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CN107921169A - 在组织再生中使用的包含衰老细胞的组合物和产品 - Google Patents

在组织再生中使用的包含衰老细胞的组合物和产品 Download PDF

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Abstract

本发明涉及体外培养的衰老细胞，诸如上皮细胞、角化细胞和/或成纤维细胞，及其在组织再生的治疗中的用途，特别地用于伤口诸如烧伤或溃疡的治疗或炎性病况的治疗。任选地，可将产品与包括抗微生物剂或抗糖尿病剂的其它药物组合使用。

Description

在组织再生中使用的包含衰老细胞的组合物和产品
描述
发明领域
本发明涉及体外培养的衰老细胞，诸如上皮细胞、角化细胞和/或成纤维细胞，及其在制造用于组织再生(特别是用于治疗伤口诸如烧伤或溃疡)的产品中的用途。
发明背景
单独地或组合地包含细胞(例如同种异体角化细胞)的生物活性产品已被良好地建立来用于制造治疗伤口，特别是烧伤或溃疡的产品。尽管在过去，同种异体角化细胞主要用于皮肤替换(参见例如Hansbrough J F,Morgan J L,Greenleaf G E和Bartel R.,1993.J.Burn Care and Rehab.14(5),485-494)，但发现治疗的成功不是因为角化细胞长入伤口并“替换”细胞。相反，移植的角化细胞仅在伤口保留特定的一段时间，然后消失或被去除，但通过归因于分泌因子复杂网络的再上皮化刺激身体自身的愈合过程(参见例如Kawai K,Ikarashi Y,Tomiyama K,Matsumoto Y,Fujiwara M,Transplantation,1993Aug；56(2):265-9)。
值得注意的是，本领域已知的角化细胞的产品主要集中于使细胞增殖。
例如，US 7247478 B2涉及具有高增殖潜能的角化细胞以及包含所述角化细胞和载体的产品。
另外，US 20070258958 A1描述了在生物聚合物膜上包含活跃增殖的角化细胞的交互型伤口覆盖物。
US 6126935 A涉及获自保持增殖能力的角化细胞的丸剂及其在伤口愈合中的用途。
此外，WO02078721 A(EP 1450827 B1)描述了双组分组合物用于原位产生包含悬浮培养的成纤维细胞和角化细胞两者的细胞移植物的用途。
US 6673603 B2显示了在组织再生中使用(例如，在皮肤伤口的治疗中)的细胞糊剂，其含有与细胞外基质材料混合的分泌生物活性物质的成纤维细胞与角化细胞的组合，使得该混合物形成粘稠的细胞糊剂。可通过辐照或丝裂霉素C使这些细胞有丝分裂失活。
此外，US 8323638 B2描述了由成纤维细胞和角化细胞组成的细胞制剂，其可以以喷雾剂或糊剂的形式施用于伤口侧。
然而，本领域已知的角化细胞产品或是复杂而难以获得、繁琐而难以应用、错综复杂而难以存储和/或不提供特别适用于高效治疗伤口的生物活性因子的最佳混合物。因此，需要用于改善组织再生，特别是用于改善伤口和炎性病况的治疗的有效组合物，并因此本发明的目的是提供所述组合物。此外，目的是提供在应用和/或储存方面易于操作的改进的生物活性产品。
这些以及其他目的(所述目的从本发明的以下描述中将变得显而易见)通过独立权利要求的主题来实现。本发明的一些优选实施方案由从属权利要求的主题来定义。
发明概述
如总结于以下项中的本发明的各个方面、有利特征和优选实施例分别单独或组合地有助于解决本发明的目的。
1.包含细胞组分的组合物，其中所述细胞组分包括衰老细胞类型或衰老细胞类型的组合，并且其中所述组合物在组织再生中使用。
2.根据第1项所述的组合物，其中所述衰老细胞来源于选自下组的细胞：上皮细胞、角膜上皮细胞、角化细胞、成纤维细胞、黑素细胞、内皮细胞、周细胞、单核细胞、淋巴细胞、凝血细胞、肥大细胞、脂肪细胞、肌细胞、神经元、骨细胞、成骨细胞、软骨细胞、间充质干细胞和/或成体或胚胎干细胞，优选其中所述衰老细胞类型来源于选自下组的细胞：上皮细胞、角膜上皮细胞、角化细胞、成纤维细胞、黑素细胞、内皮细胞、周细胞、单核细胞、淋巴细胞、凝血细胞、肥大细胞、脂肪细胞、间充质干细胞和/或成体或胚胎干细胞。
3.根据第1项或第2项所述的组合物，其中所述细胞组分包含多于10％，优选多于30％的衰老细胞，进一步优选多于50％的衰老细胞，还更优选多于70％的衰老细胞，以及特别地多于90％的衰老细胞，所述衰老细胞选自如上定义的一种衰老细胞类型或衰老细胞类型的组合。
4.根据前述项中任一项所述的组合物，其中所述细胞是同种异体的、自体的、转基因的或异种的，优选是同种异体的。
5.根据前述项中任一项所述的组合物，其中所述细胞组分主要包括一种细胞类型，所述细胞类型是角化细胞，优选其中所有细胞的至少50％是角化细胞，优选所有细胞的至少75％是角化细胞，更优选组合物中所有细胞的至少85％是角化细胞。
6.根据第5项所述的组合物，其中所述角化细胞中超过10％是衰老的，优选超过30％是衰老的，进一步优选超过50％是衰老的，更优选超过70％是衰老的，特别地超过90％是衰老的。
7.根据前述项中任一项所述的组合物，其中所述细胞组分主要包括衰老角化细胞，优选多于10％的衰老角化细胞，更优选多于30％的衰老角化细胞，更优选多于50％的衰老角化细胞，甚至更优选多于70％的衰老角化细胞，特别地多于90％的衰老角化细胞。
8.根据前述项中任一项所述的组合物，其中从人皮肤或包皮，优选人新生儿皮肤制备所述角化细胞。
9.根据前述项中任一项所述的组合物，其中所述细胞是未分化的或分化的。
10.根据前述项中任一项的组合物，其中在体外诱导衰老。
11.根据前述项中任一项所述的组合物，其中衰老是复制性衰老、应激诱导的衰老或早衰，优选应激诱导的或早衰。
12.根据前述项中任一项所述的组合物，其中通过细胞培养应激、氧化应激/活性氧、丝裂霉素C或任何其它基于化学的有丝分裂抑制剂的衰老诱导性施用、表面活性剂或其它小分子衰老诱导剂的施用、用γ射线的辐照、用X射线的辐照或用UV光(诸如UVB)的辐照或用冷的等离子体的处理，辐照或电子束处理来诱导衰老。
13.根据前述项中任一项所述的组合物，其中衰老由选自细胞过度生长、细胞接触抑制和高细胞密度的细胞培养应激诱导，优选通过细胞接触抑制诱导。
14.根据前述项中任一项所述的组合物，其中衰老的特征在于在生长刺激存在的情况下细胞周期停滞，优选其中在持续生长刺激存在的情况下通过细胞周期停滞诱导衰老，更优选其中在持续生长刺激存在的情况下通过细胞接触抑制诱导衰老。
