CN107974478A - 一种地龙蛋白多肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种地龙蛋白多肽的制备方法，包括：自溶酶解、二次酶解、纯化，先让干净的地龙在适当条件下自溶酶解，取上清液后加入枯草芽孢杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶二次酶解，酶解过程中以双频率复合超声与微波辐射交错间隔辅助酶解，二次酶解的中程添加（S）‑1‑氨基‑2‑羟甲基二氢吲哚以防止酶失活，酶解后以超滤膜纯化制得地龙蛋白多肽。有益效果为：酶解过程中以双频率超声与微波辐射交错间隔辅助酶解，不仅可以为酶解体系提供能量，维持酶解所需温度，而且双频率超声与微波辐射的交替间隔辅助还可以大大提高酶解效率，降低酶解时间，同时保证了酶解的彻底性与准确性，节约了成本。
Description
技术领域
本发明涉及多肽的制备领域，尤其是涉及一种地龙蛋白多肽的制备方法。
技术背景
地龙，又名地龙，是我国重要的中药材之一。最早的中药学专著《神农本草经》中收载的67种动物药中就有地龙。在《神农本草经》列为下品，具有清热定惊、通络、平喘、利尿的功效。常炒制后用于高热、神昏、惊痫抽搐、关节痹痛、肺热喘咳、尿少水肿、高血压等症，主含多种氨基酸。由于生品腥味太重，故入药一般需经炒制。陶弘景谓：“若服干蚓，须熬作屑”。传统用地龙，制法很多，主要有药制、醋制、熬制、酒制、油制、蛤粉炒制、盐制等法，使其质地松泡酥脆、去毒性、矫正臭味及便于煎制服用。
李时珍在《本草纲目》称之为具有通经活络、活血化瘀、预防治疗心脑血管疾病作用，在《本草纲目》虫部中有40多种药用作用。地龙可以生产多种中药、西药、人、畜用药品、地龙注射液、普恩复、溶栓、百奥、抗栓、步长胶囊。也可以作为各种家禽、家畜、渔业水产品、水族宠物食品、动物性活食饵料、饲料添剂诱食剂。干地龙可以作为各种鱼类、水产品高档开口饵料。鲜地龙是高蛋白活饵料。畜禽动物，长吃地龙可以减少用药量，降低死亡率。冻地龙是高效益药物饵料，各种畜禽动物长吃地龙可改善肉蛋奶品质，减少药物残留。冻干地龙是高营养水产品漂浮饵料。地龙含有地龙素、地龙解热素、维生素B族复合体等成分。地龙可以提取蛋白酶、蚓激酶、地龙纤溶酶等生物药品。
关于地龙多肽的制备技术有很多方法，现有技术如授权公众号为CN 101297672 B的中国发明专利，公开了一种利用地龙肠道活性酶酶解鱼蛋白生产活性肽的方法，该发明方法利用地龙加水自溶解制备活性酶液，具有制备方法简单，成本较低的优点，但是该发明方法仅仅利用了地龙的极小部分蛋白作为酶液，极大地浪费了地龙富含蛋白质的优点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种地龙蛋白多肽的制备方法，本制备方法简单易行，地龙蛋白多肽的得率与提取效率较高。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种地龙蛋白多肽的制备方法，包括：自溶酶解、二次酶解、纯化，具体包括以下步骤：
自溶酶解：取新鲜地龙，以含有充足溶氧的纯净水浸泡5-7天以使地龙吐出脏物，将干净的地龙用高速组织捣碎机捣碎，加入1.5-3.0倍的水，调节pH为6.2-6.8，以45-50℃保温反应12-24小时，静置15-30分钟后以3000-4500r/min离心10-15分钟，取上清液待用；利用地龙自身肠道中的活性酶，将地龙高达70%的蛋白质通过自溶酶解酶解为蛋白质片段，提高了效率，降低了成本，为进一步的酶解做准备；
二次酶解：调节pH为6.5-7.0后加入3.0-3.3%的复合酶，50-65℃酶解15-20分钟；在体系中加入复合酶重量5-25‰的（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚，再持续酶解15-20分钟，酶解过程中以双频率复合超声与微波辐射交替间隔辅助酶解，酶解完成后沸水浴灭活20-25分钟，静置15-30分钟，经2000-3500 r/min、0-4℃离心15-25分钟，取上清液；过长的微波辐射时长会影响枯草芽孢杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶蛋白质的空间结构，进而降低酶的活性，随着反应的进行与微波辐射时长的增加，在酶解反应的中程添加（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚，（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚在较强酸性环境下可以发生二聚合、三聚合反应，聚合产物可以与枯草芽孢杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶产生亲电作用，防止枯草芽孢杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶蛋白质结构发生变化，从而防止其活性的减低；
