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CN107923906A - 作为血液学毒性生物标记的gdf‑15 - Google Patents

作为血液学毒性生物标记的gdf‑15 Download PDF

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CN107923906A CN201680045824.8A CN201680045824A CN107923906A CN 107923906 A CN107923906 A CN 107923906A CN 201680045824 A CN201680045824 A CN 201680045824A CN 107923906 A CN107923906 A CN 107923906A
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Abstract

本发明有关于GDF‑15作为一种安全性生物标记用于判断Mdm2抑制剂的毒理学效应的用途；一种用于判断Mdm2抑制剂在对象中的毒理学效应的活体外方法，特别用于判断在对象中响应施用一定剂量的Mdm2抑制剂而产生血小板减少症的可能性；使用Mdm2抑制剂在对象中治疗癌症的方法；一种用于预测癌症患者响应一定剂量的Mdm2抑制剂的治疗而产生血小板减少症的可能性的药盒；一种用于治疗癌症患者的药盒及相关公开实施方式。

Description

作为血液学毒性生物标记的GDF-15
技术领域
本发明有关于一种安全性生物标记用于判断Mdm2抑制剂的毒理学效应的用途；一种用于判断Mdm2抑制剂在对象中的毒理学效应的活体外方法，特别用于判断在对象中响应施用一定剂量的Mdm2抑制剂而产生血小板减少症的可能性；使用Mdm2抑制剂在对象中治疗癌症的方法；一种用于预测癌症的患者响应一定剂量的Mdm2抑制剂的治疗而产生血小板减少症的可能性的药盒；一种用于治疗癌症患者的药盒及相关公开实施方式。
背景技术
蛋白质p53为控制大量的涉及DNA损伤修复、细胞凋亡及细胞周期停滞的靶基因的表达的转录因子。经常会在许多不同肿瘤类型中侦测到导致野生型p53活性丧失的突变。TP53基因为人类癌症中最频繁突变的基因之一。因此，在几近50％的人类癌症中，肿瘤抑制因子p53的功能因突变或缺失而受损。在其余人类癌症中，p53保留野生型状态但其功能受到其主要细胞抑制因子鼠双微体2(Mdm2、MDM2；HDM2(鼠双微体2的人类同系物)抑制。Mdm2为p53肿瘤抑制因子的负调节因子。Mdm2蛋白质不但发挥E3泛素连接酶作用导致p53的蛋白酶体降解，而且发挥p53转录活化的抑制因子的作用。通常在p53野生型肿瘤中发现Mdm2扩增。
因为Mdm2与p53间的相互作用为保留野生型p53的癌症中抑制p53功能的主要机制，靶向Mdm2-p53相互作用和因此再活化p53故成为一种新的有前景的治疗策略。已开发若干种抑制Mdm2-p53相互作用的Mdm2抑制剂，且因此可引发抗肿瘤效应。已报导的第一个具效力的小分子Mdm2抑制剂为Nutlin(Vassilev LT等人，Science.2004年2月6日；303(5659):844-8)。在发现Nutlin后，接着开发了若干种其他小分子Mdm2抑制剂如MI-63(DingK等人，J Med Chem.2006年6月15日；49(12):3432-5)及MI219(Shangary S等人，Proc NatlAcad Sci U S A.2008年5月11日；105(10):3933-8)。
当将药物应用于临床时，需要注意这些药物的特定毒理学效应。某些药物可造成药物诱发性血小板减少症的发展，血小板减少症为对象血小板的相对减少的病况。自具有脂肪肉瘤的患者的单药剂RG-7112(一种Nutlin家族中的抑制剂)的概念证明研究获得的结果证实，40％的患者中具有RG-7112诱发性血小板减少症。该发现表明与RG7112施用有关的一项主要剂量限制毒性为血小板减少症(Ray-Coquard I等人，Lancet Oncol,2012,13:1133–1140)。基于动物模型进行的研究表明RG7112诱发性血小板减少症在治疗期间发生较晚且在停用药物后持续，这表明该药物作用于早期造血祖细胞(Iancu-Rubun,C.等人，Experimental Hematology 2014；42:137–145)。其他Mdm2抑制剂(不仅仅RG-7112)可潜在地诱发血小板减少症，因此在此方面应注意。
重要的是，在产生血小板减少症之前或在血小板减少症发作极早期时通过停止可造成血小板减少症的特定药物的治疗或通过相应地改变治疗来调整易感患者的治疗。未在早期检测到血小板减少症发生且继续以所述可疑药物治疗可导致致命的结果。因此，本领域中存在用于预测、判断、监测在药物治疗后，特别是施用Mdm2抑制剂后对象的迟发型药物诱发性血小板减少症，及管理毒性的持续需求。
发明内容
本发明的一个目标为提供GDF-15作为一种安全性生物标记用于判断Mdm2抑制剂的毒理学效应，特别是Mdm2抑制剂的血液毒性。特别地，本发明有关于GDF-15作为一种安全性生物标记用于判断对象响应因施用Mdm2抑制剂而产生血小板减少症的可能性的用途。
根据本发明，已惊讶地发现在(i)施用一定剂量的Mdm2抑制剂后对象的GDF-15表达水平相较于相同对象的GDF-15基线表达水平相对增加与(ii)施用该剂量的该Mdm2抑制剂的毒理学效应，特别是Mdm2抑制剂的血液毒性之间存在关联性。已确定，对于给定给药方案，在向对象施用一定剂量的Mdm2抑制剂后的GDF-15表达水平与对象响应因施用该剂量的Mdm2抑制剂而产生血小板减少症的可能性之间存在关联性。特别是已确立施用一定剂量的Mdm2抑制剂后取自对象的用药后样本中的GDF-15表达相较于Mdm2抑制剂用药前取自该对象的用药前样本中的GDF-15表达增加至少25％，特别是增加至少50％时，表示患者响应因该剂量的Mdm2抑制剂而产生血小板减少症的可能性增加。使用GDF-15作为安全性生物标记可帮助医师监测用Mdm2抑制剂治疗对象(患者)的过程和及早预测迟发型药物诱发性血小板减少症以恰当地采取措施以最小化或完全预防血小板减少症。
在一方面，本发明有关于一种判断Mdm2抑制剂在对象中的毒理学效应的活体外方法，该方法包括以下步骤：
(i)提供施用该Mdm2抑制剂前取自对象的用药前生物样本；
(ii)测量该用药前样本中的GDF-15表达；
(iii)向该对象施用一定剂量的该Mdm2抑制剂；
(iv)提供施用该Mdm2抑制剂后取自该对象的用药后生物样本；
(v)测量这些用药后样本中的GDF-15表达；
(vi)将用药前样本中的GDF-15表达与用药后样本中的GDF-15表达水平进行比较，特别地，判断其中对象响应因施用该剂量的Mdm2抑制剂而产生血小板减少症的可能性。
在另一方面，本发明提供一种Mdm2抑制剂用于在对象中治疗癌症的用途，包括：
(i)测量施用一定剂量的Mdm2抑制剂前取自该对象的用药前生物样本中的GDF-15表达；
(ii)测量施用一定剂量的Mdm2抑制剂后取自该对象的用药后生物样本中的GDF-15表达；
(iii)将该用药前样本中的GDF-15表达与该用药后样本中的GDF-15表达进行比较；和
(iv)当该用药后样本中的GDF-15表达相较于该用药前样本中的GDF-15表达高出至少25％，优选高出至少50％时，改变该对象的治疗；或
(v)当该用药后样本中的GDF-15表达水平相较于该用药前样本中的GDF-15表达高出小于50％，优选小于25％时，不改变该Mdm2抑制剂用于该对象的施用方案。
在另一方面，本发明有关于一种供应用的药盒，其用于预测癌症患者响应因接受一定剂量的Mdm2抑制剂的治疗而产生血小板减少症的可能性，其包括：
(i)至少一个能够侦测GDF-15表达的探针；和
(ii)指示使用探针分析取自患者的生物样本的GDF-15表达的说明书，其中
(a)向该患者施用该剂量的该Mdm2抑制剂后的GDF-15表达增加至少25％，更优选增加至少50％时，表示该患者响应因该剂量的Mdm2抑制剂的治疗而产生血小板减少症的可能性增加，和
(b)向该患者施用该剂量的该Mdm2抑制剂至后的GDF-15表达增加小于50％，更优选增加小于25％时，表示该患者响应因该剂量的Mdm2抑制剂的治疗而产生血小板减少症的可能性降低。
在另一方面，本发明有关于一种供应用的药盒，其用于治疗癌症患者，其包括：
(i)治疗有效量的Mdm2抑制剂；
(ii)至少一种能够侦测GDF-15表达的探针；
(iii)指示使用探针分析取自患者的生物样本的GDF-15表达的说明书；和
(iv)若在向患者施用治疗有效量的Mdm2抑制剂后取自患者的生物样本的GDF-15表达相较于取自该患者的用药前样本中的GDF-15表达水平增加至少25％，更优选增加至少50％，则对患者施用该方式的说明书。
具体而言，本发明提供以下分别单独或组合的方面、优势特征及具体实施方式，如以下项目中所列出：
1.以GDF-15作为安全性生物标记用于判断Mdm2抑制剂的毒理学效应的用途。
2.一种判断Mdm2抑制剂在对象中的毒理学效应的活体外方法，该方法包括以下步骤：
(i)提供施用该Mdm2抑制剂前取自该对象的用药前生物样本；
(ii)测量该用药前样本中的GDF-15表达；
(iii)向该对象施用一定量的Mdm2抑制剂；
(iv)提供施用该Mdm2抑制剂后取自该对象的用药后生物样本；
(v)测量该用药后样本中的GDF-15表达；
(vi)将该用药前样本中的GDF-15表达与该用药后样本中的GDF-15表达水平进行比较。
3.如项目2的方法，其中判断该对象响应因施用该剂量的该Mdm2抑制剂而产生血小板减少症的可能性。
4.如项目2或项目3中任一项的方法，其中该用药后样本中的GDF-15表达相较于该用药前样本中的GDF-15表达增加小于50％，更优选增加小于25％时，表示该患者响应因施用该剂量的Mdm2抑制剂而产生血小板减少症的可能性降低。
5.如项目2至4中任一项的方法，其中该用药后样本中的GDF-15表达相较于该用药前样本中的GDF-15表达增加至少25％，更优选增加50％时，表示该患者响应因施用该剂量的Mdm2抑制剂而产生血小板减少症的可能性增加。
6.一种供应用的Mdm2抑制剂，其用于在对象中治疗癌症，包括：
(i)测量向该对象施用一定剂量的Mdm2抑制剂前取自该对象的用药前生物样本中的GDF-15表达；
(ii)测量向该对象施用一定剂量的Mdm2抑制剂后取自该对象的用药后生物样本中的GDF-15表达；
(iii)将该用药前样本中的GDF-15表达与该用药后样本中的GDF-15表达进行比较；和
(iv)当该用药后样本中的GDF-15表达相较于该用药前样本中的GDF-15表达高出至少25％，优选高出至少50％时，改变该对象的治疗；或
(v)当该用药后样本中的GDF-15表达水平相较于该用药前样本中的GDF-15表达水平高出小于50％，优选小于25％时，不改变将该Mdm2抑制剂用于该对象的施用方案。
7.如项目6的Mdm2抑制剂，其中该治疗的改变包括改变该Mdm2抑制剂用于该对象的施用方案和/或施用用于降低Mdm2抑制剂对血小板影响的方式。
8.如项目6或项目7的Mdm2抑制剂，其中该治疗的改变包括减少该Mdm2抑制剂的剂量，和/或降低该Mdm2抑制剂的施用频率。
9.如项目6或项目8的Mdm2抑制剂，其中该用于降低Mdm2抑制剂对血小板影响的方式包括输血小板和/或施用血小板生成素、和/或施用血小板生成素受体激动剂，优选包括输血小板。
10.如项目6至9中任一项的Mdm2抑制剂，其中该用于降低Mdm2抑制剂对血小板影响的方式包括施用血小板生成素受体激动剂，且其中该血小板生成素受体激动剂为艾曲波帕(eltrombopag)。
11.如项目6至10中任一项的适用于治疗癌症的Mdm2抑制剂，其中该治疗的改变包括中断该Mdm2抑制剂的治疗。
12.如项目6至10中任一项的适用于治疗癌症的Mdm2抑制剂，其中该治疗的改变包括停药期。
