CN107988246A - 一种基因敲除载体及其斑马鱼胶质瘤模型 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基因敲除载体及其斑马鱼胶质瘤模型，该基因敲除载体为将目的序列连入可表达CRISPR‑Cas9基因编辑系统相关酶的质粒获得，该目的基因为p53、Rb1或Nf1基因。本发明利用CRISPR/CAS9技术，靶向敲除rb1、nf1和tp53基因，建立的转基因诱导恶性胶质瘤斑马鱼模型，可以通过实时荧光观察恶性胶质瘤的发生、肿瘤诱导血管生成、胶质瘤干细胞发生过程，并通过分子生物学技术探讨不同遗传背景条件下胶质瘤的发病机制差异。

Description

一种基因敲除载体及其斑马鱼胶质瘤模型

技术领域

本发明涉及CRISPR/Cas9的基因修饰技术领域，特别是涉及利用该技术在不破坏基因的情况下使用内源性启动子诱导荧光蛋白表达的方法，具体涉及一种基因敲除载体及其斑马鱼胶质瘤模型。

背景技术

CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR-associated nuclease 9)基因编辑系统是基于古细菌抵御外源核酸入侵的免疫机制为基础开发出来的一种新型的基因编辑技术。相对于传统的基因编辑系统，该系统具有突变效率高、制作简单及成本低的特点。目前该技术成功应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因组精确修饰，修饰类型包括基因定点敲除、基因定点敲入、两位点同时突变和小片段的缺失。

近年来，随着基因测序技术和高通量基因芯片技术的发展，大量研究发现恶性胶质瘤的发生伴随着大量的染色体异常和基因突变。2009年，癌症与肿瘤基因图谱计划(TheCancer Genome Atlas；TCGA)发现在超过200个人恶性胶质瘤病理样本中，通过分析DNA甲基化、DNA拷贝数的变化，以及胶质瘤相关编码蛋白及非编码蛋白基因表达水平，研究显示，与胶质瘤发生最为相关的三个信号通路分别是p53信号通路、Rb信号通路和RTK/PI3K/Akt信号通路。这三种信号通路主要与细胞增殖，包括肿瘤细胞免疫逃逸和细胞周期检查点(checkpoint)相关的细胞生存、衰老，以及细胞凋亡相关(见图1A和图1B)。

RTK和PI3K/Akt信号通路组成的跨膜蛋白，通常具有介导多种生长因子表达水平的酪氨酸激酶活性(图1A)。有文献表明，多个RTK的配体如血管内皮生长因子(EGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)以及血小板衍生生长因子受体(PDGFR)均与恶性胶质瘤的发生相关。其中，EGFR是一种RTK配体的共同靶基因，大约有40％的原发性恶性胶质瘤中都有发现其突变，同时，EGFR的表达异常往往与p53基因突变相关。在已报道的包含有基因突变的恶性胶质瘤病例中，大约有88％的病例具有PI3K基因突变。在这一信号通路中，其上游Nf1抑癌基因的抑制可以激活PI3K/Akt信号通路，最终导致多种恶性肿瘤的形成。

在恶性胶质瘤发生过程中，另一种关键的信号通路为p53信号通路(图1B)。作为最经典的肿瘤抑制基因，p53在恶性胶质瘤的发生发展中起重要的作用。p53可以调控多个控制DNA修复、细胞周期、凋亡和进展的基因表达水平。p53的突变常常可以发展出各种肿瘤，包括恶性胶质瘤，同时，原发性p53肿瘤细胞突变可以极大地促进肿瘤转化和生长的易感性。然而，无论是p53杂合子(p53^-/+)或是p53纯合子(p53^-/-)转基因小鼠，均不能发展为星形细胞瘤，提示仅仅p53的突变并不足以介导肿瘤的形成，可能需要额外的表观遗传学(或遗传学)事件介导肿瘤的生成。Rb信号通路主要包括若干肿瘤抑制基因(图1B)，可以调控一系列肿瘤相关因子的表达水平。在恶性胶质瘤中，大约有40-70％的病例与Rb信号通路相关基因的突变有关。这一信号通路主要与DNA的修复和复制、细胞分化、细胞凋亡、细胞周期的调控等生物学事件相关。已有研究表明，Rb信号通路介导的遗传学和表观遗传学的调控与多种肿瘤的发生发展具有密切的关系。

综上所述，p53信号通路、Rb信号通路和RTK/PI3K/Akt信号通路是导致恶性胶质瘤发生、发展的最为关键信号通路。有研究表明，90％以上的恶性胶质瘤病例中发现至少有其中有一条通路失活，提示这三个信号通路可能是恶性胶质瘤治疗的关键性靶点。

之前，Chow等进行了构建转基因胶质瘤小鼠的研究，在该报道中，当Nf1、p53和Pten三个基因都被敲除后，100％的小鼠产生了胶质瘤，而且大多是恶性程度很高的肿瘤。尽管胶质瘤转基因小鼠中目前在研究肿瘤发病机制中发挥重要作用，但其胚胎发育的特点并不利于实时观察肿瘤发生的过程。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基因敲除载体及其斑马鱼胶质瘤模型，用于解决现有技术中基于胶质瘤的动物模型容易导致动物胚胎致死、难以适用于阐述不同遗传背景的胶质瘤患者发病机制等问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种基因敲除载体，所述基因敲除载体为将目的序列连入可表达CRISPR-Cas9基因编辑系统相关酶的质粒获得，所述目的序列选自如下序列中的至少一种：

rb1:TGCATGGAGAATATGGGAGA；

nf1:GGCGCACAAGCCCGTGGAAT；

tp53:TGATTGTGAGGATGGGCCTG。

在本发明的一些实施例中，所述可表达CRISPR-Cas9基因编辑系统相关酶的质粒为Cas9-pXT7质粒。

在本发明的一些实施例中，所述基因敲除载体还含有标记基因mCherry。

在本发明的一些实施例中，所述基因敲除载体还含有GFAP启动子启动的CAS9蛋白序列、融合蛋白P2A序列、标记基因mCherry、U6启动子启动的gRNA。

在本发明的一些实施例中，所述基因敲除载体序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明第二方面提供上述基因敲除载体在构建胶质瘤动物模型中的用途。

在本发明的一些实施例中，所述动物模型包括鱼、鼠、兔。

在本发明的一些实施例中，所述动物模型为斑马鱼。

本发明第三方面提供一种建立斑马鱼胶质瘤模型的方法，包括如下步骤：

1)确立p53、Rb1和Nf1基因打靶位点以及打靶序列，合成gRNA；

p53、Rb1和Nf1基因含有如下目标序列：

rb1:TGCATGGAGAATATGGGAGA；

nf1:GGCGCACAAGCCCGTGGAAT；

tp53:TGATTGTGAGGATGGGCCTG；

2)构建基因敲除转座重组载体；

3)将基因敲除转座重组载体和Tol2mRNA共同注射入斑马鱼单细胞期受精卵中，实现目的基因整合进入基因组；

4)筛选并鉴定出能够稳定敲除上述三种基因的纯种斑马鱼；

5)筛选出双基因或多基因敲除的纯系斑马鱼。

在本发明的一些实施例中，步骤2)中，所述重组载体包括GFAP启动子启动的CAS9蛋白序列、融合蛋白P2A序列、标记基因mCherry、U6启动子启动的gRNA。

在本发明的一些实施例中，步骤2)中，所述重组载体序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一些实施例中，步骤2)中所构建的重组载体Cas9的启动子为GFAP，序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一些实施例中，步骤2)中所构建的重组载体的筛选基因为红色荧光蛋白mCherry，序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一些实施例中，步骤2)中所构建的重组载体靶位点的启动子为U6启动子，序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一些实施例中，步骤1)中，构建打靶序列gRNA时，合成的引物包括：

rb1-gRNA-F:TAATACGACTCACTATAGGGTGCATGGAGAATATGGGAGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；

nf1-gRNA-F:TAATACGACTCACTATAGGGGCGCACAAGCCCGTGGAATGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；

tp53-gRNA-F:TAATACGACTCACTATAGGGTGATTGTGAGGATGGGCCTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；

gRNA-R:AGCACCGACTCGGTGCCAC；

所述gRNA-R为三个gRNA合成的通用下游引物。

在本发明的一些实施例中，步骤2)中，PCR扩增GFAP启动子时，采用的引物如下：

gfap-F:CTCGAGGTAAGGACTGAGGTGATG；

gfap-R:GTCGACAGGAACGCTGGGACTCCA。

在本发明的一些实施例中，步骤2)中，标记基因mCherry的引物如下：

mCherry-F:GGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAA；

mCherry-R:TTGTACAGCTCGTCCATGCCGCCGG。

在本发明的一些实施例中，步骤2)中，采用的质粒为Cas9-pXT7质粒。

在本发明的一些实施例中，步骤4)中，获得单敲斑马鱼纯合体F3的步骤如下：选择生殖细胞中表达红色荧光的嵌合体F0代，培养至成鱼，剪尾T7E1检测基因敲除情况，将基因被敲除的F0代和野生型斑马鱼进行杂交，后代中如果仍然有荧光且基因被敲除的个体，属于杂合体F1，将杂合体F1的单个个体与野生型斑马鱼再次进行杂交，后代中仍然有荧光且基因被敲除的个体为杂合体F2，由于杂合体F2来自同一个父母(杂合体F1和野生型)，因此插入的荧光片段在基因组中的位置是一样的，将杂合体F2中的雌鱼和雄鱼进行杂交，在杂交得到的后代中，筛选得到GFAP启动子启动特定荧光蛋白表达且组织特异性基因敲除的斑马鱼的纯合体F3，运用T7E1检测获得纯合敲除基因型斑马鱼。