15.根据前述项中任一项所述的组合物，其中衰老细胞表达和/或分泌一种或多种选自下组的生物活性分子：IL-1α，IL-1β，IL-6，IL-7，IL-8，IL-10，IL-13，IL-15，IL-18，MCP1，MCP2，MCP4，MIF，MIP-1a，MIP-3a，HCC-4，嗜酸细胞活化趋化因子-3，TECK，ENA-78，I-309，I-TAC，GROα，GROβ，GROγ，VEGF，EGF，HGF，FGF，bFGF，KGF，双调蛋白，血管生成素，APOJ，CAV1，OSTEO，表皮调节蛋白，Heregulin，SCF，SDF-1α，PIGF，IGFBP-2、-3、-4、-6、-7，GM-CSF，PDGF-BB，TGF-α，TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，ICAM1，ICAM3，TRAIL-R3，Fas，OPG，SGP130，EGF-RuPAR，sTNFRI，sTNFRIII，MMP1，MMP2，MMP3，MMP7，MMP9，MMP10，MMP12，MMP13，MMP14，TIMP1，TIMP2，PAI1，PAI2，Park7DJ-1，uPA/尿激酶，SLPI，多配体蛋白聚糖1、-4，腱生蛋白C，内皮素，胶原蛋白，纤连蛋白，层粘连蛋白，优选选自下组：IL-8、GROα、VEGF、内皮素、MMP7、MMP9、MMP10、MMP12、MMP13、TIMP1、TIMP2、TGF-β1、甚至更优选包含至少IL-8、GROα、VEGF、内皮素、MMP7、MMP9、MMP10、MMP12、MMP13、TIMP1、TIMP2和TGF-β1。
16.根据前述项中任一项所述的组合物，其中衰老细胞的特征在于选自下组的一种或多种特征：衰老相关(SA)β-gal活性、增殖停滞、p16INK4a表达、DNA损伤信号传导、端粒功能障碍、核纤层蛋白B1的损失，更优选显示至少SA β-gal活性和/或增殖停滞。
17.根据前述项中任一项所述的组合物，其中衰老细胞表达和/或分泌至少IL-8、GROα、VEGF、内皮素、MMP7、MMP9、MMP10、MMP12、MMP13、TIMP1、TIMP2和TGF-β1并显示SA β-gal活性和增殖停滞。
18.根据前述项中任一项所述的组合物，其中衰老的特征在于以下形态学特征的一种或多种：扩大的变平的形态、肥大的、扩大的核、通过衰老相关的异染色质灶(SAHF)的形成而导致的染色质的染色质重塑重组织、凸出的高尔基体和空泡化的细胞质。
19.根据前述项中任一项所述的组合物，其用于治疗伤口。
20.根据第17项的组合物，其中所述伤口是急性或慢性伤口。
21.根据第17项或第18项所述的组合物，其中所述伤口是皮肤的伤口，优选其中在用所述组合物治疗之前通过清创术来治疗所述伤口和/或其中所述伤口由分层皮肤移植(split skin grafting)和/或整形手术产生。
22.根据第17-19项中任一项所述的组合物，其中所述伤口是烧伤。
23.根据第17至20项中任一项所述的组合物，其中所述伤口是浅层烧伤和/或非穿透性深度烧伤。
24.根据第17项至第21项中任一项所述的组合物，其中所述伤口是二度或三度烧伤，优选二度烧伤。
25.根据第17项至第22项中任一项所述的组合物，其中所述伤口是晒伤。
26.根据第17项至第19项中任一项所述的组合物，其中所述伤口是选自溃疡、压疮、糖尿病足综合征的慢性伤口愈合病症。
27.根据第24项所述的组合物，其中所述溃疡选自缺血性、动脉性、静脉性、神经营养性血管炎、高血压性和坏疽性脓皮病、褥疮溃疡。
28.与加压疗法或负压疗法组合的根据前述项中任一项所述的组合物。
29.根据第17项至第19项中任一项所述的组合物，其中所述伤口选自擦伤、任何创伤、放射疗法损伤、所有类型的皮肤损失。
30.根据前述项中任一项所述的组合物，其用于治疗皮肤和皮下组织的炎性病况，其中所述炎症性病况优选选自下组：红斑鳞屑性皮肤病、特应性皮炎和相关病况、接触性皮炎和其它湿疹、起因于内服物质的皮炎、大疱性皮肤病、红斑病、银屑病及类似病症、苔藓、瘙痒症及相关疾病，以及皮肤和皮下组织的其它疾病诸如光化性角化病，脱发和痤疮。
31.根据前述项中任一项所述的组合物，其还包含载体。
32.根据第29项所述的组合物，其中所述载体为伤口敷料、糊剂、喷雾剂或软膏，优选伤口敷料。
33.根据第29项或第30项所述的组合物，其中所述载体为胶样纱布(jellygauze)，优选凡士林纱布和/或其中所述载体由藻酸盐、胶原蛋白、聚氨酯泡沫、水胶体、水性纤维(hydrofibers)、水凝胶、透明质酸、纤维素、无细胞动物或源自皮肤或肠的人源产品如Oasis或生物合成材料如Laserskin或Suprathel组成或包含所述物质。
34.一种组合物，其包含细胞组分和选自如下的物质的组合：抗微生物剂、抗糖尿病剂、针对在慢性非愈合性伤口中过表达的mRNA或miRNA的mRNA或miRNA拮抗剂、生长因子如例如PDGF、FGF-2、VEGF-A、-B、-C、-D、GM-CSF、SDF-1α、IL1-β或来源于这些生长因子的肽、参与皮质醇合成的酶(特别是在慢性伤口中过表达的CYP11B1)以及脯氨酰-4-羟化酶、弹性蛋白酶、GSK3β磷酸化和Cx43的抑制剂，并且其中所述细胞组分包括衰老细胞类型或衰老细胞类型的组合，优选其中所述组合物在组织再生中使用，更优选用于根据前述项中任一项的用途。
35.根据第32项所述的组合物，其中所述抗微生物剂是抗生素和/或抗真菌剂，优选其中所述抗生素选自：头孢菌素，特别是头孢唑啉、头孢西丁、头孢替坦；大环内酯类，特别是红霉素；磺胺类，特别是磺胺米隆；青霉素、氯己定、磺胺嘧啶银、硝酸银和银衍生的制剂，和/或其中所述抗糖尿病剂是DDP-4抑制剂。
36.一种包含衰老细胞裂解物的组合物，其中所述衰老细胞裂解物来源于如第1项至第17项的任一项中所定义的衰老细胞，并且其中所述组合物用于如第1项至第28项的任一项中所定义的用途。
37.根据第34项所述的组合物，其还包含如第29项至第31项的任一项中所定义的载体。
38.根据第34项或第35项所述的组合物，其还包含抗微生物剂，优选抗生素和/或抗真菌剂，优选其中所述抗生素选自头孢菌素，特别是头孢唑林、头孢西丁、头孢替坦；大环内酯类，特别是红霉素；磺胺类，特别是磺胺米隆；青霉素、氯己定、磺胺嘧啶银、硝酸银和银衍生的制剂和/或抗糖尿病剂，优选DDP-4抑制剂和/或针对在慢性非愈合性伤口中过表达的mRNA或miRNA的mRNA或miRNA拮抗剂、生长因子如例如PDGF、FGF-2、VEGF-A、-B、-C、-D、GM-CSF、SDF-1α、IL1-β或来源于这些生长因子的肽、参与皮质醇合成的酶(特别是在慢性伤口中过表达的CYP11B1)以及脯氨酰-4-羟化酶、弹性蛋白酶、GSK3β磷酸化和Cx43的抑制剂。
39.与加压疗法或负压疗法组合的根据第34项至第36项中任一项所述的组合物。
40.一种包含衰老细胞上清液的组合物，其中所述上清液获自第1项至第17项的任一项中所定义的衰老细胞，并且其中所述组合物用于如第1项至第28项的任一项中所定义的用途。
41.根据第38项所述的组合物，其还包含如第29项至第31项的任一项中所定义的载体。