13.如项目2至5中任一项的方法或如项目6至12中任一项的Mdm2抑制剂，其中该用药后样本为在施用Mdm2抑制剂后约30min至约24小时，优选约1小时至约12小时、约2小时至约12小时，约3小时至约12小时、约4小时至约8小时、约5小时至约8小时、约5小时至约7小时、约6小时至约7小时的时间范围内获得。
14.如项目13的方法或如项目13的Mdm2抑制剂，其中该用药后样本为在施用Mdm2抑制剂后约30min、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约10小时、约12小时、约24小时获得。
15.如项目14的方法或如项目13的Mdm2抑制剂，其中该用药后样本为在施用Mdm2抑制剂后约3小时获得。
16.如项目14的方法或如项目13的Mdm2抑制剂，其中该用药后样本为在施用Mdm2抑制剂后约6小时获得。
17.如项目14的方法或如项目13的Mdm2抑制剂，其中该用药后样本为在施用Mdm2抑制剂后约12小时获得。
18.如项目2至5、13至17中任一项的方法或如项目6至17中任一项的Mdm2抑制剂，其中该GDF-15表达由测量GDF-15基因转录来检测。
19.如项目18的方法或如项目18的Mdm2抑制剂，其中该GDF-15基因表达通过特异性杂交至编码GDF-15的核酸区域的寡核苷酸探针来检测。
20.如项目2至5、13至17中任一项的方法或如项目6至17中任一项的Mdm2抑制剂，其中该GDF-15表达由测量生物样本中的GDF-15蛋白质水平来检测。
21.如项目20的方法或如项目20的Mdm2抑制剂，其中该GDF-15蛋白质水平通过结合至GDF-15蛋白质的抗体来检测。
22.如项目20至21中任一项的方法或如项目20至21中任一项的Mdm2抑制剂，其中该生物样本为血液、血浆、血清或尿液。
23.如项目20至21中任一项的方法或如项目20至21中任一项的Mdm2抑制剂，其中该生物样本为血液。
24.如项目2至5、13至23中任一项的方法或如项目6至23中任一项的Mdm2抑制剂，其中该用药后样本中的GDF-15表达相较于该用药前样本中的GDF-15表达增加至少75％、100％或150％时，表示产生血小板减少症的可能性增加。
25.一种供应用的药盒，其用于预测癌症患者响应因接受一定剂量的Mdm2抑制剂的治疗而产生血小板减少症的可能性，其包括：
(i)至少一个能够检测GDF-15表达的探针；和
(ii)指示使用探针分析取自患者的生物样本的GDF-15表达的说明书，其中
(a)向该患者施用该剂量的该Mdm2抑制剂后的GDF-15表达增加至少25％，更优选增加至少50％时，表示该患者响应因接受该剂量的Mdm2抑制剂的治疗而产生血小板减少症的可能性增加，和
(b)向该患者施用该剂量的该Mdm2抑制剂后的GDF-15表达增加小于50％，更优选增加小于25％时，表示该患者响应因接受该剂量的Mdm2抑制剂的治疗而产生血小板减少症的可能性降低。
26.一种供应用的药盒，其适用于治疗癌症患者，其包括：
(i)治疗有效量的Mdm2抑制剂；
(ii)至少一种能够检测GDF-15表达的探针；
(iii)指示使用探针分析取自患者的生物样本的GDF-15表达的说明书；和
(iv)若在向患者施用治疗有效量的Mdm2抑制剂后取自该患者的生物样本的GDF-15表达相较于取自该患者的用药前样本中的GDF-15表达增加至少25％，更优选增加至少50％，则对该患者施用该方式的说明书。
27.如项目25至26中任一项的药盒，其中该探针为特异性杂交至编码GDF-15的核酸区域的寡核苷酸或结合至GDF-15蛋白质的抗体。
28.如项目1的用途、或如项目2至5、或12至24中任一项的方法、或如项目6至24中任一项的Mdm2抑制剂、或如项目25至27中任一项的药盒，其中该Mdm2抑制剂系选自以下组：
(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(3-氧-哌嗪-1-基)-反-环己基甲基]-胺基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮；
(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反-环己基甲基]-胺基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮；
(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(6-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反-环己基甲基]-胺基}-吡啶-3-基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮；
(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(6-{甲基-[4-(3-甲基-4-氧-咪唑啶-1-基)-反-环己基甲基]-胺基}-吡啶-3-基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮；
(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(5-{甲基-[4-(3-甲基-4-氧-咪唑啶-1-基)-反-环己基甲基]-胺基}-吡嗪-2-基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮；
1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-侧氧基哌嗪-1-基)-反-环己基甲基]-胺基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮；
(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧-1,2-二氢-吡啶-3-基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢-1H-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-酮；
4-[(S)-5-(3-氯-2-氟苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-3-异丙基-6-氧-3,4,5,6-四氢吡咯并[3,4-d]咪唑-4-基]-苄腈；
(S)-5-(5-氯-2-氧-1,2-二氢吡啶-3-基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢-1H-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-酮；
(S)-5-(3-氯-4-氟苯基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-1-((R)-1-甲氧基丙-2-基)-5,6-二氢吡咯并[3,4-d]咪唑-4(1H)-酮；
和
(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧-1,2-二氢吡啶-3-基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基-d6-嘧啶-5-基)-1-((R)-1-甲氧基丙-2-基)-5,6-二氢吡咯并[3,4-d]咪唑-4(1H)-酮；或前述任一者的药学上可接受的盐。
29.如项目1的用途、或如项目2至5、或12至24中任一项的方法、或如项目6至24中任一项的Mdm2抑制剂、或如项目25至27中任一项的药盒，其中该Mdm2抑制剂为(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧-1,2-二氢吡啶-3-基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢-1H-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-酮、或其药学上可接受的盐。
30.如项目1的用途、或如项目2至5、或12至24中任一项的方法、或如项目6至24中任一项的Mdm2抑制剂、或如项目25至27中任一项的药盒，其中该Mdm2抑制剂为(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反-环己基甲基]-胺基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮、或其药学上可接受的盐。
31.一种供应用的血小板生成素受体激动剂，其用于预防或治疗对象中药物诱发性血小板减少症，该对象用药后样本中的GDF-15表达相较于用药前样本中的GDF-15表达高出至少25％，优选高出至少50％；
其中“用药前样本中的GDF-15表达”为在施用一定剂量的可引起产生药物诱发性血小板减少症的药物至该对象前取自该对象的用药前生物样本中测得的GDF-15表达；
和其中“用药后样本中的GDF-15表达”为在施用一定剂量的可引起产生药物诱发性血小板减少症的药物至该对象后取自该对象的用药后生物样本中测得的GDF-15表达。
32.如项目31或32的供应用的血小板生成素受体激动剂，其中该可引起产生药物诱发性血小板减少症的药物为Mdm2抑制剂。
33.一种Mdm2抑制剂和血小板生成素受体激动剂的组合。
34.如项目33的组合供应用于医学用途。
35.如项目33的组合供应用于治疗癌症和预防或治疗药物诱发性血小板减少症。
36.如项目31至35中任一项的血小板生成素受体激动剂、组合、或供应用的组合，其中该血小板生成素受体激动剂为艾曲波帕。
37.如项目31至36中任一项的血小板生成素受体激动剂、组合、或供应用的组合，其中该Mdm2抑制剂为(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧-1,2-二氢-吡啶-3-基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢-1H-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-酮，或其药学上可接受的盐。
38.如项目31至36中任一项的血小板生成素受体激动剂、组合、或供应用的组合，其中该Mdm2抑制剂为(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反-环己基甲基]-胺基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮，或其药学上可接受的盐。
附图说明
图1基于每周三次连续口服给药方案，经(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反-环己基甲基]-胺基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮治疗的患者的血小板计数所观察到的个体的拟合的时间曲线。该图中，首次施用在400h时间时。患者的确经历3个输血小板事件。
图2基于3qw连续给药方案，经(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反-环己基甲基]-胺基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮治疗的患者的GDF-15蛋白质浓度所观察到的个体的拟合的时间曲线。
