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CN107868823A - 一种检测mds/mpn相关基因群的检测试剂盒 - Google Patents

一种检测mds/mpn相关基因群的检测试剂盒 Download PDF

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CN107868823A CN201711051636.9A CN201711051636A CN107868823A CN 107868823 A CN107868823 A CN 107868823A CN 201711051636 A CN201711051636 A CN 201711051636A CN 107868823 A CN107868823 A CN 107868823A
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汝昆
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Abstract

一种检测MDS/MPN相关基因群的检测试剂盒，该技术方案首先确定了用于筛查MDS/MPN相关基因突变的基因群，并从中筛选了具有高指向性的17个基因。在此基础上结合高通量测序技术，可以实现在形态学和流式细胞学之外对MDS/MPN进行辅助诊断，特别是对于疾病预后做出评估和针对相关靶药的作用效果做出预判具有特殊的优势。本发明提供的用于筛查MDS/MPN相关基因突变的基因群的检测试剂盒具有检测效率高、检出率高等优点。

Description

一种检测MDS/MPN相关基因群的检测试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，进一步涉及筛查MDS/MPN相关基因突变的检测试剂盒及其医学解读数据库，具体涉及一种检测MDS/MPN相关基因群的检测试剂盒。
背景技术
骨髓增生异常综合征/骨髓增殖性肿瘤(MDS/MPN)是一组临床、实验室和形态特征上既有骨髓增生异常综合征(MDS)又有骨髓增殖性肿瘤(MPN)相互重叠或复合的髓系肿瘤。MDS/MPN的临床、血液学具有MDS和MPN的双重特点，即一系或多系髓系细胞具有MDS的无效造血和病态造血，外周血出现相应系列血细胞减少，又具有另一系或多系髓系细胞出现MPN的有效增殖，导致外周血相应系列血细胞增多。然而，其病理学本质与单纯的骨髓增生异常综合征(MDS)或骨髓增殖性肿瘤(MPN)均不相同，也并非这两种疾病的简单叠加，而是具有特定病理特征和发病原因的一种疾病。世界卫生组织(WHO)髓系肿瘤分类(2016)中骨髓增生异常综合征/骨髓增殖性肿瘤(MDS/MPN)包括慢性粒-单核细胞白血病(CMML)、不典型慢性髓性白血病(aCML)、幼年型粒-单核细胞白血病(JCMML)、MDS-MPN伴环形铁幼粒细胞和血小板增多(RARS-T)和不能分类的MDS/MPN(MDS/MPN-U)等疾病类型。
MDS/MPN的发病率约为1/10万人口，多累积中老年人，中位年龄为72岁，男女之比为2:1，中位生存时间为42.3月。MDS/MPN的病因尚不明确，一般认为遗传、辐射(放疗)、化学物质(如苯、聚乙烯)、某些药物(如化疗药)及环境污染和其他职业上的暴露(如浓烟、颜料、杀虫剂等)可能与MDS/MPN的发生有关。
目前检测MDS/MPN的方法主要涉及细胞心态学、流式细胞学、细胞遗传学、分子生物学。其中分子生物学的实验方法主要有巢式PCR、一代测序等。PCR方法不能直观的得到具体的突变序列，而一代测序的方法受到测序通量的影响，无法一次性检测多个基因的全部外显子区域。而二代测序作为一种高通量的检测方法，可以一次性准确测量多个基因的外显子序列，使精准治疗成为可能。因此，如何经济有效地筛选出MDS/MPN的相关基因群并提供一种基于该基因群的检测试剂盒成为现实技术中亟待解决的问题。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种检测MDS/MPN相关基因群的检测试剂盒，以解决现有技术中MDS/MPN的诊断方法较为局限，缺乏从分子生物学角度诊断MDS/MPN的依据的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是现有技术中MDS/MPN的诊断方法准确性较低。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种检测MDS/MPN相关基因群的检测试剂盒，该试剂盒检测如表1所示的38个基因的突变情况：
表1 MDS/MPN基因群列表
作为优选，所述检测试剂盒包括以上38个基因的引物，所述引物的扩增范围包括以上38个基因的全部外显子区域。
作为优选，该试剂盒检测如表2所示的17个基因的突变情况：
表2 MDS/MPN基因群优选列表
作为优选，所述检测试剂盒包括以上17个基因的引物，所述引物的扩增范围包括以上17个基因的全部外显子区域。
作为优选，所述检测试剂盒包括以上17个基因的引物，所述引物的扩增范围包括以上17个基因的外显子区域的177个热点突变位点，所述177个热点突变及其与所述17个基因的对应关系如表3所示：
表3热点突变列表
本发明所述的17个基因外显子区域的热点突变可用于对MDS/MPN做出辅助诊断，本领域MDS/MPN常规的诊断方法有形态学、细胞遗传学和流式细胞学，本发明所述方法较佳地从分子生物学角度对MDS/MPN做出诊断。
本发明提供一组检测本发明所述MDS/MPN相关基因外显子区域的多重PCR引物，所述引物的扩增范围包括17个与MDS/MPN相关基因的外显子区域。利用本发明提供的多重PCR引物，结合二代测序技术，能够检测本发明所述突变基因群中的全部外显子区域。
其中所述的二代测序试剂为本领域常规使用的试剂，只要能够满足对所得序列进行二代测序的要求即可。所述试剂制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为市售可得。
本发明所述检测试剂盒更佳地还包括将检测对象中提取的基因组DNA制成可供测序使用的文库的试剂，该种试剂为本领域常规使用试剂，只要能够满足多重PCR对基因组DNA质量的要求即可。所述试剂制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为市售可得。
