CN107976411A

CN107976411A - 包含别构转录因子调控系统的生物传感器、试剂盒及其在小分子检测中的用途

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Publication number: CN107976411A
Application number: CN201610934491.6A
Authority: CN
Inventors: 杨克迁; 王为善; 李珊珊; 范可强; 李子龙
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2016-10-25
Filing date: 2016-10-25
Publication date: 2018-05-01
Anticipated expiration: 2036-10-25
Also published as: CN107976411B

Abstract

本发明涉及包含别构转录调控系统的生物传感器、试剂盒及其在小分子检测中的用途。

Description

包含别构转录因子调控系统的生物传感器、试剂盒及其在小分子检测中的用途

技术领域

本发明属于生物检测领域，涉及借助别构转录因子(allosteric transcriptionfactor，aTF)与DNA的相互作用，对样品中是否存在特定种类的小分子进行检测的体外(invitro)方法、试剂盒和设备。

背景技术

对样品中小分子的有效检测对于环境污染监控、食品质量控制和疾病诊断等都极为重要。现有技术中的小分子检测方法主要分为两大类，理化分析方法和生物分析方法。理化分析方法主要通过波谱法、色谱法及其联用技术。这些技术分离效能高、选择性好、定性和定量能力强。然而，其样品制备过程复杂，仪器价格昂贵，耗时长。即便熟练的操作人员也需要较长时间才能获得结果，且不适用于现场分析。

生物分析方法通常借助生物体内已有的小分子与蛋白/核酸的特异性相互作用，在较小的体系或芯片上实现信号的生成、放大、信号转换和读出。这样的方法能够实现现场、实时检测。特别地，现有技术通常模拟激动剂/拮抗剂-受体、或者抗原-抗体相互作用对，利用与小分子相互作用的受体或抗体对小分子进行抓取。或者，通过筛选获得能够与小分子发生特异性相互作用的核酸(例如适体)，实现对小分子的特异性识别。随后，通过抗体级联放大、石英晶体微量天平等方式，将此类相互作用的信号转化并放大为光/电信号，从而读出小分子是否存在和/或浓度的信息。然而，本领域所惯用的信号生成和换能元件并不能同时满足检测所需的灵敏度和特异性需求。特别是例如在使用最常用的一抗/二抗放大方式时，由于该放大过程为非定量，这样的方法大多仅能实现定性检测。此外，采用激动剂/拮抗剂-受体或者抗原-抗体作为识别元件所能够检测的小分子种类是有限的，某些疾病特异性指征或环境污染物并无相应的受体或抗体。

为了获得更大的待检测物范围，已经提出利用真核或原核细胞自身的转录调控系统进行小分子检测。例如，在可被小分子诱导的启动子下游连入荧光蛋白，借助细胞自身的转录翻译机器进行信号放大，通过检测诱导曲线-荧光强度获得小分子的浓度的信息。此类方法可使用的识别元件为包括乳糖操纵子、阿拉伯糖操纵子、水杨酸诱导型启动子等在内的转录调控系统。然而，上述方法均使用全细胞系统。由于荧光蛋白的生成与细胞的密度、生理状况等密切相关，上述方法的检测稳定性较差。另一方面，此类检测系统的检测下限不仅取决于诱导物与反式作用因子的相互作用，还受到细胞的转录机器的限制，诱导型启动子常常出现的渗透表达等问题使得检测下限的降低更加困难。

就这一点而言，本领域仍然需要针对特定小分子的兼顾灵敏度和特异性、且可定量范围较宽的检测方法。

发明内容

在第一方面，本发明提供了一种用于检测小分子的生物传感器，所述生物传感器包含识别元件和换能元件，其中，

所述识别元件由别构转录因子和DNA片段组成，所述DNA片段包含与所述别构转录因子作用的位点，所述别构转录因子与所述小分子的结合使得所述别构转录因子与所述DNA片段的结合亲和力升高或降低；以及

所述识别元件和所述换能元件均以液相形式提供。

在第二方面，本发明提供了一种用于检测小分子的试剂盒，所述试剂盒包含识别元件和换能元件，其中，

所述识别元件和所述换能元件均以液相形式提供。

在第三方面，本发明提供了别构转录因子在制备用于检测小分子的试剂盒中的用途，所述试剂盒包含识别元件和换能元件，其中，

所述识别元件和所述换能元件均以液相形式提供。

在第四方面，本发明提供了一种对样品中的小分子进行检测的方法，所述方法包含如下步骤：

(a)提供检测用溶液，所述检测用溶液包含识别元件以及换能元件，其中，

所述识别元件由别构转录因子和DNA片段组成，所述DNA片段包含与所述别构转录因子作用的位点，所述别构转录因子与所述小分子的结合使得所述别构转录因子与所述DNA片段的结合亲和力升高或降低；

(b)将所述样品与所述检测用溶液混合；以及

(c)对步骤(b)获得的混合物进行检测，

其中，步骤(a)-(c)全部在液相实施。

有益效果

本发明利用别构转录因子与其靶DNA片段(包含该别构转录因子作用位点的DNA片段)以及效应物小分子的体外相互作用，将小分子的有无或浓度的信息转换为别构转录因子-靶DNA-小分子三者相互作用的结合信号，随后可通过多种本领域已知的简单的换能方式将该相互作用信号转化放大为可检测的光学信号等。

本领域已知多种天然存在和人工改造的别构转录因子-靶DNA/效应物相互作用，也已知多种诱导和阻遏类型的基因调控系统元件。这些基因调控系统元件均可用于本发明。就这一点而言，本发明的方法能够实现针对多种效应物小分子，特别是针对酶-底物反应、受体-小分子反应或抗体-抗原反应所难以覆盖的小分子的检测，因此在生物医学研究、疾病诊断、环境监测和食品卫生检测等方面均具有广阔的应用和应用前景。另一方面，对于同时能够作为酶-底物方式和本发明的别构转录因子-效应物方式的检测对象的小分子而言，由于与酶-底物的平衡解离常数K_D相比，别构转录因子-效应物的平衡解离常数数值相当或更低，本发明方法的检测灵敏度等同于甚至优于采用酶-底物机制的生物传感器。

与现有技术的全细胞生物传感器(Whole cell biosensor)不同的是，本发明传感器的识别和换能元件均为体外存在的非细胞体系，有效避免了细胞状态、密度和单细胞间差异对检测结果的干扰以及由于采用细胞转录机制作为换能元件造成的检测灵敏度不佳的问题。

本发明采用能够产生相互作用的别构转录因子与DNA作为识别元件的优势还在于，能够与多种本领域中成熟完善且简单易行的换能和定量放大技术相结合，实现信号的转换与放大，使得小分子定量检测的敏感度、准确度均得到大幅度提升，且线性范围更宽、工作条件要求更低。例如，如本发明实施例所展示的，作为本发明一个实施方式的用于检测尿酸的生物传感器能够实现低至1nM的检测阈值，与现有的多种生物传感器相比，检测阈值降低10-125,000倍。

特别地，本发明的识别元件和换能元件均以液相形式提供，本发明的检测方法和生物传感器也不涉及将识别元件或换能元件固定在固相表面，使得样品流经表面时发生可能的结合，再用流体将残留的样品带走的固相-液相相互作用。采用固相-液相相互作用的缺陷在于，被修饰在固相表面的识别元件和/或换能元件持续处于流体的静水压力下，常常会发生识别元件和/或换能元件部分脱离的现象，从而造成定量分析的不准确；而流体压力环境干扰小分子与识别元件的结合，降低了检测灵敏度。另外，固相-液相方式需要将蛋白和/或DNA修饰在固相表面，成本较高；虽然通过反复清洗的方式能够实现检测芯片的重复利用，然而，由于清洗很难完全彻底，也会出现检测结果不稳定或污染的问题。

优选地，本发明的生物传感器的性能可通过对与别构转录因子作用的DNA片段的序列进行优化而进一步得到改善。本领域已知能够对与特定蛋白相互作用的DNA序列进行定向进化的计算和实验方法。通过这样的方法，能够容易地进一步提高别构转录因子和DNA结合的解离常数，从而降低传感器的检测下限并扩大线性范围。因而，本发明的生物传感器、试剂盒及方法可在诊断目的或非诊断目的的多种应用中发挥作用。

附图说明

图1为根据本发明一些实施方式的检测方法的原理图。图1a示出根据实施例1-3的识别元件示意图，其中，别构转录因子为作为负控诱导系统的阻遏蛋白。图1b-1d为根据本发明实施例1-3的三种识别元件-换能元件组合方式的原理。(b)识别元件为别构转录因子以及包含该别构转录因子作用位点的DNA片段。换能元件为供体化合物和受体化合物。供体化合物和受体化合物分别偶联至别构转录因子及DNA片段。(c)识别元件为别构转录因子以及包含该别构转录因子作用位点的DNA片段。换能元件为供体化合物、受体化合物、第二蛋白以及同一DNA片段上的第二位点。供体化合物和受体化合物分别偶联至第二蛋白和DNA片段。(d)识别元件为别构转录因子以及包含该别构转录因子作用位点的DNA片段。换能元件为供体化合物、受体化合物、核酸酶及其作用位点。左图中核酸酶为核酸外切酶，DNA片段包含3’或5’悬垂，右图中核酸酶为核酸内切酶，DNA片段包含限制性酶切位点。供体化合物和受体化合物纳米颗粒分别连接至DNA各链的同一端(即，均连接在3’端或均连接在5’端)。

图2示出根据实施例1的尿酸生物传感器。(a)尿酸生物传感器的原理。其中，HucR与hucO为识别元件，ALPHA供体微珠和受体微珠为换能元件。(b)野生型hucO及各hucO突变体的序列及其与HucR的平衡解离常数K_D。(c)B_UA-0、B_UA-3、B_UA-8、B_UA-11以及B_UA-19生物传感器的性能，示出各生物传感器的线性范围和检测下限(LOD)。误差棒为三次独立取样的标准偏差。

图3示出根据实施例2的土霉素生物传感器。(a)土霉素生物传感器的原理。其中，OtrR与otrO为识别元件，ALPHA供体微珠和受体微珠为第一换能元件，HucR与hucO为第二换能元件。(b)野生型otrO及各突变体otrO的序列及其与OtrR的平衡解离常数K_D。(c)各土霉素生物传感器的性能，示出各生物传感器的线性范围和检测下限(LOD)。误差棒为三次独立取样的标准偏差。

图4示出根据实施例3的普那霉素生物传感器。(a)利用核酸外切酶的普那霉素生物传感器的原理。其中，Pip与ptr为识别元件，纳米金颗粒对为第一换能元件，核酸外切酶III及其识别的3’末端较短的黏性末端为第二换能元件。(b)利用核酸内切酶的普那霉素生物传感器的原理。其中，Pip与ptr为识别元件，纳米金颗粒对为第一换能元件，核酸内切酶HindIII及HindIII限制性酶切位点为第二换能元件。(c)利用核酸外切酶的普那霉素生物传感器的性能。(d)利用核酸内切酶的普那霉素生物传感器的性能。示出各生物传感器的线性范围和检测下限(LOD)。误差棒为三次独立取样的标准偏差。