图3 21位经每周三次连续口服施用(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反-环己基甲基]-胺基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮治疗的患者中(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反-环己基甲基]-胺基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮对GDF-15及血小板计数影响的初步数据分析。各个点代表各个患者；X坐标表示GDF-15自基线的增加的变化百分比(％)；Y坐标为治疗过程中同一患者的所观察到的最低血小板计数。
图4用于描述血小板动力学的PKPD模型。MMT为平均成熟时间，E([C])为药物浓度的药物效应函数。Circ.室代表循环血小板，Prol.-增殖性未成熟细胞以及A2、A3、A4-成熟室。
图5用于描述GDF-15动力学的PKPD模型的概视图。Tlag和ka分别为延迟和一级药物吸收率参数。k12及k21为室间速率，ke为清除率，Vm和km为Michaelis Menten清除参数。kout为间接反应模型的转换率及kin为零级产生。V为中央室的表观体积和Qc/V为药物浓度。
图6已建立的PKPD模型。将个体的药物于GDF-15slGi生成上的效力与个体的药物于未成熟造血细胞slPi上的效力作图。
图7及图8在12.5mg(A)、25mg(B)、50mg(C)、100mg(D)、200mg(E)、250mg(F)、350mg(G)剂量的三周周期(本文中亦称为方案1A或q3w)的第一天或在120mg(I)剂量的4周周期(本文中亦称为方案1B)的第一及第八天接受式I化合物的实体肿瘤患者的血小板计数(图7)及嗜中性粒细胞计数(图8)的最大变化相对GDF-15倍数变化。左图：最大血小板计数变化相对于GDF-15倍数变化，GDF-15在第一周期的第1天(C1D1)进行测量。右图：最大血小板计数变化相对于GDF-15倍数变化。
具体实施方式
向患者施用Mdm2抑制剂可引起产生血小板减少症。以往的研究证实Mdm2抑制剂RG7112损伤血小板生成。本发明者已确定GDF-15可作为安全性生物标记用于判断Mdm2抑制剂的毒理学效应。本发明是基于已确定的(i)施用Mdm2抑制剂后同一对象的GDF-15表达水平相较于该对象的GDF-15基线表达水平的相对增加与(ii)该Mdm2抑制剂的毒理学效应，特别是Mdm2抑制剂的血液毒性之间的关联性。相关性的斜率可根据Mdm2的效力及给药方案而改变。特别地，本发明者已确定，就给定的给药方案而言，施用一定剂量的Mdm2抑制剂后的GDF-15表达水平与对象响应因施用该剂量的Mdm2抑制剂而产生血小板减少症的可能性之间存在关联性。有利地，本发明可用于针对给定的Mdm2抑制剂给药方案，在血小板减少症极早发作时或甚至在产生血小板减少症之前，判断对象产生血小板减少症的可能性。特别地，本发明可用于针对给定的Mdm2抑制剂给药方案，早在施用治疗有效量的Mdm2抑制剂的第1个周期的第1天后，判断对象产生血小板减少症的可能性。在另一实施例中，本发明可用于针对给定的Mdm2抑制剂给药方案，在施用治疗有效量的Mdm2抑制剂的第1个周期的第1天直至第1个周期的第7天，特别地在施用治疗有效量的Mdm2抑制剂的第1周期的第1天后、第1周期的第2天后、或第1周期的第3天后，判断对象产生血小板减少症的可能性。通过应用本发明公开的教导，技术人员可取得相关性参数，该参数将取自对象的用药前及用药后样本中的GDF-15表达的相对增加与该同一对象响应因接受给定Mdm2抑制剂的治疗而产生血小板减少症的可能性联系起来。
在一方面，本发明有关于一种以GDF-15作为安全性生物标记判断Mdm2抑制剂的毒理学效应(特别是Mdm2抑制剂的血液毒性)的用途。在一个实施方式中，本发明有关于一种以GDF-15作为安全性生物标记用于判断对象响应因接受施用一定剂量的Mdm2抑制剂而产生血小板减少症的可能性的用途。
“对象”、“个体”或“患者”在本文中可互换使用，其指脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人类。哺乳动物包括(但不限于)小鼠、猿、人类、农畜、体育动物及宠物。
如本文所使用的术语“毒理学效应”指对整个有机体的效应和对有机体的亚结构的效应。具体而言，该术语指导致有机体中血小板减少症的效应。如本文所使用的术语“血液毒性”指对造血体系的毒性，其导致血液生产组织损伤，引起白血球计数和/或绝对嗜中性粒细胞计数减少。
如本文所使用的术语“血小板减少症”指血小板的数量减少，该数量低于正常血液血小板计数(即低于150,000个血小板/微升)。其可能是巨核细胞生成的失调所致，其导致血小板数量减少。巨核细胞生成是骨髓造血母细胞的增殖、成熟、血小板形成、及血小板释放进入循环中的过程。成人的正常血小板计数为在150,000至450,000个血小板/微升血液的范围内(Ross DW；Ayscue LH；Watson J；Bentley SA(1988).“Stability ofhematologic parameters in healthy subjects.Intraindividual versusinterindividual variation”.American journal of clinical pathology 90(3):262–7)。小于150,000个血小板/微升的血小板计数低于正常值，且指示血小板减少症。血小板计数<10,000/μL，自发性出血增加。血小板计数<50,000/μL，手术程序通常因出血而复杂化。在血小板计数<100,000/μL时，小心施用化学疗法及放射疗法，担心加重血小板减少症及增加出血的风险。根据NCI常见不良事件术语标准v3.0，血小板减少症归类为下述：级别1(轻度不良事件)的特征为血小板计数<LLN(正常值的下限)-75,000/mm3，级别2(中等不良事件)的特征为血小板计数<75,000/mm3-50,000/mm3，级别3(重度不良事件)为在血小板计数<50,000/mm3-25,000/mm3，级别4(危及生命或致残的不良事件)为血小板计数<25,000/mm3(常见不良事件术语标准v3.0(CTCAE),2006年8月9日；http://ctep.cancer.gov/protocolDevelopment/electronic_applications/docs/ctcaev3.pdf)。
如本文所使用，“可能性(likelyhood)”及“可能地”是事件发生有多少可能的测量。其可与“概率”互换使用。可能性指多于推测但少于确定的概率。因此，若理性的人利用常识、培训或经验，结合环境条件，得出事件具可能性，则事件为可能的。在一些实施方式中，一旦已确定可能性，则可用化合物治疗患者(或继续治疗)或可能需要改变治疗或停止。在一个实施方式中，“可能性”及“可能地”表示事件有多少可能发生的概率百分比。
词语“提高的可能性”指事件将发生的概率的增加。例如，本文的一些方法允许预测患者响应因施用该Mdm2抑制剂而产生血小板减少症的可能性是否增加。在一个实施方式中，增加的可能性意指事件将发生的改变大于50％、改变大于60％、改变大于70％或改变大于80％。同等地，“减小的可能性”指事件将发生的改变分别小于50％、小于60％、小于70％或小于80％。
术语“施用(administration)”、“施用(administering)”及类似术语指单次施用治疗剂，以及术语“施用”也意在包括根据完整治疗方案或给药方案而施用治疗剂。术语“施用”也意在包括治疗剂不一定由相同用药途径或在相同时间施用的治疗方案。
如本文所使用的术语“连续施用”指基于给定剂量的治疗剂的治疗方案。
如本文所使用，术语“治疗方案”或“给药方案”指治疗剂可每1天、每2天、每3天、每4天、每5天、每6天、每7天、每8天、每9天、每10天、每11天、每12天、每13天、每14..天、每21..天、每26天、每27天、每28天、每29天、每30...天、每35...天、每42...天、每49...天、每56天、每57天、每58天、每59天、每60天施用一次的给药方案。该术语包括，例如，具有(i)范围自约每天一次至约每60天一次的给药周期性，(ii)范围自约每2天一次至约每40天或每6周一次的给药周期性，(iii)范围自约每5天一次至约每月一次或约每4周一次或约每30天一次的给药周期性，(iv)范围自约每周一次或约每7天一次至约每3周一次或约每20天一次的给药周期性，(v)范围自约每周一次或约每7天一次至约两周一次或每10天一次的给药周期性，或(vi)范围自每周2次至每周4次，特别是每周3次的给药周期性的给药方案。在每一种情况中，可在停药期后进行给药。给药方案每3周一次为优选。
“治疗方案”或“给药方案”也包括在停药期后施用治疗剂一段特定时间。例如，Mdm2抑制剂可每周3次连续地施用、或每周3次进行2周接着进行1周停药期(3周周期)。在另一实施例中，该抑制剂可每天一次、连续2周、隔2周施用。在又另一个实施例中，该药物可每天一次施用3周的时间，进行1周的停药期(每天1次/3周；停药期/1周)，接着进行接下来的药物施用(每天1次/3周；停药期/1周)周期。
如本文所使用，术语“GDF-15”(或“GDF15”)指生长分化因子15，也称为MIC-1、TGF-PL、PDF、PLAB及PTGFB。GDF-15的记录编号为Q99988、BC008962、GI:38196924、AAH08962。GDF-15为转化生长因子-β超家族的扩展成员。GDF-15mRNA在肝脏中最多，而在一些其他组织中浓度较低。
如本文所使用，“GDF-15表达”、“GDF-15表达水平”及类似术语指GDF-15基因转录或GDF-15蛋白质表达。GDF-15基因表达可检测或测定，例如借助于特异性杂交至编码GDF-15的核酸区域的寡核苷酸探针的手段。GDF-15蛋白质浓度可检测或测定，例如借助于结合至GDF-15蛋白质的抗体的手段，例如由ELISA分析。通常，GDF-15基因或蛋白质表达测定在彼此之间比较，例如治疗前及治疗后测定，且仅GDF-15基因转录的相对值或水平或GDF-15蛋白质表达水平可能有意义。
如本文所使用的术语“Mdm2抑制剂”或“HDM2抑制剂”指抑制HDM2/p53(Mdm2/p53)相互作用结合的任何化合物。HDM2(鼠双微体2的人类同系物)为p53的负调节剂。Mdm2抑制剂适用于用于人类或兽医用途的医药组合物，其中Mdm2/p53结合的抑制例如在处理肿瘤和/或癌细胞生长中得以指明。特别地，Mdm2抑制剂适用于治疗人类癌症，这是由于这些癌症的发展可能至少部分地取决于p53的首要“守门人(gatekeeper)”功能，例如，Mdm2的过度表达。
或者，替代Mdm2抑制剂或在其之外，作为其药理学作用模式的部分的p53路径的任何其他直接活化因子可用于本发明的多个方面中，如本文所述p53用作p53活化的替代标记般。例如，作为Mdm2抑制剂的替代品或在其之外，Mdm4抑制剂可如本文所述用于本发明的多个方面中。
