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CN107937354A - 2型猪圆环病毒及其应用 - Google Patents

2型猪圆环病毒及其应用 Download PDF

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CN107937354A CN201711107300.XA CN201711107300A CN107937354A CN 107937354 A CN107937354 A CN 107937354A CN 201711107300 A CN201711107300 A CN 201711107300A CN 107937354 A CN107937354 A CN 107937354A
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ring virus
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尹秀凤
汪爱芬
丁美娟
杜君
王艳
顾玉美
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Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其是一株2型猪圆环病毒及其应用，其全基因组序列如序列表中SEQ ID NO:3所示；保藏号CGMCC No.14336，保藏日期：2017年08月17日。本发明对大量PMWS的病料进行病毒分离，从中筛选到一株对PK15细胞高敏的毒株，不经任何特殊处理毒价就达到107.5TCID50/mL，灭活后配成油乳剂苗安全、有效。

Description

2型猪圆环病毒及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，具体领域为一株2型猪圆环病毒及其应用。
背景技术
猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus type 2，PCV2)属于圆环病毒科圆环病毒属，是断奶仔猪多系统衰竭综合症(Postweaning multi-sytemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原。PCV2还与猪皮炎与肾病综合征(PDNS)，猪的流产和不孕性疾病，猪增生性坏死性肺炎(PNP)和猪先天性脑震颤(CT)等的发生密切相关。PCV2主要在单核和巨噬细胞中复制，树突状细胞也可感染，引起机体的免疫系统损伤，造成免疫抑制，PCV2经常与猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)或猪细小病毒(PPV)，猪支原体肺炎等并发感染或继发细菌感染，使患病猪病情加重。自1991年在加拿大首次发现PMWS以来，疾病在世界各地相继爆发，现在PCV2感染在世界范围内广泛存在，给养猪业造成了巨大的经济损失，PCV2及其所致的相关疾病己经引起了各国的高度重视，预防和控制PCV2及其相关疾病已经迫在眉睫。
在PCV2相关疾病的防控中疫苗免疫是核心，已经证实使用疫苗可以减轻疾病的严重程度，抑制病毒在体内的繁殖和扩散，减少排毒，现有疫苗主要包括全病毒灭活疫苗和CAP蛋白亚单位疫苗。对于PCV2灭活疫苗来说影响免疫效果关键是抗原含量即病毒滴度，但是PCV2公认的在体外培养困难，毒价不高，必须在具有旺盛增殖能力并处于有丝分裂过程中的细胞上复制，并且PCV2的复制依赖于细胞周期s期表达的各种细胞蛋白及酶。Tischer等(1987)发现用D-氨基葡萄糖处理接种PCV的PK-15细胞时，可促进病毒DNA进入细胞核，提高病毒复制能力。Fenaux等(2004年12月病毒学杂志，美国微生物学会)报道称PCV2在细胞上的增殖滴度非常低，经过120代连续传代之后滴度增加了1个lg单位，也只达到103.75TCID50/mL。