具体实施方式

如上所述，本发明利用别构转录因子与包含该别构转录因子作用位点的DNA片段作为对效应物小分子进行检测的信号识别元件，将小分子的浓度转换为别构转录因子-DNA片段结合信号，并可结合已知的多种对蛋白-DNA结合信号进行转换放大的换能元件，实现小分子的检测。

本发明所使用的术语“别构转录因子”具有本领域公知的含义。别构转录因子包含与效应物(通常为小分子)结合的结构域以及DNA结合结构域，其与效应物的结合引起构象改变，使得该别构转录因子和与其特异性相互作用的DNA片段(通常为启动子操纵序列)的结合亲和力发生改变，从而增强或减弱由该操纵序列控制的DNA序列的转录(NatMethods.2016，13(2)：177–183)，通过这样的方式使得基因的转录依赖于小分子的浓度。在原核生物中，此类操纵序列通常出现在可被调节的与代谢有关的操纵子或报告基因的上游；别构转录因子常常起到针对细胞内效应物小分子的传感器的作用，反馈小分子的浓度信息，从而对细胞内的生物合成途径进行动态调控。在真核生物中，此类别构转录因子通常存在于控制细胞分化与个体发育的通路中。考虑到本发明中别构转录因子和DNA的相互作用发生在体外，原核和真核来源的别构转录因子均可用于本发明。不希望被理论所限地，与转录因子作用的DNA片段通常为双链DNA片段。

如上所述，别构转录因子与小分子的结合可使得被调控基因的表达升高或降低。因此，取决于所采用的特定转录调控系统，别构转录因子与效应物小分子的结合可使得其与DNA的结合亲和力增强或者减弱。例如，在色氨酸操纵子中，效应物小分子色氨酸与别构转录因子TrpR的结合使得TrpR与操纵序列的亲和力增强，阻遏功能基因TrpE、TrpD、TrpC、TrpB和TrpA的生成；而在乳糖操纵子中，效应物小分子乳糖或其类似物与别构转录因子LacI的结合使得LacI与操纵序列的亲和力减弱，诱导功能基因LacX、LacY和LacA的生成。考虑到诱导或阻遏系统中别构转录因子与效应物的结合均使得别构转录因子与DNA的结合能力发生变化，诱导或阻遏系统的别构转录因子均可用作本发明的别构转录因子。在一些实施方式中，别构转录因子与小分子的结合使得别构转录因子与DNA的结合亲和力降低。在另一些实施方式中，别构转录因子与小分子的结合使得别构转录因子与DNA的结合亲和力升高。

天然转录系统中转录因子作用位点的序列是已知的。不同物种的转录因子结合位点长度略有不同。转录因子结合位点的平均长度在大肠杆菌中为24.5bp，在果蝇中为12.5bp(J Mol Biol.1998，284(2)：241-54；Nucleic Acids Res.2003，31(1)：374-8)。在本发明中与别构转录因子作用的DNA片段的长度没有特别限制，优选为10-150bp，更优选10-80bp。

本发明所使用的与别构转录因子作用的DNA片段并不限于在天然系统中存在的别构转录因子作用位点。通过对作用位点序列进行随机或定向突变，或者结合计算机模拟选出数条候选序列并验证别构转录因子与各DNA片段的结合能力是本领域成熟的技术(MolMicrobiol.2005，55(3)：712-23.)。另外，也可对别构转录因子的小分子结合结构域和/或DNA结合结构域进行突变，优化别构转录因子与小分子和/或DNA的结合亲和力。在优选的实施方式中，可通过定向突变和进化，提高别构转录因子和与该别构转录因子作用的DNA片段之间的平衡解离常数和/或降低别构转录因子与小分子之间的平衡解离常数，进一步提高本发明传感器的灵敏度。在一些实施方式中，所述别构转录因子与所述小分子结合的平衡解离常数大于所述别构转录因子与所述DNA片段结合的平衡解离常数(即，别构转录因子为负控诱导系统中的阻遏蛋白)；优选地，所述别构转录因子与所述小分子结合的平衡解离常数是所述别构转录因子与所述DNA片段结合的平衡解离常数的10-10000倍、优选20-5000倍、更优选50-1000倍。在另一些实施方式中，所述别构转录因子与所述小分子形成的复合物与所述DNA片段结合的平衡解离常数大于所述别构转录因子与所述DNA片段结合的平衡解离常数(即，别构转录因子为负控阻遏系统中的阻遏蛋白)；优选地，所述别构转录因子与所述小分子形成的复合物与所述DNA片段结合的平衡解离常数是所述别构转录因子与所述DNA片段结合的平衡解离常数的10-10000倍、优选20-5000倍、更优选50-1000倍。

在本发明中，作为检测对象的小分子为使得别构转录因子构象变化的效应物。一般而言，小分子的特征在于它含有数个碳-碳键，并具有大于约50道尔顿但小于约5000道尔顿(5kD)的分子量。优选小分子具有小于3kD的分子量。在本发明中，小分子可为例如环境指标、疾病指标或健康指标，包括但不限于重金属离子、药物、代谢物、污染物等。小分子可为存在于环境中或为细菌、真菌、植物或动物源性，或者为人工合成。甚至对于不存在相对应的别构转录因子的效应物小分子，本领域技术人员能够通过计算机模拟设计将效应物结合结构域添加至DNA结合结构域，或改造天然转录因子的效应物结合结构域，构建人工的别构转录因子(Nat Methods.2016，13(2)：177–183)。

在本发明中，待检测的小分子可存在于任何液体样品或可通过适当操作转换为液体样品的固体样品中。样品可为环境样品，例如为地下水、中水、海水、废水、采矿废料的样品。或者，样品可为生物样品，特别是来自受试者的样品，例如以下样品中的一种或多种：血液、血清、血浆、痰、脑脊液流体、尿液、泪液、肺泡分离物、胸膜液、囊液、组织、唾液。样品也可来自于食品、饮用水或饲料。

在一些实施方式中，可对样品进行预处理，从而对待检测的小分子进行富集和提取，或者去除可能干扰检测的杂质。例如，可通过离心、过滤、超声、匀浆化、加热、冷冻、解冻、机械处理或多种操作方法的组合，和/或加入预处理的试剂。本领域技术人员知晓针对特定样品的常见预处理方法和预处理试剂。例如，常用的预处理试剂包括表面活性剂和洗涤剂、盐、细胞裂解剂、抗凝血剂、降解酶(例如蛋白酶、脂酶、核酸酶、脂肪酶、胶原酶、纤维素酶、淀粉酶等)以及溶液(例如缓冲液)等。

表1列出了多种别构转录因子及包含其作用位点的DNA片段的序列，以及对应的效应物小分子。本领域技术人员能够理解的是，用于本发明的别构转录因子并不限于所列举的这些。另外，也可对与所列举的别构转录因子相互作用的DNA序列的一个或多个碱基进行替换、删除或加入一个或多个碱基，从而改变别构转录因子和与其相互作用的DNA序列的结合强度。

表1：示例性的别构转录因子、与其相互作用的DNA序列以及所对应的效应物

如上所述，本发明生物传感器在均相体系下使用别构转录因子及与其相互作用的DNA片段作为识别元件的优势在于，能够与本领域成熟并广泛使用的多种均相放大方式组合，并使用简单易行的方式对检测信号进行读取。就这一点而言，任何均相体系下对DNA-蛋白的亲和力进行定量放大并将其转换为可检测的光信号等的方式均可用作本发明的换能元件。换能元件例如但不限于借助能量转移原理的换能元件(例如为ALPHA技术的微珠、纳米颗粒和量子点)。

采用能量转移方式的换能元件包含能量供体化合物(简称为供体化合物)和能量受体化合物(简称受体化合物)。当二者彼此接近时，供体化合物和受体化合物发生能量共振，从而改变受体化合物的能态。本领域已知的能量转移方式可为：发生能量共振时(即，供体化合物和受体化合物空间上接近时)被激发的供体化合物将能量转移给受体化合物，使得受体化合物的荧光光谱发生改变，即发射光谱的改变(例如FRET、ALPHA技术)；或者，发生能量共振时受体化合物的吸收光谱发生改变(例如量子点、纳米颗粒)。

在一些实施方式中，本发明的换能元件为ALPHA技术的微珠。ALPHA为PerkinElmer开发的基于微珠对的均相亲和检测技术。ALPHA为Amplified Luminescent ProximityHomogeneous Assay的缩写，其测定原理在于，在680nm激光的激发下，供体微珠可以使周围环境中的氧分子转化成高能活跃的单体氧，在4微秒的半衰期内，单体氧在溶液中扩散触发距离200nm内的受体微珠上的化学分子，并瞬间激发一系列化学反应后最终使受体微珠产生520nm-620nm(AlphaScreen)或615nm(AlphaLISA)的光信号，产生的光信号与被检测物的浓度定量相关。ALPHA技术采用均相实验，无需分离和水洗步骤，可用于检测不同结合力的物质之间的相互作用，检测物范围涵盖小分子和复杂大分子，检测的可重复性高且操作简单，有可供使用的商用试剂盒。

在将ALPHA技术用于换能元件中时，可直接将ALPHA供体和受体珠各自直接偶联在别构转录因子及与其相互作用的DNA片段上，也可通过使得配偶体对的一个成员偶联在别构转录因子上，利用包被有该配偶体对另一成员的珠实现别构转录因子-ALPHA珠或DNA-ALPHA珠的偶联。例如，可在DNA上修饰生物素，并利用包被有链霉亲和素的供体或受体珠构建DNA-供体珠或DNA-受体珠。类似地，也可使得别构转录因子可操作地连接有链霉亲和素，并利用包被有生物素的供体或受体珠构建别构转录因子-供体珠或别构转录因子-受体珠。别构转录因子-珠和DNA-珠的偶联可使用相同或不同的机制。只要不影响别构转录因子与DNA及效应物的结合，可将供体珠或受体珠连接于别构转录因子的N端或C端。只要不影响DNA与别构转录因子的结合，可将供体珠或受体珠连接于DNA的5’端或3’端。可使用的配偶体对以及连接方式均为本领域所熟知，例如参见http://www.perkinelmer.com.cn/ Resources/TechnicalResources/ApplicationSupportKnowledgebase/AlphaLISA- AlphaScreen-no-washassays/alpha_products.xhtml。

除ALPHA技术微珠外，也可使用能量转移机制的其它化合物作为供体和受体，实现在供体-受体距离较近时发生能量转移，从而将效应物小分子导致的DNA与别构转录因子的结合/解离信号转换为光信号。本领域知晓的是，贵金属纳米颗粒(例如纳米金颗粒、纳米银颗粒等)具有良好的光学特性。当两个纳米颗粒的距离较近而发生团聚时发生表面等离子体共振，从而光谱发生红移和蓝移。以纳米金颗粒为例，团聚时吸收的波段从500nm左右变到近600nm或以上。由于溶液的颜色是未吸收的光波，因此未团聚前呈红色(蓝色-绿色的波段被吸收)，团聚后呈蓝色(绿色-红色的波段被吸收)。因此，能够通过对吸收光谱的观测获得DNA-蛋白结合信号。用纳米颗粒标记蛋白和/或DNA的方法为本领域所熟知。