在一优选实施方式中，“Mdm2抑制剂”或“HDM2抑制剂”如所提及以时间分辨荧光能量转移(TR-FRET)分析测得IC50抑制Mdm2/p53相互作用小于10μM，优选小于1μM，优选在nM范围内。荧光能量转移(或Foerster共振能量转移)描述了供体与受体5荧光分子之间的能量转移。就该分析而言，标记有C端生物素部分的MDM2蛋白质(氨基酸2-188)与用作供体荧光团的经铕标记的链霉亲和素(Perkin Elmer,Inc.,Waltham,MA,USA)组合使用。p53衍生的经Cy5标记的肽Cy5-TFSDLWKLL(p53aa18-26)为能量受体。于340nm下激发供体10分子后，MDM2与p53肽之间的结合相互作用在665nm的受体发射波长下引起能量转移及增强的反应。由于抑制剂分子结合至MDM2的p53结合部位所致的p53-MDM2复合物的形成的中断，导致在615nm下的供体发射增加。将在时间分辨模式(计数率665nm/计数率615nm×1000)中测得的两个不同荧光信号的15个原始数据用于计算比例型FRET分析读数。该分析可根据以下程序进行：于白色1536w微量滴定盘(Greiner Bio-One GmbH,Frickenhausen,Germany)中以3.1μl的总体积进行测试，其通过混合100nl的稀释于90％DMSO/10％H2O(3.2％最终DMSO浓度)中的化合物与2μl经铕20标记的链霉亲和素(最终浓度2.5nM)，混合在反应缓冲液中进行(PBS，125mM NaCl，0.001％的Novexin(由以下组成：碳水化合物聚合物(Novexin聚合物)，设计以增加蛋白质的溶解度及稳定性；Novexin Ltd.,ambridgeshire,United Kingdom)、明胶0.01％、0.2％Pluronic(环氧乙烷与环氧丙烷的嵌段共聚物，BASF,Ludwigshafen,Germany)，1mM DTT)，接着添加稀释于分析缓冲液中的0.5μl MDM2-Bio或MDM4-Bio(最终浓度10nM)。使溶液在室温下预培养15分钟，接着添加0.5μl含在分析缓冲液中的Cy5-p53肽(最终浓度20nM)。于读取盘前在室温下培养10分钟。为测定样本，使用具有以下设置30的Analyst GT多模式微板读取器(Molecular Devices)：二向色镜380nm，激发330nm，发射供体615nm及发射受体665nm。由曲线拟合使用XLfit计算得IC50值。若未指定，试剂购买自Sigma Chemical Co,St.Louis,MO,USA。
MDM2(Mdm2)具体而言关于如EMBO J.10,1565-9,Fakharzadeh等人，1991中所述的MDM2。MDM2(Mdm2)的记录编号为Q86WA3、AJ550519、GI:29125746。MDM2(Mdm2)的变体指其的在下文所述的分析系统中仍结合至p53的变体(例如，由于氨基酸的一或多个，例如，1至430个的缺失、插入和/或交换所致的剪切变体、同型物、片段、突变体或致癌基因)，对应于如原先所述的全长蛋白质，优选至少具有MDM2与p53的亲和力的0.5％，更优选至少具有5％、10％、20％、30％、40％或特别地50％或以上，以及具有至少20％，更优选至少25％的与如原先所述的或如下文特定提及的MDM2或HDM2的序列同一性。在未另外提及的情况下，MDM2一般有关于MDM2、Mdm2、HDM2或Hdm2、或其各自的如刚刚定义的变体。
序列同一性百分比，通常也称为蛋白质与其变体之间的同源性，优选由通常用于该目的的计算机程序来确定，诸如空位程序(Wisconsin Sequence Analysis Package,Unix第8版,Genetics Computer Group,University Reseach Park,Madison Wisconsin,USA，其使用Smith及Waterman算法(Adv.Appl.Math.2:482-489(1981))，尤其使用具有空位开放罚分12及空位延伸罚分1的仿射空位搜索。
“其变体”在提及之处意指一或多种变体。
根据本发明，Mdm2抑制剂可为例如下式中任一者的化合物：
(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(3-氧-哌嗪-1-基)-反-环己基甲基]-胺基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮；
(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反-环己基甲基]-胺基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮；
(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(6-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反-环己基甲基]-胺基}-吡啶-3-基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮；
(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(6-{甲基-[4-(3-甲基-4-氧-咪唑啶-1-基)-反-环己基甲基]-胺基}-吡啶-3-基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮；
(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(5-{甲基-[4-(3-甲基-4-氧-咪唑啶-1-基)-反-环己基甲基]-胺基}-吡嗪-2-基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮；
1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反-环己基甲基]-胺基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮；
(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧-1,2-二氢-吡啶-3-基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢-1H-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-酮；
4-[(S)-5-(3-氯-2-氟苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-3-异丙基-6-氧-3,4,5,6-四氢吡咯并[3,4-d]咪唑-4-基]-苄腈；
(S)-5-(5-氯-2-氧-1,2-二氢吡啶-3-基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢-1H-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-酮；
(S)-5-(3-氯-4-氟苯基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-1-((R)-1-甲氧基丙-2-基)-5,6-二氢吡咯并[3,4-d]咪唑-4(1H)-酮；
或
(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧-1,2-二氢吡啶-3-基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基-d6-嘧啶-5-基)-1-((R)-1-甲氧基丙-2-基)-5,6-二氢吡咯并[3,4-d]咪唑-4(1H)-酮；或前述任一者的药学上可接受的盐。
术语“药学上可接受的盐”指在根据本公开使用时保留生物有效性及化合物的性质的盐，且其通常没有在生物上或在其他方面所不期望。药学上可接受的酸加成盐可用无机酸和有机酸形成，例如，乙酸盐、天冬胺酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、溴化物/氢溴酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、樟脑磺酸盐、氯化物/盐酸盐、氯茶碱盐、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、磺基水杨酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐、三氟乙酸盐或类似盐。可衍生得盐的无机酸包括(例如)盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及类似酸。
在一优选实施方式中，本发明有关于Mdm2抑制剂(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧-1,2-二氢吡啶-3-基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢-1H-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-酮或其药学上可接受的盐。Mdm2抑制剂(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧-1,2-二氢吡啶-3-基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢-1H-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-酮属于咪唑并吡咯啶酮化合物的新类别，且显示MDM2/p53相互作用(该术语特别地包括Hdm2/p53相互作用)的有效抑制。特别地，该化合物通过结合MDM2而作为MDM2与p53相互作用的抑制剂。在最优选实施方式中，Mdm2抑制剂(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧-1,2-二氢吡啶-3-基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢-1H-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-酮为式I的化合物，且述于WO2013/111105的实施例102中：
(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧-1,2-二氢吡啶-3-基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢-1H-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-酮的结晶形式以EX6、EX7及EX8述于WO2013/111105中。本发明包含(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧-1,2-二氢吡啶-3-基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢-1H-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-酮化合物的琥珀酸共晶体。
在另一优选实施方式中，本发明有关于Mdm2抑制剂(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反-环己基甲基]-胺基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮或其药学上可接受的盐。Mdm2抑制剂(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反-环己基甲基]-胺基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮为式II的化合物，且述于WO2011/076786的实施例106中：
在一个实施方式中，(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反-环己基甲基]-胺基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮的药学上可接受的盐为亚硫酸氢盐(述于WO2011/076786中)。(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反-环己基甲基]-胺基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮的硫酸氢盐的结晶形式述于WO2012/066095中。
