CN107966567B - 一种触珠蛋白测定试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及蛋白质测定试剂盒，更具体涉及一种触珠蛋白测定试剂。述的触珠蛋白测定试剂盒包含独立包装的试剂1和试剂2。上述试剂1的配方包括：50‑150mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液、3‑12g/L聚氧乙烯月桂醚‑35、3‑8g/L牛血清白蛋白、4‑8g/L氯化钠和0.1‑0.3mL/L液体生物防腐剂。上述试剂1和试剂2中还包括增强剂，加入增强剂后，试剂的稳定性大大提高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及蛋白质测定试剂盒，更具体涉及一种触珠蛋白测定试剂。
背景技术
触珠蛋白又称结合珠蛋白，是一种急性时相蛋白，在肝细胞合成，是由两条轻链(α链)和两条重链(β链)组成的糖蛋白。触珠蛋白能结合溶血引起的游离血红蛋白，并转运到肝细胞进行降解。溶血发生时，由于其清除速度比肝脏合成新的触珠蛋白速度快得多，所以任何能使红细胞破碎引起血红蛋白增多的情况，都会使血清中触珠蛋白浓度降低。溶血性贫血、肝细胞损害时浓度显著降低；炎症、创伤和冠心病时浓度明显升高。因此触珠蛋白的测定有重要的生物学和医学意义。触珠蛋白抗体可与血清中的触珠蛋白产生凝集反应，形成抗原抗体复合物，其浊度高低在一定量抗体存在时与血清中触珠蛋白成正比。通过测定特定波长的吸光度值，参照校准曲线即可计算出血清中触珠蛋白的浓度。
一个层面上，目前面市或公开的触珠蛋白检测试剂或试剂盒的种类并不多。一方面使得用户所能够选择的范围比较窄；另一方面，面市产品少意味着市场竞争小，价格高，进而用户使用成本居高不下；再一个方面，也使得这一类型的产品难以通过活跃的市场竞争形成有效的技术促进，进而使得该类型产品在技术上长期没有新进展。
另一个层面上，就目前已公开的触珠蛋白测定产品来看，虽然产品种类不足，但其在实际应用中已经暴露出严重的技术问题。例如，国家食品药品监督管理局于2012年11月26日发布了：Ortho-Clinical Diagnostics,Inc公司对触珠蛋白测定试剂盒(免疫比浊法)进行召回，由于用户使用时频繁出现样品处理和无法获得测定结果的问题，该公司对其生产的部分型号批次的触珠蛋白测定试剂盒(免疫比浊法)(注册号：国食药监械(进)字2010第2402877号)进行主动召回。虽然这次召回没有涉及中国市场，但仍然反映出了目前触珠蛋白检测试剂(盒)存在一定的技术缺陷和不稳定性。
目前我国国内也有一些触珠蛋白测定产品面市。例如浙江康特生物科技有限公司(市售1)或宁波瑞源生物科技有限公司(市售2)生产的触珠蛋白测定试剂盒(免疫比浊法)，这两种试剂盒均供体外定量检测人血清中触珠蛋白的含量。这两种试剂盒的产品储存条件及有效期均为：2-8℃条件下(干燥、避光)储存，有效期12个月。经实际验证，这两种试剂盒在开启后，其中的试剂在2-8℃避光保存最多稳定30天，其中的校准品在2-8℃避光保存最多稳定7天。有的市售触珠蛋白测定产品的密封有效期甚至只有6个月不到。而一个产品从出厂，到经历各级经销商，再到医院或其他使用机构，所经历的的流通或运输时间很多情况下长达数月之久。也就是说上述试剂盒在到达用户手中之时其实际有效期已经大大缩短，再加上试剂一旦开启其稳定期仅仅数天，最多数十天。以上原因会导致大量开封前过期产品或开封后失效产品，理论上这些过期或失效产品应当废弃或回收，但实际上其中的一部分仍混杂在流通途径中。这一方面造成了资源的极大浪费，另一方面造成了市场的混乱，更甚者这些过期失效产品一旦用于检测者很可能造成错误的测定结果从而引起严重医疗事故。
技术人员虽然无法参与到商品流通的管理，然而却能够技术层面尽可能的减少上述情况发生的可能性。因此，提高触珠蛋白测定产品的稳定性、简化其保存条件应当是该领研发人员致力研究的一个重要方向。
目前能够检索到的最新的技术更新是中国专利申请201510407469公开的一种触珠蛋白测定试剂盒，然而该发明的侧重点是试剂盒的机械构造，其仅仅公开了触珠蛋白检测中的部分常规试剂，例如聚乙二醇、磷酸盐缓冲液、羊抗人触珠蛋白抗体、牛血清白蛋白等。并且并未对如何提高检测试剂盒的稳定性提供任何新思路。
综上所述，如何进一步提高触珠蛋白测定试剂(盒)的稳定性、灵敏度、准确度等性能是本领域值得关注的研究方向。
发明内容
为弥补现有技术的不足，本发明提供了一种触珠蛋白测定试剂盒。与现有技术相比，该试剂盒的准确性、灵敏度等性能有一定程度的提高，同时该试剂盒的稳定性获得大幅提高，其保存条件得到了简化。
本发明采用的技术方案为：
一种触珠蛋白测定试剂盒，其特征在于：所述的触珠蛋白测定试剂盒包含独立包装的试剂1和试剂2。