类似地，量子点具有一元激发多元发射、发射波长随其粒径和组成可调、荧光量子产率高、耐光漂白等特点，其光谱性质使得在荧光共振能量转移中供体的激发波长的选择有很大灵活性；量子点狭窄、在红外光谱区没有拖尾的发射光谱可以大大减少它与受体发射光谱的重叠；可以选择受体发射光谱相对于供体荧光谱有很大红移的供体。适合作为本发明换能元件的量子点例如为CdSe-ZnS核-壳型量子点，可使用不同颜色的量子点分别作为供体和受体，或者仅将其作为供体，而选用荧光受体化合物(例如Texas Red)作为受体。将量子点连接至蛋白和DNA的方法也为本领域所熟知。

除可直接将上述供体化合物与受体化合物各自连接至DNA片段和别构转录因子，从而对DNA和别构转录因子的间距进行直接测量外，还可通过进一步添加第二换能元件改变信号输出方式。特别地，在使用负控诱导系统的阻遏蛋白作为别构转录因子并结合直接输出方式的传感器中，小分子的存在造成光信号下降；不存在小分子时较高的光信号使得光信号相对变化较小。为了进一步提高灵敏度，可通过设置第二换能元件，将第一换能元件偶联至第二换能元件，使得小分子的存在造成光信号的升高。

在一些实施方式中，所述第二换能元件包含DNA片段上与别构转录因子作用位点邻近的第二位点以及与该第二位点相互作用的第二蛋白，其中，供体化合物和受体化合物分别偶联至该DNA片段和第二蛋白。由于DNA片段上与别构转录因子作用的位点与第二位点相互邻近，使得别构转录因子与第二蛋白和DNA的结合存在竞争。小分子与别构转录因子的结合使得别构转录因子与DNA片段的结合亲和力降低，从而第二蛋白与DNA片段的结合概率升高，因此分别偶联至DNA片段和第二蛋白的供体化合物和受体化合物之间发生能量转移的概率升高，光信号增强。第二蛋白的类型没有特别限制，事实上，第二蛋白只要包含DNA作用位点，即能够实现与别构转录因子竞争性结合DNA片段的目的。例如，第二蛋白可为与所述别构转录因子不同的任何转录因子，第二位点可为第二蛋白作用序列。

在另一些实施方式中，所述第二换能元件包含DNA片段上与别构转录因子作用位点邻近的第二位点以及与该第二位点相互作用的第二蛋白，其中，供体化合物和受体化合物分别偶联至该DNA片段两条链的5’端，或者供体化合物和受体化合物分别偶联至该DNA片段两条链的3’端；其中，第二蛋白为核酸内切酶或核酸外切酶。别构转录因子与DNA片段的结合使得核酸酶难以作用于DNA片段。而当存在小分子时，别构转录因子从DNA片段脱离，核酸酶能够对双链序列进行切割，从而将供体化合物与受体化合物分离，不再发生能量转移。在第二蛋白为核酸外切酶时，第二位点为末端的单链位点。也就是说，取决于核酸外切酶的类型，DNA片段一条链的5’末端或3’末端多出数个不能配对的碱基(也称为悬垂末端(overhang))。优选地，悬垂末端具有3-6个碱基，优选5个碱基。在第二蛋白为核酸内切酶时，第二位点为限制性酶切位点，从而核酸内切酶能够特异性地识别并切割该位点，造成供体化合物和受体化合物的分离。

本文所述各方面的实施方式可由如下编号的段落说明：

1.一种用于检测小分子的生物传感器，所述生物传感器包含识别元件和换能元件，其中，

所述识别元件和所述换能元件均以液相形式提供。

2.如段落1所述的生物传感器，其中，所述小分子具有大于50道尔顿但小于5000道尔顿的分子量。

3.如段落1或2所述的生物传感器，其中，所述小分子为重金属离子、药物、代谢物或污染物。

4.如段落1-3中任一项所述的生物传感器，其中，所述别构转录因子与所述小分子结合的平衡解离常数大于所述别构转录因子与所述DNA片段结合的平衡解离常数。

5.如段落4所述的生物传感器，其中，所述别构转录因子与所述小分子结合的平衡解离常数是所述别构转录因子与所述DNA片段结合的平衡解离常数的10-10000倍、优选20-5000倍、更优选50-1000倍。

6.如段落1-3中任一项所述的生物传感器，其中，所述别构转录因子与所述小分子形成的复合物与所述DNA片段结合的平衡解离常数大于所述别构转录因子与所述DNA片段结合的平衡解离常数。

7.如段落6所述的生物传感器，其中，所述别构转录因子与所述小分子形成的复合物与所述DNA片段结合的平衡解离常数是所述别构转录因子与所述DNA片段结合的平衡解离常数的10-10000倍、优选20-5000倍、更优选50-1000倍。

8.如段落1-7中任一项所述的生物传感器，其中，所述DNA片段具有10-150bp，更优选10-80bp的长度。

9.如段落1-8中任一项所述的生物传感器，其中，所述换能元件将所述别构转录因子、所述小分子与所述DNA片段之间相互作用的信号转换并放大为可检测的光信号。

10.如段落9所述的生物传感器，其中，所述光信号是荧光信号或吸收光信号。

11.如段落10所述的生物传感器，其中，所述换能元件为能量供体化合物和能量受体化合物。

12.如段落11所述的生物传感器，其中，所述换能元件选自于ALPHA供体珠和受体珠、纳米颗粒和量子点。

13.如段落11或12所述的生物传感器，其中，所述能量供体化合物和所述能量受体化合物各自与所述DNA片段和所述别构转录因子相偶联。

14.如段落11或12所述的生物传感器，所述生物传感器进一步包含第二换能元件，所述第二换能元件包含位于所述DNA片段上的第二位点以及第二蛋白，所述第二蛋白能够与所述第二位点相互作用，所述能量供体化合物和所述能量受体化合物各自连接至所述DNA片段和所述第二蛋白，优选地，所述第二蛋白为与所述别构转录因子不同的第二转录因子。

15.如段落11或12所述的生物传感器，所述生物传感器进一步包含第二换能元件，所述第二换能元件包含位于所述DNA片段上的第二位点以及第二蛋白，所述第二蛋白能够与所述第二位点相互作用；所述能量供体化合物和所述能量受体化合物各自连接至所述DNA片段的5’末端，或者所述能量供体化合物和所述能量受体化合物各自连接至所述DNA片段的3’末端。

16.如段落15所述的生物传感器，其中，所述第二蛋白为核酸外切酶，所述第二位点为所述DNA片段5’或3’末端的悬垂序列；优选地，所述悬垂序列为3-6个碱基、优选5个碱基。

17.如段落15所述的生物传感器，其中，所述第二蛋白为核酸内切酶，所述第二位点为所述DNA片段上的限制性酶切位点。

18.一种用于检测小分子的试剂盒，所述试剂盒包含识别元件和换能元件，其中，

所述识别元件和所述换能元件均以液相形式提供。

19.如段落18所述的试剂盒，其中，所述小分子具有大于50道尔顿但小于5000道尔顿的分子量。

20.如段落18或19所述的试剂盒，其中，所述小分子为重金属离子、药物、代谢物或污染物。

21.如段落18-20中任一项所述的试剂盒，其中，所述别构转录因子与所述小分子结合的平衡解离常数大于所述别构转录因子与所述DNA片段结合的平衡解离常数。

22.如段落21所述的试剂盒，其中，所述别构转录因子与所述小分子结合的平衡解离常数是所述别构转录因子与所述DNA片段结合的平衡解离常数的10-10000倍、优选20-5000倍、更优选50-1000倍。

23.如段落18-20中任一项所述的试剂盒，其中，所述别构转录因子与所述小分子形成的复合物与所述DNA片段结合的平衡解离常数大于所述别构转录因子与所述DNA片段结合的平衡解离常数。

24.如段落23所述的试剂盒，其中，所述别构转录因子与所述小分子形成的复合物与所述DNA片段结合的平衡解离常数是所述别构转录因子与所述DNA片段结合的平衡解离常数的10-10000倍、优选20-5000倍、更优选50-1000倍。

25.如段落18-24中任一项所述的试剂盒，其中，所述DNA片段具有10-150bp，更优选10-80bp的长度。

26.如段落18-25中任一项所述的试剂盒，其中，所述换能元件将所述别构转录因子、所述小分子与所述DNA片段之间相互作用的信号转换并放大为可检测的光信号。

27.如段落26所述的试剂盒，其中，所述光信号是荧光信号或吸收光信号。

28.如段落27所述的试剂盒，其中，所述换能元件为能量供体化合物和能量受体化合物。

29.如段落28所述的试剂盒，其中，所述换能元件选自于ALPHA供体珠和受体珠、纳米颗粒和量子点。

30.如段落28或29所述的试剂盒，其中，所述能量供体化合物和所述能量受体化合物各自与所述DNA片段和所述别构转录因子相偶联。

31.如段落28或29所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含第二换能元件，所述第二换能元件包含位于所述DNA片段上的第二位点以及第二蛋白，所述第二蛋白能够与所述第二位点相互作用，所述能量供体化合物和所述能量受体化合物各自连接至所述DNA片段和所述第二蛋白，优选地，所述第二蛋白为与所述别构转录因子不同的第二转录因子。

32.如段落28或29所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含第二换能元件，所述第二换能元件包含位于所述DNA片段上的第二位点以及第二蛋白，所述第二蛋白能够与所述第二位点相互作用；所述能量供体化合物和所述能量受体化合物各自连接至所述DNA片段的5’末端，或者所述能量供体化合物和所述能量受体化合物各自连接至所述DNA片段的3’末端。

33.如段落32所述的试剂盒，其中，所述第二蛋白为核酸外切酶，所述第二位点为所述DNA片段5’或3’末端的悬垂序列；优选地，所述悬垂序列为3-6个碱基、优选5个碱基。

34.如段落32所述的试剂盒，其中，所述第二蛋白为核酸内切酶，所述第二位点为所述DNA片段上的限制性酶切位点。

35.别构转录因子在制备用于检测小分子的试剂盒中的用途，所述试剂盒包含识别元件和换能元件，其中，

所述识别元件和所述换能元件均以液相形式提供。

36.如段落35所述的用途，其中，所述小分子具有大于50道尔顿但小于5000道尔顿的分子量。

37.如段落35或36所述的用途，其中，所述小分子为重金属离子、药物、代谢物或污染物。

38.如段落35-37中任一项所述的用途，其中，所述别构转录因子与所述小分子结合的平衡解离常数大于所述别构转录因子与所述DNA片段结合的平衡解离常数。

39.如段落38所述的用途，其中，所述别构转录因子与所述小分子结合的平衡解离常数是所述别构转录因子与所述DNA片段结合的平衡解离常数的10-10000倍、优选20-5000倍、更优选50-1000倍。