目前国内的主要疫苗株的病毒分离和病毒滴度统计于下：洪伟彬(2005，南京农业大学博硕论文)在2mmol/l-氨基葡萄糖条件下将PCV2-SH(2002)株于PK-15细胞上连续传代至50代，结果发现F20和F50两个代次的病毒的滴度均为106.25TCID50/ml；刘长明(2005年，中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第六次研讨会)PCV2/LG株在经氨基葡萄糖处理的PK15细胞上培养传代，传30代后，毒价可稳定在105.45-105.6之间；严伟东(2008，国家星火培训计划及国家农业行业科技，第十届全国规模猪场主要疫病监控与净化专题研讨会论文集)PCV2-WH株在氨基葡萄糖处理PK-15细胞传代培养，病毒滴度随代次显著增加，第20代时达到107.0TCID50/mL；王贵华(2012，北京大北农集团动物医学研究中心-新型疫苗研发及基因工程疫苗应用研讨会)在3mmol/L的D--氨基葡萄糖条件下5个分离株(疫苗株为DBN-SX07)经过连续传代，毒价均有明显的提升，当传至15代时，均提高了约3个lg单位，可达到105.25TC1D50/ml。综上可见经刺激剂处理细胞和连续传代可以提高毒价，且不同分离株株对PK15的适应性存在差异，经过大量分离株的筛选有可能分离到对PK15细胞适应性好的毒株。
发明内容
本发明的目的在于提供一株2型猪圆环病毒及其应用，以解决现有技术中PCV2在PK15的增殖效率低，为满足疫苗生产的需求，需要通过复杂的处理(比如克隆筛选敏感的细胞、加D-氨基葡糖或其他刺激剂处理细胞、浓缩等方法)来提高毒价的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
2型猪圆环病毒PCV2JS1507，保藏号CGMCC No.14336，保藏日期：2017年08月17日。
本发明所述的2型猪圆环病毒PCV2JS1507，其全基因组序列如序列表中SEQ IDNO:3所示。
2型猪圆环病毒PCV2JS1507在制备2型猪圆环病毒疫苗或多联疫苗中的应用。
一种2型猪圆环病毒减毒活疫苗，包括本发明所述的2型猪圆环病毒PCV2JS1507。
2015年江苏省某猪场保育猪发生疑似PMWS的症状，对送检的淋巴结，进行了病毒的分离、PCR、PCV2特异性单抗进行间接免疫荧光鉴定、通过在PK-15细胞连续传代20代，得到一株高度适应PK-15细胞的PCV2毒株。
生物保藏信息：
2型猪圆环病毒PCV2JS1507，微生物保藏号是CGMCC No.14336，分类命名：猪圆环病毒2型(porcine circovirus type2)；保藏时间2017年8月17日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地点：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明对大量PMWS的病料进行病毒分离，从中筛选到一株对PK15细胞高敏的毒株PCV2JS1507。PCV2JS1507第20代毒经灭活后配成油乳剂苗，经易感阴性猪检测，猪只健康无死亡和可见临床症状，免疫后3周血清抗体滴度大于1600，活毒攻毒后用荧光定量PCR检测免疫组与对照组比较血液中病毒核酸数显著降低，指标均在现有灭活疫苗的安检校检标准之上，故PCV2JS1507制备的灭活苗安全、有效。
附图说明
图1为18份PCV2阳性样品电泳结果。泳道从左至右分别为：阴性对照、Maker(takara DL2002)、AH1201、JS1206、SD1201、SD1211、FJ1304、HN1309、JS1302、ZJ1307、ZJ1312、AH1403、AH1409、HN1408、JS1405、JS1409、JS1413、FJ1503、JS1507、ZJ1513。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 2型猪圆环病毒株PCV2JS1507的获得
1、病料来源和处理
2012年4月-2015年10月，共3年半中，从江苏、安徽、山东、河南、浙江、福建等地送检的159份疑似PMWS的病料(包括淋巴结和脾脏)。取约1克病料在灭菌生理盐水漂洗3次，加5mlDMEM培养基匀浆成组织悬液，反复冻融三次，12000r/min离心10min，取上清，分装，标记，-20℃保存。
