理组相对对照组进行归一化，2-△△Ct表示处理组相对对照组的相对表达量，表示目标基因相对表达倍数。
检测结果见表1，正常伤口创缘皮肤组织（CG）miRNA203表达量最低；DM足溃疡组创缘皮肤组织miRNA203表达量均明显增高；在DM足溃疡各分组内，健康伤口组（HW）创缘皮肤组织miRNA203表达量最低，问题伤口组（PW）创缘皮肤组织miRNA203表达量较健康伤口组（HW）增高，无效伤口组（FW）创缘皮肤组织miRNA203表达量最高。
表1正常伤口与糖尿病足不同严重程度分组创缘皮肤组织miRNA203表达量
| 分组 | miRNA203表达量 |
| 正常皮肤组（CG） | 3.47±2.89 |
| 健康伤口组（HW） | 16.68±4.63 |
| 问题伤口组（PW） | 24.01±4.35 |
| 无效伤口组（PW） | 80.25±6.02 |
实施例2：miRNA203表达量与不同严重程度DM足之间的关系
实验方法同实施例1。
经Graph Pad Prism6统计软件及One-way ANOVA方法分析（图1），结果得出，随着DM足溃疡严重程度的增加，创缘皮肤组织miRNA203表达量也逐渐增高，P＜0.05，差异具有统计学意义。
结果表明：DM足溃疡创缘皮肤组织高表达miRNA203，并且随着DM足溃疡严重程度增加，皮肤组织miRNA203表达量增高。这提示我们皮肤组织miRNA203的高表达可能与DM足溃疡的难愈密切相关。另外根据研究结果，我们推测，miRNA203有可能成为临床上评估DM足溃疡严重程度的新指标。
实施例3：抑制miRNA203表达对大鼠创面愈合的时间和速度的影响
（1）DM模型建立：
24只SD大鼠，随机分为两组；一组为正常组大鼠（12只），另一组为DB大鼠（12只）；
大鼠注射STZ前禁食12-24h。禁食时间越长，STZ对胰岛素的破坏力越明显。禁食时更换垫料。
配备1%-2%浓度柠檬酸盐缓冲液，30min内使用完毕。
STZ溶入柠檬酸盐缓冲液。
以40mg/kg的剂量体重大鼠腹腔注射。
于24h、48h空腹测尾静脉血糖高于16.7mmol/L，并出现多饮、多尿、多食、体质量减轻，视为模型成功。
继续每周检测血糖水平。未成模鼠待恢复正常状态后可再重新造模。
（2）实验方法
根据试剂商提供的miRNA203antagomir与空载体antagomir，分别设为实验组和对照组。观察并记录两组实验大鼠创面愈合情况，记录创面愈合情况。
所述创面愈合的计算是指计算残余创面率，即：第n天创面面积百分比=第n天创面面积/第0天创面面积。
（3）结果
与注射空质粒载体对照组相比，在伤后第4、8、16d，抑制miRNA203表达组DM大鼠残余创面明显减少；在伤后16d，抑制miRNA203表达组DM大鼠创面基本愈合，而对照组创面未愈合（图2）。
实施例4：抑制剂对miRNA203表达量的影响
根据试剂商提供的miRNA203 antagomir与空载体antagomir，分别设为实验组和对照组。
参照实施例1中（3）和（5）进行RNA的提取及RT-PCR的扩增，检测两组大鼠皮肤组织miRNA203表达量。
结果表明：在伤后第4d，与注射空质粒载体对照组相比，注射抑制miRNA203表达组DM大鼠创缘皮肤组织miRNA203明显低表达水平（图3），说明抑制剂确切有效。
实施例5：抑制miRNA203表达对ESCs表面标记物表达量的影响
试验方法与分组同实施例3。
与注射空质粒载体对照组相比，注射抑制miRNA203表达组DM大鼠创缘皮肤组织ESCs增殖能力标记物明显高表达（图4），说明ESCs增殖能力增强。
实施例6：抑制miRNA203表达对愈合相关通路蛋白表达量的影响
试验方法与分组同实施例3。
与注射空质粒载体对照组相比，注射抑制miRNA203表达组DM大鼠创缘皮肤组织愈合相关通路蛋白明显高表达（图5、6、7、8、9），说明愈合能力改善。
实施例7：抑制miRNA203表达对愈合相关基因表达量的影响
试验方法与分组同实施例3。
与注射空质粒载体对照组相比，注射抑制miRNA203表达组DM大鼠创缘皮肤组织愈合相关基因明显高表达（图10），说明愈合能力改善；
实施例8：抑制miRNA203表达对miRNA203靶基因表达量的影响。试验方法与分组同实施例3。
与注射空质粒载体对照组相比，注射抑制miRNA203表达组DM大鼠创缘皮肤组织miRNA203靶基因明显高表达（图11），说明愈合能力改善。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 中山大学附属第一医院
<120> miRNA203在制备治疗糖尿病难愈创面药物中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctcgcttcgg cagcaca 17
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aacgcttcac gaatttgcgt 20
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacctagtg 50
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcggtgaaat gtttaggac 19