在本发明的一些实施例中，步骤5)中，将单基因敲除的纯合斑马鱼进行两两杂交，获得双基因敲除的纯合斑马鱼，再将双基因敲除的斑马鱼与另一单基因敲除的纯合斑马鱼杂交，获得多基因敲除的斑马鱼胶质瘤模型。

如上所述，本发明的基因敲除载体及其斑马鱼胶质瘤模型，具有以下有益效果：本发明利用CRISPR/CAS9技术，靶向敲除rb1、nf1和tp53基因，建立的转基因诱导恶性胶质瘤斑马鱼模型，可以通过实时荧光观察恶性胶质瘤的发生、肿瘤诱导血管生成、胶质瘤干细胞发生过程，并通过分子生物学技术探讨不同遗传背景条件下胶质瘤的发病机制差异。本发明利用GFAP启动子对这三种基因的表达进行控制，使其在神经系统中特异性表达。这一模型所诱导的恶性胶质瘤与人类胶质瘤在发生机制上更为类似，同时利用单(多)基因敲除分别诱导的恶性胶质瘤将为阐释不同遗传背景的胶质瘤患者发病机制建立多样性的转基因胶质瘤斑马鱼模型，从而为恶性胶质瘤的个性化诊疗提供有利的研究工具。

附图说明

图1A和图1B显示为本发明实施例中与胶质瘤发生最为相关的三个信号通路，图1A为RTK/PI3K/Akt信号通路，图1B为p53信号通路和Rb信号通路；

图2显示为本发明实施例中基因rb1、nf1和tp53打靶位点T7E1检测的琼脂糖凝胶电泳图，两个白色尖头表示被T7E1酶切开的片段大小,M代表Marker,con代表对照组；

图3显示为本发明实施例中基因rb1、nf1和tp53打靶位点测序结果；

图4显示为本发明实施例中转座重组载体GFAP-CAS9-mCherry构建的菌落PCR结果；

图5显示为本发明实施例中构建成功的转座重组载体GFAP-CAS9-mCherry-U6-rb1；

图6显示为本发明实施例中构建成功的转座重组载体GFAP-CAS9-mCherry-U6-nf1；

图7显示为本发明实施例中构建成功的转座重组载体GFAP-CAS9-mCherry-U6-tp53；

图8显示为本发明实施例中F0代斑马鱼剪尾筛选PCR结果，P为阳性对照，WT为野生型对照，红色字体代表阳性结果，M为Marker；

图9显示为本发明实施例中F0代斑马鱼荧光筛选结果；

图10显示为本发明实施例中F1代剪尾T7E1检测三个基因敲除结果，M为Marker,con为对照组，g1、g2为实验组；

图11显示为本发明实施例中4个月大的纯合双敲斑马鱼的成瘤结果图；

图12显示为本发明实施例中三敲斑马鱼的畸形结果图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置；所有压力值和范围都是指绝对压力。

本实施例结合斑马鱼模型的优势，如体外受精和发育，胚胎出生后保持透明等，最终可以较好地解决胶质瘤转基因小鼠无法克服的困难。利用荧光显微镜，我们可以在早期实时观察在细胞水平上胶质瘤发病机制，同时还可以研究肿瘤为环境在胶质瘤发生过程中所起的作用，以及胶质瘤诱导血管生成的分子机制研究。

一.打靶位点的选择

本发明中我们选择的基因均为能诱发脑胶质细胞瘤的主要基因,分别为rb1,nf1和tp53。根据CRISPR/CAS9的编辑特点，位点一般为紧邻NGG特征序列之前的20bp序列，在chopchop网站上确认打靶序列。

二.构建重组转座载体相关元件的选择

本发明中实现转基因的技术包括CRISPR/CAS9基因编辑技术、Tol2技术、分子克隆技术。本发明的实施例中，具体是将红色荧光蛋白加入重组质粒中，从而将载体插入待处理模式生物(例如斑马鱼)的基因组中，实现稳定表达。

此外，本发明所选择的启动子为胶质细胞特异性表达启动子GFAP，由于这几种基因广泛存在于斑马鱼体内，通过直接敲除极可能会导致斑马鱼早期胚胎致死。因此，利用GFAP启动子对这三种基因的表达进行控制，使其在神经系统中特异性表达。

三.基因整合的方法与鉴定

把构建好的重组转座载体与Tol2mRNA通过显微注射同时注射到待处理斑马鱼的受精卵中，等待这些受精卵发育成幼鱼。鱼体透明，目的序列整合到鱼的基因组之后，鱼会在特定位置显示出特定荧光。将这些鱼收集并培育养大，得到gfap启动子特异性敲除的斑马鱼，定义为嵌合体F0代。

四.获得单基因稳定敲除的子代

选择生殖细胞中表达红色荧光的嵌合体F0代，待养至2个月大，剪尾T7E1检测基因敲除情况，将基因被敲除的F0代和野生型进行杂交，后代中如果仍然有荧光且基因被敲除的个体，属于杂合体F1。将这些杂合体F1的单个个体与野生型再次进行杂交，它们的后代仍然有荧光且基因被敲除的是杂合体F2，由于杂合体F2来自同一个父母(杂合体F1和野生型)，因此，插入的荧光片段在基因组中的位置是一样的。将杂合体中的雌鱼和雄鱼进行杂交，在杂交得到的后代中，有1/4的概率得到GFAP启动子启动特定荧光蛋白表达且组织特异性基因敲除的斑马鱼的纯合体F3。运用T7E1检测获得纯合敲除基因型斑马鱼。

五.获得双(多)基因稳定敲除的子代

将单基因敲除的纯合斑马鱼进行两两杂交，获得双基因敲除的纯合斑马鱼，再将双基因敲除的斑马鱼与剩余单基因敲除的纯合斑马鱼杂交，获得多基因敲除的纯合斑马鱼。

实施例1

建立斑马鱼胶质瘤模型

步骤1：构建打靶序列的gRNA序列

首先在NCBI(美国国家生物技术信息中心)的网站上查到斑马鱼的rb1nf1和tp53三个基因的CDs序列。在chopchop网站上查找靶位点序列，锁定的三个基因的目标序列分别为

rb1:TGCATGGAGAATATGGGAGA；

nf1:GGCGCACAAGCCCGTGGAAT；

tp53:TGATTGTGAGGATGGGCCTG。

然后，为构建打靶序列gRNA，合成以下引物：

rb1-gRNA-F:TAATACGACTCACTATAGGGTGCATGGAGAATATGGGAGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

nf1-gRNA-F:TAATACGACTCACTATAGGGGCGCACAAGCCCGTGGAATGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

tp53-gRNA-F:TAATACGACTCACTATAGGGTGATTGTGAGGATGGGCCTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

gRNA-R:AGCACCGACTCGGTGCCAC

其中，gRNA-R为三个gRNA合成的通用下游引物。

以带有gRNA骨架的质粒(中科院重庆绿色智能研究院环境健康中心)为模板，以终浓度为10μM的上游和下游引物扩增gRNA的DNA序列。

反应体系如表1所示：

表1

PCR程序设计：

第一步：95℃2min；

第二步：95℃20s；

第三步：55℃20s；

第四步：72℃10s；

第五步：返回到第二步，循环35次；

第六步：72℃10min；

反应结束。

将PCR所得产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，在1％的琼脂糖凝胶电泳上加入10％的加样缓冲液，混匀后，加入琼脂糖凝胶的样孔中，150V电压15min电泳。

