CN107929804A - 改性明胶基复合海绵及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种改性明胶基复合海绵及其制备方法和用途，是由改性明胶、多糖、交联剂聚乙二醇衍生物、缓冲盐溶液和余量的水制备而成；该改性明胶为侧链巯基化改性明胶，具有通式(I)或(II)所示化学结构；该交联剂聚乙二醇衍生物为具有巯基反应活性的聚乙二醇衍生物，用于将改性明胶的巯基进行交联；多糖包括透明质酸、壳聚糖、硫酸软骨素、肝素、海藻酸及其衍生物；缓冲盐溶液为pH5.0～8.0磷酸盐缓冲液。本发明所制得的改性明胶基复合海绵，不会造成因交联剂及交联后脱落的残留官能团引起的炎症反应，生物相容性更好。本发明的改性明胶基复合海绵可以快速高效的制得大量改性明胶基复合海绵。本发明还提供一种药物‑改性明胶基复合海绵及其制备方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种复合海绵材料及其制备方法，尤其是涉及一种改性明胶基复合海绵及其制备方法和用途。
背景技术
明胶是胶原经过酸或者碱处理得到的产物，是胶原部分水解得到的一种蛋白，保留了胶原大部分优秀的理化性能。明胶具有优良的凝胶性，持水性，成膜性，乳化性及起泡性等。研究发现，明胶具有一些生物医学特性：它具有促进细胞粘附和生长的性能，与生物组织具有良好的相容性，具有活化巨噬细胞和止血功能等。在医用材料领域，明胶可应用于止血材料，手术创面的修复等。
传统的伤口处理用材料主要是载药或者不载药的脱脂棉、纱布或者绷带，起到控制并阻止微生物感染、清创并减轻疼痛的作用。但是，传统的伤口处理用材料虽然具有一定的吸湿和保护作用，但在愈合过程中容易粘连伤口，造成二次损伤，并且存在透气性能较差，止血能力不足等缺点。针对这个问题，人们开始开发新的止血、手术创面修复材料，比如可吸收性的明胶海绵。明胶海绵能够吸收手术过程中产生的渗液已经渗血，并能加速创面组织的修复。然而，明胶在25℃以上的温度，特别是处于更高温度的人体中是可溶的，这就限制了明胶的应用，因此，必须对明胶进行改性交联。目前，交联的方式有很多，包括用甲醛、戊二醛进行化学交联，或者通过高温热交联。
中国发明专利CN105400214使用一种透明质酸交联的明胶制备止血海绵，首先用强氧化剂高碘酸钠氧化透明质酸中的顺式二醇的碳碳键，使其变为可以与氨基反应的醛基。制备的止血海绵机械性能好，具有良好的止痛作用以及促进受伤组织的愈合。中国发明专利 CN105561375A以多巴胺盐酸盐为交联剂，在强氧化剂过氧化氢或高碘酸钠作用下得到明胶吸液止血海绵，其生物降解好。
但是上述海绵材料在使用中发现具有以下缺陷：1)上述海绵材料在使用时易发生比较严重的炎症反应，主要是由明胶化学改性方法中所使用的化学交联剂及交联后脱落的残留官能团导致；2)上述明胶海绵成分比较单一，只能发挥单一的功效，因此，研究一种新的明胶基复合海绵制备方法，使其避免因交联剂引起的炎症反应以及发挥复合全面的功效是有必要的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一在于，提供一种明胶基复合海绵材料，可有效避免炎症反应。
本发明所要解决的技术问题之二在于，提供一种明胶基复合海绵材料的制备方法。
本发明所要解决的技术问题之三在于，提供一种明胶海绵材料在医药领域中的用途。
为解决上述技术问题之一，本发明提供一种改性明胶基复合海绵，是由改性明胶、多糖、交联剂聚乙二醇衍生物、缓冲盐溶液制备而成；
所述改性明胶为侧链巯基化改性明胶，其化学结构式如通式(I)或(II)所示：
其中，G1为明胶，R1为取代或未取代的C1-C3烃基、取代或未取代的苯基，取代基为甲基、乙基、甲氧羰基或乙氧羰基；R2为取代或未取代的C1-C3烃基，取代基为甲基或乙基；R3为取代或未取代的C1-C3烃基、取代或未取代的苯基，取代基为甲基或乙基；
所述交联剂聚乙二醇衍生物为具有巯基反应活性的聚乙二醇衍生物，用于将改性明胶的巯基进行交联。
本发明是将侧链巯基化改性明胶，与多糖进行混合，并用具有巯基反应活性的聚乙二醇衍生物交联剂将改性明胶的巯基进行交联，多糖嵌插其中。
具体的，所述改性明胶、多糖、交联剂聚乙二醇衍生物的质量百分比为100：1～20：0.1～10，所述缓冲盐溶液的体积用量为改性明胶质量的5～40倍。优选的，所述改性明胶、多糖、交联剂聚乙二醇衍生物的质量百分比为100：2～10：0.2～5，所述缓冲盐溶液的体积用量为改性明胶质量的10～20倍。优选的，所述改性明胶、多糖、交联剂聚乙二醇衍生物的质量百分比为 100：4～8：1～4，所述缓冲盐溶液的体积用量为改性明胶质量的14～18倍。
具体的，所述通式(I)中，R1为-CH2-、-CH2CH2-、-CH(COOCH3)CH2-、-CH(COOC2H5)CH2-或苯基；更优选的，R1为-CH2CH2-。
具体的，所述通式(I)中，R2为-CH2-、-CH2CH2-、-CH＝CH-、-CH2CH2CH2-或-CCH3＝CH-；更优选的，R2为-CH2CH2-。