上述试剂1的配方包括：50-150mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液、3-12g/L聚氧乙烯月桂醚-35、3-8g/L牛血清白蛋白、4-8g/L氯化钠和0.1-0.3mL/L液体生物防腐剂。
优选地，上述试剂1的配方包括：70-130mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液、5-11g/L聚氧乙烯月桂醚-35、4-7g/L牛血清白蛋白、5-7g/L氯化钠和0.1-0.3mL/L液体生物防腐剂。
进一步优选地，上述试剂1的配方包括：80-110mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液、7-10g/L聚氧乙烯月桂醚-35、4-6g/L牛血清白蛋白、5-6g/L氯化钠和0.1-0.3mL/L液体生物防腐剂。
在一个优选的实施方案中，上述试剂1的配方包括：100mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液、10g/L聚氧乙烯月桂醚-35、5g/L牛血清白蛋白、5.85g/L氯化钠和0.2mL/L液体生物防腐剂。
在另一个优选的实施方案中，上述试剂1的配方包括：90mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液、8.5g/L聚氧乙烯月桂醚-35、4.5g/L牛血清白蛋白、5.35g/L氯化钠和0.1mL/L液体生物防腐剂。
上述试剂2的配方包括：50-150mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液、10-30mL/L羊抗人触珠蛋白抗体、3-8g/L牛血清白蛋白和0.1-0.3mL/L液体生物防腐剂。
优选地，上述试剂2的配方包括：70-130mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液、15-25mL/L羊抗人触珠蛋白抗体、4-7g/L牛血清白蛋白和0.1-0.3mL/L液体生物防腐剂。
进一步优选地，上述试剂2的配方包括：80-110mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液、18-20mL/L羊抗人触珠蛋白抗体、4-6g/L牛血清白蛋白和0.1-0.3mL/L液体生物防腐剂。
在一个优选的实施方案中，上述试剂2的配方包括：100mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液、20mL/L羊抗人触珠蛋白抗体、5g/L牛血清白蛋白和0.2mL/L液体生物防腐剂。
在另一个优选的实施方案中，上述试剂2的配方包括：80mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液、20mL/L羊抗人触珠蛋白抗体、4g/L牛血清白蛋白和0.2mL/L液体生物防腐剂。
本发明中涉及到的液体生物防腐剂可以选自ProClin150、ProClin200或ProClin300中的任意一种；优选自ProClin200或ProClin300中的任意一种。
预期之外的是，当上述试剂1或试剂2中加入增强剂后，不仅使得本发明提供的触珠蛋白测定试剂盒的检测准确性和灵敏度略有提高，更重要的是大大提高了其稳定性，使得试剂盒保存条件简化。
上述增强剂可以为糖类；所述的糖类为三糖；所述的三糖优选为棉子糖或其衍生物。
棉子糖(Raffinose)广泛存在与自然界中，例如甜菜、马铃薯、卷心菜等蔬菜中，香蕉、葡萄等水果中，水稻、小麦等谷物中等。棉子糖是由半乳糖、果糖和葡萄糖结合而成，是一种功能性低聚糖。
棉子糖具有调节或增强免疫力、保湿美容、调节血压等功能或功效，因此被广泛应用于食品、医药、化妆品等的领域。
本发明在实施过程中还意料不到的发现，当棉子糖以一定的含量范围存在于上述试剂1或试剂2中时，能够发挥相对更好的增强效果，这一含量范围为0.5-3g/L，优选为0.7-1.9g/L，进一步优选为0.9-1.3g/L；当其含量小于0.5g/L时，并没有观察到对试剂1或试剂2有明显的增强效果，推测一种可能的原因为当其含量小于0.5g/L时，棉子糖在试剂中的分子数量不足以形成有效的分子间接触，从而无法发挥有效的增强效果；当其含量大于3g/L时，同样没有观察到对试剂1或试剂2有明显的增强效果，推测一种可能的原因为当其含量大于3g/L时，其在试剂中的分子数量过多，影响到其他配方(例如液体生物防腐剂)分子在试剂中的相互作用，从而也无法发挥有效的增强效果。
本领域技术人员可以想到的是，其它与棉子糖具有相同或相似分子结构的三糖应用于本发明中也能发挥上述技术效果，因此应当包含于本发明要求保护的范围之内。