切胶回收步骤(天根试剂盒)：在紫外的照射下，对比参照梯状条带(ladder)，将目的条带(100bp)切下(割胶尽可能的小，提高后续回收效率)，向胶块中加入等倍体积溶液PN(如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μL，则加入100μL PN溶液)，50℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；柱平衡步骤：向吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)加入500μL平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。向吸附柱CA2中加入600μL漂洗液PW，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。12,000rpm离心2min，尽量除尽漂洗液,将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干将吸附柱，将CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20μLddH2O,室温放置2min。12,000rpm离心2min收集DNA溶液。

步骤2：体外转录及RNA回收

将切胶纯化的产物转录成RNA，用mMessagemMachine Kit(Ambion公司)进行体外转录；

反应体系如表2所示：

表2

用量	组分
		600ng	DNA模板
2μL	10×缓冲液
		1μL	10mM NTP Mix
1μL	酶混合液
		至20μL	无核酸酶水

将上述混合液放入PCR仪中37℃,3h进行转录。

将RNA产物加入祛DNA酶，PCR仪中37℃15min。

RNA的纯化(天根试剂盒)：在RNA样品中加入RNase-Free水补足至100μL，加入350μL溶液RK，充分混匀。加入250μL无水乙醇，充分混匀，立即进行下一步。将上一步所得溶液和沉淀一起转入吸附柱CR2中，12,000rpm离心30sec，弃掉收集管中的废液。向吸附柱CR2中加入500μL已加入乙醇的漂洗液RW，室温放置2min后，12,000rpm离心30sec，弃废液，将CR2放入收集管中。12,000rpm离心5min，去除残余液体。将吸附柱CR2转入一个新离心管中，加14μLRNase-Free水，室温放置2min后，12,000rpm离心2min。得到gRNA放于-80℃保存。

步骤3：CAS9的体外转录和RNA回收

体外转录：

将Cas9-pXT表达载体线性化处理。步骤如下：取800ng Cas9-pXT7质粒(购自湖北武汉水生生物研究所)，加入XbaI内切酶1μL，10X缓冲液2μL，其余体积是ddH20，配成20μL的酶切体系，放在37℃的的水浴锅内酶切2小时。

反应结束后，加入1/20体积0.5M EDTA，1/10体积的5M NH4acetate，2倍体积的无水乙醇。混匀，放在-20℃冷冻20分钟后取出。放在小离心管中，最高转速离心15分钟。吸取并丢弃上清液，晾干。加入ddH₂0溶解，保证最终浓度在0.5-1μg/μL。产物中加入浓度为150μg/mL的蛋白酶K和0.5％SDS，在50℃水浴中反应30分钟。将反应产物通过胶回收试剂盒的柱子回收DNA(全式金)。首先，混合3倍体积GSB溶液，加入胶回收柱子，静置1分钟。12,000rpm离心1min。加入500μL漂洗液，14000g离心1分钟。加入45μL水洗脱，12,000rpm离心一分钟，得到线性化产物。

用mMessagemMachine Kit(Ambion公司)进行体外转录，步骤如下。

按照表3所示配方：

表3

用量	组分
		10μL	2×NTP/CAP
2μL	10×缓冲液
		0.1μg-1μg	线性模板DNA
2μL	酶混合液
		至20μL	无核酸酶水

将上述混合液放入PCR仪中37℃，3h进行转录。

将RNA产物加入祛DNA酶，PCR仪中37℃15min。

RNA的纯化(天根试剂盒)：在RNA样品中加入RNase-Free水补足至100μL，加入350μL溶液RK，充分混匀。加入250μL无水乙醇，充分混匀，立即进行下一步。将上一步所得溶液和沉淀一起转入吸附柱CR2中，12,000rpm离心30sec，弃掉收集管中的废液。向吸附柱CR2中加入500μL已加入乙醇的漂洗液RW，室温放置2min后，12,000rpm离心30sec，弃废液，将CR2放入收集管中。12,000rpm离心5min，去除残余液体。将吸附柱CR2转入一个新离心管中，加14μLRNase-Free水，室温放置2min后，12,000rpm离心2min。得到gRNA放于-80保存。

步骤4：显微注射受精卵以及打靶效率检测

1.收卵：

在喂完晚餐后30分钟后，在配鱼的专用鱼缸中，加入雌雄比2∶1放置不多于八条的斑马鱼，用隔板将雌雄分开，放入三分之二的养鱼水。第二天早晨抽去隔板，雄鱼开始追逐雌鱼，一般在15分钟雌鱼开始排卵，雄鱼将精子排入水中使卵受精，收集卵到平板培养皿中，去除死卵和杂物，用养鱼水洗涤几次，等待注射。

2.注射：

制备注射皿，30mL的2％琼脂糖加热融化，倒入直径10cm的玻璃皿中，将模具轻轻覆盖于表面，待胶凝固后，移走模具。加入少量养鱼水，保持界面湿润。准备注射针，将外径为1.02mm内径0.58mm的玻璃毛细管用拉针仪拉成针形。

待受精卵排出后，再过约10分钟卵膜膨胀，随后数分钟内细胞形态变得规整，此时可以开始注射。用无齿镊在体视镜最高倍放大率下将针头折断少许，尽量断成斜切面。用微量上样吸头吸取1-5μL胚胎纤维注射液从针尾穿入注射针上样，随后将注射针插入持针器中固定。将胚胎清洗后，放入注射模具中，排列成行，吸去多余的液体，使液面刚刚没过鱼卵。注射时，注射针从胚胎动物极插入到细胞质中和从卵黄中穿过抵达胞质中。将Cas9-pXT7载体转录出的Cas9mRNA(稀释至300ng/μL)和gRNA(20ng/μL)共同打入斑马鱼的单细胞期受精卵中。每枚卵注射，Cas9mRNA量为25pg，gRNAmRNA量为25pg的混合物。用针尖拨动注射凹槽中的胚胎使细胞质方向与针尖方向一致或者相对，与水平面约成45度下针，扎入到位后踩动踏板注射，略保持后迅速退针，整个过程注意手不要抖动。

注射结束后，将胚胎移至含有养鱼水的10cm培养皿中，再转移到28.5℃的环境中培养，等待孵化。这段时间需要定期检测，去除死胚和脱下的卵膜，并更换养鱼水。大约到4-5天时，胚胎可以进食草履虫，此时应转移至小鱼喂养盒中。幼鱼12天起可以开始用草履虫和卤水混合喂养，注意及时清理鱼缸，保持水质良好。待幼鱼全部吃卤水时(此时幼鱼的腹部呈红色)，可转入鱼房喂养。

3.打靶效率检测

提取DNA

显微注射24h后，收取对照组和注射组各30颗鱼卵，用CTAB法提取DNA，每组加入100μL的裂解液(100mMTris-Hcl pH 8.5,0.5M EDTA,10％SDS,5M NaCl,20mg/ml蛋白酶K)放入55℃水浴1h。用氯仿和异丙醇抽提后，用75％的乙醇清洗，保存于4℃或用于以下实验。

PCR扩增

设计以下引物，扩增含有打靶位点序列的DNA片段。

T-rb1-F:ACCATGTCTGTCAACTGTTGTT

T-rb1-R:TACACCACTCCTGAGAGGCAA

T-nf1-F:AACTTCCGGTGGTGTGTCAT

T-nf1-R:CAGTGCAAGCCCAAAACCAC

T-tp53-F:ACATGAAATTGCCAGAGTATGTGTC

T-tp53-R:TCGGATAGCCTAGTGCGAGC

以上述提取的DNA为模板，以终浓度为10μM的上游和下游引物PCR扩增DNA序列。

反应体系如表4所示：

表4

PCR程序设计：

第一步：95℃2min；

第二步：95℃20s；

第三步：55℃20s；

第四步：72℃10s；

第五步：返回到第二步，循环35次；

第六步：72℃10min；

反应结束。

将PCR所得产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，在1％的琼脂糖凝胶电泳上加入10％的加样缓冲液混匀后，加入琼脂糖凝胶的样孔中，150V电压15min电泳。若有条带则进行以下实验，若无条带则重新设计引物重新PCR

T7E1检测

三个基因扩增的片段大小分别为rb1：406bp；nf1：420bp；tp53：336bp。

将三种PCR产物以及对照各取8μL，在PCR仪里进行退火，然后各加入0.5μL的T7E1酶和1μL T7E1buffer的混合液，37℃25min。反应结束后，将产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，在2％的琼脂糖凝胶电泳上加入10％的加样缓冲液混匀后，加入琼脂糖凝胶的样孔中，150V电压15min电泳。结果如图2所示。箭头表示被T7E1酶切开的突变序列。

测序检测突变效率

将上述产物连入pMD^TM18-T(TAKARA)载体后送金唯智公司测序，结果如图3所示。黑色字母代表原始基因组序列，红色代表打靶序列，绿色是PAM区，黄色是突变区域。