2、PCR鉴定
PCV2的PCR鉴定用引物序列为(如序列表中SEQ ID NO:1-2所示):
PCV2F823-850：5'-ccccgttggaatggtactcctcaactg-3'
PCV2R801-827：5'-cggggtctgattgctggtaatcagaat-3'
扩增PCV2环状基因组全长，有部分重叠，产物1810bp。
2.1核酸提取
取1中病料匀浆上清分200μL，按博迈德生物病毒基因组DNA/RNA快速提取试剂盒的说明方法提取总DNA/RNA。
2.2 PCR
PCR在25μL体系中进行。反应体系Premix Ex Taq(TAKARA9152)12.5μL、上、下游引物各0.5μL、DNA产物1μL、加DDH2O至25μL，反应在95℃预变性5min，然后按以下参数变性：94℃40s；退火：55℃30s；延伸：72℃30s进行34个循环，循环结束后72℃延伸5min。
2.3琼脂糖凝胶电泳
配置1.2％的琼脂糖凝胶，取PCR产物10μL，120V电压，电泳25-30min，EB染色5-10min，凝胶成像系统观察结果。
2.4结果
159份病料PCV2阳性份数151，阳性率95％。PCV2常常与PRRSV、Mhp、CSFV、PPV、SIV等共同感染，故对PCV2阳性的病料针对这几种病原进行了进一步的检测，结果见表1。单独PCV2阳性只检出18份，阳性率11.9％。18份PCV2阳性的PCR电泳结果见附图1。
表1 159份疑似PMWS病料常见猪病检测结果
3、病毒分离
T25方瓶复苏PK15细胞，培养基为添加8％新生牛血清的DMEM，37℃5％二氧化碳培养箱培养，24h长成约75％单层时，上述18份PCV2单独感染的病料，经0.22微米滤膜滤过后接种PK15细胞，接毒量5％，换成2％血清的维持液，继续培养，72h收获，收获时冻融3次，放入适宜无菌容器，-70℃保存。
4、带毒传代
3中所述接毒后的PK15细胞，接毒后48-72小时，细胞长成致密单层后带毒传代，传代比率1:3-1:5，培养基为添加8％新生牛血清的DMEM，37℃5％二氧化碳培养箱培养，培养48-72小时，细胞长成致密单层时，继续传代，连续传代至20代。第5、10、15、20代次留取一瓶培养至72小时收获，收获时冻融3次，放入适宜无菌容器，标记明确，-70℃保存。
5、TCID50测定
由于PCV2感染PK-15细胞后不产生明显的细胞病变，采用间接免疫荧光试验(IFA)测定TCID50。步骤简述如下：PK15细胞铺96孔细胞培养板，每孔104个细胞，37℃培养24h，将收取的病毒悬浮液用维持液10倍倍比稀释至10-7，接种于96孔板(100μl/孔)，每个稀释度接种5孔，同时设不接种病毒的细胞为空白对照。每孔添加100μl维持液，继续培养48-72小时。用pH为7.4的10mmol/L无菌PBS洗涤2次，-20℃的冷无水乙醇固定30min，每孔中加50μlPCV2Cap蛋白单克隆抗体(50-100倍稀释)，37℃1小时，PBS洗2次，再加入50μl FITC标记羊抗鼠二抗(30-50倍稀释)，37℃0.5小时，PBS洗2次，最后用PBS封底，在倒置荧光显微镜下观察结果。细胞内有特异性绿色荧光判为感染，用Reed-Muench法计算TCID50，结果见表2。
从TCID50测定结果可见，JS1507分离株对PK15细胞的适应性好，第5代毒价就达到106.0TCID50/ml，20代达到了107.5TCID50/ml。在不经过细胞克隆筛选或一些刺激剂处理细胞的情况，毒价远高于现有疫苗株，用于疫苗生产可克服毒价低需要浓缩来配苗的问题。
表2 18株PCV2分离株的TCID50测定结果(lgTCID50/ml)
F5 F10 F15 F20
AH1201 3.25 3.68 4.0 4.5
JS1206 3.5 3.68 4.17 4.5
SD1201 4.0 4.32 4.83 5.5
SD1211 2.68 2.83 3.0 3.0
FJ1304 5.17 5.5 6.32 6.5
HN1309 4.17 4.68 5.5 5.5