术语“施用”也意在包括治疗剂不一定由相同用药途径或在相同时间施用的治疗方案。
在一个实施方式中，每一个28天周期的前21天每天施用Mdm2抑制剂(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧-1,2-二氢吡啶-3-基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基-嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢-1H-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-酮。在另一实施方式中，在每一个28天周期的第一周施用Mdm2抑制剂(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧-1,2-二氢吡啶-3-基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢-1H-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-酮，接着停止治疗3周(停药期)。在另一实施方式中，每一个28天周期的前两周每天施用Mdm2抑制剂(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧-1,2-二氢吡啶-3-基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢-1H-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-酮，接着停止治疗两周(停药期)。在又另一实施方式中，每一个28天的周期每天施用Mdm2抑制剂(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧-1,2-二氢吡啶-3-基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢-1H-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-酮3或5天，接着对应地停止治疗25或23天(停药期)。在又另一实施方式中，每三周一次施用Mdm2抑制剂(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧-1,2-二氢吡啶-3-基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢-1H-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-酮。
在一个实施方式中，每一个21天周期的前2周每周3次施用Mdm2抑制剂(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反-环己基甲基]-胺基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮(2周3次/停止1周)。
术语“施用该Mdm2抑制剂后”可指第一个周期的第一天的该Mdm2抑制剂的施用或该Mdm2抑制剂的任何连续施用。因此，术语“施用该Mdm2抑制剂后”可指在施用周期内进行的Mdm2抑制剂的任何施用。
如本文所使用的术语“一定剂量的Mdm2”抑制剂指治疗有效量的该Mdm2抑制剂。术语Mdm2抑制剂的“治疗有效量”指引起对象的生物或医学反应的化合物的量，例如，改良症状、缓解病症、减慢或延迟疾病进展、减慢肿瘤生长、或引起肿瘤退化、或类似的反应。在一个实施方式中，活体内治疗有效量可根据用药途径在介于约0.1至500mg/kg之间、或介于约1至100mg/kg之间的范围内。
在一个实施方式中，在口服施用的情况下，(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧-1,2-二氢吡啶-3-基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢-1H-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-酮的治疗量或剂量可介于每三周100至1500mg之间，特别地介于每三周100至800mg之间，或介于每天50至600mg之间的范围内。在一优选实施例中，就每一个28天周期的前21天的每天施用而言，(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧-1,2-二氢吡啶-3-基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢-1H-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-酮的治疗量或剂量为400mg，更优选300mg。或者，(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧-1,2-二氢吡啶-3-基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢-1H-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-酮的总治疗量或总剂量为每4周期560mg(40mg qd 2周/停止2周，或80mg qd 1周/停止3周)。静脉内剂量将需要相应地减小。
在一个实施方式中，在口服施用的情况下，(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反-环己基甲基]-胺基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮的治疗量或剂量介于500至2000mg之间，特别地介于500至1200mg之间。在一优选实施方式中，(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反-环己基甲基]-胺基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮的治疗量或剂量为500mg，更优选800mg。静脉内剂量将需要相应地减小。
应明了各治疗剂可简便地，例如以单一剂量单位或分成多个剂量单位施用。应进一步明了各治疗剂可简便地以每天一次的剂量或多达一天四次的剂量施用。
在另一方面，本发明提供一种判断Mdm2抑制剂在对象活体内的毒理学效应的活体外方法。
在一个实施方式中，本发明有关于一种判断Mdm2抑制剂在对象活体内的毒理学效应的活体外方法，该方法包括以下步骤：
(i)提供施用该Mdm2抑制剂前取自该对象的用药前生物样本；
(ii)测量该用药前样本中的GDF-15表达；
(iii)向该对象施用一定剂量的该Mdm2抑制剂；
(iv)提供施用该Mdm2抑制剂后取自该对象的用药后生物样本；
(v)测量这些用药后样本中的GDF-15表达；
(vi)将该用药前样本中的GDF-15表达与该用药后样本中的GDF-15表达水平进行比较。
在一个实施方式中，本发明有关于一种判断Mdm2抑制剂在对象活体内的毒理学效应的活体外方法，该方法包括以下步骤：
(i)提供施用该Mdm2抑制剂前取自该对象的用药前生物样本；
(ii)测量该用药前样本中的GDF-15表达；
(iii)向该对象施用一定剂量的该Mdm2抑制剂；
(iv)提供施用该Mdm2抑制剂后取自该对象的用药后生物样本；
(v)测量这些用药后样本中的GDF-15表达；
(vi)将该用药前样本中的GDF-15表达与该用药后样本中的GDF-15表达水平进行比较，
其中判断该对象响应因接受连续施用该剂量的Mdm2抑制剂而产生血小板减少症的可能性。
在一个实施方式中，该用药后样本中的GDF-15表达相较于该用药前样本中的GDF-15表达增加小于50％时，表示患者响应因接受连续施用该剂量的Mdm2抑制剂而产生血小板减少症的可能性减小。在一优选实施方式中，该用药后样本中的GDF-15表达相较于该用药前样本中的GDF-15表达增加小于25％，更优选小于10％时，表示患者响应因接受连续施用该剂量的Mdm2抑制剂而产生血小板减少症的可能性降低。在一个实施方式中，该用药后样本中的GDF-15表达相较于该用药前样本中的GDF-15表达增加至少10％时，表示患者响应因接受连续施用该剂量的Mdm2抑制剂而产生血小板减少症的可能性增加。在另一实施方式中，该用药后样本中的GDF-15表达相较于该用药前样本中的GDF-15表达增加至少25％时，表示患者响应因接受连续施用该剂量的Mdm2抑制剂而产生血小板减少症的可能性增加。在一优选实施方式中，该用药后样本中的GDF-15表达相较于该用药前样本中的GDF-15表达增加至少50％时，表示患者响应因接受连续施用该剂量的Mdm2抑制剂而产生血小板减少症的可能性增加。在又另一实施方式中，用药后样本中的GDF-15表达相较于用药前样本中的GDF-15表达增加至少75％、至少100％或至少150％时，表示产生血小板减少症的可能性增加。
如本文所使用的术语“生物样本”指由取样取得的生物样本，因此可代表取自样本源的任何其他样本。在一个实施方式中，生物样本为细胞、组织、血液、血浆、血清、尿液、漱口水、粪便、唾液及其组合。在另一实施方式中，生物样本为血液、血浆、血清或尿液。在一优选实施方式中，生物样本为血液。在另一优选实施方式中，生物样本为血清。
如本文所使用的术语“用药前生物样本”指施用Mdm2抑制剂前取自对象的生物样本。在一个实施方式中，用药前生物样本由在向对象施用Mdm2抑制剂前不久取自对象。或者，用药前生物样本在向该对象施用Mdm2抑制剂前约10min至向该对象施用Mdm2抑制剂前约7天取自对象。在另一实施方式中，用药前生物样本在向该对象施用Mdm2抑制剂前约10min、或约20min、或约30min、或约1小时、或约2小时、或约3小时、或约5小时、或约10小时、或约15小时或约1天、或约2天、或约3天、或约4天、或约5天、或约6天、或约7天1取自对象。
如本文所使用的术语“用药后生物样本”指在施用Mdm2抑制剂后取自对象的生物样本。在一个实施方式中，用药后样本在向该对象施用Mdm2抑制剂后约30min至约24小时，优选约1小时至约12小时、约2小时至约12小时、约3小时至约12小时、约4小时至约8小时、约5小时至约8小时、约5小时至约7小时、约6小时至约7小时的时间范围内取自对象。在另一实施方式中，用药后样本在施用Mdm2抑制剂后30min、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约10小时、约12小时、约24小时取自对象。在一优选实施方式中，用药后样本在施用Mdm2抑制剂后约3小时取自对象。在一更优选实施方式中，用药后样本在施用Mdm2抑制剂后约6小时取自对象。在另一优选实施方式中，用药后样本在施用Mdm2抑制剂后约12小时取自对象。
术语“约”就数值x而言为任选的并意指例如x+10％。
如本文所使用的术语“检测”或“测定”指确定、筛选、探测、判断、或测量的行为，该行为可由任何常规方式进行。例如，可出于特定标记物的存在而检测样本且该特定标记物的浓度可使用ELISA分析、蛋白印迹法、成像等测量以检测该标记物是否存于样本中。术语“检测”和“测定”包含物质的转化，例如，生物样本的转化，例如，血液样本或其他组织样本通过使该样本进行物理测试的方式自一种状态转化至另一种状态。