步骤5：构建转座重组载体

1.插入GFAP启动子序列

(1)PCR扩增GFAP启动子序列

用以下引物在斑马鱼基因组中PCR扩增GFAP启动子；

gfap-F:CTCGAGGTAAGGACTGAGGTGATG

gfap-R:GTCGACAGGAACGCTGGGACTCCA

反应体系如表5所示。

表5

用量	组分
		12.5μL	PrimeSTAR Max Premix(2×)
1μL	2A-mCherry-gfap-F
		1μL	2A-mCherry-gfap-R
1μL	模板
		9.5μL	ddH2O
25μL	总计

PCR程序设计：

第一步：98℃5min；

第二步：98℃10s；

第三步：62℃5s；

第四步：72℃1min；

第五步：返回到第二步，循环35次；

第六步：72℃10min；

反应结束。

电泳：将PCR产物加入10％的加样缓冲液混匀，加入配好的1％的琼脂糖凝胶的样槽中，150V恒压15min电泳。把琼脂糖凝胶放在紫外照射下，对比参照梯状条带(ladder)，条带应在7400bp左右。序列为SEQ ID NO.2所示。

采用购自天根的胶回收试剂盒，进行胶回收，步骤如下：向胶块中加入等倍体积溶液PN(如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μL，则加入100μL PN溶液)，50℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。柱平衡步骤：向吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)加入500μL平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。向吸附柱CA2中加入600μL漂洗液PW，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。12,000rpm离心2min，尽量除尽漂洗液,将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干将吸附柱，将CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20μLddH2O,室温放置2min。12,000rpm离心2min收集DNA溶液。

(2)载体骨架酶切

采用XholI和SalI限制性内切酶对pTol2-CAS9-mCherry-gRNA-U6载体骨架(购自南京尧顺禹生物公司)进行双酶切，50μL体系为:5μg载体，XholI和SalI限制性内切酶各5μL，酶切buffer 5μL，水补足50μL。37℃2h后进行胶回收，步骤同上。

(3)连接

将GFAP胶回收产物和载体胶回收产物进行连接反应。在10μL的连接体系中加入500ng的GFAP胶回收产物,100ng的线性化载体的产物，2μL T4连接buffer，0.1μL T4连接酶，水补足10μL体系，混匀后22℃恒温3h。

(4)转化涂板，鉴定阳性克隆

连接产物转化和涂板：将连接产物加入感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物)，冰浴30min，加入到42℃水浴锅中30s，立即至于冰上2min,加入800μL的LB培养基，37℃摇床内复苏1h后取出，6000rpm离心3min，弃去500μL上清，将余下部分混匀后涂板，涂在Amp+抗性的平板上，待液体完全干为止，平板放在37℃培养箱中过夜。

鉴定阳性克隆：待菌落长出来后，用10μL的白枪头挑单菌落，在10μL超纯水中混匀，取1μL做PCR模板，加入gfap-F和gfap-R两引物，62℃进行PCR反应35个循环。取PCR产物，加入10％的加样缓冲液混匀，加入配好的1％的琼脂糖凝胶的样槽中，150V恒压15min电泳。把琼脂糖凝胶放在紫外照射下，对比参照梯状条带(ladder)，在7400bp左右有条带的菌落，是阳性菌落，如图4所示。加入5ml带5μLAmp+的培养基摇菌，37℃过夜后提质粒。

提质粒的步骤如下(天根试剂盒)：向吸附柱CP3中，加入500μL平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。取5mL过夜培养的菌液，加入离心管中，12,000rpm离心1min，尽量吸除上清，向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1，用涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心10min。将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中，12,000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CP3放入收集管中，向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中12,000rpm离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加35μL ddH₂O静置2min，12,000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中。

金唯智公司测序，比对序列，正确的即为构建成功的重组载体GFAP-CAS9-mCherry。

2.插入打靶序列构建转座重组载体GFAP-CAS9-mCherry-U6-gRNA

(1)用步骤1中已经确认的三个打靶序列合成以下引物

rb1-F:CACCTGCATGGAGAATATGGGAGA

rb1-R:AAACTCTCCCATATTCTCCATGCA

nf1-F:CACCGGCGCACAAGCCCGTGGAAT

nf1-R:AAACATTCCACGGGCTTGTGCGCC

tp53-F:CACCTGATTGTGAGGATGGGCCTG

tp53-R:AAACCAGGCCCATCCTCACAATCA

以上上下游引物稀释成5μM 10μL体系95℃进行退火后备用。

(2)GFAP-CAS9-mCherry载体酶切

GFAP-CAS9-mCherry载体用BbsI限制性内切酶进行酶切，50μL体系为:5ug载体，BbsI限制性内切酶5μL，酶切buffer 5μL，水补足50μL。37℃2h后进行胶回收，步骤同上。

(3)连接

将GFAP-CAS9-mCherry胶回收产物和退火产物进行连接反应。在10μL的连接体系中加入100ng的GFAP胶回收产物，500ng的退火产物，2μL T4连接buffer,0.1μL T4连接酶，水补足10μL体系,混匀后22℃恒温1h。

(4)转化涂板，送测序

连接产物转化和涂板：将连接产物加入感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物)，冰浴30min，加入到42℃水浴锅中30s，立即至于冰上2min,加入800μL的LB培养基，37℃摇床内复苏1h后取出，6000rpm离心3min，弃去500μL上清，将余下部分混匀后涂板，涂在Amp+抗性的平板上，待液体完全干为止，平板放在37℃培养箱中过夜，提质粒，金唯智公司测序，比对序列，正确的即为构建成功的重组载体GFAP-CAS9-mCherry-U6-rb1(图5),GFAP-CAS9-mCherry-U6-nf1(图6),GFAP-CAS9-mCherry-U6-tp53(图7)。

步骤6.显微注射

收卵：

在喂完晚餐后30分钟后，在配鱼的专用鱼缸中，加入雌雄比2:1放置不多于八条的斑马鱼，用隔板将雌雄分开，放入三分之二的养鱼水。第二天早晨抽去隔板，雄鱼开始追逐雌鱼，一般在15分钟雌鱼开始排卵，雄鱼将精子排入水中使卵受精，收集卵到平板培养皿中，去除死卵和杂物，用养鱼水洗涤几次，等待注射。

注射：

制备注射皿，30mL的2％琼脂糖加热融化，倒入直径10cm的玻璃皿中，将模具轻轻覆盖于表面，待胶凝固后，移走模具。加入少量养鱼水，保持界面湿润。准备注射针，将外径为1.02mm内径0.58mm的玻璃毛细管用拉针仪拉成针形。

受精卵排出后，再过约10分钟卵膜膨胀，随后数分钟内细胞形态变得规整，此时可以开始注射。用无齿镊在体视镜最高倍放大率下将针头折断少许，尽量断成斜切面。用微量上样吸头吸取1-5μL胚胎纤维注射液从针尾穿入注射针上样，随后将注射针插入持针器中固定。将胚胎清洗后，放入注射模具中，排列成行，吸去多余的液体，使液面刚刚没过鱼卵。

注射时，注射针从胚胎动物极插入到细胞质中和从卵黄中穿过抵达胞质中。分别将三个转座重组载体

GFAP-CAS9-mCherry-U6-rb1,GFAP-CAS9-mCherry-U6-nf1,GFAP-CAS9-mCherry-U6-tp53

(30ng/μL)和转座Tol2mRNA(50ng/μL)共同打入斑马鱼的单细胞期受精卵中。用针尖拨动注射凹槽中的胚胎使细胞质方向与针尖方向一致或者相对，与水平面约成45度下针，扎入到位后踩动踏板注射，略保持后迅速退针，整个过程注意手不要抖动。

注射结束后，将胚胎移至含有养鱼水的10cm培养皿中，再转移到28.5℃的环境中培养，等待孵化。这段时间需要定期检测，去除死胚和脱下的卵膜，并更换养鱼水。大约到4-5天时，胚胎可以进食草履虫，此时应转移至小鱼喂养盒中。幼鱼12天起可以开始用草履虫和卤水混合喂养，注意及时清理鱼缸，保持水质良好。待幼鱼全部吃卤水时(此时幼鱼的腹部呈红色)，可转入鱼房喂养。

步骤7：嵌合体F0的筛选与鉴定

1.分子生物学验证

(1)待幼鱼长至2个月大时剪尾检测荧光表达情况，用PCR分子生物学手段，证实基因组中是否有mCherry的表达。引物设计如下：

mCherry-F:GGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAA

mCherry-R:TTGTACAGCTCGTCCATGCCGCCGG

反应体系如表6所示。

表6

PCR程序设计：

第一步：94℃3min；

第二步：94℃5s；

第三步：57℃15s；

第四步：72℃10s；

第五步：返回到第二步，循环35次；

第六步：72℃10min；

反应结束。

其中，PCR模板来源于斑马鱼的基因组。正向和反向引物由金唯智生物公司合成，其被稀释为10μL的工作浓度。Taq DNA Polymerase kit购自于全式金生物公司。总的PCR体积为20μL。反应结束后，PCR管内产物放在4℃冰箱保存或直接进行下一步。