40.如段落35-37中任一项所述的用途，其中，所述别构转录因子与所述小分子形成的复合物与所述DNA片段结合的平衡解离常数大于所述别构转录因子与所述DNA片段结合的平衡解离常数。

41.如段落40所述的用途，其中，所述别构转录因子与所述小分子形成的复合物与所述DNA片段结合的平衡解离常数是所述别构转录因子与所述DNA片段结合的平衡解离常数的10-10000倍、优选20-5000倍、更优选50-1000倍。

42.如段落35-41中任一项所述的用途，其中，所述DNA片段具有10-150bp，更优选10-80bp的长度。

43.如段落35-42中任一项所述的用途，其中，所述换能元件将所述别构转录因子、所述小分子与所述DNA片段之间相互作用的信号转换并放大为可检测的光信号。

44.如段落43所述的用途，其中，所述光信号是荧光信号或吸收光信号。

45.如段落44所述的用途，其中，所述换能元件为能量供体化合物和能量受体化合物。

46.如段落45所述的用途，其中，所述换能元件选自于ALPHA供体珠和受体珠、纳米颗粒和量子点。

47.如段落45或46所述的用途，其中，所述能量供体化合物和所述能量受体化合物各自与所述DNA片段和所述别构转录因子相偶联。

48.如段落45或46所述的用途，所述试剂盒进一步包含第二换能元件，所述第二换能元件包含位于所述DNA片段上的第二位点以及第二蛋白，所述第二蛋白能够与所述第二位点相互作用，所述能量供体化合物和所述能量受体化合物各自连接至所述DNA片段和所述第二蛋白，优选地，所述第二蛋白为与所述别构转录因子不同的第二转录因子。

49.如段落45或46所述的用途，所述试剂盒进一步包含第二换能元件，所述第二换能元件包含位于所述DNA片段上的第二位点以及第二蛋白，所述第二蛋白能够与所述第二位点相互作用；所述能量供体化合物和所述能量受体化合物各自连接至所述DNA片段的5’末端，或者所述能量供体化合物和所述能量受体化合物各自连接至所述DNA片段的3’末端。

50.如段落49所述的用途，其中，所述第二蛋白为核酸外切酶，所述第二位点为所述DNA片段5’或3’末端的悬垂序列；优选地，所述悬垂序列为3-6个碱基、优选5个碱基。

51.如段落49所述的用途，其中，所述第二蛋白为核酸内切酶，所述第二位点为所述DNA片段上的限制性酶切位点。

52.一种对样品中的小分子进行检测的方法，所述方法包含如下步骤：

(b)将所述样品与所述检测用溶液混合；以及

(c)对步骤(b)获得的混合物进行检测，

其中，步骤(a)-(c)全部在液相实施。

53.如段落52所述的方法，其中，所述样品为环境样品，例如为地下水、中水、海水、废水、采矿废料的样品；或者，所述样品为生物样品，特别是来自受试者的样品，例如以下样品中的一种或多种：血液、血清、血浆、痰、脑脊液流体、尿液、泪液、肺泡分离物、胸膜液、囊液、组织、唾液；或者，所述样品为来自于食品、饮用水或饲料的样品。

54.如段落52或53所述的方法，其中，所述小分子具有大于50道尔顿但小于5000道尔顿的分子量。

55.如段落52-54中任一项所述的方法，其中，所述小分子为重金属离子、药物、代谢物或污染物。

56.如段落52-55中任一项所述的方法，其中，所述别构转录因子与所述小分子结合的平衡解离常数大于所述别构转录因子与所述DNA片段结合的平衡解离常数。

57.如段落56所述的方法，其中，所述别构转录因子与所述小分子结合的平衡解离常数是所述别构转录因子与所述DNA片段结合的平衡解离常数的10-10000倍、优选20-5000倍、更优选50-1000倍。

58.如段落52-55中任一项所述的方法，其中，所述别构转录因子与所述小分子形成的复合物与所述DNA片段结合的平衡解离常数大于所述别构转录因子与所述DNA片段结合的平衡解离常数。

59.如段落58所述的方法，其中，所述别构转录因子与所述小分子形成的复合物与所述DNA片段结合的平衡解离常数是所述别构转录因子与所述DNA片段结合的平衡解离常数的10-10000倍、优选20-5000倍、更优选50-1000倍。

60.如段落52-59中任一项所述的方法，其中，所述DNA片段具有10-150bp，更优选10-80bp的长度。

61.如段落52-60中任一项所述的方法，其中，所述换能元件将所述别构转录因子、所述小分子与所述DNA片段之间相互作用的信号转换并放大为可检测的光信号。

62.如段落61所述的方法，其中，所述光信号是荧光信号或吸收光信号。

63.如段落62所述的方法，其中，所述换能元件为能量供体化合物和能量受体化合物。

64.如段落63所述的方法，其中，所述换能元件选自于ALPHA供体珠和受体珠、纳米颗粒和量子点。

65.如段落62或63所述的方法，其中，所述能量供体化合物和所述能量受体化合物各自与所述DNA片段和所述别构转录因子相偶联。

66.如段落62或63所述的方法，所述检测用溶液进一步包含第二换能元件，所述第二换能元件包含位于所述DNA片段上的第二位点以及第二蛋白，所述第二蛋白能够与所述第二位点相互作用，所述能量供体化合物和所述能量受体化合物各自连接至所述DNA片段和所述第二蛋白，优选地，所述第二蛋白为与所述别构转录因子不同的第二转录因子。

67.如段落62或63所述的方法，所述检测用溶液进一步包含第二换能元件，所述第二换能元件包含位于所述DNA片段上的第二位点以及第二蛋白，所述第二蛋白能够与所述第二位点相互作用；所述能量供体化合物和所述能量受体化合物各自连接至所述DNA片段的5’末端，或者所述能量供体化合物和所述能量受体化合物各自连接至所述DNA片段的3’末端。

68.如段落67所述的方法，其中，所述第二蛋白为核酸外切酶，所述第二位点为所述DNA片段5’或3’末端的悬垂序列；优选地，所述悬垂序列为3-6个碱基、优选5个碱基。

69.如段落67所述的方法，其中，所述第二蛋白为核酸内切酶，所述第二位点为所述DNA片段上的限制性酶切位点。

表1中的参考文献

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实施例

实施例1：尿酸生物传感器

本实施例利用别构转录因子HucR及与其相互作用的DNA片段hucO作为识别元件，利用ALPHA技术微珠作为换能元件，构建能够感应尿酸的生物传感器平台，并利用数学模型分析影响生物传感器的灵敏度与检测线性范围的关键因素，提供一种通用的、系统的、有效的提高生物传感器灵敏度及检测范围的策略。

HucR蛋白为来源于耐辐射奇球菌的阻遏蛋白。在无尿酸(UA)时，HucR能结合在其操纵位点hucO上，阻止下游目标基因的转录。当存在尿酸时，尿酸特异性地结合HucR，将HucR从hucO上释放，开启目标基因的转录。因此，可由HucR与hucO的结合程度确定样品中的尿酸浓度。

制备带有生物素标签的hucO和带有六聚组氨酸标签的HucR融合蛋白，从而能够通过简单混合的方式使其分别捕获链霉亲和素包被的供体珠以及镍包被的受体珠。

如图2a所示，当样品中不存在尿酸时，HucR与hucO的结合使得单态氧从供体珠传递到受体珠，产生荧光信号；当样品中存在尿酸时，尿酸与HucR的结合将HucR从hucO上释放，使得供体珠与受体珠的定位分离。当二者距离>200nm时能量转移受到阻碍，受体珠回到基态，光信号降低。因此，可通过监控光信号的改变确定样品中UA的浓度。

本实施例中所使用的培养基和试剂如下。

LB培养基：1％NaCl、1％蛋白胨、0.5％酵母粉。

HBS-P缓冲液：0.005％吐温-20、0.1％牛血白蛋白、10mM HEPES、15mM NaCl，pH7.4。

HBS-EP缓冲液：0.005％吐温-20、0.1％牛血白蛋白、10mM HEPES、15mM NaCl、3mMEDTA，pH 7.4。

PBS-P缓冲液(0.1M，100mL)：将81mL 0.1M Na₂HPO₄与19mL 0.1M NaH₂PO₄混合而制备。

AH缓冲液：25mM HEPES、20mM NaCl。

尿酸：将尿酸溶解于0.5M NaOH至终浓度0.1M。

1×结合缓冲液：0.5M NaCl、20mM Tris-HCl、5mM咪唑、5％甘油，pH 7.9。

1×洗涤缓冲液：0.5M NaCl、20mM Tris-HCl、60mM咪唑、5％甘油，pH 7.9。

1×洗脱缓冲液：0.5M NaCl、20mM Tris-HCl、0.5M咪唑、5％甘油，pH 7.9。

包含ALPHA供体珠和受体珠的试剂盒购自PerkinElmer(Cat No.6760619，包含链霉亲和素包被的供体珠和镍包被的受体珠。

尿酸、氨基酸和牛血清白蛋白均购自SIGMA。其它试剂均为分析纯，购自Aladdin。本实施例中所使用的引物如表2所示。

表2：实施例1所使用的引物

实验方法

1.HucR融合蛋白的克隆、表达和纯化

使用表2所示出的引物对RF/RR，从耐辐射奇球菌(ATCC：13939)基因组扩增hucR基因(Genbank登记号：NP_294883.1)。用NdeI/XhoI消化PCR产物，并将其插入至pET-23b(Novagen)质粒的相应限制性酶切位点，将连接产物转化至大肠杆菌TOP10菌株，利用Amp阳性平板筛选带有连接产物(pET-23b-His₆-HucR质粒)的阳性克隆，该质粒编码N端带有六聚组氨酸的HucR序列(His₆-HucR)。提取质粒，将质粒转化至表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)，筛选阳性克隆。

挑取单克隆菌落接种于100mL LB(Amp抗性)培养基中，37℃摇床培养至OD₆₀₀约为0.4～0.6，加入终浓度为0.2mM的IPTG，16℃、120rpm低温低速诱导过夜。随后在4℃、6,000rpm离心15min，收集菌体。每2L菌体用50mL预冷的1×结合缓冲液(pH 7.9)悬浮。将悬浮液置于冰上，超声裂解菌体(超声波细胞粉碎机，超声5s，间歇5s，30W，12min)至澄清。裂解液以13,000rpm、4℃离心10min，去除沉淀，收集上清液。使得细胞抽提物流经镍处理的填料柱，用100体积的1×洗涤缓冲液冲洗，然后用1×洗脱缓冲液洗脱。