因此，作为一个优选的实施方案，本发明所述的触珠蛋白测定试剂盒包含独立包装的试剂1和试剂2；所述的试剂1的配方包括：50-150mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液、3-12g/L聚氧乙烯月桂醚-35、3-8g/L牛血清白蛋白、4-8g/L氯化钠、0.1-0.3mL/L液体生物防腐剂和0.5-3g/L棉子糖；所述的试剂2的配方包括：50-150mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液、10-30mL/L羊抗人触珠蛋白抗体、3-8g/L牛血清白蛋白、0.1-0.3mL/L液体生物防腐剂和0.5-3g/L棉子糖。
进一步地，本发明提供的触珠蛋白测定试剂盒还包括校准品，所述的校准品包含独立包装或混装在一起的触珠蛋白、氯化钠、牛血清白蛋白、蔗糖和液态生物防腐剂。
因此，作为另一个优选的实施方案，本发明所述的触珠蛋白测定试剂盒包含独立包装的试剂1、试剂2和校准品；所述的试剂1的配方包括：50-150mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液、3-12g/L聚氧乙烯月桂醚-35、3-8g/L牛血清白蛋白、4-8g/L氯化钠、0.1-0.3mL/L液体生物防腐剂和0.5-3g/L棉子糖；所述的试剂2的配方包括：50-150mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液、10-30mL/L羊抗人触珠蛋白抗体、3-8g/L牛血清白蛋白、0.1-0.3mL/L液体生物防腐剂和0.5-3g/L棉子糖；所述的校准品包含独立包装或混装在一起的触珠蛋白、氯化钠、牛血清白蛋白、蔗糖和液态生物防腐剂。
本发明提供的触珠蛋白测定试剂盒的使用方法优选为：
(1)基本参数：
1)反应类型：终点法；2)反应温度：37℃；3)主波长：340nm；4)次波长：700nm；5)样本量：3μl；6)试剂1(R1)量：240μl；7)试剂2(R2)量：60μl；8)反应方向：升反应；
(2)步骤：向样本中加入试剂1，反应5分钟后测定吸光度并计为A1；再加入试剂2，反应5分钟后测定吸光度并计为A2；按下式计算吸光度变化值：△A＝A2-A1；以校准品的吸光度变化值△A为纵坐标，其相应的浓度C为横坐标绘制校准曲线，根据样本的△A在校准曲线上找出对应的样本中触珠蛋白浓度。
在上述使用方法中，样本的类型为血清，优选为空腹血清。
本发明中涉及到的所有配方范围包括在该范围内的所有整数和小数，例如3-12g/L聚氧乙烯月桂醚-35包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或3-12之间的所有小数g/L聚氧乙烯月桂醚-35。
具体实施方式
以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
如没有特别说明，本发明中涉及的物质(包括有机物质和无机物质)均为通过商业途径获得。
实施例1一种触珠蛋白测定试剂盒
包含独立包装的试剂1、试剂2和校准品。
其中，校准品包含独立包装的触珠蛋白、氯化钠、牛血清白蛋白、蔗糖和Proclin300。
其中，试剂1和试剂2的配方如下表所示：
实施例2一种触珠蛋白测定试剂盒
包含独立包装的试剂1、试剂2和校准品。
其中，校准品包含独立包装的触珠蛋白、氯化钠、牛血清白蛋白、蔗糖和Proclin300。
其中，试剂1和试剂2的配方如下表所示：
实施例3一种触珠蛋白测定试剂盒
包含独立包装的试剂1、试剂2和校准品。
其中，校准品包含独立包装的触珠蛋白、氯化钠、牛血清白蛋白、蔗糖和Proclin300。
其中，试剂1和试剂2的配方如下表所示：
如没有特别说明，本发明实施方式中涉及到的实施例或对比例的配方中，加入的羊抗人触珠蛋白抗体的母液浓度为20mg/mL。
实施例4一种触珠蛋白测定试剂盒
本实施例和实施例3的差别在于：本实施例的试剂1和试剂2的配方中还包括0.5g/L的棉子糖，其余同实施例3。
实施例5一种触珠蛋白测定试剂盒
本实施例和实施例3的差别在于：本实施例的试剂1和试剂2的配方中还包括3g/L的棉子糖，其余同实施例3。
实施例6一种触珠蛋白测定试剂盒
本实施例和实施例3的差别在于：本实施例的试剂1和试剂2的配方中还包括1g/L的棉子糖，其余同实施例3。
实施例7一种触珠蛋白测定试剂盒
本实施例和实施例6的差别在于：将实施例6的试剂1、试剂2和校准品中的Proclin300替换为Proclin200，其余同实施例6。
实施例8一种触珠蛋白测定试剂盒
本实施例和实施例6的差别在于：将实施例6的试剂1、试剂2和校准品中的Proclin300替换为Proclin150，其余同实施例6。