纯化：然后用超滤装置让酶解液依次通过10KD、3KD的超滤膜，收集3-10KD分子段的酶解液，低温干燥后以-80~-100℃冷冻保藏；超滤可以将酶解产物中大蛋白与小分子氨基酸滤除，操作简单，成本较低，不尽提高了地龙蛋白多肽的纯度，而且有利于更加精细化的考察蛋白多肽的分子量、氨基酸序列、功能等指标。
作为优选，复合酶为重量比为1:2-3的枯草芽孢杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶；利用复合酶酶解，可以大大的发挥两种酶的综合效应，在用量相同的条件下提高酶解效率，降低反应时间，节约时间成本。
作为优选，双频率复合超声与微波辐射交错间隔辅助酶解的步骤为：开启双频率超声波50-55秒，关闭超声波，开启微波辐射5-10秒，关闭微波辐射；开启双频率超声波50-55秒，关闭超声波，开启微波辐射5-10秒，关闭微波辐射；在酶解过程中持续地以双频率超声与微波辐射交错间隔辅助酶解；以双频率超声与微波辐射交错间隔辅助酶解，不仅可以为酶解体系提供能量，维持酶解所需温度，而且双频率超声与微波辐射的交替间隔辅助还可以大大提高酶解效率，降低酶解时间，同时保证了酶解的彻底性与准确性，节约了成本；
作为优选，双频率超声波的超声频率与超声密度分别为30-33kHz、0.33-0.35W/cm2与60-63kHz、0.53-0.55W/cm2，微波辐射的功率为100-120W；双频率复合超声波的双空化效应可以产生叠加作用与协同作用，所产生的空化效应较之单频甚至双频交替要强的多，其所产生的空化崩溃次数也较多，更加高效的打散团聚的蛋白质分子与酶分子，使酶与底物的接触几率与接触面积大大增大，从而提高酶解效率；微波频率的共振使蛋白质大分子能象偶极子分子一样在微波的作用下产生振荡，这种振荡使蛋白质分子在微波触发下产生相干、有序的振动，从而加快蛋白的酶解。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1）先后以自溶酶解与复合酶酶解制备地龙蛋白多肽，降低了酶解反应时间，提高了酶解效率；2）酶解过程中以双频率超声与微波辐射交错间隔辅助酶解，不仅可以为酶解体系提供能量，维持酶解所需温度，而且双频率超声与微波辐射的交替间隔辅助还可以大大提高酶解效率，降低酶解时间，同时保证了酶解的彻底性与准确性，节约了成本；3）在酶解反应的中程添加（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚，（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚在较强酸性环境下可以发生二聚合、三聚合反应，聚合产物可以与枯草芽孢杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶产生亲电作用，防止枯草芽孢杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶蛋白质结构发生变化，从而防止其活性的减低。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一种地龙蛋白多肽的制备方法，包括以下步骤：
1）取新鲜地龙，以含有充足溶氧的纯净水浸泡5天以使地龙吐出脏物，将干净的地龙用高速组织捣碎机捣碎，加入1.5倍的水，调节pH为6.2，以45℃保温反应12小时，静置15分钟后以3000r/min离心10分钟，取上清液待用； 2）调节pH为6.5后加入3.0%的复合酶，50℃酶解15分钟；在体系中加入复合酶重量5‰的（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚，再持续酶解15分钟，酶解过程中以双频率复合超声与微波辐射交替间隔辅助酶解，酶解完成后沸水浴灭活20分钟，静置15分钟，经2000 r/min、0℃离心15-25分钟，取上清液；3）然后用超滤装置让酶解液依次通过10KD、3KD的超滤膜，收集3-10KD分子段的酶解液，低温干燥后以-80℃冷冻保藏；超滤可以将酶解产物中大蛋白与小分子氨基酸滤除，操作简单，成本较低，不尽提高了地龙蛋白多肽的纯度，而且有利于更加精细化的考察蛋白多肽的分子量、氨基酸序列、功能等指标。