42.根据第38项或第39项所述的组合物，其还包含抗微生物剂，优选抗生素和/或抗真菌剂，优选其中所述抗生素选自：头孢菌素，特别是头孢唑林、头孢西丁、头孢替坦；大环内酯类，特别是红霉素；磺胺类，特别是磺胺米隆；青霉素、氯己定、磺胺嘧啶银、硝酸银和银衍生的制剂和/或抗糖尿病剂，优选DDP-4抑制剂和/或针对在慢性非愈合性伤口中过表达的mRNA或miRNA的mRNA或miRNA拮抗剂、生长因子如例如PDGF、FGF-2、VEGF-A、-B、-C、-D、GM-CSF、SDF-1α、IL1-β或来源于这些生长因子的肽，参与皮质醇合成的酶(特别是在慢性伤口中过表达的CYP11B1)以及脯氨酰-4-羟化酶、弹性蛋白酶、GSK3β磷酸化和Cx43抑制剂。
43.与加压疗法或负压疗法组合的根据前述第38项至第40项中任一项所述的组合物。
44.一种包含载体和组分的产品，所述组分选自衰老细胞、衰老细胞裂解物和衰老细胞上清液，其中所述衰老细胞、衰老细胞裂解物和/或衰老细胞上清液是如前述项的任一项中所定义的，并且其中该产品用于如前述项的任一项中所定义的用途。
45.根据第42项所述的产品，其中所述载体是伤口敷料。
46.根据第42项或第43项所述的产品，其中所述载体是胶样纱布，优选凡士林纱布。
47.根据第42项至第44项中任一项所述的产品，其中所述载体由藻酸盐、胶原蛋白、聚氨酯泡沫、水胶体、水性纤维、水凝胶、透明质酸、纤维素、无细胞动物或源自皮肤或肠的人源产品如Oasis或生物合成材料如Laserskin或Suprathel组成或包含所述物质。
48.根据第41项至第45项中任一项所述的产品，其还包含抗微生物剂，优选抗生素和/或抗真菌剂，优选其中所述抗生素选自：头孢菌素，特别是头孢唑林、头孢西丁、头孢替坦；大环内酯类，特别是红霉素；磺胺类，特别是磺胺米隆；青霉素、氯己定、磺胺嘧啶银、硝酸银和银衍生的制剂和/或抗糖尿病剂，优选DDP-4抑制剂和/或针对在慢性非愈合性伤口中过表达的mRNA或miRNA的mRNA或miRNA拮抗剂、生长因子如例如PDGF、FGF-2、VEGF-A、-B、-C、-D、GM-CSF、SDF-1α、IL1-β或来源于这些生长因子的肽、参与皮质醇合成的酶(特别是在慢性伤口中过表达的CYP11B1)以及脯氨酰-4-羟化酶、弹性蛋白酶、GSK3β磷酸化和Cx43抑制剂。
49.与加压疗法或负压疗法组合的根据第41项至第46项所述的任一项的产品。
50.一种用根据第1项至第16项的任一项中所定义的细胞定植的伤口敷料，用于治疗如第17项至第28项的任一项中所定义的伤口或炎性病况。
51.根据第48项所述的伤口敷料，其中所述伤口敷料为胶样纱布，优选凡士林纱布和/或所述衰老细胞为角化细胞。
52.根据前述第1项至第49项中任一项所述的组合物或产品用于制备用于治疗伤口和/或炎性病况的药剂的用途。
53.根据第50项所述的用途，其中所述伤口或炎性病况是如第17项至第28项的任一项所定义的。
53.一种方法，所述方法用于保存包含如第1项至第41项的任一项中所定义的衰老细胞、衰老细胞裂解物和/或衰老细胞上清液的组合物或根据第42项至第49项的任一项的产品，其中将所述组合物或产品冷冻保存，通过干燥或冷冻干燥进行保存或通过冷等离子体处理、辐照或电子束处理进行保存。
55.根据前述项中任一项所述的组合物、产品或用途，其中在与所述载体组合之前在体外培养所述衰老细胞或将所述在衰老细胞所述载体上生长或与所述载体组合。
56.一种包含SASP因子的组合物，所述SASP因子选自下组：IL-1α，IL-1β，IL-6，IL-7，IL-8，IL-10，IL-13，IL-15，IL-18，MCP1，MCP2，MCP4，MIF，MIP-1a，MIP-3a，HCC-4，嗜酸细胞活化趋化因子-3，TECK，ENA-78，I-309，I-TAC，GROα，GROβ，GROγ，VEGF，EGF，HGF，FGF，bFGF，KGF，双调蛋白，血管生成素，APOJ，CAV1，OSTEO，表皮调节蛋白，Heregulin，SCF，SDF-1α，PIGF，IGFBP-2、-3、-4、-6、-7，GM-CSF，PDGF-BB，TGF-α，TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，ICAM1，ICAM3，TRAIL-R3，Fas，OPG，SGP130，EGF-R uPAR，sTNFRI，sTNFRIII，MMP1，MMP2，MMP3，MMP7，MMP9，MMP10，MMP12，MMP13，MMP14，TIMP1，TIMP2，PAI1，PAI2，Park7DJ-1，uPA/尿激酶，SLPI，多配体蛋白聚糖1、-4，腱生蛋白C，内皮素，胶原蛋白，纤连蛋白，层粘连蛋白，优选选自下组：IL-8、GROα、VEGF、内皮素、MMP7、MMP9、MMP10、MMP12、MMP13、TIMP1、TIMP2、TGF-β1，甚至更优选包含至少IL-8、GROα、VEGF、内皮素、MMP7、MMP9、MMP10、MMP12、MMP13、TIMP1、TIMP2和TGF-β1。
57.根据第54项所述的组合物，其中所述SASP因子获自前述项的任一项中所定义的衰老细胞。
58.与如前述项的任一项中所定义的药剂和/或疗法组合的根据第54项或第55项所述的组合物。
附图简述
图1是显示表皮新生儿包皮角化细胞(该衰老细胞可用于本发明的实施方案)中SASP因子蛋白质表达和分泌的结果的表。
图2显示角化细胞层的β-半乳糖苷酶染色，所述角化细胞是可用于本发明的实施方案的衰老细胞的典型示例。
图3显示角化细胞层的抗-LAMP-1染色，所述角化细胞是可用于本发明的实施方案的衰老细胞的典型示例。
图4显示角化细胞层的抗磷酸组蛋白H2A.X染色，所述角化细胞是可用于本发明的实施方案的衰老细胞的典型示例。
图5显示在本发明的实施方案中使用角化细胞层的临床研究的结果。
图6显示取决于生长刺激的人原代角化细胞(BKB12002)的SASP特征谱。
图7显示原代人角化细胞(BKB12002)的复制性衰老中的细胞的SASP特征谱。
图8显示用t-BHP或乙醇处理的衰老细胞的SASP特征谱。
图9显示用表面活性剂处理的衰老细胞的SASP特征谱。
图10显示辐照的成纤维细胞的β-半乳糖苷酶染色。
图11显示用丝裂霉素C处理的细胞的SASP特征谱
发明详述
现在通过优选实施方案和实施例来更详细地描述本发明，然而所述实施方案和实施例仅出于说明目的而提供，并且不应被理解为以任何方式限制本发明的范围。
本发明包括含有如上定义的衰老细胞的组合物，其用于改善组织再生，特别是用于伤口愈合。因此，其对于包括任何急性和/或慢性伤口在内的伤口的治疗是特别合适和有用的，所述伤口是例如皮肤伤口诸如烧伤，优选浅度烧伤和非穿透性深度烧伤和/或二度烧伤，或选自下组的慢性伤口愈合病症：缺血性、动脉性、静脉性、神经营养性血管炎、高血压性和坏疽性脓皮病、褥疮溃疡、褥疮或压疮、糖尿病足综合征，或其中所述伤口是擦伤、创伤、放射疗法损伤或任何类型的皮肤损失或皮肤和皮下组织的炎性病症如红斑鳞屑性皮肤病、特应性皮炎和相关病况、接触性皮炎和其它湿疹、起因于内服物质的皮炎、大疱性皮肤病、红斑病、银屑病及类似病症、苔藓、瘙痒症及相关病况，以及皮肤和皮下组织的其它疾病诸如光化性角化病、脱发和痤疮。