具体的，所述通式(II)中，R3为-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-或苯基；更优选的， R3为-CH2CH2-。
具体的，改性明胶包括酸法明胶、碱法明胶及其衍生物。
具体的，所述改性明胶，是通过将明胶与含二硫键的二羰基二咪唑活化酯溶解于二甲亚砜等有机酸溶剂中反应；成胶后，提取明胶；将提取的明胶溶胀于水中，加入还原剂使双硫健被还原断开，室温密闭反应，经后处理得化学改性明胶；所述含二硫键的二羰基二咪唑活化酯，其化学结构中包含二硫键和两个羰基咪唑基团。所述含有二硫键的二羰基二咪唑活化酯选自式(a)所示化合物和式(b)所示化合物中的至少一种；
其中，R1为取代或未取代的C1-C3烃基、取代或未取代的苯基，取代基为甲基、乙基、甲氧羰基或乙氧羰基；R2为取代或未取代的C1-C3烃基，取代基为甲基或乙基；
其中，R3为取代或未取代的C1-C3烃基、取代或未取代的苯基，取代基为甲基或乙基。
具体的，所述含有二硫键的二咪唑活化酯包括双丁二酸双酰胱胺氨酸二羰基二咪唑活化酯、双丁二酸双酰胱氨酸二甲酯二羰基二咪唑活化酯、双丁二酸双酰胱氨酸二乙酯二羰基二咪唑活化酯、二硫代二丙酸二羰基二咪唑活化酯、二硫代二丁酸二羰基二咪唑活化酯，二硫代二苯甲酸二羰基二咪唑活化酯等。
具体的，所述交联剂聚乙二醇衍生物包括双臂聚乙二醇衍生物(式1)、三臂聚乙二醇衍生物(式2)、四臂聚乙二醇衍生物(式3)、八臂聚乙二醇衍生物(式4)等，其结构式如下：
其中，G2代表巯基反应活性官能团，包括乙烯砜、马来酰亚胺、α,β不饱和丙烯酸酯、α,β不饱和甲基丙烯酸酯、碘代丙烯酸酯、溴代丙烯酸酯、二硫代吡啶。双臂、三臂、四臂、八臂的聚乙二醇衍生物中的巯基反应活性官能团G2可以是相同的，也可以是不同的，PEG代表分子量在100到1000000的具有CH2CH2O重复单元链段。在反应时，所述交联剂可直接加入或溶解于溶剂(如水、醇)中以溶液形式加入。
具体的，所述多糖包括多糖及其衍生物，具体包括透明质酸(HA)、透明质酸钠、壳聚糖、硫酸软骨素、肝素、海藻酸及其衍生物。
具体的，所述缓冲盐溶液为pH5.0～8.0磷酸盐缓冲液；优选的，磷酸盐缓冲液的pH为 7.0～7.6。
以双臂聚乙二醇二(甲基)丙烯酸酯交联剂和通式(I)所示改性明胶为例，本发明的改性明胶基复合海绵具有如下所示的基本结构：
R＝H或CH3
以双臂聚乙二醇二(甲基)丙烯酸酯交联剂和通式(II)所示改性明胶为例，本发明的改性明胶基复合海绵具有如下所示的基本结构：
R＝H或CH3
其中G为明胶，R1、R2、R3的定义如前述，其它含巯基反应活性官能团的聚乙二醇交联剂(包含三臂、四臂、八臂的聚乙二醇)参与反应所得的交联材料结构与上述结构式相似。
为解决上述技术问题之二，本发明还提供一种改性明胶基复合海绵材料的制备方法，包括以下步骤：
1)将改性明胶与多糖混合，充分搅拌，形成稳定泡沫；
2)向泡沫中加入交联剂聚乙二醇衍生物，继续搅拌，然后将泡沫转移至金属模具中，干燥，得到改性明胶基复合海绵材料；
所述改性明胶为侧链巯基化改性明胶，其化学结构式如通式(I)或(II)所示：
其中，G1为明胶，R1为取代或未取代的C1-C3烃基、取代或未取代的苯基，取代基为甲基、乙基、甲氧羰基或乙氧羰基；R2为取代或未取代的C1-C3烃基，取代基为甲基或乙基；R3为取代或未取代的C1-C3烃基、取代或未取代的苯基，取代基为甲基或乙基；
所述交联剂聚乙二醇衍生物为具有巯基反应活性的聚乙二醇衍生物，用于将改性明胶的巯基进行交联。
具体的，所述交联剂聚乙二醇衍生物包括双臂聚乙二醇衍生物(式1)、三臂聚乙二醇衍生物(式2)、四臂聚乙二醇衍生物(式3)、八臂聚乙二醇衍生物(式4)等，其结构式如下：
其中，G2代表巯基反应活性官能团，包括乙烯砜、马来酰亚胺、α,β不饱和丙烯酸酯、α,β不饱和甲基丙烯酸酯、碘代丙烯酸酯、溴代丙烯酸酯、二硫代吡啶。双臂、三臂、四臂、八臂的聚乙二醇衍生物中的巯基反应活性官能团G2可以是相同的，也可以是不同的，PEG代表分子量在100到1000000的具有CH2CH2O重复单元链段。
具体的，所述多糖包括多糖及其衍生物，具体包括透明质酸(HA)、透明质酸钠、壳聚糖、硫酸软骨素、肝素、海藻酸及其衍生物。
具体的，所述缓冲盐溶液为pH5.0～8.0磷酸盐缓冲液；优选的，pH为7.0～7.6。
具体的，所述步骤1)中充分搅拌，至泡沫体积为原混合液体积5-6倍。优选的，在1600 转/分钟转速下搅拌5分钟。
具体的，所述步骤2)中，继续搅拌约0.5～1min。
具体的，所述方法还包括，将所述步骤2)中转移至金属模具中的泡沫于0～4℃冰箱中冷藏，和/或再使用冻干机进行冻干，以促进其硬化。
具体的，所述方法还包括，将得到的改性明胶基复合海绵材料进行灭菌。灭菌方法可采用本领域常用的不会使对热工序敏感的活性基团失活/降解的任何灭菌方法，包括但不局限于环氧乙烷、γ照射，紫外照射。