用分子筛凝胶层板对洗脱后的蛋白进行纯化：将蛋白洗脱液加入截留分子量为11KD的浓缩管，在4℃以4000rpm水平离心浓缩至体积为0.5-1mL(约1h)。通过SDS-PAGE对纯化的His₆-HucR蛋白进行验证，测定其纯度>95％。

纯化的蛋白中加入终浓度为50％的甘油，保存于-20℃。长期保存时加入1mMDTT，-80℃保存。

2.生物素标记hucO片段的扩增与纯化

通过两轮PCR获得生物素标记的野生型hucO片段(图2b中的序列0#，SEQ ID NO：1)。首先，通过正向引物OF和反向引物OR0(表2)重叠PCR扩增获得未标记的hucO。再以未标记的hucO PCR产物为模板，利用带有生物素的正向引物BioP和反向引物OR0获得生物素标记的hucO片段，并用凝胶回收试剂盒(Axygen)对生物素标记的hucO片段进行纯化。

3.生物素标记hucO突变体片段的扩增与纯化

对hucO序列中的回文区域进行随机突变，设计引物OR1-OR23(表2)。通过两轮PCR获得各生物素标记的hucO突变体片段(图2b，标示为hucO突变体1#-hucO突变体23#)(SEQID NO：2-SEQ ID NO：24)。首先，通过正向引物OF和各反向引物OR1至OR23重叠PCR扩增获得未标记的hucO1#-hucO23#突变体。再以未标记的hucO1#-hucO23#PCR产物为模板，利用带有生物素的正向引物BioP和反向引物OR1-OR23分别获得生物素标记的hucO突变体1#-hucO突变体23#片段，并用凝胶回收试剂盒(Axygen)对该片段进行纯化。

利用琼脂糖凝胶电泳对各野生型和突变体hucO片段进行验证，并用NanoVue plus(GE Healthcare)定量。

4.HucR融合蛋白与生物素标记的hucO片段相互作用的测定

借助凝胶阻滞分析(EMSA)和生物膜层表面干涉技术(BLI)对HucR与各野生型和突变型hucO片段的结合进行分析。EMSA使用的hucO探针(P-hucO，SEQ ID NO：25)为利用引物对P-hucOF/P-hucOR以耐辐射奇球菌的基因组DNA为模板通过PCR获得，EMSA的实验条件和数据采集方法均根据Wang等，Molecular Microbiology，2011，82(1)：236–250。借助BLI技术，使用Octet RED96系统(FortéBIO)测定HucR融合蛋白与生物素标记的hucO片段的亲和性和特异性。将HBS-EP缓冲液用于基线平衡和样品稀释。BLI的分析步骤为根据Gao等，2016进行。对获得的数据进行基线修正和归一化后，利用Octet Analysis System 21CFR Part11(9.0版)按照1:1结合模型拟合，获得动力学参数结合速率常数k_on、解离速率常数k_off和平衡解离常数K_D(K_D＝k_off/k_on)。

5.荧光信号检测

将等体积(各5μl)的HucR融合蛋白、生物素标记的hucO片段(野生型或突变体1#-23#)与待测样品(可能包含尿酸)加入至白色不透光的384微孔板(PerkinElmer；No.6007299)并利用甩板机充分混合，室温下反应30min；加入5μl受体珠(20μg/ml)，在室温下避光反应30min；之后加入5μl供体珠(20μg/ml)，在室温下继续避光反应60min。

反应结束后，将微孔板放到多功能酶标仪(EnSpire Multimode Plate Reader，PerkinElmer)中平衡1min，设定激发波长680nm、检测波长520-620nm，读取光信号数值。

对读取的数值进行基线修正，使用GraphPad Prism软件(5.0版)内置的单结合位点K_I模型和单结合位点LogI₅₀模型分别对数据进行拟合，计算K_I和I₅₀。UA生物传感器的检测下限(LOD)为造成光信号降低的最小UA浓度，其中，所测得的光信号与噪声之比(S/N)大于3被认定为有效测量(Long et al.；Zhang et al.2014)。

6.尿样中UA浓度的HPLC检测

收集健康受试者的尿液样品，用HBS-P缓冲液稀释并用0.22μm乙酸纤维素膜过滤。使用配置有SPD-20A UV检测器的HPLC-20AT(Shimadzu)对样品中的UA进行分析。分析柱为Zorbax SB-Aq(Agilent；250mm×4.6mm，5μm)。移动相由98％乙酸(pH3.2)和2％甲醇组成，流速为1.0mL/min。UA的检测通过其在280nm的UV吸收测定，注射体积为20μL。

研究1：识别元件HucR与hucO在体外的功能评估

借助EMSA对体外体系中HucR与hucO的结合活性进行测定。结果显示，在加入24nM的HucR时毫无困难地检测到阻滞，表明在体外环境下HucR与hucO具有高结合能力。BLI研究进一步表明，HucR与野生型hucO的平衡解离常数K_D是1.74±0.03nM(图2b)。该值稍高于Wilkinson和Grove 2004用EMSA测得的K_D(0.29±0.02nM)，这可能是由于EMSA的鸟笼效应阻碍HucR-hucO复合物的解离(Cann 1989)。

研究2：缓冲液与传感器性能

本研究对缓冲液的成分和pH对生物传感器性能的影响进行了研究，测试的缓冲液为分子相互作用研究中最常用的HBS-EP缓冲液(Wang等，2009)，以及HBS-P缓冲液、PBS-P缓冲液(Zhang等，2013)和AH缓冲液(D’Agostino等，2013)。HBS-P缓冲液为考虑到螯合剂EDTA可能与HucR融合蛋白竞争镍包被的受体珠，从HBS-EP去除EDTA的缓冲液。结果表明，在仅含有受体珠和供体珠的空白对照中，HBS-P缓冲液的背景信号为约9000相对荧光单位(RLU)，与AH、HBS-EP和PBS-P缓冲液背景信号相比，HBS-P缓冲液的背景信号分别降低44.5％、38.6％和29.1％。当存在HucR融合蛋白和生物素标记的hucO时，HBS-P缓冲液产生的信噪比为25.5，分别是AH、HBS-EP和PBS-P缓冲液的2.08倍、4.46倍和1.40倍。因此，选取HBS-P缓冲液作为本实施例中生物传感器的缓冲液。为了测试缓冲液pH对检测体系的影响，在不同pH的HBS-P缓冲液中测量了HucR融合蛋白和生物素标记的hucO的结合。结果表明，当pH为5.0-8.0之间时(对应于正常的人尿液pH)，光信号无显著变化。而在pH升高至9.0-10.0时，光信号略有降低。此外，还测试了尿样和血样中可能存在的不同离子和氨基酸(Jin等，2016)对生物传感器性能的影响。如表3所示，当这些离子和氨基酸的浓度高达100mM时也几乎不影响检测结果。这些结果显示，本发明的生物传感器对检测环境的要求较低，适用于多种检测条件。

表3：待测样品中可能存在的多种金属离子和化合物对传感器检测结果的影响

^a光信号的改变为在HBS-P缓冲液中外加100mM浓度的该物质时测得的荧光信号相对

于未加入该物质时荧光信号的变异系数，为三次独立实验的平均值。

研究3：HucR浓度与传感器性能

考虑到过高的HucR与hucO浓度均可能造成供体和受体珠的Hook效应，从而信号变化程度不能反应相互作用强度，而过低的浓度可能导致检测灵敏度降低，在本研究中寻求本体系下最佳的HucR/hucO浓度。所测试的HucR融合蛋白浓度为0、0.05nM、0.1nM、0.5nM、1nM和3nM；测试的生物素标记的hucO浓度为0、0.5nM、1nM、2.5nM和5nM。借助HucR与hucO双滴定法观察到，在未达到供体和受体珠的饱和浓度时，光信号以剂量响应的方式改变(图2c)。而最强荧光信号和信噪比分别为220,000RLU和24.4，对应于使用0.1nM HucR融合蛋白与1nM生物素标记的hucO。在该浓度下，测定窗口的最大和最小光信号差别为11倍。这里的最小光信号的S/N为3.24，大于一般建议的下限3.0(Zhang et al.2014；Zhao etal.2016)。更重要的是，此时HucR与hucO的浓度远低于供体和受体珠的结合能力，因此能够保证HucR与hucO的结合程度以及所产生的光信号精确反应样品中UA的浓度。在上下文中，将0.1nM HucR融合蛋白与1nM生物素标记的hucO这一测定条件的组合称为B_UA-0。

通过测量包含不同UA浓度的一系列样品，对生物传感器B_UA-0的性能进行表征。结果显示，随着UA浓度的升高，光信号降低；该生物传感器对UA的检测灵敏度下限为约0.1μMUA(图2c)。通过数值拟合得到HucR对于UA的平衡抑制常数(K_I)是1.84μM，B_UA-0的检测线性范围为1-10μM(表4)。

表4：本实施例各UA传感器的主要参数

^a利用BLI技术测量HucR对于hucO的亲和力，使用1:1模型计算K_D(R²>0.96)。利用GraphPad Prism 5.0的内置的单位点竞争性结合模型确定I₅₀和K_I(R²>0.93)。使用如下的公式(5)确定k_max。数据为三次独立试验的平均值。

研究4：降低生物传感器检测限及改变线性范围的普适性策略探索

本研究基于数学模型来确定影响本发明生物传感器的检测限及线性范围的关键因素。该数学模型的简化假设在于，该生物传感器体系中存在两个平衡：转录因子与其作用位点的平衡，以及转录因子与效应物小分子的平衡。

其中，K_D和K_I分别是HucR与hucO以及HucR与UA的平衡解离常数。由于传感器中hucO的浓度远高于HucR(差别为10倍以上)，可用竞争抑制模型(Yung-Chi和Prusoff 1973)来描述HucR与hucO的结合(B_I)

其中，B_max是结合的最大理论荧光信号。方括号表示该物质的浓度。其中，当不存在UA时，结合体系可简化为式(2)

UA与HucR的结合使得HucR从hucO的解离的信号强度B_dis通过剂量响应模型来描述(Crump等，1976)，如式(3)所示

其中，B′_max和B_min分别为解离曲线的最大和最小荧光强度。I₅₀为实现50％抑制时的UA浓度的对数。根据该曲线，生物传感器的灵敏度和线性范围均与I₅₀和最大斜率k_max相关。因此，可通过调整影响I₅₀和k_max的参数来调整传感器的灵敏度和线性范围。

在[UA]＝I₅₀且B₀＝2B_I时，由式(1)和式(2)推导出式(4)：

由于生物传感器中hucO的浓度是固定的，从式(4)可以明显看出，I₅₀与K_I正相关，与K_D负相关。

在[UA]＝I₅₀时，从式(3)得到最大斜率k_max如式(5)所示：

k_max＝-ln(10)×(B′_max‐B_min) (5)

