CN107858404A - 一种用于多重pcr扩增的颈环引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于多重PCR扩增的颈环引物及其应用，所述引物为一段长度为35~50bp的寡核苷酸；该寡核苷酸的3’端为与靶基因互补的序列，5’端为一段人为编辑的序列。本发明适用于任何一种多重PCR扩增，靶基因越多，效果越好；本发明不仅适用于探针法荧光PCR，也适用于染料法PCR；适用于多种临床用途，特别是能够为临床微生物鉴定提供解决方案。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于多重PCR扩增的颈环引物及其应用。
背景技术
聚合酶链式反应 (PCR) 技术是一种简单快捷、高灵敏、特异的基因扩增方法，其过程通常包括20-50个由变性、退火和延伸三步反应构成的循环。可以在1.5-3小时内特异地扩增靶核酸序列至几百万倍。近年来，由于实时PCR仪的出现使普通PCR不再需要凝胶电泳分析，从而不必PCR后操作，杜绝了PCR污染。因此实时PCR技术在临床上应用越来越广泛。实时荧光PCR检测技术中应用最广泛的是标记荧光的核酸探针，例如5'-核酸外切酶技术中使用的Taqman探针、分子信标等。
随着荧光探针标记技术的进步以及多重实时荧光定量PCR仪的开发以及体外检测市场对多重靶标联合检测的需求日益增加，多重荧光实时定量PCR技术应用越来越广泛。初期的多重PCR技术，主要是以巢式PCR为代表的两轮扩增技术，而由于体系内的引物探针数量过多，导致引物二聚体及非特异性扩增概率增加，进而影响扩增的灵敏度及特异性。
所以，为了满足临床需求，亟需发明一种能够提高检测灵敏度及扩增特异性的多重荧光PCR方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于多重PCR扩增的颈环引物及其应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明中包含一种多重PCR的引物设计方法，用独特的设计方式来避免引物二聚体的发生，并且通过第一轮扩增后消除不同靶基因模板浓度之间的差异造成的竞争性抑制，适用于多靶基因同时检测和分析。
本发明设计的引物包含两种：一种是带标签序列的特异性扩增引物，用于第一步的特异性扩增；一种是标签引物，用于第二部的通用扩增；特异性引物包含上下游引物，其标签序列保持一致，而标签引物只有一条，即作为上游引物也作为下游引物。所述的标签序列为CAAGAAGGTGGTGAA。
带标签序列的特异性扩增引物，总长度为35~50bp，其中标签序列15~20bp，特异性序列20~30bp。其结构见图1所示，3’端为针对不靶基因序列设计的特异性引物；5’端为标签序列，所有引物的标签序列保持一致。由于所有引物的5’端序列都是一模一样的，大大减小了引物二聚体形成的概率、降低了二聚体形成的稳定性。
第一步扩增时，特异性引物的特异性序列与靶基因互补结合。完成扩增后，模板序列两端被添加了标签序列，如图2所示。下一轮变性后，这些产物单链将会自身形成一个环状结构，结构如图3所示，这些环状产物将不会参与接下来的扩增。从而在体系中不同靶基因初始浓度不同的情况下，尽可能减少不同模板之间的竞争抑制。
第一步扩增结束后，不同靶基因模板数量接近一致，接下来进行第二步扩增，第二步扩增将由标签引物来完成。标签引物序列是人为筛选处理的一段具有高扩增效率的序列，且所有模板都通过这条引物进行扩增，这一步扩增中高效的将第一步得到的模板通过扩增转换为荧光信号，达到多靶基因同时扩增的目的。
发明的优点：本发明的优势为1、提高多重PCR扩增灵敏度；2、减少引物二聚体的发生，提高多重PCR扩增的特异性；3、消除同一体系中不同模板初始浓度不同造成的干扰。
发明的有益效果：1、本发明适用于任何一种多重PCR扩增，靶基因越多，效果越好；2、本发明不仅适用于探针法荧光PCR，也适用于染料法PCR；3、适用于多种临床用途，特别是能够为临床微生物鉴定提供解决方案。
附图说明
图1 含标签序列的特异性引物结构图。
图2 第一步扩增完后的模板序列结构图。
图3 第一步产物变性后，单链形成的环状结构图。
图4 第二步扩增示意图。
图5样本01（HBV与内控浓度为1：1）扩增结果。
图6样本02（HBV与内控浓度为100：1）扩增结果。
图7样本03（HBV与内控浓度为1000：1）扩增结果。
图8样本04（HBV与内控浓度为10000：1）扩增结果。
图9样本05（HBV与内控浓度为100000：1）扩增结果。
图10样本06（浓度均为5.0×102copies/mL）扩增结果。
图11样本07（浓度均为5.0×104copies/mL）扩增结果。
图12样本08（浓度均为5.0×105copies/mL）扩增结果。
图13样本09（浓度均为5.0×106copies/mL）扩增结果。
具体实施方式
实施例一：颈环标签引物系统用于乙型肝炎病毒核酸定量检测