实施2：
一种地龙蛋白多肽的制备方法，包括以下步骤：
1）自溶酶解：取新鲜地龙，以含有充足溶氧的纯净水浸泡7天以使地龙吐出脏物，将干净的地龙用高速组织捣碎机捣碎，加入3.0倍的水，调节pH为6.8，以50℃保温反应24小时，静置30分钟后以4500r/min离心15分钟，取上清液待用；利用地龙自身肠道中的活性酶，将地龙高达70%的蛋白质通过自溶酶解酶解为蛋白质片段，提高了效率，降低了成本，为进一步的酶解做准备；
2）二次酶解：调节pH为7.0后加入3.3%的复合酶，复合酶为重量比为1:3的枯草芽孢杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶的混合酶，65℃酶解20分钟；在体系中加入复合酶重量25‰的（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚，再持续酶解20分钟，酶解过程中以双频率复合超声（55秒）与微波辐射（5秒）交替间隔辅助酶解，双频率超声波的超声频率与超声密度分别为33kHz、0.35W/cm2与63kHz、0.55W/cm2，微波辐射的功率为120W，酶解完成后沸水浴灭活25分钟，静置30分钟，经3500 r/min、4℃离心25分钟，取上清液；过长的微波辐射时长会影响枯草芽孢杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶蛋白质的空间结构，进而降低酶的活性，随着反应的进行与微波辐射时长的增加，在酶解反应的中程添加（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚，（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚在较强酸性环境下可以发生二聚合、三聚合反应，聚合产物可以与枯草芽孢杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶产生亲电作用，防止枯草芽孢杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶蛋白质结构发生变化，从而防止其活性的减低；
3）纯化：然后用超滤装置让酶解液依次通过10KD、3KD的超滤膜，收集3-10KD分子段的酶解液，低温干燥后以-100℃冷冻保藏；超滤可以将酶解产物中大蛋白与小分子氨基酸滤除，操作简单，成本较低，不尽提高了地龙蛋白多肽的纯度，而且有利于更加精细化的考察蛋白多肽的分子量、氨基酸序列、功能等指标。
实施3：
一种地龙蛋白多肽的制备方法，包括：自溶酶解、二次酶解、纯化，具体包括以下步骤：
自溶酶解：取新鲜地龙，以含有充足溶氧的纯净水浸泡6天以使地龙吐出脏物，将干净的地龙用高速组织捣碎机捣碎，加入2.0倍的水，调节pH为6.5，以48℃保温反应20小时，静置25分钟后以3600r/min离心12分钟，取上清液待用；利用地龙自身肠道中的活性酶，将地龙高达70%的蛋白质通过自溶酶解酶解为蛋白质片段，提高了效率，降低了成本，为进一步的酶解做准备；
二次酶解：调节pH为6.8后加入3.0%的复合酶，复合酶为重量比为1:3的枯草芽孢杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶的混合酶，55℃酶解15分钟；在体系中加入复合酶重量20‰的（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚，再持续酶解15-20分钟，酶解过程中以双频率复合超声（55秒）与微波辐射（5秒）交替间隔辅助酶解，酶解完成后沸水浴灭活20分钟，静置25分钟，经3000 r/min、3℃离心20分钟，取上清液；过长的微波辐射时长会影响枯草芽孢杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶蛋白质的空间结构，进而降低酶的活性，随着反应的进行与微波辐射时长的增加，在酶解反应的中程添加（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚，（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚在较强酸性环境下可以发生二聚合、三聚合反应，聚合产物可以与枯草芽孢杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶产生亲电作用，防止枯草芽孢杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶蛋白质结构发生变化，从而防止其活性的减低；