从式(5)可以看出，生物传感器的线性范围与式(3)的最大和最小荧光信号的差值相关，根据理论计算，该差值与K_D负相关。因此，理论上k_max与K_D正相关。

可见，I₅₀的降低或k_max的升高均能降低LOD，并扩大生物传感器的线性范围。如上所分析的，可通过降低HucR和hucO之间的亲和力(升高K_D)，或者提高HucR与UA的亲和力(降低K_I)进一步降低LOD或增大线性范围。本领域知晓能够对转录因子或与其结合的DNA序列进行工程化来改变蛋白与DNA的结合亲和力的方法(Akashi等，2005；Hallikas和Taipale，2006)。考虑到构建同时具有升高的K_D和降低的K_I的HucR理想突变体所需的蛋白质工程和筛选步骤的工作量，通过改变DNA上的hucO位点能够更简单易行地获得改进的K_D，因为能够简单地通过点突变获得多种hucO突变体。因此提出，降低传感器的检测下限并扩大其线性范围的一种普适策略是，对与转录因子作用的DNA片段的序列进行点突变并选出具有期望K_D的突变体。

研究5：通过对hucO序列进行突变改进生物传感器的性能

基于如上分析，在hucO的保守回文区域进行一系列点突变，随后通过BLI来检测HucR与hucO突变体之间的结合和解离，通过数值拟合获得结合常数k_on和解离常数k_off，从而获得平衡解离常数K_D(图2b)。总体来说，当非互补碱基对的数量增加时，HucR对hucO的结合亲和力降低，然而当回文序列中非互补碱基对多于4对，亲和力过弱以至于检测不到。另外，基于拟合模型所计算的应用各hucO突变体的不同生物传感器的K_I几乎相同(表4)，表明hucO并不改变HucR与尿酸的结合。

对应用四种hucO突变体3#、8#、11#和19#与HucR融合蛋白的生物传感器(分别为B_UA-3、B_UA-8、B_UA-11和B_UA-19)的UA检测性能进行评价(同样，使用0.1nMHucR融合蛋白与1nM生物素标记的hucO突变体)，结果如表4和图2c所示。利用具有不同序列特征的hucO突变体的生物传感器表现出不同的检测性能。随着k_max升高，K_D和I₅₀数值均升高，从而降低了生物传感器的LOD并扩大了线性范围。该结果与数学模型的预测一致。然而，传感器B_UA-19虽然具有最大的K_D，其线性范围较B_UA-11更窄。这可能是由于HucR与hucO19#突变体的亲和力更低，难以分辨由不同的UA浓度造成的荧光信号的差别。与采用野生型hucO的生物传感器B_UA-0相比，采用hucO突变体的全部生物传感器具有更低的LOD。其中，B_UA-11与B_UA-19能够感应到低至1nM的UA浓度(表4)，该浓度远低于现有技术中报告的利用不同方法的UA传感器的检测下限(0.02-140μM)。此外，B_UA-11的线性范围为跨越5个数量级的UA浓度(1nM至3×10⁴nM)。该范围远宽于现有技术报导的最宽的线性范围(0.2μM-710μM)。可见，本实施例的利用别构转录因子及其相互作用的DNA片段作为识别元件的传感器能够实现优异的传感性能。如上所述，该传感性能易于通过对DNA片段的序列进行优化而进一步提高。

研究6：对实际尿液样品的检测

为了评价本实施例生物传感器的精确性，利用HPLC和这些生物传感器检测来自健康受试者的4份尿液样品。HPLC检测到的各样品的UA浓度范围为1.53-3.34mM(表5)，落入尿分泌的正常范围1.49-4.46mM范围内(Azmi等，2015)。通过五种生物传感器测得的结果与HPLC数据一致，准确度为93.2％-106.2％。五种生物传感器的准确度相对标准偏差(RSD)为2.48％-5.00％，收率为96.5％-104.3％(表5)。这些结果在现有技术的精度(5％)和收率(90％-110％)限度内(Zhao等，2016)。表明这些生物传感器具有优异的UA检测能力。

结论

在本工作中，我们开发了利用别构转录因子HucR及与其相互作用的DNA片段hucO为识别元件的一系列传感器。该传感器具有较好的鲁棒性，且将UA的检测下限降低至1nMUA，能够将其有利地用于确定尿液样品中的尿酸浓度。

表5：各传感器的实际样品的检测

^a通过将各传感器的尿酸浓度数据与HPLC数据进行比较获得，将HPLC数据归一至100。

^b对于各传感器，精度为由四份不同样品得到的准确度相对标准偏差(RSD)。

^c使用1μM UA测试收率。

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实施例2：土霉素生物传感器

本实施例利用别构转录因子OtrR及包含其作用位点otrO的DNA片段作为识别元件，ALPHA技术的供体珠和受体珠作为第一换能元件，HucR及其相互作用位点hucO作为第二换能元件，构建能够感应土霉素的生物传感器平台。所述DNA片段同时带有otrO和hucO片段(图3a)。

OtrR为来源于龟裂链霉菌的阻遏蛋白。天然状态下，在无土霉素时，OtrR能结合在其操纵位点otrO上，阻止下游目标基因的转录。当存在土霉素时，土霉素特异性地结合OtrR，将OtrR从otrO上释放，开启目标基因的转录。因此，可由OtrR与otrO的结合程度确定样品中的土霉素的浓度。HucR与hucO的作用机理如实施例1所述。

制备带有生物素标签且带有彼此相邻的hucO和otrO操作位点的DNA片段，以及带有六聚组氨酸标签的HucR融合蛋白，从而其分别能够捕获链霉亲和素包被的供体珠以及镍包被的受体珠。另外，构建带有Flag标签的OtrR蛋白，从而该蛋白与供体珠和受体珠均不结合。

如图3a所示，当样品中不存在土霉素时，OtrR与DNA片段上的otrO结合，复合物的空间位阻使得HucR无法与DNA片段上的hucO结合，此时受体珠处于基态，在供体珠的激发波长照射下仍不能产生荧光信号。当样品中存在土霉素时，OtrR与土霉素的结合使得OtrR从DNA片段上脱离，暴露hucO位点，从而HucR能够与otrO位点附近的hucO位点结合，单态氧从供体珠传递到受体珠，产生荧光信号。通过这样的方式，能够通过监控光信号的改变确定样品中的土霉素浓度。

实施例2所使用的各引物如表6所示。

表6：实施例2所使用的引物

本实施例中所使用的培养基和HucR蛋白纯化试剂与实施例1相同。OtrR蛋白纯化所需要的缓冲液如下：

缓冲液W：100mM Tris-HCl pH 8.0，150mM NaCl，1mM EDTA。

缓冲液E：100mM Tris-HCl pH 8.0，150mM NaCl，1mM EDTA，2.5mM脱硫生物素。

1.融合蛋白的表达、制备和保存

带有六聚组氨酸标签的HucR融合蛋白、序列及表达纯化和保存方法如实施例1所述。

带有Flag标签的OtrR融合蛋白的表达纯化和保存方法如下。otrR基因序列为NCBIGI:74053557。利用与实施例1相同的诱导表达体系，利用全合成的引物OR-F与OR-R(表6)通过重叠PCR(overlap PCR)得到带有Flag标签的双链otrR序列(Flag-OtrR)(SEQ ID NO：26)，并将其插入至pET-23b质粒。将质粒转化至表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)，筛选阳性克隆。

挑取单克隆菌落接种于100mL LB(Amp抗性)培养基中，37℃摇床培养至OD₆₀₀约为0.4～0.6，加入终浓度为0.2mM的IPTG，16℃、120rpm低温低速诱导过夜。随后在4℃、6,000rpm离心15min，收集菌体。用预冷的W缓冲液(pH 8.0)洗涤2遍并悬浮。将悬浮液置于冰上，超声裂解菌体(超声波细胞粉碎机，超声5s，间歇5s，30W，12min)至澄清。裂解液13,000rpm、4℃离心10min，去除沉淀，收集上清液。使得细胞抽提物流经Strep-II-tag填料柱，用5-10体积的W缓冲液冲洗。每0.5mL分段收集E缓冲液洗脱液。

用分子筛凝胶层板对洗脱后的蛋白进行纯化：将蛋白洗脱液加入截留分子量为11KD的浓缩管，在4℃以4000rpm水平离心浓缩至体积为0.5-1mL(约1h)。纯化的蛋白中加入终浓度为50％的甘油，保存于-20℃。长期保存时加入1mM DTT，-80℃保存。

2.生物素标记D2片段的扩增与纯化

将全合成的D2单链ORT0与ORR(表6)通过重叠PCR得到双链D2-O0片段(SEQ ID NO：27)，并用凝胶回收试剂盒(Axygen)对生物素标记的D2片段进行纯化。

3.生物素标记D2突变体片段的扩增与纯化

对otrO序列中的回文区域进行随机突变，设计引物ORT1-ORT3(表6)。将全合成的突变体单链ORT1-ORT3与ORR(表6)通过重叠PCR得到双链D2-O1至D2-O3突变体片段(SEQ IDNO：28-30，图3b的灰色部分示出各片段的otrO突变位点)，并用凝胶回收试剂盒(Axygen)对各片段进行纯化。

利用琼脂糖凝胶电泳对各野生型和突变体otrO片段进行验证，并用NanoVue plus(GE Healthcare)定量。

4.荧光信号检测

将等体积(各5μl)的HucR融合蛋白、OtrR融合蛋白、生物素标记的D2片段(野生型或突变体1-3)与待测样品(可能包含土霉素)加入至白色不透光的384微孔板(PerkinElmer；No.6007299)并利用甩板机充分混合，室温下反应30min；加入5μl受体珠(20μg/ml)，在室温下避光反应30min；之后加入5μl供体珠(20μg/ml)，在室温下继续避光反应60min。

对读取的数值进行基线修正，使用GraphPad Prism软件(5.0版)内置的单结合位点K_I模型和单结合位点LogI₅₀模型分别对数据进行拟合，计算K_I和I₅₀。土霉素生物传感器的检测下限(LOD)为造成光信号降低量3倍于噪声的最小土霉素浓度，其中，所测得的光信号与噪声之比(S/N)大于3被认定为有效测量(Long等；Zhang等，2014)。

研究1：OtrR融合蛋白、HucR融合蛋白及D2-O0片段的浓度与传感器性能

本研究对用于构建土霉素生物传感器所使用的OtrR、HucR及DNA片段D2-O0的浓度进行了确定。利用组合滴定的方法，确定体系的OtrR、HucR及D2-O0最佳浓度分别为0.01nM、0.1nM和1nM。所测试浓度分别是OtrR：0、0.003nM、0.01nM、0.03nM、0.1nM和0.3nM；HucR：0、0.01nM、0.03nM、0.1nM、0.3nM、1nM，和3nM；D2-O0：0、0.03nM、0.1nM、0.3nM、1nM和3nM。

研究2：构建土霉素生物传感器

本研究构建了以别构转录因子OtrR及otrO位点序列为识别元件，以HucR、hucO序列及ALPHA供体和受体珠为换能元件的土霉素生物传感器，表征了土霉素生物传感器的检测限与检测线性范围。该传感器的最低检测限为1nM(图3c，左上)，线性范围是2-20nM。构建该传感器所使用的OtrR，HucR和otrO的浓度为研究1中所确定的最佳浓度，分别是0.01nM，0.1nM和1nM。确定该生物传感器的检测限与线性范围所使用的土霉素的测试范围是1×10^-11M、1×10^-10M、2×10^-10M、5×10^-10M、1×10^-9M、3×10^-9M、1×10^-8M、3×10^-8M和1×10^-7M(图3c)。