在高于明胶凝冻温度之上，使用本发明中具有巯基反应活性的聚乙二醇衍生物交联剂与本发明通式(I)或(II)改性明胶发生交联反应，反应非常迅速，通常以分钟计，约0.5～1 分钟。这样有利于在明胶或混合HA等多糖的明胶在搅拌发泡后尽快的完成交联反应，维持并固定其多孔蓬松的状态，有利于HA等多糖能高效的嵌插于交联材料中。
发泡后的明胶或混合HA等多糖的明胶通过干燥即可获得改性明胶基海绵，巯基是一种活性很强的基团，本发明采用的干燥方式不会影响材料的活性基团以及材料本身，这些干燥方法包括但不局限于冷冻干燥、真空干燥以及风干。一般说来，风干花费时间较长，冷冻干燥和真空干燥速度较快，也可以基本保持海绵原有的多孔结构。
本发明还提供一种改性明胶基海绵材料结合药物活性成分制备药物-改性明胶基复合海绵的方法，包括以下两种方式：a.将本发明的改性明胶基海绵材料浸泡在含有药物的液体中，使药物活性成分吸附于改性明胶基海绵材料中，然后冻干，得到药物-改性明胶基复合海绵；或者
b.在本发明的改性明胶基复合海绵材料的制备方法的步骤1)中，加入药物，然后充分搅拌至形成稳定泡沫，然后将步骤2)得到的改性明胶基海绵冻干，得到药物-改性明胶基复合海绵。
本发明得到的改性明胶基复合海绵材料可以单独使用，也可以结合药物使用，采用的一种方法是浸泡，即将含有药物的液体置于容器(如表面皿)中，海绵部分或全部侵入液体中，使药物活性成分吸附于明胶海绵中，然后再次冻干即得药物-明胶基复合海绵。另外一种方法就是将本发明的改性明胶于磷酸盐缓冲液中溶解后，加入药物，然后搅拌发泡，泡沫稳定后加入巯基反应活性的聚乙二醇衍生物交联剂进行交联，最后冷冻干燥得到药物-明胶基复合海绵。明胶基复合海绵/药物-改性明胶基复合海绵在医药中具有广泛的用途，包括可用作烧伤创面的敷料或者科外手术术后止血消炎。这里所述的药物，为医疗领域所使用的包含药物活性成分的药物制剂，该药物制剂可以溶解或分散于适合的溶剂中。通过浸泡吸附或者机械搅拌的方式，是药物与本发明的改性明胶基复合海绵材料有效结合，从而得到药物-改性明胶基复合海绵。所述药物，主要包括常用的激素药物或其他药物，如曲安奈德、地塞米松、糠酸莫米松等。
本发明提供的海绵材料，其所使用的改性明胶与现有技术中的明胶不同，该改性明胶本身不会产生炎症反应，将该改性明胶与多糖、交联剂聚乙二醇衍生物反应制得的海绵材料也未观察到炎症反应。
本发明提供的海绵材料，采用侧链巯基化改性明胶，与多糖进行混合，并用具有巯基反应活性的聚乙二醇衍生物交联剂将改性明胶的巯基进行交联，侧链交联后所形成的孔穴适合于多糖嵌插其中。多孔的明胶基海绵能够更有利于细胞的三维增值、生长，具有促进细胞粘附、促进细胞生长的性能。而嵌插于海绵材料中的多糖(如HA)具有进一步的促进细胞生长的效果，还通过促进粒细胞的吞噬活性调节炎症反应以及局部降解产生的低分子量的HA 促进血管生成的作用。本发明提供的海绵材料同时具备了多重功效，能够发挥更全面的效果。
本发明所制得的改性明胶基复合海绵或药物-改性明胶基复合海绵，可用于外科手术中伤口覆盖，可用作烧伤创面的敷料，可用于组织缺损的修复，比如关节软骨缺损的修复、肩袖组织(Rotator Cuff)，可用作细胞携带基质进行组织工程修复损伤组织，比如沙漠化的子宫内膜再生，关节软骨再生等等。
本发明所制得的改性明胶基复合海绵，不会造成因交联剂及交联后脱落的残留官能团引起的炎症反应，生物相容性更好。本发明的改性明胶基复合海绵可以快速高效的制得大量改性明胶基复合海绵。
具体实施方式
下面对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1制备经双丁二酸双酰胱氨酸二羰基二咪唑活化酯改性合成的巯基化改性明胶
胱氨二盐酸盐10g溶解于150ml蒸馏水中，磁力搅拌透明溶液。向上述溶液中加入4mol/L 的氢氧化钠调节溶液pH值为9～10。然后加入13.3g丁二酸酐，同时不断加入4mol/L的氢氧化钠使溶液pH值维持在8～10、室温反应2小时后，向溶液中加入6mol/L的盐酸，调节溶液 pH值2～3，过滤收集白色沉淀产物，滤饼用200ml蒸馏水水洗3次。然后置于50℃鼓风干燥箱中干燥，得到白色固体双丁二酸双酰胱氨酸约13.4g。
向250mL烧杯中加入10g双丁二酸双酰胱氨酸、60ml无水N’N-二甲基甲酰胺，室温磁力搅拌溶解后，加入11.2g羰基二咪唑，约2分钟后，溶液中产生大量气体和白色沉淀，继续反应2小时。然后加入200ml乙酸乙酯稀释，过滤收集沉淀产物。滤饼用100ml乙酸乙酯洗涤3次，然后置于30℃鼓风干燥箱中干燥，得到白色固体产物双丁二酸双酰胱胺酸二羰基二咪唑活化酯11.3g。
明胶(B型，来自牛骨，罗赛诺，中国)12g溶解于260ml二甲亚砜中，50℃加热磁力搅拌，得到澄清溶液。3g实施例1制备的双丁二酸双酰胱氨酸二羰基二咪唑活化酯预先用40ml二甲亚砜溶解，然后加至明胶溶液中，约5分钟后，溶液逐渐失去流动性形成凝胶，继续振荡反应2小时。取出并捣碎凝胶，加入500ml无水乙醇，磁力搅拌萃取凝胶中的二甲亚砜。每隔2小时更换无水乙醇，直至凝胶成为白色硬质颗粒。