电泳：取PCR产物，加入10％的加样缓冲液(loading buffer)混匀，加入配好的1％的琼脂糖凝胶的样槽中，150V恒压15min电泳。把琼脂糖凝胶放在紫外照射下，对比参照梯状条带(ladder)，测定产物条带应在300bp左右(图8)。将有此条带的的个体确定为F0代。

2.荧光筛选

荧光蛋白在注射24h后出现表达，在荧光显微镜下观察幼鱼，挑出表达红色荧光蛋白的幼鱼，将幼鱼放在10cm的皿中，再次检查是否都有荧光，将没有荧光的幼鱼丢弃，剩下的就是嵌合体F0(图9)。

步骤8：筛选纯合单基因敲除的斑马鱼

将得到的嵌合体F0和野生型进行杂交，后代中仍然带有红色荧光特性的个体属于杂合体F1，杂合体F1代其全身基因组都带有转座的外源基因，所以剪尾检测的结果也可以遗传，所以在杂合子F1代长至2个月大时剪尾检测基因的敲除情况。

取单条鱼剪尾后用CTAB法提取DNA，如步骤4所述，之后根据步骤4的引物和PCR程序进PCR扩增和T7E1检测，结果如图10所示。筛选出能被T7E1酶酶切的DNA所对应的个体，此F1代为单基因敲除的杂合子。

用此F1代进行互交，其中有1/4为纯合子，同样用PCR和T7E1检测筛选出纯合子。即得到单基因敲除纯合子斑马鱼。

步骤9：双(多)基因敲除的斑马鱼胶质瘤模型的获得

用纯合的单基因敲除斑马鱼进行两两互交就能够得到双基因敲除斑马鱼，再用双基因敲除斑马鱼与另一单基因敲除斑马鱼杂交就得到多基因敲除斑马鱼胶质瘤模型。其中，如图11所示，双基因敲除斑马鱼在4个月时成瘤；如图12所示，三基因敲除的模型在出生后基本畸形。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