“(细胞)衰老”是体内和体外发生的将细胞锁定在细胞周期停滞中的机制，并且在该常规情况下，已知该机制抑制恶性转化并促成衰老。据报道，广泛的不同应激因子引发细胞衰老(Ben-Porath I,Weinberg RA,J.Clin.Investig.2004；113:8-13；Ben-Porath I,Weinberg RA,Int.J.Biochem.Cell Biol.2005；37:961-76)。这些应激因子包括在反复细胞分裂(复制性衰老)、氧化应激、线粒体退化、严重或无法修复的DNA损伤和染色质破坏(基因毒性应激)和某些癌基因表达时的端粒功能障碍(Schmitt CA.Nat.Rev.Cancer.2003；3:286–95；Martin GM,Cell.2005；120:523–32；Balaban RS,Nemoto S,Finkel T,Cell.2005；120:483–95)。除了其作为高效肿瘤抑制机制和对衰老的贡献因素的已良好确立的作用以外，还有证据表明衰老细胞发展了改变的分泌活性，从而促进肿瘤发生(Krtolica A,Parrinello S,Lockett S,Desprez P,Campisi J；Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2001；98:12072–77；Coppé JP,Boysen M,Sun CH,Wong BJ,Kang MK等，Mol.Cancer Res.2008；6:1085–98)。例如，Coppéand及同事描述，成纤维细胞具有衰老相关的分泌表型，从而将衰老的成纤维细胞转化为促炎细胞，其具有促进肿瘤进展的能力(Coppé JP,Desprez PY,Krtolica A,Campisi J.Annu Rev Pathol.2010；5:99-118)。最近，已显现出衰老的第四作用，当时Krizhanovsky等发现组织损伤诱导的肝星状细胞(HSC)的过度增殖诱导细胞衰老，导致细胞外基质(ECM)蛋白分泌减少和ECM降解蛋白的分泌增强，由此在肝脏内组织损伤时限制纤维化(Krizhanovsky V,Yon M,Dickins RA,Hearn S,Simon J,Miething C,Yee H,Zender L,Lowe SW(2008),Cell 134(4):657–667；54.Sagiv A,Biran A,Yon M,Simon J,Lowe SW,Krizhanovsky V,(2013)Oncogene 32(15):1971–1977)。优选地，“衰老”不应被简单地削减至细胞周期停滞。相反，当细胞周期被阻止时，衰老可由生长刺激引起(Blagosklonny MV，2012年3月，AGING第4卷，第3期，第159-165页；AGING，2011年2月，第3卷，第2期，第94-101页)。因此，作为另一个标志，衰老细胞可能失去恢复增殖的潜力。
然而，衰老细胞是具有代谢活性并且在蛋白质表达和分泌模式中经历广泛改变，因此最终发展成其类似于指纹的个体SASP的潜在永存细胞(persisting cell)(Coppé JP,Desprez PY,Krtolica A,Campisi J.Annu Rev Pathol.2010；5:99-118)。这个事实可以解释上述衰老细胞的四个明显相反的功能，突出了细胞背景(即细胞类型和衰老诱导刺激)的重要性(Coppé JP,Desprez PY,Krtolica A,Campisi J.Annu Rev Pathol.2010；5:99-118；Coppé JP,Patil CK,Rodier F,Sun Y,Munoz DP等.PLoS Biol.2008；6:2853–68)。SASP(衰老相关的分泌表型)，也称为衰老信息分泌组(senescence-messagingsecretome)，类似于衰老的另一个标志，可包括以下生物活性因子的表达/分泌(Pawlikowski JS,Adams PD和Nelson DM,September 15,2013J Cell Sci 126,4061-4067)：
i.白介素，诸如IL-1α,IL-1β,IL-6,IL-7,IL-13,IL-15；
ii.趋化因子，诸如IL-8,MCP2,MCP4,GROα,GROβ,GROγ；
iii.生长因子，诸如EGF,HGF,VEGF；
iv.受体和配体，诸如ICAM1,ICAM3,TRAIL-R3,Fas,uPAR,sTNFRI,sTNFRIII；
v.蛋白酶和调节剂，诸如MMP1,MMP3,MMP10,MMP12,TIMP1,TIMP2,PAI1,PAI2；
vi.细胞外不溶性分子，诸如胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白。
除了上述细胞周期阻滞和特定的SASP以外，衰老细胞还可通过以下标志来表征(Pawlikowski JS,Adams PD和Nelson DM,September 15,2013J Cell Sci 126,4061-4067)：
a.扩大的、变平的形态
b.p16INK4a表达
c.升高的溶酶体活性(衰老相关的b-半乳糖苷酶；SA b-gal)
d.DNA损伤应答
e.染色质重塑
f.自噬
与以前对相关产品的研究有惊人的区别的是，本发明人发现，特别是衰老细胞显示复杂的SASP，从而提供了在刺激机体自身再上皮化中特别有效的生物活性因子的混合物。如实施例中所述和如附图中所说明的，实验证明了预期的治疗效果与衰老的相关细胞状态之间的相关性。因此，本发明的总体概念是将衰老有益地用于伤口和炎症疗法中。相反，如上所述的本领域已知的生物活性产品主要集中于以高增殖速率为特征的细胞，因此抑制衰老途径。
如在本发明中所理解的“衰老细胞”是特征在于细胞周期停滞的细胞，其进一步的典型特征在于包含一种或多种以下因子的SASP：IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-13、IL-15、IL-18、MCP1、MCP2、MCP4、MIF、MIP-1a、MIP-3a、HCC-4、嗜酸细胞活化趋化因子-3、TECK、ENA-78、I-309、I-TAC、GROα、GROβ、GROγ、VEGF、EGF、HGF、FGF、bFGF、KGF、双调蛋白、表皮调节素、Heregulin、SCF、SDF-1α、PIGF、IGFBP-2、-3、-4、-6、-7、GM-CSF、PDGF-BB、TGF-α、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、ICAM1、ICAM3、TRAIL-R3、Fas、OPG、SGP130、EGF-R uPAR、sTNFRI、sTNFRIII、MMP1、MMP3、MMP7、MMP9、MMP10、MMP12、MMP13、MMP14、TIMP1、TIMP2、PAI1、PAI2、SLPI、内皮素、胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白，优选以下的一种或多种：IL-8、GROα、VEGF、内皮素、MMP7、MMP9、MMP10、MMP12、MMP13、TIMP1、TIMP2、TGF-β1，甚至更优选包含至少IL-8、GROα、VEGF、内皮素、MMP7、MMP9、MMP10、MMP12、MMP13、TIMP1、TIMP2和TGF-β1。
