CN107881162A - 一种工业化生产凝乳酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种工业化生产凝乳酶的方法，步骤是：用原始菌株作传代菌株制备；活化液培养；种子培养；发酵种子培养；发酵培养；发酵结束，检测参数，放料离心处理，得到湿菌体；湿菌体溶解，再清洗，然后离心收集；菌体悬浮液破碎，离心收集包涵体；包涵体经过复性，得到粗制凝乳酶液；粗制凝乳酶液经过膜过滤、加水洗脱，微滤除杂、超滤浓缩、除菌过滤得到无菌液态产品。本发明的工业化生产凝乳酶的方法，1、发酵工艺简单，高密度发酵产量大，成本低；2、细胞破碎工艺减少了固体菌渣带来的环境污染问题；3、膜处理技术效率高，成本低，易操作，减少了传统物理化学工艺带来的产品二次污染问题；4、除菌工艺对产品的保存有极大的作用。
Description
技术领域
本发明涉及食品深加工技术领域，具体地说涉及一种工业化生产凝乳酶的方法。
背景技术
凝乳酶chymosin一般也称为rennin,是一种蛋白酶，目前来源有小牛皱胃酶、植物提取物、微生物来源。
凝乳酶是干酪制作过程中首要催化剂，起到不可或缺的作用，传统工艺中选择动物来源的小牛皱胃酶，但是该来源的酶供不应求，价格昂贵，产量有限，随着生物技术的发展，不少研究者从产凝乳酶菌株中获得凝乳酶，通过微生物的高密度发酵制得凝乳酶，来取代小牛皱胃酶，成为该产业中凝乳酶的供应者。
总体来说，动物来源的凝乳酶生长比较慢，来源有限；植物来源的凝乳酶有较高的蛋白水解活性和本身有毒，所以未出现大规模的商业化应用；微生物来源的凝乳酶来源广泛，目前有几十种微生物可用来发酵生产凝乳酶，主要涉及放线菌，细菌和真菌等等；微生物发酵成本低廉，安全无毒，产量大等优点被广泛使用。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术的缺陷，提供一种工业化生产凝乳酶的方法，利用细菌-大肠杆菌发酵生产凝乳酶，具有周期短，成本低，易纯化，酶活力高，产业化简单等优势。凝乳酶易纯化，产量大，易规模化生产，可以取代动物来源的凝乳酶，成本低，符合食品酶制剂要求
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
一种工业化生产凝乳酶的方法，该方法的步骤是：
S1、以来源于大肠杆菌K-12的发酵菌株为原始菌株；
S2、传代菌株制备：将原始菌株划线在固体平板上，28-30℃恒温培养箱用固定平板培养基培养24-30小时；
S3、活化液培养：从平板内挑选单菌落分别接入准备好的三角瓶中，用活化培养基培养，28-30℃、180rpm摇床，16-24小时；
S4、种子培养：从活化液中挑选长势较好的菌落转接到大瓶培养，扩大种量，接种量按照1％-2％接种,用种子培养基培养，28-30℃、180rpm摇床培养，活化转接要求OD值为2-5，培养时间8-12h；
S4、发酵种子培养，用饱和蒸汽对发酵种子培养基进行灭菌消毒，降温到35-38℃，接种量按照1％-2％接种，开启搅拌220rpm，调节通气量1:1VVM，氢氧化钠调节PH值控制在6.7-7.5，培养时间8-12h，控制OD值在2-5转接；
S5、发酵培养：按照接种量1％-1.5％接入发酵培养基中，在36-37℃，开启搅拌,通气量按照溶氧条件调节，培养18-24小时；
S6、发酵结束，检测菌体含量、湿重、OD值，放料离心处理，收集得到湿菌体，并计重；
S7、湿菌体MEDT溶解，再用EDTA缓冲液清洗菌体，然后离心收集菌体，计重后用EDTA溶解成悬浮液；
S8、菌体悬浮液在800-1000Bar高压均质机破碎2次以上，检测OD值在50-65左右时，再次离心收集包涵体；
S9、包涵体经过复性，得到粗制凝乳酶液；