SEQUENCE LISTING

<110> 汕头大学医学院

<120> 一种基因敲除载体及其斑马鱼胶质瘤模型

<130> PCQST176837

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17534

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 基因敲除载体

<400> 1

gtaaggactc gaggtgatgc acagtgttgg gtatgttact ttcaataagt tattctttgc 60

taattattag tcatttgaat tgtattgaaa ttacattttt agttactttg cctaaaaaaa 120

aacttgataa gtaatcgaat tacatacttg aagtccacat aaatctcatt cattcattcc 180

ttctcttttc gacttagtcc ctttattaat caggggtttc tacagcggaa cgaacctcat 240

atgtttcaat ttagtgacta ttttttataa attattgaca atgtttttgt tgcttgttca 300

aactacttat ttaaaatgag ctgaaactgc acaattattg atatttcatt ggaacagctt 360

aatttttttt atgtttaatc cacttaaata aaattccaat tatataatat tccaattata 420

aagttactta atcaatttgt attaggacaa tatgaatgaa ttgtgtggaa ccctgcattt 480

tttacagtga acctttcctt gtttcttaaa catgggtgat tttcggagaa ataaaatttg 540

acaatatctg aaatgtaaaa agaaaatatt cagttactct gcctttctaa atgcatagtt 600

tatattatca tcagagttgt aaagtaacta gttacaaata ctcaaattac tgtaattgag 660

tagttttttt caggaattgt aatttactaa gtagctaaaa aatgtgtact tttactttcc 720

cttgagtaca ttattaatgc tgtaacggta cttttactcc actactttcc ttcagcctgc 780

actcactact ttgttttatc ttgtctatga ggattagaaa aatcaatcct gtgattccaa 840

tcaaatcgca catccaaagt ctttacaaaa gcattttgtt tggatgtgaa aatcgggttg 900

atgtcagaac tcaatgtcag cccaacgtca atgtccaacc taaaatcaac ctaatatcaa 960

cgtctaatga tgttacagct tgacgttgtg tgggcgttac cattatttgt cagacattgg 1020

attttagttg ccatacctga taaataaatg tcagtatttg atgtccgtat gatcttggat 1080

ttagatgttg gctcgacatt ggattttggt cacctgacat aacaacctaa atctatccta 1140

ataataacgt cttatgacgt tgtgtgccaa ccatttttgt ttattaaaaa tttatataaa 1200

catttacaat aatatattat ccatgtgatt taatagaaat gttatttgtt ttttttctcc 1260

cccatatttc tgaatgactt aaagctttta ttatcaggat aaggttgtgg tttttatttt 1320

ttgcttgcta acttcaattg ctattgcatt tacatttatg caaatgggga gacgcggtgg 1380

gtcagttggc gtttctgtgt ggagtttgca tgttctcccc gtgttcgcgt gggttttctc 1440

tgggtgctct ggtttcccct aaagacatgt agtataggtg aattgggtaa gctaaattgt 1500

ccgtagtgtg tatgtgtgaa tgtatggatg ttttcctgtg atgggttgca gctgaaaggg 1560

catccgctgt gtaaaacata tgctggataa gttggcaatt catttcgctg tggtaacccc 1620

agattaatat cggaactacg ccaaaaagaa aatgaatgaa tgagtgaatt aatgcaaatg 1680

gctcatcctt ccacctaatt ccagtgcctt gcattgcatt caagctctac aattaatcag 1740

ttcctttatt ttcactttcc aaactgaatc caacaactca tgaggacccc agggtgcctt 1800

gatttaccag tgtcatgatg aacacaatct accccacttt aacccactcg tcaacataaa 1860

tactccctta aagggtgtac ttgtgtctga gtagaagtgt ctgctgggtt ggaggtgtcg 1920

cacattccag gacacgtcaa gaagaacgct aagagcaaca ggagaacaat gtcacaaaaa 1980

aggtcaaaga aacgccatcc attagccagc tttataaaca gctgtctcgt ggctaaagaa 2040

gttctcaaga ataaccaacc ttgcattttt ccacattagt tttacaccgc agcaaagtca 2100

ccatgtggat ttatagcatc caaaccccat tttcaatgag aggcttcaca tttctcgctc 2160

tcattcaatc ccacactgcc tctcttttca gactaaatcc tgataggatg agtggtatgg 2220

gggcggggag ggggcacaat acctcagtcc agcttccaca aagactcaac acacccatgc 2280

agatgtcctg ttgttgggga agtgcatttg taaccaaatt tcaaactttc aactttcatt 2340

tgaagcagtg gagactgctc cattcctatt caagatcaat ttattgaaat atgacaacat 2400

ttagaataac tttgttatat gttattatgt tttataatgc aattttgttt ctgtgacata 2460

cattttttta tttagtgcag tcttcagagc cacaggaacc ttgagaatca ttctaattat 2520

gatttgctac tcgaaaaaca tttttcatca tcaataataa gaaattaaaa cggtatacat 2580

atagatgttt agtataacag ttcttagtag tttaaaagaa catttgtaac aacattccaa 2640

ccttttaata actttagcct tgcttacatt tctaaaggag agccttccag ctgtttttct 2700

gaacccagtg atgaatgtaa agttcttaaa accaagttct aagaatgttt taatgattac 2760

atttaaccca atttcaagcc aaatttccta taccacgagt aaaatatagt tataattagg 2820

atagatcttt ggtaaaataa gatacaattt taagatttga atttaaaagt agctaaattg 2880

tttttttatg acagaacttt taagtttata gaatattaat acaggacaaa acttgtaaat 2940

gtatttaatt tcctatgaat atttgataaa atataaatga catctatatg taaattcatg 3000

aaccatgact cttatgaatt atcagtgcac aaattatgtt tgatgcacac ttaaggtcaa 3060

aagtttaggg tcagtttatt ttttttttta tttttaattt tatttaataa tttaaataaa 3120

attattctgt tcatcaaggc acatttatta aatgtaacaa taaattgtta aatacttatt 3180

aaatatttat tttttactta ttgtatgcag tttcaattga agtcattatt gcttttatta 3240

ctattaccat taataaaaat aacattaata ataataataa taataataat aattgatatt 3300

acagtgattt ctgaaggatc acgtgactga agactggagt aatgaagctg aaaactcatc 3360

atttaaatca ctggagtaaa tgattcaatt aaatgatcat ttaatgatca ttcttttgaa 3420

cagttatttt atagtgcaat aacatttcac agttttacca tttgttttgt atttttgatt 3480

caataaatgc agccttggtg agcaggagaa gcttaattta aaacatttaa aactcctact 3540

gaccccaaac ttttgaccgg tagtgtacat gtattactgt atgttcaaac tatatgcttt 3600

tattcataag tgtttctatt gctgtacatt tgactgtctg catcaggtga agtgtatgaa 3660

agagtgtgtg tttactccac cccgtgggaa agagcagtag ctgcaatgtg tgtgtgtgag 3720

tagttagtga tgcatgagtg atccactgaa ccctgtccag ccccctgctg cagctctcaa 3780

cacatcatga taggtcacct ctactgggag gctttcagca cagctctcac aactgattta 3840

tcagagagta ctctgaaatg gagaaattac tttcatatta aagagcacac acacacacac 3900

acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac ctagttcacc 3960

ttattaacgt ggttaagcct ttaaatgtca ctttaagctg tatagaagtg tcttgaaaaa 4020

tatctattca aatattattt actgtcatca aggaaaagat aaaataaatc agttattaga 4080

aataagtttt taaaactatt atacttagaa atgtgctgaa acaatcttcc tagaacagaa 4140

cagaaattgg ggaaaaaata aacaaaaata aataaatcta tctatctata gtgtgtataa 4200

tgtgtgtagt gagtatgttt aaaataggtc aactaatatg ttcataataa aaatacagca 4260

tcaatggttt gggtgttttt agatccaaag gtcttaaacg tggttattgc tggttgttca 4320

gttttttcta ggctctaaga aaaatcattt tagaaactgt aactgtttcc ttatccatct 4380

gaattccacc tttgggatgt agtggaacgg gagatcaact gcatgatgct atcaagtcaa 4440

tatggatcaa aatctcagga atatttccag gaccttattg aatctatgcc atgaaggatt 4500

aaggcagttc tgaaagggga aatgcggttt aacccggtaa tagcaaggtg tacctaataa 4560

agtggccggt gagtgtatat attgttattg tttcaccttc agaaatgaca tatctagaca 4620

atagtttcct ttttcttttt taattattgt acttctgtaa gattcttcaa tgttcaatgg 4680

ttttcttatg ttaaaggcgc agagctgtag ttttagtgaa gtaacagcat tccgttgacc 4740

aaagctgaca gatgaaggag agtcagttct gaccttgcag ttgtcagtca caattaagcc 4800

tggtttggtt acaagttaaa cgtagacctg cttgtggtca ggatcatcct ttaaaagaac 4860

tagatttgtt tttaacaatt tgtaaccggt gtgctctgaa gtgtcttaaa taaagcatat 4920

aggaagcaaa gcagtgaaaa atgttcctta taatctacga gcattagctt aaatgtataa 4980

acaaaataat attaattgtg tgttcagatc aaatataggt attgttacac ctaaaataaa 5040

cccattgctt taaaaaataa ttaaacacag tgtacaatat tagcatactt cctctgacat 5100

ctctaagtaa aacaagagct ttcacgattt actcactgac ccatcttaca gcacttctct 5160

gtgaatttag gccatcacaa atgctgtgcc cagttctctg actgggtttg acagtcgccc 5220

atctgtgtcc agcagtctga tgagctcatc ctctgtaaat ctggctggct gccgtgttgt 5280

tttgtgtctg tccgtgagtc tctctggcct tcatacactc ctctgctact tcatagactg 5340

ctgatgagtg cagaggccaa accattagtg cttttctttt tttttagacc tcagtaatgc 5400

acaacaatgc aaaacaagta gattgagcct tttgttcttt ggactgagca tttggttaga 5460

atagcttgaa gggatagtta gaagatattt tgaagggaaa ctaaaaacct gttaccattt 5520

gacatccaaa gaaggaaaac taatatgatt gagtggttac agatttccaa cacttttcaa 5580

catatattat tttgtgttcc actaaagaaa cagtcaaata ttatactgtc aaccaaagta 5640

ctgcacttga ctcaaaaaag ctctgcagca agttgcctct tattctaggt cgagtcaacc 5700

tttttttctc tctctctgtc ggttcattca aggttcagta aatgatgaca gaattttcag 5760

cttttatttt gggtgaacta accctttata tatttgttgt aagtttattt ttctgtatat 5820

tataaatata ttagcaacat aattctaagc tacacttgta cccaatcaag ggtcacactt 5880

tattttgatg gtatgtttgt ttgaatttaa gttacattgc atctacatgt caactaattc 5940

tcattagatt ataagaagac tgttaggttg gggttagtgt aagttgacat gtacttgcaa 6000

agtttctcag agtcagttaa atgtctgttt tgtagcagta ttaacagata ttaagcacac 6060

tgtatattaa tactcaaatg aaccgtcaaa ataaagtgtt accgtaaaaa ttatttccac 6120

atctcaaggt agctttatga ggaaagtttt ctttaagatt agtttcttcg aacaaacttg 6180

catgttaaat atgtgctcag atatggggca cacagacaaa atgtttattg gacgaataac 6240

ccctttaaca gttaaccagc attttttaaa gggatagtca gaagatattt tgaaggaaac 6300

taaaaacctg taaccattcg acaatcgaag aaggtaaaag aaatatgata gagtagttac 6360

agtttttcaa cactctttat aatatattgt ttagtattca actgaagaaa tagtcaaaca 6420

cactgtaaaa aaagttggtt taaattgact caactttcaa ctcaagtata gtacttgact 6480

tgatttaagt tgagttaact agactaaact aaaagcacta aaagcactgc ggcaagtcgc 6540

ctttcaattt taggttgagt aaattattat tatttttttt tacagttcag gttcagtaaa 6600

tgataacata attttcagtt ttgggtgaac tatcccttta tatatttgtt gtaagttaat 6660

ttttctgtaa attataaatt aattagcaaa aaagctgcac ttcttcacca ttaattaatt 6720

aatacatctc aaagtagctt tataaggaaa gttttcttta attatgtttc tttgcatgtt 6780

aaaattgtgc tcagatatgg agcacacaag caaaatgttt attggatgaa taaccccttt 6840

aacatttaac cagcatgagt tcaagtaaac aaatcaattc ctatgatttt tctgctaaac 6900

cgatataaat cagtgctgct gaagagcatg tgtgtgatgt tctcagatca gcacaaaaga 6960

gggagcgcca gtttctttta ataatgaaga attacgtaat cacctcctgt gttccctgaa 7020

accattaaac tcccagacag aacaaaactg tgactgagaa agcagagcaa ctccggagta 7080

actcagaaga tctgcaaacc aactctttag catgaggtaa gagagaatta aagtccaata 7140

tcagtgctga tgccatctca gtctctctat ttctgtgttc cagcagggta tgaataggat 7200

tttctctgac tcactgtgaa aagaggcagt caggagactg gctggacaag cacaaacaat 7260

tgcgggctca caaacacccc ctcggccttt gccctcccca tcagaccccc cctctctctt 7320

tcacccccca catcaactct ataaaaaccc agagttcacc cgcactcgat ctcattctcc 7380

tccaccatgg agtcccagcg ttcctcctcg agggatccgt cgaccatatg accggtgcca 7440

ccatggacta taaggaccac gacggagact acaaggatca tgatattgat tacaaagacg 7500

atgacgataa gatggcccca aagaagaagc ggaaggtcgg tatccacgga gtcccagcag 7560

ccgacaagaa gtacagcatc ggcctggaca tcggcaccaa ctctgtgggc tgggccgtga 7620

tcaccgacga gtacaaggtg cccagcaaga aattcaaggt gctgggcaac accgaccggc 7680

acagcatcaa gaagaacctg atcggagccc tgctgttcga cagcggcgaa acagccgagg 7740

ccacccggct gaagagaacc gccagaagaa gatacaccag acggaagaac cggatctgct 7800

atctgcaaga gatcttcagc aacgagatgg ccaaggtgga cgacagcttc ttccacagac 7860

tggaagagtc cttcctggtg gaagaggata agaagcacga gcggcacccc atcttcggca 7920

acatcgtgga cgaggtggcc taccacgaga agtaccccac catctaccac ctgagaaaga 7980

aactggtgga cagcaccgac aaggccgacc tgcggctgat ctatctggcc ctggcccaca 8040

tgatcaagtt ccggggccac ttcctgatcg agggcgacct gaaccccgac aacagcgacg 8100

tggacaagct gttcatccag ctggtgcaga cctacaacca gctgttcgag gaaaacccca 8160

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tgctgagcga catcctgaga gtgaacaccg agatcaccaa ggcccccctg agcgcctcta 8520