上述明胶反应物溶解于300ml蒸馏水中，35℃加热磁力搅拌，明胶反应物颗粒吸水膨胀。加入4mol/L的氢氧化钠调节溶液pH值为9～10，然后加入12g二硫苏糖醇，同时不断加入 4mol/L的氢氧化钠使溶液pH值维持在8～10、室温密闭反应过夜。向上述溶液中滴加6mol/L 盐酸，调节pH值3左右。将试液装入透析管袋，用10L 0.001mol/L盐酸和0.3mol/L氯化钠溶液透析前3天，每隔8小时更换透析液，后4天改用10L 0.001mol/L盐酸透析。
收集透析袋内溶液，滤纸过滤后于-86℃冰箱中预冻24小时后，置于冷干燥机中干燥得到最终产物(侧链巯基化改性明胶衍生物)。经检测，该最终产物中氨基的接枝度为105％。
采用上述基本相同的方法，可以制得式(a)和式(b)所示的其他含有二硫键的二羰基二咪唑活化酯，比如双丁二酸双酰胱氨酸二甲酯二羰基二咪唑活化酯、双马来酸双酰胱氨酸二羰基二咪唑活化酯、二硫代二丙酸二羰基二咪唑活化酯、二硫代二丁酸二羰基二咪唑活化酯等等。利用上述含有二硫键的二羰基二咪唑活化酯均可以制得本发明所使用的改性明胶。
实施例2制备改性明胶基复合海绵
向100ml烧杯中加入2.4g经双丁二酸双酰胱氨酸二羰基二咪唑活化酯改性合成的巯基化改性明胶(A型，来自猪皮，罗赛诺，中国)，并用40ml pH＝7.4的磷酸盐缓冲液溶解，溶解后加入0.12g透明质酸继续搅拌使之溶解。使用机械搅拌器搅拌，在1600转/分钟转速下搅拌 5分钟，此时形成体积为原混合液体积5-6倍的稳定泡沫，然后加入2.5ml浓度为2.4％的双臂聚乙二醇丙烯酸酯(2-arm-PEGDA)试液，继续搅拌1分钟，将泡沫转移至金属模具中并将模具放置于30℃烘箱中5分钟，使泡沫完成交联。为了使泡沫继续硬化，将模具转移至4℃冰箱中冷藏2小时，然后用冻干机进行冻干。将冻干后的海绵可利用刀具切割成1cm×1cm ×0.5cm、2.2cm×2.2cm×0.5cm、5cm×5cm×1cm等尺寸的海绵块并置于泡罩盒中塑封然后进行环氧乙烷灭菌即可得到改性明胶基复合海绵。
实施例3制备改性明胶基复合海绵
向100ml烧杯中加入2.4g经双丁二酸双酰胱氨酸二羰基二咪唑活化酯改性合成的巯基化改性明胶(A型，来自猪皮，罗赛诺，中国)，并用40ml pH＝7.4的磷酸盐缓冲液溶解，溶解后加入0.06g透明质酸继续搅拌使之溶解。使用机械搅拌器搅拌，在1600转/分钟转速下搅拌 5分钟，此时形成体积为原混合液体积5-6倍的稳定泡沫，然后加入2.5ml浓度为2.4％的双臂聚乙二醇丙烯酸酯(2-arm-PEGDA)试液，继续搅拌1分钟，将泡沫转移至金属模具中并将模具放置于30℃烘箱中5分钟，使泡沫完成交联。为了使泡沫继续硬化，将模具转移至4℃冰箱中冷藏2小时，然后用冻干机进行冻干。将冻干后的海绵可利用刀具切割成1cm×1cm ×0.5cm、2.2cm×2.2cm×0.5cm、5cm×5cm×1cm等尺寸的海绵块并置于泡罩盒中塑封然后进行环氧乙烷灭菌即可得到改性明胶基复合海绵。
实施例4制备改性明胶基复合海绵
向100ml烧杯中加入2.4g经双丁二酸双酰胱氨酸二羰基二咪唑活化酯改性合成的巯基化改性明胶(A型，来自猪皮，罗赛诺，中国)，并用40ml pH＝7.4的磷酸盐缓冲液溶解，溶解后加入0.24g透明质酸继续搅拌使之溶解。使用机械搅拌器搅拌，在1600转/分钟转速下搅拌 5分钟，此时形成体积为原混合液体积5-6倍的稳定泡沫，然后加入2.5ml浓度为2.4％的双臂聚乙二醇丙烯酸酯(2-arm-PEGDA)试液，继续搅拌1分钟，将泡沫转移至金属模具中并将模具放置于30℃烘箱中5分钟，使泡沫完成交联。为了使泡沫继续硬化，将模具转移至4℃冰箱中冷藏2小时，然后用冻干机进行冻干。将冻干后的海绵可利用刀具切割成1cm×1cm ×0.5cm、2.2cm×2.2cm×0.5cm、5cm×5cm×1cm等尺寸的海绵块并置于泡罩盒中塑封然后进行环氧乙烷灭菌即可得到改性明胶基复合海绵。
实施例5制备改性明胶基复合海绵
向100ml烧杯中加入2.4g经双丁二酸双酰胱氨酸二羰基二咪唑活化酯改性合成的巯基化改性明胶(A型，来自猪皮，罗赛诺，中国)，并用40ml pH＝7.4的磷酸盐缓冲液溶解，溶解后加入0.12g透明质酸继续搅拌使之溶解。使用机械搅拌器搅拌，在1600转/分钟转速下搅拌5分钟，此时形成体积为原混合液体积5-6倍的稳定泡沫，然后加入2.5ml浓度为4.8％的双臂聚乙二醇丙烯酸酯(2-arm-PEGDA)试液，继续搅拌1分钟，将泡沫转移至金属模具中并将模具放置于30℃烘箱中5分钟，使泡沫完成交联。为了使泡沫继续硬化，将模具转移至4℃冰箱中冷藏2小时，然后用冻干机进行冻干。将冻干后的海绵可利用刀具切割成1cm×1cm ×0.5cm、2.2cm×2.2cm×0.5cm、5cm×5cm×1cm等尺寸的海绵块并置于泡罩盒中塑封然后进行环氧乙烷灭菌即可得到改性明胶基复合海绵。
实施例6制备改性明胶基复合海绵
