CN107988075B - 一种从水体中筛选产生高活性细菌挥发物的菌种的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从水体中筛选产生高活性细菌挥发物的菌种的方法。本发明方法是将环境水样分别装入第一样品瓶和第二样品瓶中；以LB平板涂布法分离获得环境水样中细菌的菌苔，以LB摇瓶发酵法制备受试菌的菌悬液；将菌苔接入第二样品瓶中，将菌悬液接入第一样品瓶中，再将第二样品瓶置于第一样品瓶中，密封第一样品瓶瓶口，置于恒温摇床发酵培养；测定第一样品瓶中的菌悬液的吸光值，根据吸光值计算得到的抑制率或促进率的值，筛选得到产生高活性细菌挥发物的菌种。本发明方法可快速筛选得到水体环境中可产生高活性细菌挥发物的菌种，为水体微生物资源开发提供了新的方法和材料，且本发明方法可实现模块化、流程化操作，具有良好的应用前景。

Description

一种从水体中筛选产生高活性细菌挥发物的菌种的方法

技术领域

本发明属微生物资源开发技术领域，更具体地说，本发明涉及一种从水体中筛选产生高活性细菌挥发物的菌种的方法。

背景技术

挥发性物质是一类低分子量(＜300u)、在常温常压下易蒸发的化合物。尽管微生物学家很早就开始认识到细菌可以产生特有的气味物质，但这些挥发性物质的多样性和复杂性是以往微生物学家所忽视的。前人关于细菌产生的挥发性物质的研究主要集中在食物发酵和腐败过程中由细菌产生的芳香气味和臭味或者是建筑材料产生的霉味，而对于细菌产生挥发性物质的能力和效率研究较少。近年来，人们发现细菌产生的挥发性物质可以抑制或促进其他生物(包括真菌、植物和动物等)的生长和代谢，并且已发现了很多可以防治植物病虫害、促进植物生长等可提高作物产量的挥发性物质，因此对细菌挥发物产生了越来越浓厚的兴趣。

随着气质联用和其他鉴定技术的飞速发展，可以定性或定量地鉴定出细菌产生的大部分主要的挥发性物质。Schulz(2007)和Korpi(2009)等对前人报道的细菌挥发性物质进行了总结分析，发现不同种类的细菌共产生了200种以上有机化合物，包括脂肪酸衍生物、芳香族化合物、含氮化合物、含硫化合物、萜类化合物和含硒(或其他非金属元素)化合物等。还有很多细菌产生的挥发性物质未能得到结构鉴定，其生物活性也尚处于初级研究阶段。这些数据充分说明了细菌挥发性物成分的复杂多样，可作为某些特殊生物学功能化合物的一个重要来源。

迄今为止，还未见有针对水体环境中细菌活性挥发物质的研究体系报道，更未见有水体细菌挥发物快速筛选的专利申请。正如植物真菌病防治的迫切需求一样，水产养殖动物细菌病的防治任务十分重大而紧迫。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种从水体中筛选产生高活性细菌挥发物的菌种的方法，为水体微生物资源开发提供了新的方法和材料。

为了实现上述发明目的，本发明提供了一种从水体中筛选产生高活性细菌挥发物的菌种的方法，其包括如下步骤：

S1、将环境水样分别装入第一样品瓶和第二样品瓶中，所述环境水样、第一样品瓶和第二样品瓶均为无菌，所述第二样品瓶可容置于第一样品瓶中；

S2、以LB平板涂布法分离获得环境水样中细菌的菌苔，以LB摇瓶发酵法制备受试菌的菌悬液；

S3、将所述菌苔接入第二样品瓶中，将菌悬液接入第一样品瓶中，将第二样品瓶置于第一样品瓶中，密封第一样品瓶瓶口，置于恒温摇床发酵培养；

S4、以不接种菌苔作为空白对照，用酶标仪法测定第一样品瓶中的菌悬液的吸光值，根据吸光值计算得到的抑制率或促进率的值，筛选得到产生高活性细菌挥发物的菌种。

本发明的技术原理为：在瓶壁阻隔作用下，第二样品瓶中的环境水样的细菌(目标菌株)与第一样品瓶中的受试菌株不发生直接接触，仅允许上部气相部分有双向传质作用即间接接触。当前者产生的细菌挥发物在自身水相中达到一定浓度后，会逃逸入气相并传质进入后者的水相中，进而与后者的受试菌株发生作用，表现出促进生长、抑制生长或无明显影响等现象。据此确定目标菌株产生活性细菌挥发物的潜力。