JS1302 3.68 4.5 5.17 5.5
ZJ1307 5.0 5.17 5.17 5.5
ZJ1312 2.5 2.5 2.83 3.0
AH1403 5.68 6.5 6.5 6.83
AH1409 3.5 4.17 4.83 5.0
HN1408 5.32 5.5 5.83 6.0
JS1405 4.32 4.68 4.75 5.0
JS1409 3.68 4.68 5.17 5.32
JS1413 5.5 5.83 6.17 6.17
FJ1503 4.0 4.0 4.17 4.5
JS1507 6.0 6.32 7.0 7.5
ZJ1513 3.83 4.17 5.0 5.17
6、PCV2JS1507全基因序列测定
PCV2JS1507第20代病毒按2中所述步骤提取DNA然后PCR，PCR产物送至TAKARA大连公司测序，序列拼接后得到PCV2全基因序列，共1767碱基。参见序列表中SEQ ID NO:3所示。两个主要的ORF，ORF1位于正链151-995bp，945个碱基，编码rep蛋白，与病毒复制有关；ORF2位于负链1734-1033bp，702个碱基，编码Cap蛋白，是病毒唯一的结构蛋白。
实施例2疫苗制备及安全性评价和效力试验
1、灭活苗制备
PCV2JS1507第20代毒(107.5EID50/ml)以0.2％甲醛37℃灭活24小时，以适当比例加入吐温-80作为水相，与marcol52白油按合适比例乳化配苗，20ml每瓶分装，4-8℃保存。
2、安全性评价
将7头21-28日龄PCV2抗原抗体阴性仔猪随机分成3组，5头免疫灭活苗双倍剂量2ml/只，对照组注射DMEM培养基2ml作为对照。在免疫前测量体温，免疫后每天测定体温，至第7d，除第1天有2头猪有0.5℃升高外体温正常；免疫后观察猪群的状况，连续28d，猪只采食正常，健康、精神状况良好。注射部位无肿块出现，免疫后28d，每组解剖2头猪，注射部位也未见有白色油乳剂样物质存在，疫苗吸收完全。可见疫苗大剂量注射对猪是安全的。
3、效力试验
将12头21-28日龄PCV2抗原抗体阴性仔猪随机分成2组，5头免疫灭活苗1mL/头，另7头不免疫作为对照组。于免疫后3周进行攻毒保护性试验，攻毒前采血，分离血清用ELISA试剂盒测定抗体滴度。免疫组和未免疫组5头分别攻毒，未免疫组留2头作为对照。每头各用PCV2JS1507株病毒液(107.5TCID50/ml)滴鼻1ml、肌肉注射1ml，隔离饲养观察。攻毒后14日，剖杀，取腹股沟淋巴结进行病毒分离。
抗体测定：血清40倍稀释后2倍倍比稀释，稀释至640。免疫组1头猪为320，3头为640，一头高于640，未免猪均低于40。
病毒分离：按3进行，结果免疫组1/5只猪分离到病毒，对照攻毒组4/5分离到病毒。
现有猪圆环病毒2型灭活苗效检方法中，除免疫攻毒法(小鼠和猪)抗体检测有四种：
1、小鼠免疫两次ELISA检测滴度高于800；
2、仔猪两次免疫IPMA检测滴度高于800；
3、仔猪免疫两次ELISA检测高于400；
4、仔猪免疫两次ELISA检测高于320。
为了更直观的观察免疫效果，采用猪一次免疫测抗体和攻毒后病毒分离的作为效检标准，无论是抗体检测还是免疫攻毒后病毒分离结果均显示PCV2JS1507灭活后制备的灭活苗具有良好的免疫原性，对猪的保护效果在现有标准之上。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (4)

1.一株2型猪圆环病毒PCV2JS1507，保藏号CGMCC No.14336，保藏日期：2017年08月17日。
2.根据权利要求1所述的2型猪圆环病毒PCV2JS1507，其特征在于：其全基因组序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。
3.权利要求1或2所述的2型猪圆环病毒PCV2JS1507在制备2型猪圆环病毒疫苗或多联疫苗中的应用。
4.一种2型猪圆环病毒减毒活疫苗，其特征在于：包括权利要求1所述的2型猪圆环病毒PCV2JS1507。
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