S10、粗制凝乳酶液经过膜过滤、加水洗脱，微滤除杂、超滤浓缩、除菌过滤得到无菌液态产品；
S11、根据客户需求用无菌水配制要求的酶活。
作为对上述技术方案的改进，所述发酵培养的具体步骤为：
S5.1、配置发酵培养基，用饱和蒸汽120-122℃灭菌，然后降温到37℃备用；
S5.2、按照接种量1％-1.5％将凝乳酶种子移种发酵培养基中，在36-37℃下开启搅拌，起始通气量500(1:1vvm)M3/h,利用氢氧化钠和盐酸控制PH值在6.7-7.5左右，罐压0.02-0.05Mpa,培养时间4-5h；
S5.3、培养期间检测OD、湿重、氨基氮、甘油含量指标，当OD超过12、湿重超过20g/L时，开始流加二次补料培养基，二次补料培养基与发酵培养基的质量比为10：100；
S5.4、在培养5h-6h时，随二次补料培养基同时流加乳糖补料，流加量为50kg/h，乳糖与与发酵培养基的质量比为10：100；
S5.5、当湿重指标50以上时，一次性加入诱导剂IPTG，开始诱导产酶，诱导剂与发酵液的体积为0.3：1000；
S5.6、当湿重不在增长时中止发酵；
作为对上述技术方案的改进，所述固体平板培养基组成为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉、1％氯化钠、1.5％琼脂、0.1‰氨苄青霉素，其余为水。
作为对上述技术方案的改进，所述活化培养基的组成为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉、1％氯化钠、0.1‰氨苄青霉素，其余为水。
作为对上述技术方案的改进，所述种子培养基的组成为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉、1％氯化钠、0.3‰消泡剂、0.1‰氨苄青霉素，其余为水。
作为对上述技术方案的改进，所述发酵种子培养基的组成为：0.5％酵母粉、1％蛋白胨、1％氯化钠、0.1‰氨苄青霉素，其余为水。
作为对上述技术方案的改进，所述发酵培养基组成为：3.08％酵母粉、1.54％蛋白胨、2.35‰氯化铵、1％氯化钠、0.3‰消泡剂、0.1‰氨苄青霉素，0.165‰盐酸硫铵、0.157‰微量元素、4％甘油，其余为水。
作为对上述技术方案的改进，所述二次补料培养基组成为：10％蛋白胨、20％酵母粉、1.2％氯化铵、10％葡萄糖、0.1％微量元素、其余为水。
作为对上述技术方案的改进，所述微量元素由硼酸、氯化镁、钼酸钠、氯化锰、氯化铝、硫酸、氯化铁、氯化钴、氯化钙、氯化锌、VB、氯化铜、亚硒酸钠和生活饮用水配制而成，硼酸、氯化镁、钼酸钠、氯化锰、氯化铝、硫酸、氯化铁、氯化钴、氯化钙、氯化锌、VB、氯化铜、亚硒酸钠和生活饮用水的质量比为：74.4：2800：2：160：2：5000：640：10：240：5.4：4：1.4：1.4：1000。
与现有技术相比，本发明具有的优点和积极效果是：
本发明的工业化生产凝乳酶的方法，1、发酵工艺简单，高密度发酵产量大，成本低；2、细胞破碎工艺减少了固体菌渣带来的环境污染问题；3、膜处理技术效率高，成本低，易操作，减少了传统物理化学工艺带来的产品二次污染问题；4、除菌工艺对产品的保存有极大的作用。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本发明的工业化生产凝乳酶的方法，步骤是：
S1、以来源于大肠杆菌K-12的发酵菌株为原始菌株；
S2、传代菌株制备：将原始菌株划线在固体平板上，28-30℃恒温培养箱用固定平板培养基培养24-30小时；
S3、活化液培养：从平板内挑选单菌落分别接入准备好的三角瓶中，用活化培养基培养，28-30℃、180rpm摇床，16-24小时；