研究3：降低土霉素生物传感器的检测限并改变其线性范围

根据实施例1研究4的理论指导，以OtrR蛋白和与其具有不同亲和力的otrO突变体构建了三个不同的土霉素生物传感器。所构建的土霉素生物传感器的检测限最低可达0.03nM，线性范围最大为0.5-30nM(图3c，B_OTC-1、B_OTC-2和B_OTC-3分别为利用D2-O1、D2-O2和D2-O3突变体构建的传感器)。用于构建这三个生物传感器的otrO突变体与OtrR的K_D分别为1.69、9.49和11.97nM，图3b)。

实施例3:普那霉素生物传感器

本实施例构建了两种利用核酸酶作为第二换能元件的普那霉素生物传感器。传感器的识别元件均为别构转录因子Pip及ptr位点，第一换能元件均为纳米金颗粒对。在利用核酸外切酶的实施方式中，使用核酸外切酶III及具有3’悬垂末端的DNA片段作为第二换能元件。在利用核酸内切酶的实施方式中，使用HindIII核酸内切酶和HindIII限制性酶切位点作为第二换能元件。

Pip为来源于天蓝色链霉菌的阻遏蛋白。天然状态下，在无普那霉素时，Pip能结合在其操纵位点ptr上，阻止下游目标基因的转录。当存在普那霉素时，普那霉素特异性地结合Pip，将Pip从ptr上释放，开启目标基因的转录。因此，可由Pip与ptr的结合程度确定样品中的普那霉素的浓度。HindIII内切酶识别序列A|AGCTT。核酸外切酶识别3’悬垂末端。

如图4a所示，本实施例的核酸外切酶换能元件的原理为：当样品中不存在普那霉素时，Pip结合于ptr，阻碍了核酸外切酶III从3’悬垂序列开始的3’至5’方向的碱基切割，分别偶联于DNA片段正义链和反义链末端的纳米金颗粒之间发生共振，吸收光信号产生红移，在600nm附近具有吸光信号。当样品中存在普那霉素时，Pip从ptr处脱离，核酸外切酶III进行3’至5’方向的碱基切割，使得位于各DNA片段末端的纳米金颗粒彼此分离，吸收光信号在500nm左右，而在600nm附近检测不到吸光值。

如图4b所示，本实施例的核酸内切酶换能元件的原理为：当样品中不存在普那霉素时，Pip结合于ptr，从而阻止HindIII结合ptr位点附近的AAGCTT，分别偶联于DNA片段正义链和反义链末端的纳米金颗粒之间发生共振，吸收光信号产生红移，在600nm附近具有吸光信号。当样品中存在普那霉素时，Pip从ptr处脱离，暴露AAGCTT，HindIII切割该位点，使得位于各DNA片段末端的纳米金颗粒彼此分离，吸收光信号在500nm左右，而在600nm附近检测不到吸光值。

本实施例中所使用的LB培养基、蛋白纯化使用的各缓冲液与实施例1相同。

磷酸缓冲液(PB)：10mM，pH 7.4。

磷酸盐缓冲液(PBS)：10mM磷酸缓冲液，0.3M氯化钠，pH 7.4。

纳米金颗粒聚集反应液(NRS)：10mM Tris-HCl(pH 7.0)、4mM MgCl₂和10μM DTT。

限制性内切酶HindIII和核酸外切酶III均购自NEB公司。

1.融合蛋白的表达、制备和保存

通过与实施例1相同的方法和步骤，制备Pip蛋白(SEQ ID NO：31)。

2.核酸内切酶HindIII作用序列和核酸外切酶III作用序列的制备。

首先确定核苷酸链的互补区域的位置及长度。

针对利用核酸外切酶III的体系，正义链(5’-3’)依次由以下几个部分构成：任意20个以上的碱基序列，Pip别构转录因子的识别位点(TCTATCATTGATAGA)，以及5个以上任意碱基。相应的，反义链(5’-3’)依次由以下几个部分构成：与正义链3’端不互补的20个以上的碱基序列，Pip别构转录因子的识别位点，以及3个以下与反义链不互补的碱基。

针对利用核酸内切酶的体系，正义链(5’-3’)依次由以下几个部分构成：任意20个以上的碱基序列，Pip别构转录因子的识别位点(TCTATCATTGATAGA)，核酸内切酶HindIII的识别位点(AAGCTT)，以及5个任意碱基。相应地，反义链(5’-3’)依次由以下几个部分构成：与正义链3’端不互补的15个以上的碱基序列，与正义链3’端互补的5个碱基，核酸内切酶HindIII的识别位点，Pip别构转录因子的识别位点，以及5个与正义链相应位置互补的碱基。其中，与正义链3’端互补的5个碱基作为核酸内切酶的保护碱基；而与正义链3’端不互补的15个以上的碱基序列为蛋白与DNA的结合提供充足的空间，并避免形成单链间的结合。

本实施例中实际使用的作为核酸外切酶体系识别和换能元件的DNA序列的正义链和反义链分别为SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33。本实施例中实际使用的作为核酸内切酶体系识别和换能元件的DNA序列的正义链和反义链分别为SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35。

3.氨基标记的核苷酸与硫辛酸的交联方法

采用琥珀酸亚胺偶联法，将硫辛酸连接至氨基修饰的核苷酸。将100μL氨基修饰的核苷酸(10μM)与100μL含有10mM硫辛酸、1mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和5mM N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)的PBS混合，37℃孵育2小时。利用500mL PBS(10mM)在黑暗处将交联物透析3天去除多余的硫辛酸。

4.DNA修饰的纳米金颗粒的制备方法

将硫辛酸交联的核苷酸(200μL，5μM)加入柠檬酸包被的纳米金颗粒溶液(1mL，～13nM)。18小时后，向溶液中加入1.2mL含有0.1M氯化钠的PB，混匀反应8小时。在后续的盐老化过程中，首先将纳米金颗粒溶液与0.1M氯化钠孵育8小时；然后将盐浓度提高至0.2M继续孵育8小时；最后将盐浓度提高至0.3M再孵育8小时。22000g，20min离心除去未修饰的核苷酸，将沉淀物悬浮于1mL PBS，该步骤重复3次以充分去除未修饰的核苷酸。将纳米金颗粒重新悬浮于1mL PBS并于4℃保存。纳米金颗粒连接在序列的FITC-5’末端。

5.修饰的纳米金颗粒上DNA浓度的确定方法

纳米金颗粒对不同修饰的核苷酸的容载量相同。将硫辛酸交联的纳米金颗粒与异硫氰酸荧光素标签相连接(方法同DNA修饰的纳米金颗粒的制备方法)，得到有FITC标记DNA的纳米金颗粒。确定FITC标记核苷酸的方法如下：在100μl DNA修饰的纳米金颗粒溶液中加入20μl氰化钾(0.2M)和2mM铁氰化钾，使FITC标记的核苷酸从纳米金颗粒上解离下来，然后采用三种不同的标准方法测定FITC(Ou et al.,Anal Chem,2010,82:6015-6024)。测得的纳米金颗粒的DNA容载量约为0.9μM。

6.DNA交联的纳米金颗粒聚集体的制备方法

将分别连接有正义链和反义链的纳米金颗粒PBS溶液(各50μl，～13nM)混合，加热至70℃并孵育10min，后降低至室温。纳米金颗粒聚集，颜色由红变紫。用NRS溶液洗涤聚集物，8000g离心5min，后将沉淀重新悬浮，并重复该步骤3次，充分去除未聚集的纳米金颗粒。

7.检测方法

将2μl样品溶液加入50μl步骤6制备的NRS溶液中，37℃反应30min。然后，加入8U/μl核酸外切酶III，利用多功能酶标仪(PerkinElmer)监测光吸收(525nm)的变化。定性测量时用肉眼观测颜色变化。

研究1普那霉素生物传感器的Pip最佳浓度

本研究确定了：(1)利用核酸外切酶III进行链切割的普那霉素生物传感器中，Pip的最佳浓度为3nM。当向纳米金颗粒-Pip复合物中加入核酸外切酶III时，消化20min后不产生颜色变化的最低Pip浓度为0.3nM；而在此Pip浓度下，加入3nM普那霉素则可观测到显著的颜色变化。Pip测试浓度分别为0、0.01nM、0.03nM、0.1nM、0.3nM、1nM、3nM和10nM；(2)利用类似方法得到，利用核酸内切酶HindIII进行链切割的普那霉素生物传感器中，Pip的最佳浓度为3nM。

研究2普那霉素生物传感器的性能表征

如图4c所示，利用核酸外切酶III的生物传感器的检测限与线性范围分别是0.2nM和0.5-10nM。其中，普那霉素的测试浓度分别是0、0.01nM、0.05nM、0.1nM、0.5nM、1nM、2.5nM、5nM、7.5nM、10nM、和20nM。如图4d所示，利用核酸内切酶HindIII的生物传感器的检测限与线性范围分别是0.1nM和0.5-10nM。其中，普那霉素的测试浓度分别是0、0.01nM、0.05nM、0.1nM、0.5nM、1nM、2.5nM、5nM、7.5nM、10nM、和20nM。

SEQUENCE LISTING

<110> 中科院微生物所

<120> 包含别构转录因子调控系统的生物传感器、试剂盒及其在小分子检测中的用途

<160> 35

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Deinococcus radiodurans

<400> 1

tacttagatg tctaccta 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tacttagatg tctaagta 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

taggtagatg tctaccta 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tacgtagatg tctaccta 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tacttagatg tctacgta 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tacgaagatg tctaccta 18

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tacgtcgatg tctaccta 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tacgtatatg tctaccta 18