优选地，所述环境水样中含有微生物生长所需的碳源、氮源、P、S及其它无机矿物类元素，包括但不限于水产养殖废水、生活污水、天然水体或人工配水。

优选地，所述第一样品瓶的体积为6～200mL，所述第二样品瓶的体积为3～20mL。

优选地，所述以LB平板涂布法分离获得环境水样中细菌的菌苔的方法包括如下步骤：将环境水样10倍梯度稀释，分别均匀涂布至LB平板上，然后倒置，于30～55℃下培养1～5天，以接种环挑取半环单个新长出的菌落，得到菌苔。

优选地，所述以LB摇瓶发酵法制备受试菌的菌悬液的方法包括如下步骤：挑取受试菌，接入LB液体培养基中，于30～55℃下摇床培养8～24h，得到菌悬液。

优选地，所述菌悬液接入第一样品瓶的量为10～200μL。

优选地，所述密封为螺纹密封，需要说明的是，当螺纹密封时，与第一样品瓶相匹配的盖子也应为无菌。

优选地，所述恒温摇床发酵培养的条件是：30～55℃培养12～48h。

优选地，所述酶标仪法检测可采用本领域常规步骤，具体可以如下：以无菌排枪取菌悬液于96孔板(或6孔、12孔、24孔板等)，利用酶标仪检测各孔在600nm波长下的吸光值；所述抑制率的计算公式为：抑制率(％)＝(OD_600空白组-OD_600试验组)/OD_600空白组×100；所述促进率的计算公式为：促进率(％)＝(OD_600试验组-OD_600空白组)/OD_600空白组×100。

优选地，以抑制率/促进率大于20％的受试菌作为筛选得到的产生高活性细菌挥发物的菌种，也可以抑制率/促进率排位前3位的孔中所接种的受试菌作为筛选得到的产生高活性细菌挥发物的菌种。

相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：

(1)本发明为从水体环境中筛选产活性挥发物微生物种质资源提供了新方法。

(2)本发明构建了适用于水体环境中活性挥发物产生菌株筛选的系统，详见图1，适用于水环境中细菌挥发物的研究。

(3)本发明方法可实现模块化和流程化操作，可满足从水体环境中快速筛选活性挥发物产生菌株的要求，为产活性挥发物的菌种资源挖掘提供了强有力技术手段。

(4)本发明方法快速、简便，兼具有重要的理论研究和生产实践价值，值得推广。

附图说明

图1适用于水环境中细菌挥发物的研究的系统。

图2为从养殖水体中筛选对常见鱼类致病菌有抑制活性的菌株。

图3为从天然水体中筛选对污染物降解菌有促进作用的菌株。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。

如无特别说明，以下实施例中使用的试剂和材料均为市售商品。

实施例中使用的第一样品瓶为螺纹密封型。

实施例1

(1)将水产养殖废水400mL、第二样品瓶51只(体积为6mL)、第一样品瓶51只(体积为20mL)、第一样品瓶的带内衬垫螺纹盖等分别装在灭菌盒中于121℃灭菌30min。以无菌排枪取3mL水产养殖废水分别加入上述样品瓶中。

(2)称取商品化LB琼脂粉36g，加入蒸馏水1L，溶解后分装三角瓶，121℃灭菌15min，待冷至50℃左右倾注平板，备用。取1mL水产养殖废水(未灭菌)，10倍梯度稀释获得10^-1～10^-7浓度样品，采用涂布棒将之均匀涂布在上述平板上，然后倒置于30℃培养箱中培养2d，观察菌落生长情况。以接种环挑取半环新长出的不同色泽、性状和大小的16个单菌落(依次编号为BS1～BS16)逐一接入第二样品瓶中。

(3)称取商品化LB粉25g，加入蒸馏水1L，溶解后分装三角瓶，121℃灭菌15min，冷却备用。以接种环挑取一环斜面保藏的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)接入三角瓶中，然后置于30℃摇床中培养16h，观察菌悬液生长情况。

以无菌排枪取20μL菌悬液加入第一样品瓶中，然后将第二样品瓶置于第一样品瓶内，并以已灭菌的带内衬垫螺纹盖密封第一品瓶。于30℃摇床发酵培养48h。每个样品设置三个重复，以不接种菌苔为空白对照。

(4)以无菌排枪取经培养后的第一样品瓶中菌悬液于96孔板中，利用酶标仪快速检测各孔在600nm波长下的吸光值，并保存和下载数据结果。

(5)将步骤(4)相应数据代入计算式：抑制率(％)＝(OD_600空白组-OD_600试验组)/OD_600空白组×100，得到抑制率结果见图2。将此结果按照大小排序，取抑制率排位前3位的孔中所接种菌苔作为目标菌株，即BS1、BS5和BS11。

本实施例的特点是：适用于从养殖水体环境中快速筛选对常见鱼类致病菌有抑制作用的功能菌株。

实施例2

(1)将河水100mL、第二样品瓶9只(体积为6mL)、第一样品瓶9只(体积为20mL)、第一样品瓶的带内衬垫螺纹盖等分别装在灭菌盒中于121℃灭菌30min。以无菌排枪取3mL河水分别加入上述样品瓶中。