S4、种子培养：从活化液中挑选长势较好的菌落转接到大瓶培养，扩大种量，接种量按照1％-2％接种,用种子培养基培养，28-30℃、180rpm摇床培养，活化转接要求OD值为2-5，培养时间8-12h；
S4、发酵种子培养，用饱和蒸汽对发酵种子培养基进行灭菌消毒，降温到35-38℃，接种量按照1％-2％接种，开启搅拌220rpm，调节通气量1:1VVM，氢氧化钠调节PH值控制在6.7-7.5，培养时间8-12h，控制OD值在2-5转接；
S5、发酵培养：按照接种量1％-1.5％接入发酵培养基中，在36-37℃，开启搅拌,通气量按照溶氧条件调节，培养18-24小时；
S6、发酵结束，检测菌体含量、湿重、OD值，放料离心处理，收集得到湿菌体，并计重；
S7、湿菌体MEDT溶解，再用EDTA缓冲液清洗菌体，然后离心收集菌体，计重后用EDTA溶解成悬浮液；
S8、菌体悬浮液在800-1000Bar高压均质机破碎2次以上，检测OD值在50-65左右时，再次离心收集包涵体；
S9、包涵体经过复性，得到粗制凝乳酶液；
S10、粗制凝乳酶液经过膜过滤、加水洗脱，微滤除杂、超滤浓缩、除菌过滤得到无菌液态产品；
S11、根据客户需求用无菌水配制要求的酶活。
作为对上述技术方案的改进，所述发酵培养的具体步骤为：
S5.1、配置发酵培养基，用饱和蒸汽120-122℃灭菌，然后降温到37℃备用；
S5.2、按照接种量1％-1.5％将凝乳酶种子移种发酵培养基中，在36-37℃下开启搅拌，起始通气量500(1:1vvm)M3/h,利用氢氧化钠和盐酸控制PH值在6.7-7.5左右，罐压0.02-0.05Mpa,培养时间4-5h；
S5.3、培养期间检测OD、湿重、氨基氮、甘油含量指标，当OD超过12、湿重超过20g/L时，开始流加二次补料培养基，二次补料培养基与发酵培养基的质量比为10：100；
S5.4、在培养5h-6h时，随二次补料培养基同时流加乳糖补料，流加量为50kg/h，乳糖与与发酵培养基的质量比为10：100；
S5.5、当湿重指标50以上时，一次性加入诱导剂IPTG，开始诱导产酶，诱导剂与发酵液的体积为0.3：1000；
S5.6、当湿重不在增长时中止发酵；
作为对上述技术方案的改进，所述固体平板培养基组成为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉、1％氯化钠、1.5％琼脂、0.1‰氨苄青霉素，其余为水。
作为对上述技术方案的改进，所述活化培养基的组成为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉、1％氯化钠、0.1‰氨苄青霉素，其余为水。
作为对上述技术方案的改进，所述种子培养基的组成为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉、1％氯化钠、0.1‰氨苄青霉素，其余为水。
作为对上述技术方案的改进，所述发酵种子培养基的组成为：0.5％酵母粉、1％蛋白胨、1％氯化钠、0.1‰氨苄青霉素，其余为水。
作为对上述技术方案的改进，所述发酵培养基组成为：0.5％酵母粉、1％蛋白胨、1％氯化钠、0.3‰消泡剂、0.1‰氨苄青霉素，0.15‰微量元素、4％甘油，其余为水。作为对上述技术方案的改进，所述微量元素由硼酸、氯化镁、钼酸钠、氯化锰、氯化铝、硫酸、氯化铁、氯化钴、氯化钙、氯化锌、VB、氯化铜、亚硒酸钠和生活饮用水配制而成，硼酸、氯化镁、钼酸钠、氯化锰、氯化铝、硫酸、氯化铁、氯化钴、氯化钙、氯化锌、VB、氯化铜、亚硒酸钠和生活饮用水的质量比为：74.4：2800：2：160：2：5000：640：10：240：5.4：4：1.4：1.4：1000。