在一些实施方式中，测定GDF-15的核酸表达水平。在一些实施方式中，由杂交测定GDF-15的核酸表达水平。在一些实施方式中，由扩增测定GDF-15的核酸表达水平。在其他实施方式中，测定GDF-15的核酸表达水平的扩增方法为RT-PCT扩增。在其他实施方式中，用于测定GDF-15的核酸表达水平的方法选自由以下组成的群：基于核酸序列的扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)、定量PCR(qPCR)、实时PCT、环介导等温扩增(LAMP)、TaqMan、Invader、InvaderPlus、滚环、链替代扩增(SDA)、Q-β-复制酶、解螺旋酶依赖扩增(HAD)、分支DNA、水解FRET探针、连接酶链反应(LCR)、简并寡核苷酸引物PCR、或本领域技术人员已知的其他方法。在一个实施方式中，由测定GDF-15基因转录检测GDF-15表达。在一个实施方式中，可通过特异性杂交至编码GDF-15的核酸区域的寡核苷酸探针检测GDF-15基因表达。
在一些实施方式中，测定GDF-15的蛋白质表达水平。在一些实施方式中，通过进行使用一或多种特异性结合GDF-15蛋白质或其片段的抗体的免疫分析，特别是进行ELISA，测定GDF-15的蛋白质表达水平。在一些实施方式中，通过进行2D-凝胶电泳测定GDF-15的蛋白质表达水平。在一优选实施方式中，通过测定生物样本中的GDF-15蛋白质浓度分析GDF-15表达。可通过结合至GDF-15蛋白质或其片段的抗体分析GDF-15蛋白质水平。
在另一方面，本发明提供一种用于在对象中治疗癌症的Mdm2抑制剂，包括：
(i)测量向该对象施用一定剂量的Mdm2抑制剂前取自该对象的用药前生物样本中的GDF-15表达；
(ii)测量向该对象施用一定剂量的Mdm2抑制剂后取自该对象的用药后生物样本中的GDF-15表达；
(iii)将该用药前样本中的GDF-15表达与该用药后样本中的GDF-15表达进行比较；和
(iv)当该用药后样本中的GDF-15表达相较于该用药前样本中的GDF-15表达高出至少25％，优选高出至少50％时，改变该对象的治疗；或
(v)当该用药后样本中的GDF-15表达水平相较于该用药前样本中的GDF-15表达高出小于50％，优选小于25％时，不改变该Mdm2抑制剂用于该对象的施用方案。
在一个实施方式中，用药后样本中的GDF-15表达相较于用药前样本中的GDF-15表达增加至少25％，优选至少50％时，表示产生血小板减少症的可能性增加。
在另一实施方式中，用药后样本中的GDF-15表达相较于用药前样本中的GDF-15表达增加至少75％、至少100％或至少150％时，表示产生血小板减少症的可能性增加。
在一个实施方式中，本发明提供一种用于在对象中治疗癌症的Mdm2抑制剂，包括：
(i)测量向该对象施用一定剂量的Mdm2抑制剂前取自该对象的用药前生物样本中的GDF-15表达；
(ii)测量向该对象施用一定剂量的Mdm2抑制剂后取自该对象的用药后生物样本中的GDF-15表达；
(iii)将该用药前样本中的GDF-15表达与该用药后样本中的GDF-15表达进行比较；和
(iv)当该用药后样本中的GDF-15表达相较于该用药前样本中的GDF-15表达高出至少75％，优选高出至少100％，更优选高出至少150％时，改变该对象的治疗；或
(v)当该用药后样本中的GDF-15表达水平相较于该用药前样本中的GDF-15表达高出小于150％，优选小于100％，更优选小于75％时，不改变该Mdm2抑制剂施用于该对象的施用方案。
如文中所使用，术语“治疗”任何疾病或病症指在一实施方式中，改善该疾病或病症(即减缓或阻止或减慢该疾病或其至少一项临床症状的发展)。在另一实施方式中，“治疗”指缓解或改善至少一种物理参数(包括那些无法被患者识别的参数)。在又一实施方式中，“治疗”指以物理方式(例如稳定可识别症状)或生理方式(例如稳定物理参数)或两者调节该疾病或病症。在又一实施方式中，“治疗”指预防或推迟该疾病或病症的出现或发展或进展。
术语“癌症”系指癌症疾病，包括(例如)乳腺、肺、胰腺、卵巢、中枢神经系统(CNS)、子宫内膜、胃、大肠、结肠、食道、骨骼、尿道、造血、淋巴、肝脏、皮肤、黑色素瘤、肾脏、软组织肉瘤及胸膜。
在一个实施方式中，治疗的改变包括改变该Mdm2抑制剂向对象的施用方案和/或使用用于降低Mdm2抑制剂对血小板的影响的手段。在另一实施方式中，治疗的改变包括减小该Mdm2抑制剂的剂量，和/或减小该Mdm2抑制剂的施用频率和/或停药期及/或完全停止治疗。在一优选实施方式中，用于降低Mdm2抑制剂对血小板上的影响的手段包括输血小板。在另一优选实施方式中，用于降低Mdm2抑制剂对血小板上的影响的手段包括施用血小板生成素受体激动剂，且其中该血小板生成素受体激动剂为艾曲波帕(eltrombopag)。艾曲波帕-(rINN，代号SB-497115-GR，商标名称：Promacta,Revolade)为c-mpl(TpoR)受体的小分子激动剂，其为激素血小板生成素的生理标靶。
在另一实施方式中，治疗的改变包括停止该Mdm2抑制剂的治疗。在另一实施方式中，该治疗改变包括停药期。如本文所使用的术语“停药期(drug holiday)”(有时也称为停药期(drug vacation)、药疗假期、结构化治疗中止或策略性治疗中止)指停止治疗一段时间；自数天至数月或数年的任何时间。在一个实施方式中，停药期为停止Mdm2抑制剂的治疗为期1周、2周、3周或4周的时间。
在一个实施方式中，生物样本为细胞、组织、血液、血浆、血清、尿液、漱口水、粪便、唾液及其组合。在另一实施方式中，生物样本为血液、血浆、血清或尿液。在一优选实施方式中，生物样本为血液。
在另一方面，本发明有关于一种用于预测癌症患者响应因接受Mdm2抑制剂的连续治疗而产生血小板减少症的可能性的药盒，其包括：
(i)至少一个能够检测GDF-15表达的探针；和
(ii)指示使用探针分析取自患者的生物样本的GDF-15表达的说明书，其中
(a)向该患者施用该剂量的该Mdm2抑制剂后的GDF-15表达增加至少25％，更优选增加至少50％时，表示该患者响应因该剂量的Mdm2抑制剂连续治疗而产生血小板减少症的可能性增加，和
(b)向该患者施用该剂量的该Mdm2抑制剂后的GDF-15表达增加小于50％，更优选增加小于25％时，表示该患者响应因该剂量的Mdm2抑制剂连续治疗而产生血小板减少症的可能性降低。
如本文所使用，“预测”指本文所述的方法为医疗服务提供者提供信息用于判断经过治疗的对象将更高可能性地产生血小板减少症的可能性。其并非指以100％精确度预测反应的能力。相反地，技术人员应明了其指增加的概率。
在一个实施方式中，该药盒包括探针，该探针为特异性杂交至编码GDF-15的核酸区域的寡核苷酸或结合至GDF-15蛋白质的抗体。
在又一方面，本发明有关于一种用于治疗癌症患者的药盒，其包括：
(i)治疗有效量的Mdm2抑制剂；
(ii)至少一种能够检测GDF-15表达的探针；
(iii)指示使用探针分析取自患者的生物样本的GDF-15表达的说明书；和
(iv)若在向患者施用治疗有效量的Mdm2抑制剂后取自该患者的生物样本的GDF-15表达相较于取自该患者的用药前样本中的GDF-15表达水平增加至少25％，更优选增加至少50％，则对患者施用该方式的说明书。
在一个实施方式中，该药盒包括探针，该探针为特异性杂交至编码GDF-15的核酸区域的寡核苷酸，或结合至GDF-15蛋白质的抗体。
在本发明的方面涉及包括活性医药成分(API，例如Mdm2抑制剂、血小板生成素受体激动剂)的医疗用途或治疗方法，以及适应症(例如癌症、血小板减少症)的情况下，这些方面可以以下替代形式表示：
用于治疗“适应症(INDICATION)”的“API”。
治疗需要此种治疗的人类患者中治疗“适应症(INDICATION)”的方法，其包括施用有效量的“API”。
用于制备适于治疗“适应症(INDICATION)”的药物的“API”。
用于治疗“适应症(INDICATION)”的包括“API”的药物。
进一步惊讶地发现GDF-15表达不仅指示癌症患者将产生血小板减少症的可能性而且指示癌症患者将产生中性白细胞减少症的可能性，中性白细胞减少症即，异常低浓度的嗜中性粒细胞，例如小于1.5×109个细胞/L的嗜中性粒细胞计数[参见Hsieh MM等人(2007年4月):“Prevalence of neutropenia in the U.S.population:age,sex,smokingstatus,and ethnic differences”.Ann.Intern.Med.146(7):486–92]。
基于该令人惊讶的发现，本发明进一步提供如本文所述的就血小板/血小板计数/血小板减少症而言的所有方面，以及就嗜中性粒细胞/嗜中性粒细胞计数/嗜中性球减少症而言的相应替代形式的所有方面。
以下实施例说明上文所述的公开内容，但并不意在以任何方式限制本发明的范围。其他为技术人员已知的测试模型也可判断所主张发明的有益效果。
实施例
实施例1：
方法：
用(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反-环己基甲基]-胺基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮(化合物A)治疗患者。剂量范围为10至500mg，每周三次(3QW)，采用连续或进行2周停止1周的给药方案。在给药第一天于给药前及给药后0.5至6h自各个对象收集血清样本。
使用酶联免疫吸附分析法(ELISA；R&D Systems药盒DGD150)测定血清的GDF-15表达水平。
在治疗期过程中从所有患者收集临床数据(包括血小板计数)。
基于可用的血小板数据，最长观察期为448天。
结果：
图1表示基于一位患者的示例，基于3QW连续给药方案经(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反-环己基甲基]-胺基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮治疗的患者的血小板计数的典型所观察的个体的预测的时间曲线。该模型也整合了给药4周后的任何给药中止，以及输PLT事件的影响。在显示于图1中的图上，第一次施用在400h时间时。图2表示基于图1所示的相同患者的示例，基于3qw连续给药方案的经(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反-环己基甲基]-胺基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮治疗的患者的GDF-15蛋白质浓度的所观察到的个体的拟合的时间曲线。
针对21位经每周三次连续口服施用(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反-环己基甲基]-胺基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮治疗的患者进行(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反-环己基甲基]-胺基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮对GDF-15及血小板计数影响的初步数据分析。所进行的数据分析显示于图3的曲线中。该图中，各点表示个体患者。X坐标为周期1的第1天GDF-15自基线增加的变化百分比(％)。Y坐标表示治疗过程中对同一患者所观察到的最低血小板计数。如该图上所显示，GDF-15浓度自基线增加大于25％与更高发生血小板计数降低低于150G/L(1级血小板减少症CTCAE V4)相关联。
实施例2：
方法：
该方法允许对于给药方案和GDF-15的取样时间中异质性的数据分析。已开发描述药物浓度、GDF-15浓度及血小板(PLT)的完整时间进程的PK/PD模型。因为个体间高变化性，应用非线性混合效应模型进行所有模型化分析。
·药物浓度(PK)与GDF-15动力学间的关系以具有刺激生成的间接反应模型(III型，Br J Clin Pharmacol 1998；45:229-239)描述。通过应用该方法，估计个体的药物对于GDF-15slGi生成的效力。