此外，如本发明中所理解的“衰老细胞”是特征在于细胞周期停滞的细胞，其进一步的典型特征在于包含下组因子中的一种或多种的SASP：IL-1α，IL-1β，IL-6，IL-7，IL-8，IL-10，IL-13，IL-15，IL-18，MCP1，MCP2，MCP4，MIF，MIP-1a，MIP-3a，HCC-4，嗜酸细胞活化趋化因子-3，TECK，ENA-78，I-309，I-TAC，GROα，GROβ，GROγ，VEGF，EGF，HGF，FGF如FGF酸性的，bFGF，KGF，双调蛋白，血管生成素，APOJ，CAV1，OSTEO，表皮调节蛋白，Heregulin，SCF，SDF-1α，PIGF，IGFBP-2、-3、-4、-6、-7，GM-CSF，PDGF-BB，TGF-α，TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，ICAM1，ICAM3，TRAIL-R3，Fas，OPG，SGP130，EGF-R uPAR，sTNFRI，sTNFRIII，MMP1，MMP2，MMP3，MMP7，MMP9，MMP10，MMP12，MMP13，MMP14，TIMP1，TIMP2，PAI1，PAI2，Park7DJ-1，uPA/尿激酶，SLPI，多配体蛋白聚糖1、-4，腱生蛋白C，内皮素，胶原蛋白，纤连蛋白，层粘连蛋白，优选选自下组的一种或多种：IL-8、GROα、VEGF、内皮素、MMP7、MMP9、MMP10、MMP12、MMP13、TIMP1、TIMP2、TGF-β1，甚至更优选包含至少IL-8、GROα、VEGF、内皮素、MMP7、MMP9、MMP10、MMP12、MMP13、TIMP1、TIMP2和TGF-β1。
与相应的对照细胞，即非衰老细胞相比，所述SASP因子的表达和/或分泌可在衰老诱导的细胞中增加。优选地，所述SASP因子的表达和/或分泌显著增加。显著性可通过本领域已知的任何数学方法计算，例如通过学生氏t-检验计算。如本文中所指，如果上述SASP因子的表达和/或分泌相较于对应的对照细胞为至少1.5倍，则所述SASP因子的表达和/或分泌增加。优选地，相较于对照细胞，所述表达为至少2倍，进一步优选至少3倍，甚至进一步优选至少5倍，更优选至少10倍，甚至更优选至少20倍，特别地至少50倍。
此外，本发明的衰老细胞可以特别地显示SAβ-gal活性、增殖停滞、p16INK4a表达、DNA损伤信号传导、端粒功能障碍和/或核纤层蛋白B1的损失、至少增殖停滞和/或SAβ-gal活动。此外，它们可显示增加的LAMP 1或磷酸组蛋白H2A.X表达。
另外，本发明的衰老细胞可以显现出以下形态学特征：扩大的变平的形态、肥大、扩大的核、通过衰老相关的异染色质灶(SAHF)的形成而导致的染色质的染色质重塑重组织、凸出的高尔基体和空泡化的细胞质。
此外，根据本发明的衰老可以是复制性的，即取决于端粒缩短或早衰，即在任何可检测的端粒丢失或功能障碍不存在的情况下。
值得注意的是，已经发现，当在细胞组分中包含超过30％的体外培养的衰老细胞，优选超过50％的体外培养的衰老细胞，更优选超过70％的体外培养的衰老细胞，甚至更优选超过90％的体外培养的衰老细胞时，根据发明的组合物特别有效。另外，细胞组分中超过10％的体外培养的衰老细胞，优选超过30％的体外培养的衰老细胞，更优选超过50％的体外培养的衰老细胞，甚至更优选超过70％的体外培养的衰老细胞，特别地超过90％的体外培养的衰老细胞是特别有效的。
根据本发明的细胞包括一种衰老细胞类型或者衰老细胞类型的组合。例如，根据本发明使用的衰老细胞所源自的细胞可选自上皮细胞、角膜上皮细胞、角化细胞、成纤维细胞、黑素细胞、内皮细胞、周细胞、单核细胞、淋巴细胞、凝血细胞、肥大细胞、脂肪细胞、肌细胞、神经元、骨细胞、成骨细胞、软骨细胞、间充质干细胞和/或成体或胚胎干细胞。优选地，根据本发明使用的衰老细胞所源自的细胞可选自上皮细胞、角膜上皮细胞、角化细胞、成纤维细胞、黑素细胞、内皮细胞、周细胞、单核细胞、淋巴细胞、凝血细胞、肥大细胞、脂肪细胞、间充质干细胞和/或成体或胚胎干细胞。另外，可将根据本发明的细胞进行遗传工程以分泌如上定义的SASP因子。这种分泌可以是组成型的，或者可以通过基因转换来控制。另外，根据本发明的细胞可以包括非衰老细胞。
根据本发明的所有细胞可以是自体的、同种异体的或异种的，优选同种异体的。优选地，根据本发明的细胞是人的。此外，细胞可以是转基因的。
特别地，根据本发明的细胞包括角化细胞，更特别地原代表皮角化细胞，例如从供体分离的角化细胞。可从成人或新生儿皮肤，优选人新生儿包皮分离这些角化细胞。本领域技术人员可以例如按照Rheinwald和Green于1975年描述的方法(Cell，第6卷，第3期，1975年11月，第331-343页)进行角化细胞的分离和初始培养。然而，这些角化细胞也可包括角化细胞系。
在优选实施方案中，角化细胞类似于本发明组合物的主要细胞类型，即组合物中所有细胞的至少50％是角化细胞，优选组合物中所有细胞的至少75-85％是角化细胞，更优选组合物中所有细胞的至少85-95％是角化细胞。它们可以是衰老的和/或非衰老的。在这些细胞当中，优选超过10％是衰老的，进一步优选地超过30％，甚至更优选超过50％，还更优选超过70％，特别地超过于90％是衰老的。
在本发明的优选实施方案中，在体外培养细胞。然后，通过导致细胞培养应激的不适当的生长条件诱导根据本发明的衰老，所述细胞培养应激为例如细胞的过度生长、高细胞密度、细胞接触抑制、H2O2的存在、ROS的存在、丝裂霉素C或任何其他基于化学的有丝分裂抑制剂的施用、用γ射线的辐照、用X射线的辐照或用UV光的辐照，特别是如例如由Lewis等(Mol Biol Cell.2008 Apr；19(4):1346–1353)描述的UVB辐照和用冷的等离子体的处理(Volotskova等，Sci Rep.2012；2:636,doi:10.1038/srep00636.)。
在本发明的另一个实施方案中，通过氧化应激/活性氧、辐照或电子束处理诱导根据本发明的衰老。
此外，通过亚致死剂量的表面活性剂例如NP-40(优选以1-10μM的浓度)、TritonX-100(优选以2-20μM的浓度)、SDS、Tween 20、Tween 80(优选以5-20μM的浓度)、心磷脂和肥皂诱导根据本发明的衰老。为了诱导衰老，将细胞与亚致死浓度的表面活性剂一起培养1至6周。