作为对上述技术方案的改进，所述二次补料培养基组成为：10％蛋白胨、20％酵母粉、1.2％氯化铵、10％葡萄糖、0.1％微量元素、其余为水。
实施例1：
本发明使用菌株为大肠杆菌K-12，保存于本公司的低温冰箱；
(1)传代菌株制备：将原始菌株划线在固体平板上，28℃恒温培养箱培养24小时；
(2)活化液培养：从平板内挑选单菌落分别接入准备好的三角瓶(液态培养基)，28℃、180rpm摇床培养，16小时；
(3)种子培养：活化液中挑选长势较好的转接大瓶培养，接种量1.0％扩大种量，28℃、180rpm摇床培养，活化转接要求OD值达到2为宜，培养时间约10h；
(4)发酵种子培养(按照消后500kg配料，定容450kg)：培养基：酵母粉(0.5％)2.5Kg、蛋白胨：(1％)5Kg、氯化钠(1％)5Kg、消泡剂(0.3‰)150g、氨苄青霉素(0.1‰)50g，生活饮用水补足至450kg用饱和蒸汽进行灭菌，灭菌后体积约为500kg，降温至37℃接种量按照1％接种，开启搅拌，调节通气量1:1VVM，氢氧化钠调节PH值控制在6.7，培养时间约10h，控制OD值在2左右转接；
(4)发酵培养(按照移种后5T配料，定容4T)培养基：酵母粉25Kg、蛋白胨50Kg、氯化钠50Kg、消泡剂1500g、氨苄青霉素500g、微量元素785g、甘油200Kg，生活饮用水补足至4T；
(5)微量元素：(按照1kg比例配置，生产按比例扩大)硼酸：74.4mg氯化镁：2800mg钼酸钠:2mg氯化锰：160mg氯化铝：2mg硫酸：5g氯化铁：640mg氯化钴:10mg氯化钙：240mg氯化锌：5.4mgVB:4mg氯化铜：1.4mg亚硒酸钠：1.4mg生活饮用水补足；
(6)二次补料培养基(500KG灭菌备用)蛋白胨：50kg酵母粉：100kg氯化铵：6kg葡萄糖：50kg微量元素：260g生活饮用水补足；
(7)乳糖(250kg灭菌备用)投料30Kg，定容至250kg,比例：12％；
(8)诱导剂(按照总体积约6T计)IPTG：1500g定容至7.5kg,生活饮用水补足；
(9)发酵培养基配置后用饮用水定容至规定体积后用饱和蒸汽120-122℃灭菌，灭菌后体积约4.5吨。降温至37℃备用，微量元素和氨苄经过过滤除菌备用，按照比例加入培养基，确定菌种指标后开始移种培养，接种量约1-1.5％，开启搅拌，起始通气量500(1:1vvm)M3/h,利用氢氧化钠和盐酸控制PH值在6.7-7.5左右，罐压0.02-0.05Mpa,培养时间约4-5h，检测指标：OD、湿重、氨基氮、甘油含量等；
(10)检测指标OD到12以上，湿重20g/kg以上，开始流加补料，采取此方式补料易于控制培养基成分比例，依据消耗量与溶氧等参数做适当调整；
(11)约5h开始补料，乳糖补料从二次补料开始流加50kg/h流加至结束，二次补料控制步骤：
时间：0湿重：21.9g/kgOD:10.93氨基氮：2.7溶氧25.6补料：0通气量1:1；
时间：1湿重：30.2g/kgOD:16.92氨基氮：2.9溶氧28.5补料：90kg/h通气量1:1；
时间：2湿重：40.3g/kgOD:21.95氨基氮：2.5溶氧25.4补料：80kg/h通气量1:1.5；
时间：3湿重：51.9g/kgOD:28.31氨基氮：3.1溶氧21.2补料：75kg/h通气量1:2；
(12)湿重指标50以上时，一次性加入诱导剂IPTG，开始诱导产酶；
时间：4湿重：62.6g/kgOD:30.50氨基氮：2.3溶氧18.6补料：80kg/h通气量1:2；
时间：5湿重：66.9g/kgOD:43.08氨基氮：2.7溶氧19.3补料：80kg/h通气量1:3；
时间：6湿重：71.3g/kgOD:50.29氨基氮：2.4溶氧12.2补料：85kg/h通气量1:3；