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tacttagctg tctacgta 18

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gacttagatg tctacgta 18

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tacttagatg tcttccta 18

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tacttagatg tcaaccta 18

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tacttagatg tgtaccta 18

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cacttagatg tctaccta 18

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tgcttagatg tctaccta 18

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tacttagctg tctaccta 18

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tactgcgatg tctaccta 18

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

tactgagatg tataccta 18

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tactgagatg gctaccta 18

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tgcttcgatg tatgagta 18

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

tacttagttg tcgaactg 18

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

tacttagatg acgacctg 18

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

cactgctatg tctaagca 18

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

tacttggttg tctgcgtc 18

<210> 25

<211> 307

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gtcagaccgt ccgagtctgg tccctgaccg tgattgagcc tcgcccagtc gctccgaatc 60

cgctccagaa gggctgccgt gtcgttgtcc atgcgggctg acaccctaac acgagcaaca 120

gtgctacact gcggccctca gtaggtagac atctaagtat ctggcggcgg caccgggtcg 180

tgtcttcgtc gggacacggg aggacatgat gacgggaacc cagcaaccgg gcacgcagcc 240

gaaagtcaaa gtgcggctcg gcgagaacaa ctatggcaag gccgaagtgc agctcatgaa 300

gatcaag 307

<210> 26

<211> 525

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

cttgtcatcg tcgtccttgt agtcctcgag ggcggactgc cgcccggacc cggccccggt 60

cccgaactcc gtcgccggac gggcgtccag cttctcccgc aggcggctca gcaccgcgat 120

cgccacgcgc atgtcctcga ccggaatgtc ctcggccaga tactccagcc accgccgttc 180

caggggacgc aggtcgtcca gcgcctgccg gccgcgtgcg gtgagctcga ccagggggct 240

gcgctggtcc tgcgggttgg gccgggtcgt gacgacgccc tcggccttca gccgctcgac 300

ggtctgctgg accgcctgcc gccgcagccc ccgctcgcgg gccaggcggg cgaccgtcga 360

ggggccgctc agcagcagtc cggccacctg ccagcgcgcc gaggtcagcc ccgcgtgggc 420

ggtgaggctg tcgccttcgc ggagcaggcg gccgttgacc gcgaagacct cggcggtcac 480

ctcgatcaga gcggccaggt caggggctga ggaatccatg gccat 525

<210> 27

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

cacacacgtt gttcaccatc agcaacagtg ctacactgcg gccctcagta gggacaagac 60

cttgtctaga catctaagta tctggcggcg gca 93

<210> 28

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

cacacacgtt gttcaccatc agcaacagtg ctacactgcg gccctcagta gggacatgac 60

cttggctaga catctaagta tctggcggcg gca 93

<210> 29

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

cacacacgtt gttcaccatc agcaacagtg ctacactgcg gccctcagta gggacgtcac 60

cttgtctaga catctaagta tctggcggcg gca 93

<210> 30

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

cacacacgtt gttcaccatc agcaacagtg ctacactgcg gccctcagta ggcacaagac 60

ctggactaga catctaagta tctggcggcg gca 93

<210> 31

<211> 783

<212> DNA

<213> Streptomyces coelicolor

<400> 31

gtgatgagtc gaggagaggt gcgcatggcg aaggcagggc gggaggggcc gcgggacagc 60

gtgtggctgt cgggggaggg gcggcgcggc ggtcgccgtg ggcggcagcc gtccgggctc 120

gaccgggacc ggatcaccgg ggtcaccgtc cggctgctgg acacggaggg cctgacgggg 180

ttctcgatgc accgcctggc cgccgagctg aacgtcaccg cgatgtccgt gtactggtac 240

gtcgacacca aggaccagtt gctcgagctc gccctggacg ccgtcttcgg cgagctgcgc 300

cacccggacc cggacgccgg gctcgactgg cgcgaggaac tgcgggccct ggcccgggag 360

aaccgggcgc tgctggtgcg ccacccctgg tcgtcccggc tggtcggcac ctacctcaac 420

atcggcccgc actcgctggc cttctcccgc gcggtgcaga acgtcgtgcg ccgcagcggg 480

ctgcccgcgc accgcctgac cggcgccatc tcggccgtct tccagttcgt ctacggctac 540

ggcaccatcg agggccgctt cctcgcccgg gtggcggaca ccgggctgag tccggaggag 600

tacttccagg actcgatgac cgcggtgacc gaggtgccgg acaccgcggg cgtcatcgag 660

gacgcgcagg acatcatggc ggcccggggc ggcgacaccg tggcggagat gctggaccgg 720

gacttcgagt tcgccctcga cctgctcgtc gcgggcatcg acgcgatggt cgaacaggcc 780

tga 783

<210> 32

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

gctagtgaag ctcgaggatc tctatcattg atagacgtac ag 42

<210> 33

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

gatcctagag cttagaatgc tctatcattg atagacta 38

<210> 34

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

gctagtgaag ctcgaggatc tctatcattg atagaaagct tcatac 46

<210> 35

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

gatcctagag tctatgtatg aagctttcta tcattgatag agatcc 46

Claims

所述识别元件和所述换能元件均以液相形式提供。

2.如权利要求1所述的生物传感器，所述生物传感器进一步包含如下的任意一种或多种特征：

所述小分子具有大于50道尔顿但小于5000道尔顿的分子量；

所述小分子为重金属离子、药物、代谢物或污染物；

所述别构转录因子与所述小分子结合的平衡解离常数大于所述别构转录因子与所述DNA片段结合的平衡解离常数；优选地，所述别构转录因子与所述小分子结合的平衡解离常数是所述别构转录因子与所述DNA片段结合的平衡解离常数的10-10000倍、优选20-5000倍、更优选50-1000倍；

所述别构转录因子与所述小分子形成的复合物与所述DNA片段结合的平衡解离常数大于所述别构转录因子与所述DNA片段结合的平衡解离常数；优选地，所述别构转录因子与所述小分子形成的复合物与所述DNA片段结合的平衡解离常数是所述别构转录因子与所述DNA片段结合的平衡解离常数的10-10000倍、优选20-5000倍、更优选50-1000倍；

所述DNA片段具有10-150bp，更优选10-80bp的长度。

所述换能元件将所述别构转录因子、所述小分子与所述DNA片段之间相互作用的信号转换并放大为可检测的光信号；优选地，所述光信号是荧光信号或吸收光信号；

所述换能元件为能量供体化合物和能量受体化合物；

所述换能元件选自于ALPHA供体珠和受体珠、纳米颗粒和量子点；

所述能量供体化合物和所述能量受体化合物各自与所述DNA片段和所述别构转录因子相偶联；优选地，所述生物传感器进一步包含第二换能元件，所述第二换能元件包含位于所述DNA片段上的第二位点以及第二蛋白，所述第二蛋白能够与所述第二位点相互作用，所述能量供体化合物和所述能量受体化合物各自连接至所述DNA片段和所述第二蛋白，优选地，所述第二蛋白为与所述别构转录因子不同的第二转录因子；或者，所述生物传感器进一步包含第二换能元件，所述第二换能元件包含位于所述DNA片段上的第二位点以及第二蛋白，所述第二蛋白能够与所述第二位点相互作用；所述能量供体化合物和所述能量受体化合物各自连接至所述DNA片段的5’末端，或者所述能量供体化合物和所述能量受体化合物各自连接至所述DNA片段的3’末端；优选地，所述第二蛋白为核酸外切酶，所述第二位点为所述DNA片段5’或3’末端的悬垂序列；优选地，所述悬垂序列为3-6个碱基、优选5个碱基；或者，所述第二蛋白为核酸内切酶，所述第二位点为所述DNA片段上的限制性酶切位点。

3.一种用于检测小分子的试剂盒，所述试剂盒包含识别元件和换能元件，其中，

所述识别元件和所述换能元件均以液相形式提供。

4.如段落3所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含如下的任意一种或多种特征：

所述小分子具有大于50道尔顿但小于5000道尔顿的分子量；

所述小分子为重金属离子、药物、代谢物或污染物；

所述DNA片段具有10-150bp，更优选10-80bp的长度。

所述换能元件为能量供体化合物和能量受体化合物；

所述能量供体化合物和所述能量受体化合物各自与所述DNA片段和所述别构转录因子相偶联；优选地，所述试剂盒进一步包含第二换能元件，所述第二换能元件包含位于所述DNA片段上的第二位点以及第二蛋白，所述第二蛋白能够与所述第二位点相互作用，所述能量供体化合物和所述能量受体化合物各自连接至所述DNA片段和所述第二蛋白，优选地，所述第二蛋白为与所述别构转录因子不同的第二转录因子；或者，所述试剂盒进一步包含第二换能元件，所述第二换能元件包含位于所述DNA片段上的第二位点以及第二蛋白，所述第二蛋白能够与所述第二位点相互作用；所述能量供体化合物和所述能量受体化合物各自连接至所述DNA片段的5’末端，或者所述能量供体化合物和所述能量受体化合物各自连接至所述DNA片段的3’末端；优选地，所述第二蛋白为核酸外切酶，所述第二位点为所述DNA片段5’或3’末端的悬垂序列；优选地，所述悬垂序列为3-6个碱基、优选5个碱基；或者，所述第二蛋白为核酸内切酶，所述第二位点为所述DNA片段上的限制性酶切位点。

5.别构转录因子在制备用于检测小分子的试剂盒中的用途，所述试剂盒包含识别元件和换能元件，其中，

所述识别元件和所述换能元件均以液相形式提供。

6.如段落5所述的用途，所述用途进一步包含如下的任意一种或多种特征：

所述小分子具有大于50道尔顿但小于5000道尔顿的分子量；

所述小分子为重金属离子、药物、代谢物或污染物；

所述DNA片段具有10-150bp，更优选10-80bp的长度。

所述换能元件为能量供体化合物和能量受体化合物；

7.一种对样品中的小分子进行检测的方法，所述方法包含如下步骤：

(b)将所述样品与所述检测用溶液混合；以及

(c)对步骤(b)获得的混合物进行检测，

其中，步骤(a)-(c)全部在液相实施。

8.如权利要求7所述的方法，所述方法进一步包含如下的任意一种或多种特征：

所述样品为环境样品，例如为地下水、中水、海水、废水、采矿废料的样品；或者，所述样品为生物样品，特别是来自受试者的样品，例如以下样品中的一种或多种：血液、血清、血浆、痰、脑脊液流体、尿液、泪液、肺泡分离物、胸膜液、囊液、组织、唾液；或者，所述样品为来自于食品、饮用水或饲料的样品；

所述小分子具有大于50道尔顿但小于5000道尔顿的分子量；

所述小分子为重金属离子、药物、代谢物或污染物；

所述DNA片段具有10-150bp，更优选10-80bp的长度；

所述换能元件为能量供体化合物和能量受体化合物；

所述能量供体化合物和所述能量受体化合物各自与所述DNA片段和所述别构转录因子相偶联；优选地，所述检测用溶液进一步包含第二换能元件，所述第二换能元件包含位于所述DNA片段上的第二位点以及第二蛋白，所述第二蛋白能够与所述第二位点相互作用，所述能量供体化合物和所述能量受体化合物各自连接至所述DNA片段和所述第二蛋白，优选地，所述第二蛋白为与所述别构转录因子不同的第二转录因子；或者，所述检测用溶液进一步包含第二换能元件，所述第二换能元件包含位于所述DNA片段上的第二位点以及第二蛋白，所述第二蛋白能够与所述第二位点相互作用；所述能量供体化合物和所述能量受体化合物各自连接至所述DNA片段的5’末端，或者所述能量供体化合物和所述能量受体化合物各自连接至所述DNA片段的3’末端；优选地，所述第二蛋白为核酸外切酶，所述第二位点为所述DNA片段5’或3’末端的悬垂序列；优选地，所述悬垂序列为3-6个碱基、优选5个碱基；或者，所述第二蛋白为核酸内切酶，所述第二位点为所述DNA片段上的限制性酶切位点。