纯化：然后用超滤装置让酶解液依次通过10KD、3KD的超滤膜，收集3-10KD分子段的酶解液，低温干燥后以-85℃冷冻保藏；超滤可以将酶解产物中大蛋白与小分子氨基酸滤除，操作简单，成本较低，不尽提高了地龙蛋白多肽的纯度，而且有利于更加精细化的考察蛋白多肽的分子量、氨基酸序列、功能等指标。
双频率复合超声与微波辐射交错间隔辅助酶解的步骤为：开启双频率超声波52秒，关闭超声波，开启微波辐射8秒，关闭微波辐射；开启双频率超声波52秒，关闭超声波，开启微波辐射8秒，关闭微波辐射；在酶解过程中持续地以双频率超声与微波辐射交错间隔辅助酶解；以双频率超声与微波辐射交错间隔辅助酶解，不仅可以为酶解体系提供能量，维持酶解所需温度，而且双频率超声与微波辐射的交替间隔辅助还可以大大提高酶解效率，降低酶解时间，同时保证了酶解的彻底性与准确性，节约了成本；
双频率超声波的超声频率与超声密度分别为32kHz、0.33W/cm2与61kHz、0.53W/cm2，微波辐射的功率为110W；双频率复合超声波的双空化效应可以产生叠加作用与协同作用，所产生的空化效应较之单频甚至双频交替要强的多，其所产生的空化崩溃次数也较多，更加高效的打散团聚的蛋白质分子与酶分子，使酶与底物的接触几率与接触面积大大增大，从而提高酶解效率；微波频率的共振使蛋白质大分子能象偶极子分子一样在微波的作用下产生振荡，这种振荡使蛋白质分子在微波触发下产生相干、有序的振动，从而加快蛋白的酶解。
本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种地龙蛋白多肽的制备方法，其特征在于，所述的地龙蛋白多肽的制备方法包括：
自溶酶解：取新鲜地龙，以含有充足溶氧的纯净水浸泡5-7天以使地龙吐出脏物，将干净的地龙用高速组织捣碎机捣碎，加入1.5-3.0倍的水，自溶酶解，静置15-30分钟后以3000-4500r/min离心10-15分钟，取上清液待用；
二次酶解：调节pH为6.5-7.0后加入复合酶，50-65℃酶解15-20分钟；在体系中加入（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚，持续酶解15-20分钟，以双频率复合超声与微波辐射交替间隔辅助酶解，酶解完成后沸水浴灭活20-25分钟，静置15-30分钟，经2000-3500 r/min、0-4℃离心15-25分钟，取上清；
纯化：然后用超滤装置让酶解液依次通过10KD、3KD的超滤膜，收集3-10KD分子段的酶解液，低温干燥后冷冻保藏。
2.根据权利要求1所述的一种地龙蛋白多肽的制备方法，其特征在于：所述自溶酶解步骤中的自溶pH为6.2-6.8，温度为45-50℃，保温反应时间为12-24小时。
3.根据权利要求1所述的一种地龙蛋白多肽的制备方法，其特征在于：所述二次酶解步骤中复合酶的添加量为地龙组织重量的3.0-3.3%。
4.根据权利要求1所述的一种地龙蛋白多肽的制备方法，其特征在于：所述二次酶解步骤中的复合酶为重量比为1:2-3的枯草芽孢杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶。
5.根据权利要求1所述的一种地龙蛋白多肽的制备方法，其特征在于：所述二次酶解步骤中的（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚的添加量为复合酶重量的5-25‰。
6.根据权利要求1所述的一种地龙蛋白多肽的制备方法，其特征在于：所述二次酶解步骤中以双频率复合超声与微波辐射交错间隔辅助酶解的步骤为：开启双频率超声波50-55秒，关闭超声波，开启微波辐射5-10秒，关闭微波辐射，开启双频率超声波50-55秒，关闭超声波，开启微波辐射5-10秒，关闭微波辐射，在酶解过程中持续地以双频率超声与微波辐射交错间隔辅助酶解。
7.根据权利要求1所述的一种地龙蛋白多肽的制备方法，其特征在于：所述二次酶解步骤中双频率超声波的超声频率与超声密度分别为30-33kHz、0.33-0.35W/cm2与60-63kHz、0.53-0.55W/cm2，微波辐射的功率为100-120W。
8.根据权利要求1所述的一种地龙蛋白多肽的制备方法，其特征在于：所述纯化步骤中冷冻保藏的温度为-80~-100℃。
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