(13)约6小时补料结束，过程中控制溶氧不掉零，可采取增加通气量，提高搅拌。提高罐压(不建议使用)等方式；
(14)PH值控制，菌体增值初期，大量繁殖代谢乙酸，PH至迅速下降，此时用1M氢氧化钠来调节，过程需要补碱约400kg，发酵过程补料接近结束阶段PH值会阶段性的上浮，此时补料产酸已经不能够抑制PH值变化，此时需要补酸来控制，4M盐酸约100kg，此过程维持2小时左右后恢复补碱；
(15)根据每小时检测指标OD，湿重变化来确定发酵结束时间，当湿重不在增长，并下降时中止发酵，湿菌体重量约80-100g/kg，补料结束时发酵市场约11h，诱导时间从补料开始3h左右，诱导时间参数：
时间：1湿重：51.9g/kgOD:28.31氨基氮：3.1溶氧21.2补料速度：75kg/h通气量1:2；
时间：2湿重：62.6g/kgOD:30.50氨基氮：2.3溶氧18.6补料速度：80kg/h通气量1:2；
时间：3湿重：66.9g/kgOD:43.08氨基氮：2.7溶氧19.3补料速度：80kg/h通气量1:3；
时间：4湿重：71.3g/kgOD:50.29氨基氮：2.4溶氧12.7补料速度：85kg/h通气量1:3；
时间：5湿重：74.1g/kgOD:52.23氨基氮：2.2溶氧13.4还原糖：7.7g/kg通气量1:3；
时间：6湿重：76.0g/kgOD:54.26氨基氮：2.0溶氧21.2还原糖：7.4g/kg通气量1:3；
时间：7湿重：79.4g/kgOD:55.31氨基氮：1.8溶氧35.1还原糖：7.2g/kg通气量1:3；
时间：8湿重：81.3g/kgOD:56.11氨基氮：1.8溶氧66.3还原糖：6.8g/kg通气量1:3；
时间：9湿重：82.5g/kgOD:56.89氨基氮：1.7溶氧80.5还原糖：6.5g/kg通气量1:3；
时间：11湿重：83.8g/kgOD:57.55氨基氮：1.5溶氧90.3还原糖：5.9g/kg通气量1:3；
时间：12湿重：84.6g/kgOD:57.56氨基氮：1.3溶氧89.3还原糖：5.8g/kg通气量1:3；
时间：13湿重：82.1g/kgOD:57.32氨基氮：1.2溶氧90.6还原糖：5.5g/kg通气量1:3；
(16)发酵过程约20h，湿重OD值下降，发酵中止，体积约6000kg，发酵液经过蝶式高速离心机离心处理，弃去上清液,计重湿菌体约480kg；
(17)根据湿菌体加入四倍量1mMEDT溶解，再次加入4倍量的EDTA，在4℃条件下搅拌半小时,总重量约7.5T,搅拌均匀，开始破碎，破碎后测OD值，每次破碎后检测OD值，直到OD值不再下降，一般50-65左右(参考指标)；
(18)破碎结束，再经过高速离心后，弃去上清液收集包涵体，包涵体含量能够达到菌体重量的20-30％；
(19)包涵体经过复性后得到粗制凝乳酶，检测酶活力，折算发酵液酶活力；
(20)粗制酶液经过微滤膜除杂，加水洗脱，去除分子量高的大颗粒杂质；
(21)再经过超滤膜浓缩，去除小分子物质，水分无机盐小分子蛋白等，提高单位酶活力；
(22)根据客户需求配置成所需要的酶活力，经无菌过滤灌装成成品。
实施例2：
本实施例使用菌株为大肠杆菌K-12，保存于本公司的低温冰箱；
(6)传代菌株制备：将原始菌株划线在固体平板上，30℃恒温培养箱培养30小时；
(7)活化液培养：从平板内挑选单菌落分别接入准备好的三角瓶(液态培养基)，30℃、180rpm摇床培养，24小时；
(8)种子培养：活化液中挑选长势较好的转接大瓶培养，接种量1.5％扩大种量，30℃、180rpm摇床培养，活化转接要求OD值达到5为宜，培养时间约10h；