或者，可通过例如由Tsai K.C.等(Cancer Res 2005；65(15):6734-44)、Papadopoulou A.和Kletsas D.(INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY 39:989-999,2011,DOI:10.3892/ijo.2011.1132)和Alessio N.等.(Oncotarget，第6卷，第10期，2015，第8155-8166页)所述的低剂量电离辐照诱导衰老。
或者，已发现相对低水平的丝裂霉素C是诱导衰老的(例如以0.02-1μM的浓度)。优选地，将包含上述浓度的丝裂霉素C的细胞培养基更换数次，例如2至7次，例如每天一次至每三天一次。然后，略低剂量的丝裂霉素C也可诱导衰老。
或者，可将适当浓度的t-BHP或乙醇和衰老的小分子诱导剂(如例如别处(Dierick,J.F.等(2002),FEBS Lett 531(3):499-504；Pascal,T.等(2005),FEBS Lett579(17):3651-3659；Ewald,J.A.等(2009),J Biomol Screen 14(7):853-858)中所述的)用于诱导衰老。
通过例如使用各自药剂的适当浓度和处理持续时间或各自物理处理的适当强度和持续时间来控制各自使用的方法，达到获得衰老细胞周期停滞的程度，这可通过上述衰老或SASP的特征的任一种来验证。
在优选实施方案中，可在持续生长刺激存在(即将生长刺激同时应用于细胞周期停滞)的情况下，例如通过上述方法或处理中的任一种诱导根据本发明的衰老。换句话说：可通过将细胞周期停滞与生长刺激偶联，优选通过将接触抑制与生长刺激偶联来诱导根据本发明的衰老。根据本发明的此类生长刺激可选自由以下方式：培养基组分，如血清或血清组分(特别地来自异种或人来源)、血小板、血小板裂解物或后者的组分，以及以本领域技术人员已知的浓度存在的单一生长因子(如例如EGF、KGF、FGF、胰岛素、氢化可的松或脱铁转铁蛋白)或其组合。其它生长刺激可以是TGF-β。
此外，可通过本领域已知的方法(例如涉及3H-胸苷或BrdU的DNA染色或细胞周期调节剂的染色)分析细胞周期阻滞/增殖。
在另一方面，本发明涉及用于如上所述的用途的产品，其包含衰老细胞，优选衰老上皮细胞、角化细胞和/或成纤维细胞，特别是如上所述的衰老角化细胞，以及合适的载体或载体材料。根据本发明的合适的载体或载体材料可以是任何生物相容性基质或膜(例如以伤口敷料或纱布的形式)，包括例如薄膜诸如聚氨酯膜、烃类诸如凡士林、水胶体、水凝胶、亲水性或疏水性泡沫和藻酸钙，以及分别与生物制品施用相容的任何溶剂、分散介质、包衣剂、等渗溶液等，例如水、盐水、finger's溶液、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白、脂质体和非水性媒介物诸如本领域已知的不挥发性油以及添加剂诸如吸收延迟剂。载体或载体材料可部分或完全被上述细胞定殖。在本发明的优选实施方案中，载体是伤口敷料，优选凝胶纱布，更优选凡士林纱布。
取决于上述载体或载体材料，本发明的组合物呈(伤口)敷料、糊剂、喷雾剂或软膏形式。此外，局部、皮下或经吸入施用或应用根据本发明的产品。
在另一方面，本发明涉及产品，其包含衰老细胞裂解物，包括全细胞裂解物或来自特定细胞区室的裂解物，或者包含衰老细胞上清液，其分别获自上述细胞和任选的如上所定义的载体。裂解物或上清液可含有或也可不含有细胞材料(无论是否具有活力)。另外，根据本发明使用的产品可包含为如本文其它地方所述的衰老细胞的SASP的特征的生物活性因子的混合物-包括以其分离形式存在的因子，以及任选的如上所述的载体。在该实施方案中，根据本发明的“衰老细胞组分”意指分别从本文公开的衰老细胞获得的细胞裂解物或衰老细胞上清液或SASP因子分离物(任选地分别与合适的载体组合)。
如下文进一步描述的，可将上述裂解物、上清液或SASP分离物分别与另外的治疗性物质(附加组分)组合。
存在于根据本发明使用的组合物中的SASP因子的优选列表以及它们对于指定的疗法有用的浓度列于下表1中：
表1：
此外，上述指定的产品可额外地包括活细胞和/或死细胞。
取决于伤口或炎症病况的性质，本发明还涉及药物组合，其包含根据本发明的产品以及抗微生物剂，例如抗生素或抗真菌剂，包括来自头孢菌素种类的抗生素，例如头孢唑啉、头孢西丁、头孢替坦；大环内酯类，例如红霉素；磺胺类，例如磺胺米隆；青霉素、氯己定、磺胺嘧啶银、硝酸银和银衍生的制剂或-在糖尿病伤口的情况下-与抗糖尿病药物例如DDP-4抑制剂诸如利格列汀、西他列汀、维格列汀或沙格列汀组合。此外，所述药物组合可以额外地包含或替代上述药剂包含针对在慢性非愈合性伤口中过表达的mRNA或miRNA的拮抗剂；生长因子如例如PDGF、FGF-2、VEGF-A、-B、-C、-D、GM-CSF、SDF-1α、IL1-β或衍生自这些生长因子的肽；参与皮质醇合成的酶(特别是在慢性伤口中过表达的CYP11B1)以及脯氨酰-4-羟化酶、弹性蛋白酶、GSK3β磷酸化和Cx43的抑制剂。
可在上述产品之前，与之同时或连续地，优选与之同时施用或应用另外的组分(例如抗微生物剂、抗糖尿病剂或上述的其它药剂)。因此，一个优选实施方案涉及一种试剂盒，其包含如上定义的产品和如上所述的任何试剂，优选抗微生物剂和/或抗糖尿病剂，优选DDP-4抑制剂。
此外，可将如上所述的组合物与加压疗法或负压疗法结合使用。
在另外方面，本发明涉及如上所述的衰老细胞或产品或组合用于制备用于治疗伤口和/或炎症病况的药物的用途。
在另一方面，本发明涉及通过冷冻、干燥或冷冻干燥冷冻保存如上所述的衰老细胞或产品的方法。
可将上述组合物与施用说明书一起包含在容器、包装或分配器中。剂量方案由普通熟练医师或兽医根据多种因素来选择，所述因素包括患者的物种、年龄、体重、性别和医学状况、伤口的类型和严重程度、施用形式以及具体的细胞类型。
以下实施例说明了本发明的优选实施方案。可以如WO96/14738A(EP0790767B)中所述，特别地如其实施例1中所述进行伤口敷料组装和冷冻保存。
实施例1：
人同种异体角化细胞的制备和培养、衰老诱导：
根据Rheinwald和Green于1975年描述的方法(Cell，第6卷，第3期，1975年11月，第331–343页)从包皮或其它部位，优选人新生儿包皮的皮肤活检物分离根据本发明的角化细胞。在细胞层的最终生产过程中，以5000个细胞/cm2的密度接种角化细胞，培养14天而不分开细胞并施加4个培养基变化。培养基补充有生长因子(包括FCS(4％)、EGF(10ng/μl)、胰岛素(0.12U/μl)、氢化可的松(0.8μg/μl)或脱铁转铁蛋白(5μg/μl)的组合，以保持恒定高的增长刺激。6-9天后，细胞减慢或停止增殖，最后在培养结束时显示出衰老表型，如图2中所示。
通过分析SASP来测定衰老