实施例9一种触珠蛋白测定试剂盒
本实施例和实施例6的差别在于：将实施例6的试剂1和试剂2中的三羟甲基氨基甲烷缓冲液的浓度改为70mM，其余同实施例6。
对比例1一种触珠蛋白测定试剂盒
本实施例和实施例6的差别在于：本实施例的试剂1和试剂2的配方中棉子糖的浓度为0.4g/L的，其余同实施例6。
对比例2一种触珠蛋白测定试剂盒
本实施例和实施例6的差别在于：本实施例的试剂1和试剂2的配方中棉子糖的浓度为3.5g/L的，其余同实施例6。
性能试验：对上述实施例和对比例中的试剂1和试剂2进行性能试验
1、线性范围：利用已知浓度的触珠蛋白样本检测上述实施例和对比例的线性范围，结果如下：
| 实例 | 线性范围 | 线性相关系数(r) |
| 实施例1 | 0.5-2.7g/L | ≥0.9900 |
| 实施例2 | 0.3-2.8g/L | ≥0.9900 |
| 实施例3 | 0.2-3.0g/L | ≥0.9900 |
| 实施例4 | 0.1-3.0g/L | ≥0.9900 |
| 实施例5 | 0.2-3.3g/L | ≥0.9900 |
| 实施例6 | 0.05-4.0g/L | ≥0.9999 |
| 实施例7 | 0.2-3.5g/L | ≥0.9900 |
| 实施例8 | 0.1-3.4g/L | ≥0.9900 |
| 实施例9 | 0.2-3.5g/L | ≥0.9900 |
| 对比例1 | 0.1-3.5g/L | ≥0.9900 |
| 对比例2 | 0.1-3.0g/L | ≥0.9900 |
2、稳定性
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种触珠蛋白测定试剂盒，其特征在于：所述的触珠蛋白测定试剂盒包含独立包装的试剂1和试剂2；所述的试剂1的配方包括：50-150mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液、3-12g/L聚氧乙烯月桂醚-35、3-8g/L牛血清白蛋白、4-8g/L氯化钠、0.1-0.3mL/L液体生物防腐剂和0.5-3g/L棉子糖；所述的试剂2的配方包括：50-150mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液、10-30mL/L羊抗人触珠蛋白抗体、3-8g/L牛血清白蛋白、0.1-0.3mL/L液体生物防腐剂和0.5-3g/L棉子糖。
2.如权利要求1所述的触珠蛋白测定试剂盒，其特征在于：所述的液体生物防腐剂选自ProClin150、ProClin200或ProClin300中的任意一种。
3.如权利要求2所述的触珠蛋白测定试剂盒，其特征在于：所述的液体生物防腐剂选自ProClin200或ProClin300中的任意一种。
4.如权利要求3所述的触珠蛋白测定试剂盒，其特征在于：所述的液体生物防腐剂为ProClin300。
5.如权利要求1所述的触珠蛋白测定试剂盒，其特征在于：所述的试剂1的配方包括：100mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液、10g/L聚氧乙烯月桂醚-35、5g/L牛血清白蛋白、5.85g/L氯化钠、0.2mL/L液体生物防腐剂和1g/L棉子糖；所述的试剂2的配方包括：100mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液、20mL/L羊抗人触珠蛋白抗体、5g/L牛血清白蛋白、0.2mL/L液体生物防腐剂和1g/L棉子糖。
6.如权利要求1-4任意一项所述的触珠蛋白测定试剂盒，其特征在于：所述的触珠蛋白测定试剂盒包含独立包装的试剂1、试剂2和校准品；所述的试剂1的配方包括：50-150mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液、3-12g/L聚氧乙烯月桂醚-35、3-8g/L牛血清白蛋白、4-8g/L氯化钠、0.1-0.3mL/L液体生物防腐剂和0.5-3g/L棉子糖；所述的试剂2的配方包括：50-150mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液、10-30mL/L羊抗人触珠蛋白抗体、3-8g/L牛血清白蛋白、0.1-0.3mL/L液体生物防腐剂和0.5-3g/L棉子糖；所述的校准品包含独立包装或混装在一起的触珠蛋白、氯化钠、牛血清白蛋白、蔗糖和液态生物防腐剂。
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| GR01 | Patent grant | ||
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