(4)发酵种子培养(按照消后500kg配料，定容450kg)：培养基：酵母粉：(0.5％)2.5Kg、蛋白胨：(1％)5Kg、氯化钠：(1％)5Kg、消泡剂：(0.3‰)150g、氨苄青霉素(0.1‰)50g，生活饮用水补足至450kg，用饱和蒸汽进行灭菌，灭菌后体积约为500kg，降温至37℃接种量按照1％-1.5％接种，开启搅拌，调节通气量1:1VVM，氢氧化钠调节PH值控制在6.7-7.5，培养时间约10h，控制OD值在2-5左右转接；
(9)发酵培养(按照移种后5T配料，定容4T)培养基：酵母粉25Kg、蛋白胨50Kg、氯化钠50Kg、消泡剂1500g、氨苄青霉素500g、微量元素785g、甘油200Kg，生活饮用水补足至4T；
(10)微量元素：(按照1kg比例配置，生产按比例扩大)硼酸74.4mg、氯化镁2800mg、钼酸钠2mg、氯化锰160mg、氯化铝2mg、硫酸5g、氯化铁640mg、氯化钴10mg、氯化钙240mg、氯化锌5.4mg、VB4mg、氯化铜1.4mg、亚硒酸钠1.4mg，生活饮用水补足；
(6)二次补料培养基(500KG灭菌备用)蛋白胨50kg、酵母粉100kg、氯化铵6kg、葡萄糖50kg、微量元素260g、生活饮用水补足；
(7)乳糖(250kg灭菌备用)投料30Kg，定容至250kg,比例：12％；
(8)诱导剂(按照总体积约6T计)IPTG：1500g定容至7.5kg,生活饮用水补足；
(9)发酵培养基配置后用饮用水定容至规定体积后用饱和蒸汽122℃灭菌，灭菌后体积约4.5吨。降温至37℃备用，微量元素和氨苄经过过滤除菌备用，按照比例加入培养基，确定菌种指标后开始移种培养，接种量约1.5％，开启搅拌，起始通气量500(1:1vvm)M3/h,利用氢氧化钠和盐酸控制PH值在7.5左右，罐压0.05Mpa,培养时间约4-5h，检测指标：OD、湿重、氨基氮、甘油含量等；
(10)检测指标OD到12以上，湿重20g/kg以上，开始流加补料，采取此方式补料易于控制培养基成分比例，依据消耗量与溶氧等参数做适当调整；
(11)约5h开始补料，乳糖补料从二次补料开始流加50kg/h流加至结束，二次补料控制步骤：
时间：0湿重：21.9g/kgOD:10.93氨基氮：2.7溶氧25.6补料：0通气量1:1；
时间：1湿重：30.2g/kgOD:16.92氨基氮：2.9溶氧28.5补料：90kg/h通气量1:1；
时间：2湿重：40.3g/kgOD:21.95氨基氮：2.5溶氧25.4补料：80kg/h通气量1:1.5；
时间：3湿重：51.9g/kgOD:28.31氨基氮：3.1溶氧21.2补料：75kg/h通气量1:2；
(12)湿重指标50以上时，一次性加入诱导剂IPTG，开始诱导产酶；
时间：4湿重：62.6g/kgOD:30.50氨基氮：2.3溶氧18.6补料：80kg/h通气量1:2；
时间：5湿重：66.9g/kgOD:43.08氨基氮：2.7溶氧19.3补料：80kg/h通气量1:3；
时间：6湿重：71.3g/kgOD:50.29氨基氮：2.4溶氧12.2补料：85kg/h通气量1:3；
(13)约6小时补料结束，过程中控制溶氧不掉零，可采取增加通气量，提高搅拌。提高罐压(不建议使用)等方式；
(14)PH值控制，菌体增值初期，大量繁殖代谢乙酸，PH至迅速下降，此时用1M氢氧化钠来调节，过程需要补碱约400kg，发酵过程补料接近结束阶段PH值会阶段性的上浮，此时补料产酸已经不能够抑制PH值变化，此时需要补酸来控制，4M盐酸约100kg，此过程维持2小时左右后恢复补碱；
(15)根据每小时检测指标OD，湿重变化来确定发酵结束时间，当湿重不在增长，并下降时中止发酵，湿菌体重量约80-100g/kg，补料结束时发酵市场约11h，诱导时间从补料开始3h左右，诱导时间参数：
时间：1湿重：51.9g/kgOD:28.31氨基氮：3.1溶氧21.2补料速度：75kg/h通气量1:2；