为了确定由衰老诱导的角化细胞分泌的SASP因子的类型和量，在最后的培养步骤之后，在冷冻保存细胞之前，从细胞培养瓶中收集上清液，并如图1中所示，测量SASP因子的蛋白质浓度。使用来自BIO-RAD的 Multiplex Immunoassays或ELISA试剂盒对蛋白质浓度进行定量。图1(分泌的)显示表示为三个细胞培养瓶的上清液的平均值和相应标准偏差的分泌的因子的浓度。
在通过使用BIO-RAD的Bio-PlexTM Cell Lysis试剂盒裂解细胞层获得的蛋白质提取物中定量冷冻保存的表皮片材(epidermal sheet)的SASP因子的细胞内水平。在图1(细胞内)中描绘了如上所述测定的SAP因子的浓度(以pg因子/μg蛋白质提取物给出的)。
根据本发明的衰老可额外地或可选地通过SA β-Gal染色或通过使用抗LAMP 1和/或H2A.X抗体的免疫染色来进行分析，如下面实施例2中所说明的。
实施例2：
2.1通过SA β-Gal染色测定衰老
如上所述进行人同种异体角化细胞的制备和培养以及衰老诱导。
作为细胞衰老的标志物，使用来自Cell Signaling的Senescence β-Galactosidase Staining试剂盒对冷冻保存的表皮片材进行β-Gal染色。将1cm2的表皮片材在37℃于2mlβ-半乳糖苷酶染色溶液中孵育过夜，用2ml PBS漂洗5次，并如图2中所示用光学显微镜进行分析。
2.2通过针对LAMP 1和H2A.X的免疫染色测定衰老
如上所述进行人同种异体角化细胞的制备和培养以及衰老诱导。作为细胞衰老的标志，使用来自Cell Signaling的兔抗磷酸组蛋白H2A.X或兔抗LAMP 1进行冷冻保存的表皮片材的免疫染色。按照供应商提供的方案进行测定。为了增强抗体与抗原之间的免疫反应或使抗体与抗原之间的免疫反应能够进行，热诱导的水解(微波)作为抗原修复。通过缀合有过氧化物酶聚合物的抗兔或抗小鼠二抗检测免疫反应。将3,3'-二氨基联苯胺(DAB)用作色原体。为了对加工的切片进行更加有区别的分析，将载玻片用苏木精复染，这通过使DAB信号变黑并对细胞核提供蓝色到紫色的染色以及对体细胞组分和纤维提供浅蓝色染色来产生足够的反差。为了检测二抗的非特异性结合，省略一抗并用预温育的溶液(仅含有PBS和BSA)代替。
如图3(A和B)中所示，对比LAMP 1染色的切片显示对于衰老细胞是典型的强烈的无处不在的点状染色，但对于二抗没有非特异性染色。对比H2A.X衰老标志物染色的切片显示更强的核染色，但对于二抗没有非特异性染色(图4(A-C))。
实施例3：
衰老角化细胞的治疗作用
通过根据实施例1和/或2的方法获得的伤口敷料改善了伤口愈合(如在患有2级烧伤的患者的临床研究中分析的)，数据概括于下面的图3中。简言之，将297名年龄在2个月与16岁之间的患者纳入研究中，所述研究的性别平衡良好(45％女性/55％男性)。烧伤的主要原因是烫伤，患者的中位总烧伤表面积约为12％。治疗导致在6天(中值)中发生伤口的上皮形成。6天后52％的患者表现出愈合，9或14天后78％或95％的患者表现出愈合(图5)。
实施例4：
取决于增长刺激的SASP特征谱
使用来自GibcoTM的EpiLife培养基+S7补充剂，在胶原蛋白I包被的6孔板上培养来源于新生儿包皮(De Corte,Verween等2012)的人原代角化细胞(BKB12002)。在S7补充剂中递送生长刺激物的组分是例如EGF、TGF-β和胰岛素。使细胞生长至80％汇合，除去培养基，并使用不含提供生长刺激物的S7补充剂、含有0.5x或1.0x所述S7补充剂的EpiLife培养基将细胞再培养7天。收集培养结束时细胞培养孔中的上清液，并如图II中所示测量SASP因子的蛋白质浓度。使用来自BIO-RAD的 Multiplex Immunoassays或ELISA试剂盒对蛋白质浓度进行定量。图6显示基于两个细胞培养孔的上清液的平均值的分泌因子的浓度相较于无S7的值的相对变化。
实施例5：
复制性衰老中的细胞的SASP特征谱
为了测定经历复制性衰老的原代人BKB12002细胞中的SASP因子特征谱的变化，将细胞生长至第13代，在第7代和第13代，收集细胞培养瓶的上清液，并测定SASP因子的蛋白质浓度。使用来自BIO-RAD的 Multiplex Immunoassays或ELISA试剂盒对蛋白质浓度进行定量。图7显示基于两个细胞培养孔的上清液的平均值的来自第13代的上清液中分泌因子的浓度相较于第7代的值的相对变化。
实施例6：
用t-BHP或乙醇处理的细胞的SASP特征谱
为了测定经历应激诱导的衰老的人成纤维细胞系(SCRC1041)的细胞中的SASP因子特征谱的变化，如上所述用乙醇或t-BHP处理细胞。使细胞生长至80％汇合，除去培养基，并用相同的培养基将细胞再培养3天，每天用5％乙醇处理2小时或用30μM t-BHP处理1小时。图8概括了如上所述测定的分泌的SASP因子的水平的变化。
实施例7：
用表面活性剂处理的细胞的SASP特征谱
用表面活性剂NP40处理人原代角化细胞BKB10002细胞以诱导衰老。在EpiLife培养基+不具有(对照)或具有2uM NP40的S7补充剂中生长14天，每隔一天更换一次培养基。在培养的第14天，使用来自Cell Signaling的染色试剂盒和制造商的方案(未显示)，11％的细胞显示阳性的β-Gal染色。使用来自BIO-RAD的 Multiplex Immunoassays或ELISA试剂盒定量细胞培养物上清液中的蛋白质浓度。图9显示了相较于对照值的分泌因子浓度的相对变化。
实施例8：
用经辐照的细胞的衰老测试
为了确定用不同剂量的γ辐照处理的人成纤维细胞(SCRC1041)是否显示衰老表型，如图10所示用不同剂量处理细胞。如实施例7所述，测定β-Gal阳性细胞的百分比。
实施例9：
用丝裂霉素处理的细胞的SASP特征谱
将BKB12002角化细胞或SCRC1041成纤维细胞与不同剂量的丝裂霉素一起孵育一次或反复孵育，并测定β-半乳糖苷酶阳性细胞的百分比和选定的分泌因子的浓度。
对于用丝裂霉素进行的单一处理，使用来自GibcoTM的EpiLife培养基+S7补充剂将细胞生长至80％汇合，并用包含不同浓度的丝裂霉素的相同培养基孵育5小时。除去培养基，用PBS洗涤细胞一次，然后将细胞在不含丝裂霉素的培养基中再培养7天。
对于反复处理，使用来自GibcoTM的EpiLife培养基+S7补充剂培养BKB12002细胞2天，然后用含有不同量的mytomicin的相同培养基再培养12天，每隔一天更换一次培养基。
使用染色试剂盒Cell Signaling和制造商的方案测定β-Gal染色阳性的衰老细胞的百分比。使用来自BIO-RAD的 Multiplex Immunoassays或ELISA试剂盒定量细胞培养物上清液中的蛋白质浓度。图11显示分泌因子的浓度相较于对照值的相对倍数变化。

Claims (16)

1.包含细胞组分的组合物，其中所述细胞组分包含衰老细胞类型或衰老细胞类型的组合，并且其中所述组合物在组织再生中使用。