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agcagcggac cttcgacaac ggcagcatcc cccaccagat ccacctggga gagctgcacg 8820

ccattctgcg gcggcaggaa gatttttacc cattcctgaa ggacaaccgg gaaaagatcg 8880

agaagatcct gaccttccgc atcccctact acgtgggccc tctggccagg ggaaacagca 8940

gattcgcctg gatgaccaga aagagcgagg aaaccatcac cccctggaac ttcgaggaag 9000

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ataacgagct gaccaaagtg aaatacgtga ccgagggaat gagaaagccc gccttcctga 9180

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tgaagcagct gaaagaggac tacttcaaga aaatcgagtg cttcgactcc gtggaaatct 9300

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gcctgacctt taaagaggac atccagaaag cccaggtgtc cggccagggc gatagcctgc 9720

acgagcacat tgccaatctg gccggcagcc ccgccattaa gaagggcatc ctgcagacag 9780

tgaaggtggt ggacgagctc gtgaaagtga tgggccggca caagcccgag aacatcgtga 9840

tcgaaatggc cagagagaac cagaccaccc agaagggaca gaagaacagc cgcgagagaa 9900

tgaagcggat cgaagagggc atcaaagagc tgggcagcca gatcctgaaa gaacaccccg 9960

tggaaaacac ccagctgcag aacgagaagc tgtacctgta ctacctgcag aatgggcggg 10020

atatgtacgt ggaccaggaa ctggacatca accggctgtc cgactacgat gtggaccata 10080

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actactggcg gcagctgctg aacgccaagc tgattaccca gagaaagttc gacaatctga 10260

ccaaggccga gagaggcggc ctgagcgaac tggataaggc cggcttcatc aagagacagc 10320

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ctaagtacga cgagaatgac aagctgatcc gggaagtgaa agtgatcacc ctgaagtcca 10440

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ctctgatcga gacaaacggc gaaaccgggg agatcgtgtg ggataagggc cgggattttg 10800

ccaccgtgcg gaaagtgctg agcatgcccc aagtgaatat cgtgaaaaag accgaggtgc 10860

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ccagaaagaa ggactgggac cctaagaagt acggcggctt cgacagcccc accgtggcct 10980

attctgtgct ggtggtggcc aaagtggaaa agggcaagtc caagaaactg aagagtgtga 11040

aagagctgct ggggatcacc atcatggaaa gaagcagctt cgagaagaat cccatcgact 11100

ttctggaagc caagggctac aaagaagtga aaaaggacct gatcatcaag ctgcctaagt 11160

actccctgtt cgagctggaa aacggccgga agagaatgct ggcctctgcc ggcgaactgc 11220

agaagggaaa cgaactggcc ctgccctcca aatatgtgaa cttcctgtac ctggccagcc 11280

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tcctggccga cgctaatctg gacaaagtgc tgtccgccta caacaagcac cgggataagc 11460

ccatcagaga gcaggccgag aatatcatcc acctgtttac cctgaccaat ctgggagccc 11520

ctgccgcctt caagtacttt gacaccacca tcgaccggaa gaggtacacc agcaccaaag 11580

aggtgctgga cgccaccctg atccaccaga gcatcaccgg cctgtacgag acacggatcg 11640

acctgtctca gctgggaggc gacaaaaggc cggcggccac gaaaaaggcc ggccaggcaa 11700

aaaagaaaaa gggaagcgga gctactaact tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg 11760

aggagaaccc tggacctatg gtgagcaagg gcgaggagga taacatggcc atcatcaagg 11820

agttcatgcg cttcaaggtg cacatggagg gctccgtgaa cggccacgag ttcgagatcg 11880

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aggcctacgt gaagcacccc gccgacatcc ccgactactt gaagctgtcc ttccccgagg 12060

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tgtaccccga ggacggcgcc ctgaagggcg agatcaagca gaggctgaag ctgaaggacg 12300

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tcgtggaaca gtacgaacgc gccgagggcc gccactccac cggcggcatg gacgagctgt 12480

acaagtaaga attcccccgg atctttgtga aggaacctta cttctgtggt gtgacataat 12540

tggacaaact acctacagag atttaaagct ctaaggtaaa tataaaattt ttaagtgtat 12600

aatgtgttaa actactgatt ctaattgttt gtgtatttta gattccaacc tatggaactg 12660

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ctgtgtttag taatagaact cttgcttgct ttgctattta caccacaaag gaaaaagctg 12900

cactgctata caagaaaatt atggaaaaat attctgtaac ctttataagt aggcataaca 12960

gttataatca taacatactg ttttttctta ctccacacag gcatagagtg tctgctatta 13020

ataactatgc tcaaaaattg tgtaccttta gctttttaat ttgtaaaggg gttaataagg 13080

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gttttacttg ctttaaaaaa cctcccacac ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat 13200

gcaattgttg ttgttaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc 13260

atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa 13320

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aagcatatga tagtccattt taaaacataa ttttaaaact gcaaactacc caagaaatta 13560

ttactttcta cgtcacgtat tttgtactaa tatctttgtg tttacagtca aattaattcc 13620

aattatctct ctaacagcct tgtatcgtat atgcaaatat gaaggaatca tgggaaatag 13680

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tgtgctgctc gcagctgctg atgaatcaca tacttcctcc attttcttcc actgattgac 13800

tgttataatt tccctaattt ccaggtcaag gtgctgtgca ttgtggtaat agatgtgaca 13860

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cctaccttca gcaagcccag cagatccact agttctagag cggccgccac cgcggtggag 14280

ctccagcttt tgttcccttt agtgagggtt aattgcgcgc ttggcgtaat catggtcata 14340

gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag 14400

cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg 14460

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ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct 14880

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ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc 15000

ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt 15060

aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta 15120

tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac 15180

agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc 15240

ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat 15300

tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc 15360

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atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg 15600

cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga 15660

tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt 15720

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cttcctcttt ataggaatgg agactacctc ctgtccaaca aggctcttgg atacgagtac 16860

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<210> 2

<211> 7416

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<213> Artificial

<220>

<223> GFAP

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ctcgaggtaa ggactgaggt gatgcacagt gttgggtatg ttactttcaa taagttattc 60

tttgctaatt attagtcatt tgaattgtat tgaaattaca tttttagtta ctttgcctaa 120

aaaaaaactt gataagtaat cgaattacat acttgaagtc cacataaatc tcattcattc 180

attccttctc ttttcgactt agtcccttta ttaatcaggg gtttctacag cggaacgaac 240

ctcatatgtt tcaatttagt gactattttt tataaattat tgacaatgtt tttgttgctt 300

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agcttaattt tttttatgtt taatccactt aaataaaatt ccaattatat aatattccaa 420

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atcaacgtct aatgatgtta cagcttgacg ttgtgtgggc gttaccatta tttgtcagac 1020

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gcttttattc ataagtgttt ctattgctgt acatttgact gtctgcatca ggtgaagtgt 3660

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aaaaatatct attcaaatat tatttactgt catcaaggaa aagataaaat aaatcagtta 4080