Claims (9)
1.miRNA203在制备治疗糖尿病难愈创面药物中的应用，其特征在于，所述miRNA203的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述治疗糖尿病难愈创面药物包含miRNA203抑制剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述miRNA203抑制剂能够抑制miRNA203的表达或者能够抑制miRNA203的功能。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述miRNA203抑制剂是miRNA203的反义寡核苷酸或拮抗剂。
5.一种治疗糖尿病难愈创面药物，其特征在于：所述药物包含权利要求2-4任一项所述miRNA203抑制剂。
6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于：所述药物还包括药学上可接受的载体。
7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于：对所述药物效果的检测方法包括检测抑制所述miRNA203表达量对大鼠创面愈合的时间和速度的影响。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：对所述药物效果的检测方法包括检测抑制所述miRNA203表达量对ESCs表面标记物表达量的影响。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：对所述药物效果的检测方法包括检测抑制所述miRNA203表达对愈合相关通路蛋白表达量的影响。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN109966496A (zh) * | 2018-07-09 | 2019-07-05 | 中山大学 | miRNA-5571在制备抗结直肠肿瘤药物中的应用 |
| CN118792398A (zh) * | 2024-08-27 | 2024-10-18 | 广州市东源药业科技有限公司 | 慢性难愈合创面的诊断标志物及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011017697A1 (en) * | 2009-08-07 | 2011-02-10 | New York University | Compositions and methods for treating inflammatory disorders |
| CN104684563A (zh) * | 2012-07-27 | 2015-06-03 | 科技研究局(A*Star) | 促进伤口愈合的方法 |
-
2017
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011017697A1 (en) * | 2009-08-07 | 2011-02-10 | New York University | Compositions and methods for treating inflammatory disorders |
| CN104684563A (zh) * | 2012-07-27 | 2015-06-03 | 科技研究局(A*Star) | 促进伤口愈合的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| JIAN LIU等: "Quantification of the differential expression levels of microRNA-203 in different degrees of diabetic foot", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF CLINICAL & EXPERIMENTAL PATHOLOGY》 * |
| 宋向卫等: "微小RNA在创面愈合中的作用", 《中华创伤杂志》 * |
| 李燕等: "《精编分子生物学实验技术》", 30 September 2017, 世界图书出版西安有限公司 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109966496A (zh) * | 2018-07-09 | 2019-07-05 | 中山大学 | miRNA-5571在制备抗结直肠肿瘤药物中的应用 |
| CN109966496B (zh) * | 2018-07-09 | 2021-06-25 | 中山大学 | miRNA-5571在制备抗结直肠肿瘤药物中的应用 |
| CN118792398A (zh) * | 2024-08-27 | 2024-10-18 | 广州市东源药业科技有限公司 | 慢性难愈合创面的诊断标志物及其应用 |
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