2.根据权利要求1使用的所述组合物，其中所述衰老细胞类型来源于选自下组的细胞：上皮细胞、角膜上皮细胞、角化细胞、成纤维细胞、黑素细胞、内皮细胞、周细胞、单核细胞、淋巴细胞、凝血细胞、肥大细胞、脂肪细胞、肌细胞、神经元、骨细胞、成骨细胞、软骨细胞、间充质干细胞和/或成体或胚胎干细胞，优选其中所述衰老细胞类型来源于选自下组的细胞：上皮细胞、角膜上皮细胞、角化细胞、成纤维细胞、黑素细胞、内皮细胞、周细胞、单核细胞、淋巴细胞、凝血细胞、肥大细胞、脂肪细胞、间充质干细胞和/或成体或胚胎干细胞。
3.根据权利要求1或2使用的所述组合物，其中所述细胞组分包含超过10％的衰老细胞，优选超过30％的衰老细胞，进一步优选超过50％的衰老细胞，还更优选超过70％的衰老细胞，特别地超过90％的衰老细胞，其选自如上定义的一种衰老细胞类型或衰老细胞类型的组合。
4.根据前述权利要求中任一项使用的所述组合物，其中所述细胞是同种异体的、自体的或异种的，优选同种异体的。
5.根据前述权利要求中任一项使用的所述组合物，其中所述细胞组分主要包括一种细胞类型，所述细胞类型是角化细胞。
6.根据前述权利要求中任一项使用的所述组合物，其中所述细胞组分包括衰老角化细胞，优选超过10％的衰老角化细胞，进一步优选超过30％的衰老角化细胞，更优选超过50％的衰老角化细胞，甚至更优选超过70％的衰老角化细胞，特别地超过90％的衰老角化细胞。
7.根据前述权利要求中任一项使用的所述组合物，其中衰老由选自下组的细胞培养应激诱导：细胞过度生长、细胞接触抑制、高细胞密度、氧化应激、活性氧簇的存在；表面活性剂或衰老的其他小分子诱导剂的施用；丝裂霉素C或任何其它基于化学的有丝分裂抑制剂的衰老诱导性施用；或通过用γ-射线辐照、用X-射线辐照或用包括UVB在内的UV光辐照；或通过用冷的等离子体的处理，辐照或电子束处理，其中衰老优选通过细胞培养应激诱导，更优选通过细胞接触抑制或表面活性剂的施用诱导。
8.根据前述权利要求中任一项使用的所述组合物，其中衰老的特征在于在生长刺激存在的情况下的细胞周期停滞和/或其中在持续生长刺激存在的情况下通过细胞周期停滞诱导衰老。
9.根据前述权利要求中任一项使用的所述组合物，其中衰老细胞表达和/或分泌选自下组的一种或多种生物活性分子：IL-1α，IL-1β，IL-6，IL-7，IL-8，IL-10，IL-13，IL-15，IL-18，MCP1，MCP2，MCP4，MIF，MIP-1a，MIP-3a，HCC-4，嗜酸细胞活化趋化因子-3，TECK，ENA-78，I-309，I-TAC，GROα，GROβ，GROγ，VEGF，EGF，HGF，FGF，bFGF，KGF，双调蛋白，血管生成素，APOJ，CAV1，OSTEO，表皮调节蛋白，Heregulin，SCF，SDF-1α，PIGF，IGFBP-2、-3、-4、-6、-7，GM-CSF，PDGF-BB，TGF-α，TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，ICAM1，ICAM3，TRAIL-R3，Fas，OPG，SGP130，EGF-RuPAR，sTNFRI，sTNFRIII，MMP1，MMP2，MMP3，MMP7，MMP9，MMP10，MMP12，MMP13，MMP14，TIMP1，TIMP2，PAI1，PAI2，Park7DJ-1，uPA/尿激酶，SLPI，多配体蛋白聚糖1、-4，腱生蛋白C，内皮素，胶原蛋白，纤连蛋白，层粘连蛋白，优选选自下组：IL-8、GROα、VEGF、内皮素、MMP7、MMP9、MMP10、MMP12、MMP13、TIMP1、TIMP2、TGF-β1，甚至更优选表达和/或分泌IL-8、GROα、VEGF、内皮素、MMP7、MMP9、MMP10、MMP12、MMP13、TIMP1、TIMP2和TGF-β1的至少一种或多种，优选全部；和/或其中衰老细胞的特征在于选自下组的一种或多种特征，优选全部特征：SAβ-gal活性、增殖停滞、p16INK4a表达、DNA损伤信号传导、端粒功能障碍、核纤层蛋白B1的损失，优选至少显示至少SAβ-gal活性和/或增殖停滞。
10.根据前述权利要求中任一项使用的所述组合物，其用于治疗急性或慢性伤口和/或炎性病况。
11.根据权利要求10使用的所述组合物，其中所述伤口是烧伤，特别地选自下组的烧伤：浅层烧伤和/或非穿透性深度烧伤、2度或3度烧伤、晒伤，和/或其中所述伤口是选自溃疡、压疮、糖尿病足综合征的慢性伤口愈合病症。
12.根据权利要求10使用的所述组合物，其中所述炎性病况是皮肤和皮下组织的炎症，优选选自下组：红斑鳞屑性皮肤病、特应性皮炎、皮炎、湿疹、大疱性皮肤病、红斑病、银屑病及类似病症、苔藓、瘙痒症、光化性角化病、脱发和痤疮。
13.根据前述权利要求中任一项使用的所述组合物，其还包含载体，其中所述载体优选选自下组：伤口敷料、糊剂、喷雾剂、软膏，更优选其中所述载体为伤口敷料。
14.根据前述权利要求中任一项使用的所述组合物，其还包含选自下组的物质：
抗微生物剂；
抗糖尿病剂；
针对在慢性非愈合性伤口中过表达的mRNA或miRNA的mRNA或miRNA拮抗剂；生长因子，优选PDGF、FGF-2、VEGF-A、-B、-C、-D、GM-CSF、SDF-1α、IL1-β或衍生自这些生长因子的肽；和
参与皮质醇合成的酶，特别是在慢性伤口中过表达的CYP11B1以及脯氨酰基-4-羟化酶、弹性蛋白酶、GSK3β磷酸化和Cx43的抑制剂。
15.根据前述权利要求中任一项的病况或治疗中使用的所述组合物，所述组合物包含分别获自如前述权利要求的任一项中定义、表征和/或处理的衰老细胞的细胞裂解物、细胞上清液或SASP因子分离物，所述细胞裂解物、细胞上清液或SASP因子分离物任选地与如权利要求13中定义的载体和/或与如权利要求14中定义的物质组合。
16.SASP因子的组合物，其包含至少IL-8、GROα、VEGF、内皮素、MMP7、MMP9、MMP10、MMP12、MMP13、TIMP1、TIMP2和TGF-β1，任选地还包含选自下组的SASP因子：IL-1α，IL-1β，IL-6，IL-7，IL-10，IL-13，IL-15，IL-18，MCP1，MCP2，MCP4，MIF，MIP-1a，MIP-3a，HCC-4，嗜酸细胞活化趋化因子-3，TECK，ENA-78，I-309，I-TAC，GROβ，GROγ，EGF，HGF，FGF，bFGF，KGF，双调蛋白，血管生成素，APOJ，CAV1，OSTEO，表皮调节蛋白，Heregulin，SCF，SDF-1α，PIGF，IGFBP-2、-3、-4、-6、-7，GM-CSF，PDGF-BB，TGF-α，TGF-β2，TGF-β3，ICAM1，ICAM3，TRAIL-R3，Fas，OPG，SGP130，EGF-R uPAR，sTNFRI，sTNFRIII，MMP1，MMP2，MMP3，MMP14，PAI1，PAI2，Park7DJ-1，uPA/尿激酶，SLPI，多配体蛋白聚糖1、-4，腱生蛋白C，胶原蛋白，纤连蛋白，层粘连蛋白。
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