向100ml烧杯中加入2.4g经双丁二酸双酰胱氨酸二羰基二咪唑活化酯改性合成的巯基化改性明胶(B型，来自牛骨，罗赛诺，中国)，并用40ml pH＝7.4的磷酸盐缓冲液溶解，溶解后加入0.12g透明质酸继续搅拌使之溶解。使用机械搅拌器搅拌，在1600转/分钟转速下搅拌 5分钟，此时形成体积为原混合液体积4-5倍的稳定泡沫，然后加入2.5ml浓度为2.4％的双臂聚乙二醇丙烯酸酯(2-arm-PEGDA)试液，继续搅拌1分钟，将泡沫转移至金属模具中并将模具放置于30℃烘箱中5分钟，使泡沫完成交联。为了使泡沫继续硬化，将模具转移至4℃冰箱中冷藏2小时，然后用冻干机进行冻干。将冻干后的海绵可利用刀具切割成1cm×1cm ×0.5cm、2.2cm×2.2cm×0.5cm、5cm×5cm×1cm等尺寸的海绵块并置于泡罩盒中塑封然后进行环氧乙烷灭菌即可得到改性明胶基复合海绵。
实施例7制备改性明胶基复合海绵
向100ml烧杯中加入2.4g经双丁二酸双酰胱氨酸二羰基二咪唑活化酯改性合成的巯基化改性明胶(A型，来自猪皮，罗赛诺，中国)，并用40ml pH＝7.4的磷酸盐缓冲液溶解，溶解后加入0.12g硫酸软骨素继续搅拌使之溶解。使用机械搅拌器搅拌，在1600转/分钟转速下搅拌5分钟，此时形成体积为原混合液体积5-6倍的稳定泡沫，然后加入2.5ml浓度为2.4％的双臂聚乙二醇丙烯酸酯(2-arm-PEGDA)试液，继续搅拌1分钟，将泡沫转移至金属模具中并将模具放置于30℃烘箱中5分钟，使泡沫完成交联。为了使泡沫继续硬化，将模具转移至4℃冰箱中冷藏2小时，然后用冻干机进行冻干。将冻干后的海绵可利用刀具切割成1cm×1cm ×0.5cm、2.2cm×2.2cm×0.5cm、5cm×5cm×1cm等尺寸的海绵块并置于泡罩盒中塑封然后进行环氧乙烷灭菌即可得到改性明胶基复合海绵。
实施例8制备改性明胶基复合海绵
向100ml烧杯中加入2.4g经二硫代二丁酸二羰基二咪唑活化酯改性合成的巯基化改性明胶(A型，来自猪皮，罗赛诺，中国)，并用40ml pH＝7.4的磷酸盐缓冲液溶解，溶解后加入 0.12g透明质酸继续搅拌使之溶解。使用机械搅拌器搅拌，在1600转/分钟转速下搅拌5分钟，此时形成体积为原混合液体积5-6倍的稳定泡沫，然后加入2.5ml浓度为2.4％的双臂聚乙二醇丙烯酸酯(2-arm-PEGDA)试液，继续搅拌1分钟，将泡沫转移至金属模具中并将模具放置于30℃烘箱中5分钟，使泡沫完成交联。为了使泡沫继续硬化，将模具转移至4℃冰箱中冷藏2小时，然后用冻干机进行冻干。将冻干后的海绵可利用刀具切割成1cm×1cm×0.5cm、 2.2cm×2.2cm×0.5cm、5cm×5cm×1cm等尺寸的海绵块并置于泡罩盒中塑封然后进行环氧乙烷灭菌即可得到改性明胶基复合海绵。
实施例9制备改性明胶基复合海绵
向100ml烧杯中加入2.4g经双丁二酸双酰胱氨酸二羰基二咪唑活化酯改性合成的巯基化改性明胶(A型，来自猪皮，罗赛诺，中国)，并用40ml pH＝7.4的磷酸盐缓冲液溶解，溶解后加入0.12g透明质酸继续搅拌使之溶解。使用机械搅拌器搅拌，在1600转/分钟转速下搅拌 5分钟，此时形成体积为原混合液体积5-6倍的稳定泡沫，然后加入2.5ml浓度为2.4％的八臂聚乙二醇乙烯基砜(8-arm-PEGVS)试液，继续搅拌1分钟，将泡沫转移至金属模具中并将模具放置于30℃烘箱中5分钟，使泡沫完成交联。为了使泡沫继续硬化，将模具转移至4℃冰箱中冷藏2小时，然后用冻干机进行冻干。将冻干后的海绵可利用刀具切割成1cm×1cm× 0.5cm、2.2cm×2.2cm×0.5cm、5cm×5cm×1cm等尺寸的海绵块并置于泡罩盒中塑封然后进行环氧乙烷灭菌即可得到改性明胶基复合海绵。
实施例10共混法制备曲安奈德-改性明胶基复合海绵
向100ml烧杯中加入2.4g经双丁二酸双酰胱氨酸二羰基二咪唑活化酯改性合成的巯基化改性明胶(A型，来自猪皮，罗赛诺，中国)，并用40ml pH＝7.4的磷酸盐缓冲液溶解，溶解后加入0.12g透明质酸继续搅拌使之溶解，继续加入0.4g曲安奈德并搅拌均匀，使用机械搅拌器搅拌，在1600转/分钟转速下搅拌5分钟，此时形成体积为原混合液体积5-6倍的稳定泡沫，然后加入2.5ml浓度为2.4％的双臂聚乙二醇丙烯酸酯(2-arm-PEGDA)试液，继续搅拌 1分钟，将泡沫转移至金属模具中并将模具放置于30℃烘箱中5分钟，使泡沫完成交联。为了使泡沫继续硬化，将模具转移至4℃冰箱中冷藏2小时，然后用冻干机进行冻干。将冻干后的海绵可利用刀具切割成1cm×1cm×0.5cm、2.2cm×2.2cm×0.5cm、5cm×5cm×1cm等尺寸的海绵块并置于泡罩盒中塑封然后进行环氧乙烷灭菌即可得到改性明胶基复合海绵。
实施例11共混法制备地塞米松-改性明胶基复合海绵