·PK与PLT时间进程间的关系以仿真造血的PKPD模型(Friberg L.等人J ClinOncol.2002年12月15日；20(24):4713-21.)描述。该模型包括PLT生成的局部及系统性调节，且考虑输PLT事件为PLT循环室中的输注。估计个体的药物对于未成熟造血细胞slPi上的效力。
用于PKPD建模的数据：
用(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反-环己基甲基]-胺基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮治疗患者。总共有45位对象用于血小板减少症的PKPD建模。剂量范围为10至500mg，每周3次(3QW)，采用连续或进行2W停止1W的给药方案。在对C1D1、C1D8及C2D1给药前及给药后0.5至8h从各对象收集血型样本。使用酶联免疫吸附分析法(ELISA；R&D Systems kit DGD150)测定血清GDF-15蛋白质浓度。在治疗期过程中从所有患者收集临床数据(包括血小板计数)。基于可用的血小板数据，最长观察期为448天。
结果：
PKPD模型描述于图4及图5中且模型代码报告于附录A1中。
图5表示用于描述GDF-15动力学的PKPD模型的示意图。Tlag和ka分别为延迟和一级药物吸收率参数。k12及k21为室间速率，ke为清除率，Vm和km为Michaelis Menten清除参数。kout为间接反应模型的转换率以及kin为零级产生。V为中央室的表观体积和Qc/V为药物浓度。
图4表示用于描述血小板动力学的PKPD模型。MMT为平均成熟时间，E([C])为药物浓度的药物效应函数。Circ.室表示循环血小板，Prol.-增殖性未成熟细胞及A2、A3、A4-成熟室。首先通过对slGi(个体的于GDF-15slGi生成上的药物效力)相对slPi(个体的于未成熟造血细胞上的药物效力)作图研究估计对GDF-15和骨髓的药物效力之间的相关性。
图6说明研究2个参数之间的相关性的初步结果，即个体的于GDF-15(slGi)生成上的药物效力与个体的于未成熟造血细胞(slPi)上的药物效力之间的相关性。利用源自45位患者的数据进行该分析。
在下面附录A1中，呈现PKPD模型的示例性描述。使用非线性混合效应建模软件MONOLIX(版本4.3.2)(例如“Estimation of population pharmacokinetic parametersof saquinavir in HIV patients with the MONOLIX software.J PharmacokinetPharmacodyn.2007年4月；34(2):229-49.Lavielle M,Mentré F.”或http://www.lixoft.eu/中所述)进行所有建模。
附录A1：于MONOLIX 4.3.2下的以MLXTRAN语言的PKPD模型代码
实施例3
如上所述，PKPD血小板减少症模型用于建立化合物A对GDF-15和骨髓的药物效力之间的相关性。该方法进一步验证GDF-15作为生物标记改进迟发型药物诱发性血小板减少症的预测的重要性，早到足以恰当地采取措施最小化血小板减少症或整体上防止血小板减少症。该数据也支持对于其他MDM2抑制剂在GDF-15和药物诱发性血小板减少症之间存在类似相关性的概念，其他MDM2抑制剂包括(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧-1,2-二氢吡啶-3-基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢-1H-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-酮。自化合物A的经验可知，本文所述的相似方法可用作其他MDM2抑制剂可遵循的指南。例如，若使用另一种Mdm2抑制剂，施用一定剂量的Mdm2抑制剂后对象的GDF-15表达水平(即取自对象的用药后样本中的GDF-15表达)相较于同一对象的基线的GDF-15表达水平(即取自对象的用药前样本中的GDF-15表达)相对增加与同一对象产生血小板减小症的可能性之间的关联性可由完成以下步骤实现：
1)提供施用该Mdm2抑制剂前取自对象的用药前生物样本；
2)测量该用药前样本中的GDF-15表达；
3)向该对象施用一定剂量的该另一Mdm2抑制剂；
4)提供施用该Mdm2抑制剂后取自该对象的用药后生物样本；
5)测量这些用药后样本中的GDF-15表达；
6)选择该Mdm2抑制剂的特定PK模型，该模型描述个体PK曲线；
7)通过描述该Mdm2抑制剂对于血小板(PLT)计数的时间进程上的效应确定PKPD关系，这是使用具有再现造血成熟过程的串有五个室的半机械模型(如附录A1中针对化合物A所述)，同时保持模型中的一些PD参数诸如血小板的基线，其成熟时间以及反馈参数与化合物A模型中所用相同。药物效力为新药物特有且根据该模型进行估计。在PKPD模型中考虑Mdm2抑制剂的给药方案。
8)确定GDF-15的PKPD关系。结构及生理参数(GDF-15的基线、转换率)应保持与化合物A模型中相同。从该模型读取对于GDF-15产生和血小板产生的药物效力作为固定值，这些固定值为给定的Mdm2i所特有且与给药方案无关。
9)确定于血小板产生和GDF-15的个体参数上的药物效力之间的相关性，用于确定引起预测迟发性血小板减少症所需要的GDF-15表达(早期)增加水平。此外，于GDF-15上的药物效力可视为在对PLT产生的药物作用中以降低PLT药物效力的个体间变化性。
最终，所确定的PKPD模型应用于定义适宜的剂量减小或任何防止血小板减少症的措施。
本领域中的每一位专家知晓于准备PK及PKPD模型上的一般指导，例如，有关需要以便达成满意模型的最小数目的数据点和患者，或所需数目的数据点(即患者)可如何取决于数据组的变化性、或药物毒性(即可取决于PLT数目或差别性GDF-15表达的变化水平)。所选择的PK模型应为描述各个Mdm2抑制剂的最佳PK曲线的PK模型。如何制备所给定的药学化合物的PK模型为技术人员的一般视界，在本发明情况中，给定的药学化合物为Mdm2抑制剂，特别是(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧-1,2-二氢吡啶-3-基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢-1H-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-酮或其盐。技术人员也可参考PK建模的一般原理，参见“Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Data Analysis:Concepts and Applications”，第四版，2007,Swedish Pharmaceutical Press,JohanGabrielsson及Daniel Weiner。
实施例4：
测定在三周周期的第一天(本文也称为方案1A或q3w)以12.5mg(A)、25mg(B)、50mg(C)、100mg(D)、200mg(E)、250mg(F)、350mg(G)的剂量或在4周周期的第1天及第8天(本文也称为方案1B)以120mg(I)的剂量接受式I的化合物，亦即(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧-1,2-二氢吡啶-3-基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢-1H-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-酮的具有实体肿瘤的患者的血小板计数(图7)及嗜中性粒细胞计数(图8)的最大变化及GDF-15值。左图显示最大血小板计数变化相对于GDF-15倍数变化，GDF-15在第一周期的第1天(C1D1)测定。右图显示最大血小板计数变化相对于GDF-15倍数变化。
在接受第一剂量(基线)前和针对方案1A(A-G)在第一及第二周期的第1天、第7天及第15天或针对方案1B(I)在第一及第二周期的第1天、第8天、第14天、第22天测定血小板/嗜中性粒细胞计数，和选择相对于基线的最大血小板变化值。“血小板/嗜中性粒细胞计数变化”值计算为基线后值减去基线值且以每微升血液中血小板/嗜中性粒细胞的数目给出。
在接受第一剂量前(基线，C1D1给药前)和针对方案1A(A-G)及方案1B(I)在第一周期的第一天第一次给药后24h(C1D1给药后24h)和在第二周期的第一天于给药后24h(C2D1给药前24h)测定GDF-15。对于方案1B，在第一周期的第8天于给药后8h(C1D8给药后8h)测定另一GDF-15值。“GDF-15C1D1倍数变化”定义为C1D1 24给药后/C1D1给药前。“GDF-15最大倍数变化”定义为给药后值除以C1D1给药前值的最大值。
这证实生物标记GDF-15的增加与用式I的化合物治疗期间血小板及嗜中性粒细胞计数的减少相关联。已经观察到GDF-15 C1D1值的该种相关性，如在式I化合物的第一次给药后24h测定(参见图7及图8的左图)。因此，Mdm2抑制剂治疗的早期阶段中GDF-15值变大时，表示该治疗期间血小板及嗜中性粒细胞计数减小。

Claims (38)

1.GDF-15作为安全性生物标记用于判断Mdm2抑制剂的毒理学效应的用途。
2.一种判断Mdm2抑制剂在对象活体内的毒理学效应的活体外方法，该方法包括以下步骤：
(i)提供施用该Mdm2抑制剂前取自该对象的用药前生物样本；
(ii)测量该用药前样本中的GDF-15表达；
(iii)向该对象施用一定剂量的该Mdm2抑制剂；
(iv)提供施用该Mdm2抑制剂后取自该对象的用药后生物样本；
(v)测量这些用药后样本中的GDF-15表达；
(vi)比较该用药前样本中的GDF-15表达和该用药后样本中的GDF-15表达水平。
3.如权利要求2所述的方法，其中判断该对象响应因连续施用该剂量的Mdm2抑制剂而产生血小板减少症的可能性。
4.如权利要求2或3中任一项所述的方法，其中该用药后样本中的GDF-15表达相较于该用药前样本中的GDF-15表达增加小于50％，更优选增加小于25％时，表示该患者响应因连续施用该剂量的Mdm2抑制剂而产生血小板减少症的可能性降低。
5.如权利要求2至4中任一项所述的方法，其中该用药后样本中的GDF-15表达相较于该用药前样本中的GDF-15表达增加至少25％，更优选增加50％时，表示该患者响应因连续施用该剂量的Mdm2抑制剂而产生血小板减少症的可能性增加。
6.一种供应用的Mdm2抑制剂，其用于在对象中治疗癌症，包括：
(i)测量向该对象施用一定剂量的Mdm2抑制剂前取自该对象的用药前生物样本中的GDF-15表达；
(ii)测量向该对象施用一定剂量的Mdm2抑制剂后取自该对象的用药后生物样本中的GDF-15表达；
(iii)将该用药前样本中的GDF-15表达与该用药后样本中的GDF-15表达进行比较；和
(iv)当该用药后样本中的GDF-15表达相较于该用药前样本中的GDF-15表达高出至少25％，优选高出至少50％时，改变该对象的治疗；或
(v)当该用药后样本中的GDF-15表达水平相较于该用药前样本中的GDF-15表达高出小于50％，优选小于25％时，不改变该Mdm2抑制剂用于该对象的施用方案。
7.如权利要求6所述的Mdm2抑制剂，其中该治疗的改变包括改变该Mdm2抑制剂用于该对象的施用方案和/或使用用于降低Mdm2抑制剂对血小板影响的手段。
8.如权利要求6或7所述的Mdm2抑制剂，其中该治疗的改变包括减少该Mdm2抑制剂的剂量，和/或降低该Mdm2抑制剂的施用频率。