(2)称取商品化LB琼脂粉36g，加入蒸馏水1L，溶解后分装三角瓶，121℃灭菌15min，待冷至50℃左右倾注平板，备用。取1mL河水(未灭菌)，10倍梯度稀释获得10^-1～10^-7浓度样品，采用涂布棒将之均匀涂布在上述平板上，然后倒置于30℃培养箱中培养2d，观察菌落生长情况。以接种环挑取半环新长出的不同性状和大小的2个单菌落(依次编号为H1～H2)逐一接入第二样品瓶中。

(3)称取商品化LB粉25g，加入蒸馏水1L，溶解后分装三角瓶，121℃灭菌15min，冷却备用。以接种环挑取一环斜面保藏的疏水鞘氨醇杆菌(Sphingobium hydrophobicum，具有降解多环芳烃和多溴联苯醚等有机污染物的功能)接入三角瓶中，然后置于30℃摇床中培养16h，观察菌悬液生长情况。

以无菌排枪取20μL菌悬液加入第一样品瓶中，然后将第二样品瓶置于第一样品瓶内，并以已灭菌的带内衬垫螺纹盖密封第一品瓶。于30℃摇床发酵培养48h。每个样品设置三个重复，以不接种菌苔为空白对照。

(4)以无菌排枪取经培养后的第一样品瓶中菌悬液于96孔板中，利用酶标仪快速检测各孔在600nm波长下的吸光值，并保存和下载数据结果。

(5)将步骤(4)相应数据代入计算式：促进率(％)＝(OD_600试验组-OD_600空白组)/OD_600空白组×100，得到促进率结果见图3。取此结果中促进率大于20％的孔中所接种菌苔作为目标菌株，即H2。

本实施例的特点是：适用于从天然水体中筛选对污染物降解菌有促进作用的功能菌株。

根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (9)

1.一种从水体中筛选产生高活性细菌挥发物的菌种的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、将环境水样分别装入第一样品瓶和第二样品瓶中，所述环境水样、第一样品瓶和第二样品瓶均为无菌，所述第二样品瓶容置于第一样品瓶中；

S2、以LB平板涂布法分离获得环境水样中细菌的菌苔，以LB摇瓶发酵法制备受试菌的菌悬液；

S3、将所述菌苔接入第二样品瓶中，将菌悬液接入第一样品瓶中，将第二样品瓶置于第一样品瓶中，密封第一样品瓶瓶口，置于恒温摇床发酵培养；

S4、以不接种菌苔作为空白对照，用酶标仪法测定第一样品瓶中的菌悬液的吸光值，根据吸光值计算得到的抑制率或促进率的值，以抑制率/促进率大于20%或从大到小排序前3位的受试菌作为筛选得到的产生高活性细菌挥发物的菌种。

2.根据权利要求1所述的从水体中筛选产生高活性细菌挥发物的菌种的方法，其特征在于，所述环境水样为水产养殖废水、生活污水、天然水体或人工配水。

3.根据权利要求1所述的从水体中筛选产生高活性细菌挥发物的菌种的方法，其特征在于，所述第一样品瓶的体积为6~200mL，所述第二样品瓶的体积为3~20mL。

4.根据权利要求1所述的从水体中筛选产生高活性细菌挥发物的菌种的方法，其特征在于，所述以LB平板涂布法分离获得环境水样中细菌的菌苔的方法包括如下步骤：

将环境水样10倍梯度稀释，分别均匀涂布至LB平板上，然后倒置，于30~55℃下培养1~5天，得到菌苔。

5.根据权利要求1所述的从水体中筛选产生高活性细菌挥发物的菌种的方法，其特征在于，所述以LB摇瓶发酵法制备受试菌的菌悬液的方法包括如下步骤：

挑取受试菌，接入LB液体培养基中，于30~55℃下摇床培养8~24h，得到菌悬液。

6.根据权利要求1所述的从水体中筛选产生高活性细菌挥发物的菌种的方法，其特征在于，所述菌悬液接入第一样品瓶的量为10~200μL。

7.根据权利要求1所述的从水体中筛选产生高活性细菌挥发物的菌种的方法，其特征在于，所述密封为螺纹密封。

8.根据权利要求1所述的从水体中筛选产生高活性细菌挥发物的菌种的方法，其特征在于，所述恒温摇床发酵培养的条件是：30~55℃培养12~48h。

9.根据权利要求1所述的从水体中筛选产生高活性细菌挥发物的菌种的方法，其特征在于，所述抑制率的计算公式为：

抑制率(%)=(OD_{600 空白组}-OD_{600 试验组})/OD_600空白组×100；

所述促进率的计算公式为：

促进率(%)=(OD_{600 试验组}-OD_{600 空白组})/OD_600空白组×100。

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