向100ml烧杯中加入2.4g经双丁二酸双酰胱氨酸二羰基二咪唑活化酯改性合成的巯基化改性明胶(A型，来自猪皮，罗赛诺，中国)，并用40ml pH＝7.4的磷酸盐缓冲液溶解，溶解后加入0.12g透明质酸继续搅拌使之溶解，继续加入0.4g地塞米松并搅拌均匀，使用机械搅拌器搅拌，在1600转/分钟转速下搅拌5分钟，此时形成体积为原混合液体积5-6倍的稳定泡沫，然后加入2.5ml浓度为2.4％的双臂聚乙二醇丙烯酸酯(2-arm-PEGDA)试液，继续搅拌 1分钟，将泡沫转移至金属模具中并将模具放置于30℃烘箱中5分钟，使泡沫完成交联。为了使泡沫继续硬化，将模具转移至4℃冰箱中冷藏2小时，然后用冻干机进行冻干。将冻干后的海绵可利用刀具切割成1cm×1cm×0.5cm、2.2cm×2.2cm×0.5cm、5cm×5cm×1cm等尺寸的海绵块并置于泡罩盒中塑封然后进行环氧乙烷灭菌即可得到改性明胶基复合海绵。
实施例12共混法制备地塞米松-改性明胶基复合海绵
向100ml烧杯中加入2.4g经双丁二酸双酰胱氨酸二羰基二咪唑活化酯改性合成的巯基化改性明胶(A型，来自猪皮，罗赛诺，中国)，并用40ml pH＝7.4的磷酸盐缓冲液溶解，溶解后加入0.12g透明质酸继续搅拌使之溶解，继续加入0.4g地塞米松并搅拌均匀，使用机械搅拌器搅拌，在1600转/分钟转速下搅拌5分钟，此时形成体积为原混合液体积5-6倍的稳定泡沫，然后加入2.5ml浓度为2.4％的三臂聚乙二醇丙烯酸酯(3-arm-PEGDA)试液，继续搅拌 1分钟，将泡沫转移至金属模具中并将模具放置于30℃烘箱中5分钟，使泡沫完成交联。为了使泡沫继续硬化，将模具转移至4℃冰箱中冷藏2小时，然后用冻干机进行冻干。将冻干后的海绵可利用刀具切割成1cm×1cm×0.5cm、2.2cm×2.2cm×0.5cm、5cm×5cm×1cm等尺寸的海绵块并置于泡罩盒中塑封然后进行环氧乙烷灭菌即可得到改性明胶基复合海绵。
实施例13共混法制备地塞米松-改性明胶基复合海绵
向100ml烧杯中加入2.4g经双丁二酸双酰胱氨酸二羰基二咪唑活化酯改性合成的巯基化改性明胶(A型，来自猪皮，罗赛诺，中国)，并用40ml pH＝7.4的磷酸盐缓冲液溶解，溶解后加入0.12g透明质酸继续搅拌使之溶解，继续加入0.4g地塞米松并搅拌均匀，使用机械搅拌器搅拌，在1600转/分钟转速下搅拌5分钟，此时形成体积为原混合液体积5-6倍的稳定泡沫，然后加入2.5ml浓度为2.4％的四臂聚乙二醇丙烯酸酯(4-arm-PEGDA)试液，继续搅拌 1分钟，将泡沫转移至金属模具中并将模具放置于30℃烘箱中5分钟，使泡沫完成交联。为了使泡沫继续硬化，将模具转移至4℃冰箱中冷藏2小时，然后用冻干机进行冻干。将冻干后的海绵用刀具切割成1cm×1cm×0.5cm、2.2cm×2.2cm×0.5cm、5cm×5cm×1cm等尺寸的海绵块并置于泡罩盒中塑封然后进行环氧乙烷灭菌即可得到改性明胶基复合海绵。
实施例14共混法制备地塞米松-改性明胶基复合海绵
向100ml烧杯中加入2.4g经双丁二酸双酰胱氨酸二羰基二咪唑活化酯改性合成的巯基化改性明胶(A型，来自猪皮，罗赛诺，中国)，并用40ml pH＝7.4的磷酸盐缓冲液溶解，溶解后加入0.12g透明质酸继续搅拌使之溶解，继续加入0.4g地塞米松并搅拌均匀，使用机械搅拌器搅拌，在1600转/分钟转速下搅拌5分钟，此时形成体积为原混合液体积5-6倍的稳定泡沫，然后加入2.5ml浓度为2.4％的八臂聚乙二醇丙烯酸酯(8-arm-PEGDA)试液，继续搅拌 1分钟，将泡沫转移至金属模具中并将模具放置于30℃烘箱中5分钟，使泡沫完成交联。为了使泡沫继续硬化，将模具转移至4℃冰箱中冷藏2小时，然后用冻干机进行冻干。将冻干后的海绵用刀具切割成1cm×1cm×0.5cm、2.2cm×2.2cm×0.5cm、5cm×5cm×1cm等尺寸的海绵块并置于泡罩盒中塑封然后进行环氧乙烷灭菌即可得到改性明胶基复合海绵。
实施例15吸附法制备曲安奈德-改性明胶基复合海绵
向100ml烧杯中加入2.4g经双丁二酸双酰胱氨酸二羰基二咪唑活化酯改性合成的巯基化改性明胶(A型，来自猪皮，罗赛诺，中国)，并用40ml pH＝7.4的磷酸盐缓冲液溶解，溶解后加入0.12g透明质酸继续搅拌使之溶解。使用机械搅拌器搅拌，在1600转/分钟转速下搅拌 5分钟，此时形成体积为原混合液体积5-6倍的稳定泡沫，然后加入2.5ml浓度为2.4％的双臂聚乙二醇丙烯酸酯(2-arm-PEGDA)试液，继续搅拌1分钟，将泡沫转移至金属模具中并将模具放置于30℃烘箱中5分钟，使泡沫完成交联。为了使泡沫继续硬化，将模具转移至4℃冰箱中冷藏2小时，然后用冻干机进行冻干。将冻干后的海绵用刀具切割成1cm×1cm× 0.5cm、2.2cm×2.2cm×0.5cm、5cm×5cm×1cm等尺寸的海绵块。
将1ml浓度为10mg/ml的曲安奈德悬浊液置于表面皿中，取一片尺寸为2.2cm×2.2cm× 0.5cm的海绵，让海绵的一个表面触及曲安奈德悬浊液并完全吸附。然后将海绵置于40℃烘箱中干燥12小时，干燥后的含有曲安奈德悬的复合明胶基海绵置于泡罩盒中塑封然后进行环氧乙烷灭菌即可得到曲安奈德悬-改性明胶基复合海绵。
实施例16吸附法制备曲安奈德-改性明胶基复合海绵