ttagaaataa gtttttaaaa ctattatact tagaaatgtg ctgaaacaat cttcctagaa 4140

cagaacagaa attggggaaa aaataaacaa aaataaataa atctatctat ctatagtgtg 4200

tataatgtgt gtagtgagta tgtttaaaat aggtcaacta atatgttcat aataaaaata 4260

cagcatcaat ggtttgggtg tttttagatc caaaggtctt aaacgtggtt attgctggtt 4320

gttcagtttt ttctaggctc taagaaaaat cattttagaa actgtaactg tttccttatc 4380

catctgaatt ccacctttgg gatgtagtgg aacgggagat caactgcatg atgctatcaa 4440

gtcaatatgg atcaaaatct caggaatatt tccaggacct tattgaatct atgccatgaa 4500

ggattaaggc agttctgaaa ggggaaatgc ggtttaaccc ggtaatagca aggtgtacct 4560

aataaagtgg ccggtgagtg tatatattgt tattgtttca ccttcagaaa tgacatatct 4620

agacaatagt ttcctttttc ttttttaatt attgtacttc tgtaagattc ttcaatgttc 4680

aatggttttc ttatgttaaa ggcgcagagc tgtagtttta gtgaagtaac agcattccgt 4740

tgaccaaagc tgacagatga aggagagtca gttctgacct tgcagttgtc agtcacaatt 4800

aagcctggtt tggttacaag ttaaacgtag acctgcttgt ggtcaggatc atcctttaaa 4860

agaactagat ttgtttttaa caatttgtaa ccggtgtgct ctgaagtgtc ttaaataaag 4920

catataggaa gcaaagcagt gaaaaatgtt ccttataatc tacgagcatt agcttaaatg 4980

tataaacaaa ataatattaa ttgtgtgttc agatcaaata taggtattgt tacacctaaa 5040

ataaacccat tgctttaaaa aataattaaa cacagtgtac aatattagca tacttcctct 5100

gacatctcta agtaaaacaa gagctttcac gatttactca ctgacccatc ttacagcact 5160

tctctgtgaa tttaggccat cacaaatgct gtgcccagtt ctctgactgg gtttgacagt 5220

cgcccatctg tgtccagcag tctgatgagc tcatcctctg taaatctggc tggctgccgt 5280

gttgttttgt gtctgtccgt gagtctctct ggccttcata cactcctctg ctacttcata 5340

gactgctgat gagtgcagag gccaaaccat tagtgctttt cttttttttt agacctcagt 5400

aatgcacaac aatgcaaaac aagtagattg agccttttgt tctttggact gagcatttgg 5460

ttagaatagc ttgaagggat agttagaaga tattttgaag ggaaactaaa aacctgttac 5520

catttgacat ccaaagaagg aaaactaata tgattgagtg gttacagatt tccaacactt 5580

ttcaacatat attattttgt gttccactaa agaaacagtc aaatattata ctgtcaacca 5640

aagtactgca cttgactcaa aaaagctctg cagcaagttg cctcttattc taggtcgagt 5700

caaccttttt ttctctctct ctgtcggttc attcaaggtt cagtaaatga tgacagaatt 5760

ttcagctttt attttgggtg aactaaccct ttatatattt gttgtaagtt tatttttctg 5820

tatattataa atatattagc aacataattc taagctacac ttgtacccaa tcaagggtca 5880

cactttattt tgatggtatg tttgtttgaa tttaagttac attgcatcta catgtcaact 5940

aattctcatt agattataag aagactgtta ggttggggtt agtgtaagtt gacatgtact 6000

tgcaaagttt ctcagagtca gttaaatgtc tgttttgtag cagtattaac agatattaag 6060

cacactgtat attaatactc aaatgaaccg tcaaaataaa gtgttaccgt aaaaattatt 6120

tccacatctc aaggtagctt tatgaggaaa gttttcttta agattagttt cttcgaacaa 6180

acttgcatgt taaatatgtg ctcagatatg gggcacacag acaaaatgtt tattggacga 6240

ataacccctt taacagttaa ccagcatttt ttaaagggat agtcagaaga tattttgaag 6300

gaaactaaaa acctgtaacc attcgacaat cgaagaaggt aaaagaaata tgatagagta 6360

gttacagttt ttcaacactc tttataatat attgtttagt attcaactga agaaatagtc 6420

aaacacactg taaaaaaagt tggtttaaat tgactcaact ttcaactcaa gtatagtact 6480

tgacttgatt taagttgagt taactagact aaactaaaag cactaaaagc actgcggcaa 6540

gtcgcctttc aattttaggt tgagtaaatt attattattt ttttttacag ttcaggttca 6600

gtaaatgata acataatttt cagttttggg tgaactatcc ctttatatat ttgttgtaag 6660

ttaatttttc tgtaaattat aaattaatta gcaaaaaagc tgcacttctt caccattaat 6720

taattaatac atctcaaagt agctttataa ggaaagtttt ctttaattat gtttctttgc 6780

atgttaaaat tgtgctcaga tatggagcac acaagcaaaa tgtttattgg atgaataacc 6840

cctttaacat ttaaccagca tgagttcaag taaacaaatc aattcctatg atttttctgc 6900

taaaccgata taaatcagtg ctgctgaaga gcatgtgtgt gatgttctca gatcagcaca 6960

aaagagggag cgccagtttc ttttaataat gaagaattac gtaatcacct cctgtgttcc 7020

ctgaaaccat taaactccca gacagaacaa aactgtgact gagaaagcag agcaactccg 7080

gagtaactca gaagatctgc aaaccaactc tttagcatga ggtaagagag aattaaagtc 7140

caatatcagt gctgatgcca tctcagtctc tctatttctg tgttccagca gggtatgaat 7200

aggattttct ctgactcact gtgaaaagag gcagtcagga gactggctgg acaagcacaa 7260

acaattgcgg gctcacaaac accccctcgg cctttgccct ccccatcaga ccccccctct 7320

ctctttcacc ccccacatca actctataaa aacccagagt tcacccgcac tcgatctcat 7380

tctcctccac catggagtcc cagcgttcct gtcgac 7416

<210> 3

<211> 711

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> mCherry

<400> 3

atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60

gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120

cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180

ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240

cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300

gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaagac 360

ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420

atgcagaaaa aaaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480

gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540

gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600

aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660

cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagta a 711

<210> 4

<211> 241

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> U6启动子

<400> 4

gtcctttcca caagatatat aaagccaaga aatcgaaata ctttcaagtt acggtaagca 60

tatgatagtc cattttaaaa cataatttta aaactgcaaa ctacccaaga aattattact 120

ttctacgtca cgtattttgt actaatatct ttgtgtttac agtcaaatta attccaatta 180

tctctctaac agccttgtat cgtatatgca aatatgaagg aatcatggga aataggccct 240

c 241

Claims (10)

1.一种基因敲除载体，其特征在于，所述基因敲除载体为将目的序列连入可表达CRISPR-Cas9基因编辑系统相关酶的质粒获得，所述目的序列选自如下序列中的至少一种：

rb1:TGCATGGAGAATATGGGAGA；

nf1:GGCGCACAAGCCCGTGGAAT；

tp53:TGATTGTGAGGATGGGCCTG。。

2.根据权利要求1所述的基因敲除载体，其特征在于：所述可表达CRISPR-Cas9基因编辑系统相关酶的质粒为Cas9-pXT7质粒；

和/或，所述基因敲除载体还含有标记基因mCherry。

3.根据权利要求1所述的基因敲除载体，其特征在于：所述基因敲除载体还含有GFAP启动子启动的CAS9蛋白序列、融合蛋白P2A序列、标记基因mCherry、U6启动子启动的gRNA。

4.根据权利要求3所述的基因敲除载体，其特征在于：所述基因敲除载体序列如SEQ IDNO.1所示。

5.根据权利要求1-4任一项所述基因敲除载体在构建胶质瘤动物模型中的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述动物模型包括鱼、鼠、兔，优选为斑马鱼。

7.一种建立斑马鱼胶质瘤模型的方法，包括如下步骤：

1)确立p53、Rb1和Nf1基因打靶位点以及打靶序列，合成gRNA；

p53、Rb1和Nf1基因含有如下目标序列：

rb1:TGCATGGAGAATATGGGAGA；

nf1:GGCGCACAAGCCCGTGGAAT；

tp53:TGATTGTGAGGATGGGCCTG；

2)构建基因敲除转座重组载体；

3)将基因敲除转座重组载体和Tol2mRNA共同注射入斑马鱼单细胞期受精卵中，实现目的基因整合进入基因组；

4)筛选并鉴定出能够稳定敲除上述三种基因的纯种斑马鱼；

5)筛选出双基因或多基因敲除的纯系斑马鱼。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤2)中，所述重组载体包括GFAP启动子启动的CAS9蛋白序列、融合蛋白P2A序列、标记基因mCherry、U6启动子启动的gRNA；

和/或，所述重组载体序列如SEQ ID NO.1所示；

和/或，步骤2)中所构建的重组载体Cas9的启动子为GFAP，序列如SEQ ID NO.2所示；

和/或，步骤2)中所构建的重组载体的筛选基因为红色荧光蛋白mCherry，序列如SEQID NO.3所示；

和/或，步骤2)中所构建的重组载体靶位点的启动子为U6启动子，序列如SEQ ID NO.4所示。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤4)中，获得单敲斑马鱼纯合体F3的步骤如下：选择生殖细胞中表达红色荧光的嵌合体F0代，培养至成鱼，剪尾T7E1检测基因敲除情况，将基因被敲除的F0代和野生型斑马鱼进行杂交，后代中如果仍然有荧光且基因被敲除的个体，属于杂合体F1，将杂合体F1的单个个体与野生型斑马鱼再次进行杂交，后代中仍然有荧光且基因被敲除的个体为杂合体F2，将杂合体F2中的雌鱼和雄鱼进行杂交，在杂交得到的后代中，筛选得到GFAP启动子启动特定荧光蛋白表达且组织特异性基因敲除的斑马鱼的纯合体F3，运用T7E1检测获得纯合敲除基因型斑马鱼。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤5)中，将单基因敲除的纯合斑马鱼进行两两杂交，获得双基因敲除的纯合斑马鱼，再将双基因敲除的斑马鱼与另一单基因敲除的纯合斑马鱼杂交，获得多基因敲除的斑马鱼胶质瘤模型。