9.如权利要求6或8所述的Mdm2抑制剂，其中该用于降低Mdm2抑制剂对血小板影响的手段包括输血小板和/或施用血小板生成素，和/或施用血小板生成素受体激动剂，优选包括输血小板。
10.如权利要求6至9中任一项所述的Mdm2抑制剂，其中该用于降低Mdm2抑制剂对血小板影响的手段包括施用血小板生成素受体激动剂，且其中该血小板生成素受体激动剂为艾曲波帕。
11.如权利要求6至10中任一项所述的用于治疗癌症的Mdm2抑制剂，其中该治疗的改变包括中断该Mdm2抑制剂的治疗。
12.如权利要求6至10中任一项所述的用于治疗癌症的Mdm2抑制剂，其中该治疗的改变包括停药期。
13.如权利要求2至5中任一项所述的方法或如权利要求6至12中任一项所述的Mdm2抑制剂，其中该用药后样本为在施用Mdm2抑制剂后约30分钟至约24小时，优选约1小时至约12小时、约2小时至约12小时、约3小时至约12小时、约4小时至约8小时、约5小时至约8小时、约5小时至约7小时、约6小时至约7小时的时间范围内获得。
14.如权利要求13所述的方法或如权利要求12所述的Mdm2抑制剂，其中该用药后样本为在施用Mdm2抑制剂后约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约10小时、约12小时、约24小时获得。
15.如权利要求14所述的方法或如权利要求13所述的Mdm2抑制剂，其中该用药后样本为在施用Mdm2抑制剂后约3小时获得。
16.如权利要求14所述的方法或如权利要求13所述的Mdm2抑制剂，其中该用药后样本为在施用Mdm2抑制剂后约6小时获得。
17.如权利要求14所述的方法或如权利要求13所述的Mdm2抑制剂，其中该用药后样本为在施用Mdm2抑制剂后约12小时获得。
18.如权利要求2至5、13至17中任一项所述的方法或如权利要求6至17中任一项所述的Mdm2抑制剂，其中该GDF-15表达由测量GDF-15基因转录来检测。
19.如权利要求18所述的方法或如权利要求18所述的Mdm2抑制剂，其中该GDF-15基因表达通过特异性杂交至编码GDF-15的核酸区域的寡核苷酸探针来检测。
20.如权利要求2至5、13至17中任一项所述的方法或如权利要求6至17中任一项所述的Mdm2抑制剂，其中该GDF-15表达由测量生物样本中的GDF-15蛋白质水平来检测。
21.如权利要求20所述的方法或如权利要求20所述的Mdm2抑制剂，其中该GDF-15蛋白质水平通过结合至GDF-15蛋白质的抗体来检测。
22.如权利要求20至21中任一项所述的方法或如权利要求18至19中任一项所述的Mdm2抑制剂，其中该生物样本为血液、血浆、血清或尿液。
23.如权利要求20至21中任一项所述的方法或如权利要求20至21中任一项所述的Mdm2抑制剂，其中该生物样本为血液。
24.如权利要求2至5、13至23中任一项所述的方法或如权利要求6至23中任一项所述的Mdm2抑制剂，其中该用药后样本中的GDF-15表达相较于该用药前样本中的GDF-15表达增加至少75％、100％或150％时，表示产生血小板减少症的可能性增加。
25.一种供应用的药盒，其用于预测癌症患者响应因接受一定剂量的Mdm2抑制剂的治疗而产生血小板减少症的可能性，包括：
(i)至少一个能够检测GDF-15表达的探针；和
(ii)指示使用探针分析取自患者的生物样本的GDF-15表达的说明书，其中
(a)向该患者施用该剂量的该Mdm2抑制剂后的GDF-15表达增加至少25％，更优选增加至少50％时，表示该患者响应因接受该剂量的Mdm2抑制剂的连续治疗而产生血小板减少症的可能性增加，和
(b)向该患者施用该剂量的该Mdm2抑制剂后的GDF-15表达增加小于50％，更优选增加小于25％时，表示该患者响应因接受该剂量的Mdm2抑制剂的治疗而产生血小板减少症的可能性降低。
26.一种供应用的药盒，其用于治疗癌症患者，包括：
(i)治疗有效量的Mdm2抑制剂；
(ii)至少一种能够检测GDF-15表达的探针；
(iii)指示使用探针分析取自患者的生物样本的GDF-15表达的说明书；和
(iv)若在向患者施用治疗有效量的Mdm2抑制剂后取自患者的生物样本的GDF-15表达相较于取自该患者的用药前样本中的GDF-15表达水平增加至少25％，更优选增加至少50％时，则对该患者施用该方式的说明书。
27.如权利要求25至26中任一项所述的药盒，其中该探针为特异性杂交至编码GDF-15的核酸区域的寡核苷酸或结合至GDF-15蛋白质的抗体。
28.如权利要求1所述的用途、或如权利要求2至5、或12至24中任一项所述的方法、或如权利要求6至24中任一项所述供应用的Mdm2抑制剂、或如权利要求25至27中任一项所述的药盒，其中该Mdm2抑制剂选自以下组：
(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(3-氧-哌嗪-1-基)-反-环己基甲基]-胺基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮；
(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反-环己基甲基]-胺基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮；
(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(6-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反-环己基甲基]-胺基}-吡啶-3-基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮；
(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(6-{甲基-[4-(3-甲基-4-氧-咪唑啶-1-基)-反-环己基甲基]-胺基}-吡啶-3-基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮；
(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(5-{甲基-[4-(3-甲基-4-氧-咪唑啶-1-基)-反-环己基甲基]-胺基}-吡嗪-2-基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮；
1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反-环己基甲基]-胺基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮；
(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧-1,2-二氢-吡啶-3-基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢-1H-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-酮；
4-[(S)-5-(3-氯-2-氟苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-3-异丙基-6-氧-3,4,5,6-四氢吡咯并[3,4-d]咪唑-4-基]-苄腈；
(S)-5-(5-氯-2-氧-1,2-二氢吡啶-3-基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢-1H-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-酮；
(S)-5-(3-氯-4-氟苯基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-1-((R)-1-甲氧基丙-2-基)-5,6-二氢吡咯并[3,4-d]咪唑-4(1H)-酮；
和
(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧-1,2-二氢吡啶-3-基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基-d6-嘧啶-5-基)-1-((R)-1-甲氧基丙-2-基)-5,6-二氢吡咯并[3,4-d]咪唑-4(1H)-酮；或前述任一者的药学上可接受的盐。
29.如权利要求1所述的用途、或如权利要求2至5、或12至24中任一项所述的方法、或如权利要求6至24中任一项所述供应用的Mdm2抑制剂、或如权利要求25至27中任一项所述的药盒，其中该Mdm2抑制剂为(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧-1,2-二氢吡啶-3-基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢-1H-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-酮、或其药学上可接受的盐。
30.如权利要求1所述的用途、或如权利要求2至5、或12至24中任一项所述的方法、或如权利要求6至24中任一项所述的Mdm2抑制剂、或如权利要求25至27中任一项所述的药盒，其中该Mdm2抑制剂为(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反-环己基甲基]-胺基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮、或其药学上可接受的盐。
31.一种供应用的血小板生成素受体激动剂，其用于预防或治疗对象中药物诱发性血小板减少症，该对象用药后样本中的GDF-15表达相较于用药前样本中的GDF-15表达高出至少25％，优选高出至少50％；
其中“用药前样本中的GDF-15表达”为在施用一定剂量的可引起产生药物诱发性血小板减少症的药物至该对象前取自该对象的用药前生物样本中测得的GDF-15表达；
和其中“用药后样本中的GDF-15表达”为在施用一定剂量的可引起产生药物诱发性血小板减少症的药物至该对象后取自该对象的用药后生物样本中测得的GDF-15表达。
32.如权利要求31或32所述的供应用的血小板生成素受体激动剂，其中该可引起产生药物诱发性血小板减少症的药物为Mdm2抑制剂。
33.一种Mdm2抑制剂和血小板生成素受体激动剂的组合。
34.如权利要求33所述的组合供应用于医学用途。
35.如权利要求33所述的组合供应用于治疗癌症和预防或治疗药物诱发性血小板减少症。
36.如权利要求31至35中任一项所述的血小板生成素受体激动剂、组合、或供应用的组合，其中该血小板生成素受体激动剂为艾曲波帕。
37.如权利要求31至36中任一项所述的血小板生成素受体激动剂、组合、或供应用的组合，其中该Mdm2抑制剂为(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧-1,2-二氢-吡啶-3-基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢-1H-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-酮，或其药学上可接受的盐。
38.如权利要求31至36中任一项的血小板生成素受体激动剂、组合、或供应用的组合，其中该Mdm2抑制剂为(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反-环己基甲基]-胺基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮，或其药学上可接受的盐。
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