向100ml烧杯中加入2.4g经双丁二酸双酰胱氨酸二羰基二咪唑活化酯改性合成的巯基化改性明胶(A型，来自猪皮，罗赛诺，中国)，并用40ml pH＝7.4的磷酸盐缓冲液溶解，溶解后加入0.12g透明质酸继续搅拌使之溶解。使用机械搅拌器搅拌，在1600转/分钟转速下搅拌 5分钟，此时形成体积为原混合液体积5-6倍的稳定泡沫，然后加入2.5ml浓度为2.4％的双臂聚乙二醇丙烯酸酯(2-arm-PEGDA)试液，继续搅拌1分钟，将泡沫转移至金属模具中并将模具放置于30℃烘箱中5分钟，使泡沫完成交联。为了使泡沫继续硬化，将模具转移至4℃冰箱中冷藏2小时，然后用冻干机进行冻干。将冻干后的海绵用刀具切割成1cm×1cm× 0.5cm、2.2cm×2.2cm×0.5cm、5cm×5cm×1cm等尺寸的海绵块。
将20ml浓度为10mg/ml的曲安奈德悬浊液置于表面皿中，取一片尺寸为2.2cm×2.2cm ×0.5cm的海绵，让海绵全部侵入曲安奈德悬浊液并完全吸附。然后将海绵置于40℃烘箱中干燥12小时，干燥后的含有曲安奈德悬的复合明胶基海绵置于泡罩盒中塑封然后进行环氧乙烷灭菌即可得到曲安奈德悬-改性明胶基复合海绵。
实施例17炎症反应实验
实验组是将实施例2-9中制备的改性明胶基复合海绵剪裁成0.8cm×0.8cm×0.2cm的薄片或更小，置于24孔超低吸附培养板中，然后每孔加入1ml细胞培养液和2x105个小鼠单核细胞系RAW264.7。37℃、5％二氧化碳细胞培养箱中培养24小时，取培养液用ELISA方法检测炎症因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)。对照组1未使用改性明胶基复合海绵并按相同的方法直接培养细胞；对照组2是使用背景技术中介绍的透明质酸交联的明胶制备止血海绵，对照组3是使用背景技术中介绍的多巴胺盐酸盐交联的明胶制备止血海绵，采用相同的步骤培养细胞。经过检测发现，实验组和对照组1无明显区别，说明明胶基海绵不会引起明显的炎症反应。对照组2、3与实验组和对照组1相比，炎症因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)有明显上升，说明对照组2、3引起了明显的炎症反应。
实施例18明胶基海绵三维细胞培养
实验组是将实施例2-9中制备改性明胶基复合海绵剪裁成0.8cm×0.8cm×0.2cm的薄片或更小，置于24孔超低吸附培养板中，然后每孔加入1ml细胞培养液和2x105个成纤维细胞。 37℃、5％二氧化碳细胞培养箱中培养24小时，将海绵块取出，用2.5ml浓度为0.08％Ⅰ型胶原蛋白酶和浓度为300单位透明质酸酶的混合液进行消化，待海绵完全酶解后，进行细胞计数。对照组1未使用改性明胶基复合海绵按相同步骤培养细胞；对照组2是使用背景技术中介绍的透明质酸交联的明胶制备止血海绵并按相同的步骤培养细胞。细胞计数结果显示，实验组细胞数量为1x106，对照组1细胞数量为1x105，对照组2细胞数量为5x105。实验组好于对照组，说明本发明的改性明胶基复合海绵能够有利于细胞的三维增值、生长，可促进伤口愈合。
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。
Claims (29)
1.一种改性明胶基复合海绵，其特征在于，是由改性明胶、多糖、交联剂聚乙二醇衍生物、缓冲盐溶液制备而成；
所述改性明胶为侧链巯基化改性明胶，其化学结构式如通式(I)或(II)所示：
其中，G1为明胶，R1为取代或未取代的C1-C3烃基、取代或未取代的苯基，取代基为甲基、乙基、甲氧羰基或乙氧羰基；R2为取代或未取代的C1-C3烃基，取代基为甲基或乙基；R3为取代或未取代的C1-C3烃基、取代或未取代的苯基，取代基为甲基或乙基；
所述交联剂聚乙二醇衍生物为具有巯基反应活性的聚乙二醇衍生物，与所述改性明胶的巯基进行交联。
2.如权利要求1所述改性明胶基复合海绵，其特征在于，所述通式(I)中，R1为-CH2-、-CH2CH2-、-CH(COOCH3)CH2-、-CH(COOC2H5)CH2-或苯基。
3.如权利要求2所述改性明胶基复合海绵，其特征在于，R1为-CH2CH2-。
4.如权利要求1所述改性明胶基复合海绵，其特征在于，所述通式(I)中，R2为-CH2-、-CH2CH2-、-CH＝CH-、-CH2CH2CH2-或-CCH3＝CH-。
5.如权利要求4所述改性明胶基复合海绵，其特征在于，R2为-CH2CH2-。
6.如权利要求1所述改性明胶基复合海绵，其特征在于，所述通式(II)中，R3为-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-或苯基。
7.如权利要求6所述改性明胶基复合海绵，其特征在于，R3为-CH2CH2-。
8.如权利要求1所述改性明胶基复合海绵，其特征在于，所述改性明胶包括酸法明胶、碱法明胶及其衍生物。
9.如权利要求1所述改性明胶基复合海绵，其特征在于，所述交联剂聚乙二醇衍生物包括式1所示的双臂聚乙二醇衍生物、式2所示的三臂聚乙二醇衍生物、式3所示的四臂聚乙二醇衍生物、式4所示的八臂聚乙二醇衍生物，其结构式如下：