乙型肝炎病毒 (Hepatitis B Virus，HBV) 的免疫学检测是诊断 HBV 感染的传统方法。一般认为，在血清或血浆中乙肝病毒表面抗原 (HBsAg) 的存在，就表明已感染乙肝病毒，但 HBsAg 的出现并不能提供病毒在体内复制活动的信息。单一 e 抗原 (HBeAg) 作为判断乙肝病毒复制是否活跃、传染性强弱的免疫指标是不够确切的。随着基因诊断技术的不断发展和临床应用，血清中 HBV-DNA 的水平被认为既能证明乙肝病毒的存在，又能反映病毒的活性，其可信值要高于免疫法，对临床诊断治疗合理用药和判断预后具有重要意义。
现阶段HBV-DNA的检测通常采用的是荧光定量PCR法，此方法的检测流程为：样本获取→核酸提取→PCR反应体系配制→上机检测→结果分析。为了保证结果的准确性，在HBV-DNA检测的同时会加入内控来监控核酸提取过程、体系的有效性以及仪器的均一性。但是由于内控的扩增和HBV-DNA的扩增在同一个体系中同时进行，两者存在竞争抑制的关系。当HBV-DNA浓度较高的时候，内控的扩增将会被抑制，从而出现内控没有扩增的情况。而颈环标签引物系统能够很好的避免这种由于竞争抑制而导致的某一靶标无扩增的情况。
为了验证颈环标签引物系统的有效性，分别采用不同浓度的HBV与内控的混合样本来进行验证。样本如下：
颈环标签引物系统包含的引物探针序列如下：
HBV上游引物：5'-CAAGAAGGTGGTGAATCCTGTCCTCCAATTTGTCC-3'；
HBV下游引物：5'-CAAGAAGGTGGTGAAGGTCCCGTACTGGTTGTTGT-3'；
HBV探针：FAM-5'-TTCCTCTTCATCCTGCTGCT-3'-BHQ1；
内控上游引物：5'-CAAGAAGGTGGTGAAACCGGACTGAAGGAGCTG-3'；
内控下游引物：5'-CAAGAAGGTGGTGAAACTGCTGACTATGTCCCGC-3'；
内控探针：HEX-5'-CCTGCCCTGTGCAACGTGGA-3'-BHQ1；
标签引物：5'-CAAGAAGGTGGTGAA-3'；
反应体系配方如下：
反应条件为 ：95℃预变性10min； 95℃15s，62℃40s，15个循环；95℃15s，58℃40s，35个循环。
结果分析：采用了颈环标签引物系统后，无论HBV-DNA的浓度高低，内控都能正常扩增，说明颈环标签引物系统能够很好的消除同一体系下的不同靶基因扩增之间的竞争抑制。
附图如下：
图5，样本01扩增结果（HBV与内控浓度为1：1），二者皆正常扩增；
图6，样本02扩增结果（HBV与内控浓度为100：1），二者皆正常扩增；
图7，样本03扩增结果（HBV与内控浓度为1000：1），二者皆正常扩增
图8，样本04扩增结果（HBV与内控浓度为10000：1），二者皆正常扩增；
图9，样本05扩增结果（HBV与内控浓度为100000：1），二者皆正常扩增。
实施例二：颈环标签引物系统用于多重荧光PCR的细菌鉴定
细菌性肺炎由肺炎链球菌引起的急性肺部感染叫肺炎链球菌肺炎。约占社区获得性肺炎的半数。通常急骤起病，以高热、寒战、咳嗽、血痰及胸痛为特征。X线胸片呈肺段或肺叶急性炎性实变，近年来因抗菌药物的广泛使用，致使本病的起病方式症状及X线改变均不典型。本病以冬季与初春多见，常与呼吸道病毒感染相伴行。患者常为原先健康的青壮年或老年与婴幼儿，男性较多见。吸烟者、痴呆者、慢性支气管炎、支气管扩张、充血性心力衰竭、慢性病患者以及免疫抑制宿主均易受肺炎链球菌侵袭。机体免疫功能正常时，肺炎链球菌是寄居在口腔及鼻咽部的一种正常菌群，其带菌率常随年龄、季节及免疫状态的变化而有差异。机体免疫功能受损时有毒力的肺炎链球菌人侵人体而致病。肺炎链球菌除引起肺炎外，少数可发生菌血症或感染性休克，老年人及婴幼儿的病情尤为严重。
细菌性肺炎的检测手段主要有：胸部X线检查、细菌培养、血液检查、免疫学检查、细菌核酸检测等。荧光定量PCR具有快速、准确、简单的特点，被广泛应用于临床细菌的鉴别。多重荧光PCR能够在同一次反应中检测多个细菌，从而提高检测效率和检测通量。但是普通的多重荧光PCR由于需要检测多个模板，反应体系中的引物和探针通常有许多条，不同引物之间极易产生引物二聚体从而影响检测效果。
为了验证颈环标签引物系统在多重荧光PCR检测中的有效性，本次方案设计了一套多重颈环标签引物系统，同时检测肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌四种细菌。
样本如下：
颈环标签引物系统包含的引物探针序列如下：
肺炎链球菌上游引物：5'-CAAGAAGGTGGTGAActatgcagcggttgaactga-3'
肺炎链球菌下游引物：5'-CAAGAAGGTGGTGAAttggttggttattcgtgcaa-3'
肺炎链球菌探针：FAM-5'-agctggaattaaaacgcacg-3'-BHQ1
金黄色葡萄球菌上游引物：5'-CAAGAAGGTGGTGAAggttgatacacctgaaacaaagc-3'
金黄色葡萄球菌下游引物：5'-CAAGAAGGTGGTGAAatacgctaagccacgtccat-3'
金黄色葡萄球菌探针：HEX-5'-ggtcctgaagcaagtgcatt-3'-BHQ1
肺炎克雷伯杆菌上游引物：5'-CAAGAAGGTGGTGAAgcgaacaagctggatgtgta-3'
肺炎克雷伯杆菌下游引物：5'-CAAGAAGGTGGTGAAgtcttttgctggctggagtc-3'
肺炎克雷伯杆菌探针：ROX-5'-ttgggaatctgaattctcgg-3'-BHQ2