本发明所述检测试剂盒较佳地还包括：dNTP溶液，DNA聚合酶，用于分离或纯化核酸的是Backman磁珠。
本发明所述的样本为检测对象的组织，只要能从检测样本中抽提检测对象的基因组DNA即可。所述检测样本较佳地为骨髓、血液、实体瘤样本中的一种或几种，优选地为骨髓样本。
一种本发明所述试剂盒的使用方法，其包括以下步骤：
(1)利用本发明所述检测试剂盒抽提检测对象的骨髓，提取基因组DNA；
(2)用多重PCR引物对基因组DNA中发明中所述17个MDS/MPN相关基因的外显子区域进行扩增；
(3)将步骤(2)中扩增所得的片段制成可供Ion Torrent测序平台测序的文库；
(4)对步骤(3)中所得DNA文库进行测序，得到下机数据；
(5)对(4)中的下机数据进行生物信息学分析，而后利用医学解读数据库进行解读做出诊断即可。
以上各个步骤的具体操作方法详见试剂盒说明书。
本发明所用的试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：利用本发明提供的可用于筛查MDS/MPN相关基因突变的基因群，结合高通量测序技术，可以实现在形态学和流式细胞学之外对MDS/MPN进行辅助诊断，特别是对于疾病预后做出评估和针对相关靶药的作用效果做出预判具有特殊的优势。本发明提供的用于筛查MDS/MPN相关基因突变的基因群的检测试剂盒具有检测效率高、检出率高等优点。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
材料和方法：
在中国医学科学院血液病医院和协和华美医学诊断中心2015年8月至2017年3月诊断的患者中，根据以下标准，我们进行连续性入组(44名)。
入选标准为：经细胞形态学和流式细胞学诊断为骨髓增生异常综合征/骨髓增殖性肿瘤(MDS/MPN)的患者。
44名患者的诊断结果如表4所示：
表4患者诊断结果列表
收集3mL患者骨髓提取基因组DNA待测，该检测经过中国医学科学院血液病医院伦理委员会批准。
样本处理：样本中基因组利用天根DNA提取试剂盒进行抽提，具体操作方法参见试剂盒的使用说明书。
用多重PCR引物对基因组DNA进行扩增，实验操作方法参见Life公司试剂盒的使用说明书。
文库的构建：对扩增得到的DNA片段使用Life公司生产的Ion Torrent平台建库试剂盒进行测序文库的构建，实验操作方法参见Life公司试剂盒的使用说明书。
高通量测序：将构建好的测序文库经油包水处理后在Ion Torrent平台上进行高通量测序，油包水处理方法和高通量测序方法请参考高通量测序仪Ion Torrent以及其配套设备One Touch的使用说明书。
使用本发明试剂盒检测结果：
44名患者所检测出17个基因的阳性率如下表5所示：
表5 17个基因阳性率列表
突变基因 突变病例数 突变率 突变基因 突变病例数 突变率
NRAS 11 25.00 CBL 2 4.55
U2AF1 8 18.18 CSF3R 2 4.55
SETBP1 7 15.91 JAK2 2 4.55
PTPN11 6 13.64 KRAS 2 4.55
ASXL1 5 11.36 KIT 1 2.27
RUNX1 5 11.36 NPM1 1 2.27
SRSF2 5 11.36 SF3B1 1 2.27
TET2 5 11.36 TP53 1 2.27
DNMT3A 4 9.09
经统计后表明：(根据上述表格进行总结)由此可见，使用二代测序的方法对骨髓增生异常综合征/骨髓增殖性肿瘤(MDS/MPN)进行辅助诊断，具有诊断准确、获得信息量大的特点。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种检测MDS/MPN相关基因群的检测试剂盒，其特征在于该试剂盒检测如下表所示的38个基因的突变情况：
2.根据权利要求1所述的一种检测MDS/MPN相关基因群的检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒包括以上38个基因的引物，所述引物的扩增范围包括以上38个基因的全部外显子区域。
3.根据权利要求1所述的一种检测MDS/MPN相关基因群的检测试剂盒，其特征在于该试剂盒检测如下表所示的17个基因的突变情况：
4.根据权利要求3所述的一种检测MDS/MPN相关基因群的检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒包括以上17个基因的引物，所述引物的扩增范围包括以上17个基因的全部外显子区域。
5.根据权利要求3所述的一种检测MDS/MPN相关基因群的检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒包括以上17个基因的引物，所述引物的扩增范围包括以上17个基因的外显子区域的177个热点突变位点，所述177个热点突变及其与所述17个基因的对应关系如下表所示：
6.根据权利要求5所述的一种检测MDS/MPN相关基因群的检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括用于扩增所述突变基因群外显子区域的多重PCR引物，以及用于二代测序的试剂。
7.根据权利要求5所述的一种检测MDS/MPN相关基因群的检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括将检测对象中抽提出基因组DNA制成可供测序的文库的试剂。
8.根据权利要求5所述的一种检测MDS/MPN相关基因群的检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括dNTP溶液，DNA聚合酶，用于分离或纯化核酸的试剂，阳性对照或阴性对照。
9.根据权利要求5所述的一种检测MDS/MPN相关基因群的检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括基因群检测报告的数据库，所述数据库包含了对所述热点突变的医学解释。
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