时间：2湿重：62.6g/kgOD:30.50氨基氮：2.3溶氧18.6补料速度：80kg/h通气量1:2；
时间：3湿重：66.9g/kgOD:43.08氨基氮：2.7溶氧19.3补料速度：80kg/h通气量1:3；
时间：4湿重：71.3g/kgOD:50.29氨基氮：2.4溶氧12.7补料速度：85kg/h通气量1:3；
时间：5湿重：74.1g/kgOD:52.23氨基氮：2.2溶氧13.4还原糖：7.7g/kg通气量1:3；
时间：6湿重：76.0g/kgOD:54.26氨基氮：2.0溶氧21.2还原糖：7.4g/kg通气量1:3；
时间：7湿重：79.4g/kgOD:55.31氨基氮：1.8溶氧35.1还原糖：7.2g/kg通气量1:3；
时间：8湿重：81.3g/kgOD:56.11氨基氮：1.8溶氧66.3还原糖：6.8g/kg通气量1:3；
时间：9湿重：82.5g/kgOD:56.89氨基氮：1.7溶氧80.5还原糖：6.5g/kg通气量1:3；
时间：11湿重：83.8g/kgOD:57.55氨基氮：1.5溶氧90.3还原糖：5.9g/kg通气量1:3；
时间：12湿重：84.6g/kgOD:57.56氨基氮：1.3溶氧89.3还原糖：5.8g/kg通气量1:3；
时间：13湿重：82.1g/kgOD:57.32氨基氮：1.2溶氧90.6还原糖：5.5g/kg通气量1:3；
(16)发酵过程约20h，湿重OD值下降，发酵中止，体积约6000kg，发酵液经过蝶式高速离心机离心处理，弃去上清液,计重湿菌体约480kg；
(17)根据湿菌体加入四倍量1mMEDT溶解，再次加入4倍量的EDTA，在4℃条件下搅拌半小时,总重量约7.5T,搅拌均匀，开始破碎，破碎后测OD值，每次破碎后检测OD值，直到OD值不再下降，一般65左右(参考指标)；
(18)破碎结束，再经过高速离心后，弃去上清液收集包涵体，包涵体含量能够达到菌体重量的20-30％；
(19)包涵体经过复性后得到粗制凝乳酶，检测酶活力，折算发酵液酶活力；
(20)粗制酶液经过微滤膜除杂，加水洗脱，去除分子量高的大颗粒杂质；
(21)再经过超滤膜浓缩，去除小分子物质，水分无机盐小分子蛋白等，提高单位酶活力；
(22)根据客户需求配置成所需要的酶活力，经无菌过滤灌装成成品。
Claims (9)
1.一种工业化生产凝乳酶的方法，其特征在于，该方法的步骤是：
S1、以来源于大肠杆菌K-12的发酵菌株为原始菌株；
S2、传代菌株制备：将原始菌株划线在固体平板上，28-30℃恒温培养箱用固定平板培养基培养24-30小时；
S3、活化液培养：从平板内挑选单菌落分别接入准备好的三角瓶中，用活化培养基培养，28-30℃、180rpm摇床，16-24小时；
S4、种子培养：从活化液中挑选长势较好的菌落转接到大瓶培养，扩大种量，接种量按照1％-2％接种,用种子培养基培养，28-30℃、180rpm摇床培养，活化转接要求OD值为2-5，培养时间8-12h；
S4、发酵种子培养，用饱和蒸汽对发酵种子培养基进行灭菌消毒，降温到35-38℃，接种量按照1％-2％接种，开启搅拌220rpm，调节通气量1:1VVM，氢氧化钠调节PH值控制在6.7-7.5，培养时间8-12h，控制OD值在2-5转接；
S5、发酵培养：按照接种量1％-1.5％接入发酵培养基中，在36-37℃，开启搅拌,通气量按照溶氧条件调节，培养18-24小时；
S6、发酵结束，检测菌体含量、湿重、OD值，放料离心处理，收集得到湿菌体，并计重；
S7、湿菌体MEDT溶解，再用EDTA缓冲液清洗菌体，然后离心收集菌体，计重后用EDTA溶解成悬浮液；
S8、菌体悬浮液在800-1000Bar高压均质机破碎2次以上，检测OD值在50-65左右时，再次离心收集包涵体；