流感嗜血杆菌上游引物：5'-CAAGAAGGTGGTGAAccgacttgcatttgctctct-3'
流感嗜血杆菌下游引物：5'-CAAGAAGGTGGTGAAgcactcgggctatgtgaaac-3'
流感嗜血杆菌探针：Cy5-5'-gaggtgattgcagtagggga-3'-BHQ2
标签引物：5'-CAAGAAGGTGGTGAA-3'
反应体系配方如下：
反应条件为 ：95℃预变性10min； 95℃15s，60℃40s，15个循环；95℃15s，55℃40s，35个循环。
结果分析：采用了颈环标签引物系统后，四重荧光PCR反应，不论模板浓度高低，均能保证每一个通道的扩增都正常进行，检测灵敏度能够达到5.0×102copies/mL。
附图如下：
图10，样本06扩增结果（浓度均为5.0×102copies/mL），四重荧光扩增较为皆正常且较为均一；
图11，样本07扩增结果（浓度均为5.0×104copies/mL），四重荧光扩增较为皆正常且较为均一；
图12，样本08扩增结果（浓度均为5.0×105copies/mL），四重荧光扩增较为皆正常且较为均一；
图13，样本09扩增结果（浓度均为5.0×106copies/mL），四重荧光扩增较为皆正常且较为均一；
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 嘉兴雅康博贝南生物科技有限公司
<120> 一种用于多重PCR扩增的颈环引物及其应用
<130> 19
<160> 19
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
caagaaggtg gtgaa 15
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
caagaaggtg gtgaatcctg tcctccaatt tgtcc 35
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
caagaaggtg gtgaaggtcc cgtactggtt gttgt 35
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttcctcttca tcctgctgct 20
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
caagaaggtg gtgaaaccgg actgaaggag ctg 33
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
caagaaggtg gtgaaactgc tgactatgtc ccgc 34
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cctgccctgt gcaacgtgga 20
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
caagaaggtg gtgaactatg cagcggttga actga 35
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
caagaaggtg gtgaattggt tggttattcg tgcaa 35
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<211> 20
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<213> 人工序列
<400> 10
agctggaatt aaaacgcacg 20
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ggtcctgaag caagtgcatt 20
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<400> 18
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gaggtgattg cagtagggga 20
Claims (4)
1.一种用于多重PCR扩增的颈环引物，其特征在于：所述引物为一段长度为35~50bp的寡核苷酸；该寡核苷酸的3’端为与靶基因互补的序列，5’端为一段人为编辑的序列。
2.根据权利要求1所述的一种用于多重PCR扩增的颈环引物，其特征在于：包含两条寡核苷酸引物，上游颈环标签引物以及下游颈环标签引物；颈环标签引物由两部分组成，3’端为针对不靶基因序列设计的特异性引物；5’端为标签序列，所有引物的标签序列保持一致。
3.根据权利要求1所述的一种用于多重PCR扩增的颈环引物，其特征在于：所述的5’端标签序列为CAAGAAGGTGGTGAA。
4.如权利要求1所述的一种用于多重PCR扩增的颈环引物在多重实时荧光PCR反应中的应用。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20180330 |