其中，G2为巯基反应活性官能团，包括乙烯砜、马来酰亚胺、α,β不饱和丙烯酸酯、α,β不饱和甲基丙烯酸酯、碘代丙烯酸酯、溴代丙烯酸酯、二硫代吡啶；所述交联剂聚乙二醇衍生物分子中的多个G2可以是相同的，也可以是不同的；PEG为分子量在100到1000000的具有CH2CH2O重复单元的链段。
10.如权利要求1所述改性明胶基复合海绵，其特征在于，所述多糖选自透明质酸、壳聚糖、硫酸软骨素、肝素、海藻酸及其衍生物。
11.如权利要求1所述改性明胶基复合海绵，其特征在于，所述缓冲盐溶液为pH5.0～8.0磷酸盐缓冲液。
12.如权利要求11所述改性明胶基复合海绵，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液pH为7.0～7.6。
13.一种改性明胶基复合海绵材料的制备方法，包括以下步骤：
1)将改性明胶与多糖混合，充分搅拌，形成稳定泡沫；
2)向泡沫中加入交联剂聚乙二醇衍生物，继续搅拌，然后将泡沫转移至金属模具中，干燥，得到改性明胶基复合海绵材料；
所述改性明胶为侧链巯基化改性明胶，其化学结构式如通式(I)或(II)所示：
其中，G1为明胶，R1为取代或未取代的C1-C3烃基、取代或未取代的苯基，取代基为甲基、乙基、甲氧羰基或乙氧羰基；R2为取代或未取代的C1-C3烃基，取代基为甲基或乙基；R3为取代或未取代的C1-C3烃基、取代或未取代的苯基，取代基为甲基或乙基；
所述交联剂聚乙二醇衍生物为具有巯基反应活性的聚乙二醇衍生物，用于将改性明胶的巯基进行交联。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述交联剂聚乙二醇衍生物包括式1所示的双臂聚乙二醇衍生物、式2所示的三臂聚乙二醇衍生物、式3所示的四臂聚乙二醇衍生物、式4所示的八臂聚乙二醇衍生物，其结构式如下：
其中，G2为巯基反应活性官能团，包括乙烯砜、马来酰亚胺、α,β不饱和丙烯酸酯、α,β不饱和甲基丙烯酸酯、碘代丙烯酸酯、溴代丙烯酸酯、二硫代吡啶；交联剂聚乙二醇衍生物分子中的多个G2可以是相同的，也可以是不同的；PEG为分子量在100到1000000的具有CH2CH2O重复单元的链段。
15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述多糖选自透明质酸、壳聚糖、硫酸软骨素、肝素、海藻酸及其衍生物。
16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述缓冲盐溶液为pH5.0～8.0磷酸盐缓冲液。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液pH为7.0～7.6。
18.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中充分搅拌，至泡沫体积为原混合液体积5-6倍。
19.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，继续搅拌约0.5～1min。
20.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法还包括，将所述步骤2)中转移至金属模具中的泡沫于0～4℃冰箱中冷藏，和/或再使用冻干机进行冻干，以促进其硬化。
21.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法还包括，将得到的改性明胶基复合海绵材料进行灭菌。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，灭菌方式为环氧乙烷、γ照射或紫外照射。
23.如权利要求13所述的方法，其特征在于，干燥方式为冷冻干燥、真空烘箱或风干。
24.如权利要求1-12任一项所述的改性明胶基海绵材料制备医疗用品的应用。
25.如权利要求24所述的应用，其特征在于，所述应用包括用于制成外科手术中伤口覆盖的止血棉、用作烧伤创面的敷料、可用于组织缺损的修复、用作细胞携带基质进行组织工程修复损伤组织。
26.一种改性明胶基海绵结合药物活性成分制备药物-改性明胶基复合海绵的方法，其特征在于，将权利要求1所述的改性明胶基海绵材料浸泡在含有药物的液体中，使药物活性成分吸附于改性明胶基海绵材料中，然后冻干，得到药物-改性明胶基复合海绵；
或者在权利要求13所述的方法的步骤1)中，加入药物，然后充分搅拌至形成稳定泡沫，然后将步骤2)得到的改性明胶基海绵冻干，得到药物-改性明胶基复合海绵。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述药物包括曲安奈德、地塞米松、糠酸莫米松。
28.一种由权利要求26或27所述的方法制得的药物-改性明胶基复合海绵。
29.如权利要求28所述的药物-改性明胶基复合海绵制备医疗用品的应用。
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