S9、包涵体经过复性，得到粗制凝乳酶液；
S10、粗制凝乳酶液经过膜过滤、加水洗脱，微滤除杂、超滤浓缩、除菌过滤得到无菌液态产品；
S11、根据客户需求用无菌水配制要求的酶活。
2.如权利要求1所述工业化生产凝乳酶的方法，其特征在于，，所述发酵培养的具体步骤为：
S5.1、配置发酵培养基，用饱和蒸汽120-122℃灭菌，然后降温到37℃备用；
S5.2、按照接种量1％-1.5％将凝乳酶种子移种发酵培养基中，在36-37℃下开启搅拌，起始通气量500(1:1vvm)M3/h,利用氢氧化钠和盐酸控制PH值在6.7-7.5左右，罐压0.02-0.05Mpa,培养时间4-5h；
S5.3、培养期间检测OD、湿重、氨基氮、甘油含量指标，当OD超过12、湿重超过20g/L时，开始流加二次补料培养基，二次补料培养基与发酵培养基的质量比为10：100；
S5.4、在培养5h-6h时，随二次补料培养基同时流加乳糖补料，流加量为50kg/h，乳糖与与发酵培养基的质量比为10：100；
S5.5、当湿重指标50以上时，一次性加入诱导剂IPTG，开始诱导产酶，诱导剂与发酵液的体积为0.3：1000；
S5.6、当湿重不在增长时中止发酵。
3.如权利要求1所述工业化生产凝乳酶的方法，其特征在于，所述固体平板培养基组成为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉、1％氯化钠、1.5％琼脂、0.1‰氨苄青霉素，其余为水。
4.如权利要求1所述工业化生产凝乳酶的方法，其特征在于，所述活化培养基的组成为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉、1％氯化钠、0.1‰氨苄青霉素，其余为水。
5.如权利要求1所述工业化生产凝乳酶的方法，其特征在于，所述种子培养基的组成为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉、1％氯化钠、0.1‰氨苄青霉素，其余为水。
6.如权利要求1所述工业化生产凝乳酶的方法，其特征在于，所述发酵种子培养基的组成为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉、1％氯化钠、0.1‰氨苄青霉素，其余为水。
7.如权利要求1或2所述工业化生产凝乳酶的方法，其特征在于，所述发酵培养基组成为：3.08％酵母粉、1.54％蛋白胨、2.35‰氯化铵、1％氯化钠、0.3‰消泡剂、0.1‰氨苄青霉素，0.165‰盐酸硫铵、0.157‰微量元素、4％甘油，其余为水。
8.如权利要求1所述工业化生产凝乳酶的方法，其特征在于，所述二次补料培养基组成为：10％蛋白胨、20％酵母粉、1.2％氯化铵、10％葡萄糖、0.1％微量元素、其余为水。
9.如权利要求7或8所述工业化生产凝乳酶的方法，其特征在于，所述微量元素由硼酸、氯化镁、钼酸钠、氯化锰、氯化铝、硫酸、氯化铁、氯化钴、氯化钙、氯化锌、VB、氯化铜、亚硒酸钠和生活饮用水配制而成，硼酸、氯化镁、钼酸钠、氯化锰、氯化铝、硫酸、氯化铁、氯化钴、氯化钙、氯化锌、VB、氯化铜、亚硒酸钠和生活饮用水的质量比为：74.4：2800：2：160：2：5000：640：10：240：5.4：4：1.4：1.4：1000。
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2017
- 2017-12-25 CN CN201711422200.6A patent/CN107881162A/zh active Pending
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