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CN107858321A - 一种含类囊体人造细胞的制备方法及光合作用的模拟方法 - Google Patents

一种含类囊体人造细胞的制备方法及光合作用的模拟方法 Download PDF

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韩晓军
宗薇
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Abstract

一种含类囊体人造细胞的制备方法及光合作用的模拟方法，属于生物技术、生物化学、合成生物学领域。所述方法如下：从新鲜的菠菜叶中提取类囊体颗粒，并保存在缓冲溶液中备用；将磷脂溶液涂抹在ITO玻璃电极上，待溶剂挥发后形成一层磷脂膜，用真空脂固定聚四氟乙烯框架，聚四氟乙烯框架内部添加液相，ITO玻璃电极上加交流电制备GUV溶液；将GUV溶液与类囊体溶液混合，制得含类囊体人造细胞。本发明受自然界植物细胞结构和功能启发制备出了含类囊体的人造细胞，该模型在人造太阳光照射下能够实现光驱动电子转移过程。该模型的建立从结构和功能上双重模拟了自然界中叶绿体的属性。将复杂细胞简单化研究，推动了仿生化学的发展与进步。

Description

一种含类囊体人造细胞的制备方法及光合作用的模拟方法
技术领域
本发明属于生物技术、生物化学、合成生物学技术领域，具体涉及一种含类囊体人造细胞的制备方法及光合作用的模拟方法。
背景技术
自然界的植物细胞内部含有很多个隔室，其中叶绿体是植物细胞进行光合作用的关键细胞器，叶绿体内部含有大量的类囊体，类囊体膜上含有光合色素和电子传递链组分，“光能向活跃的化学能的转化（光反应）”在类囊体膜上进行，因此类囊体膜亦称光合膜。目前使用磷脂成分、二氧化硅成分等包裹从植物中提取出来的类囊体颗粒的研究已经有些报道，但是都是在单室的球壳中，从结构上不能满足人造植物细胞的模拟研究，并且大多数研究了光合作用中产生的氧气和ATP含量，这些都是光反应中的终产物，并没有将光合作用中的关键机理介绍清楚。因此，对于目前报道中的人造光合作用体系，不能即从结构又从功能上双重进行仿生学研究，该问题有待解决。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的对于仿生自然界进行光合作用体系时，不能即从结构又从功能上进行双重模拟的问题，提供一种含类囊体人造细胞的制备方法及光合作用的模拟方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种含类囊体人造细胞的制备方法，所述方法步骤如下：
步骤一：提取类囊体颗粒：从新鲜的菠菜叶中提取类囊体颗粒，并保存在缓冲溶液中备用；
步骤二：GUV溶液的制备：将磷脂溶液涂抹在ITO玻璃电极上，待溶剂挥发后形成一层磷脂膜，用真空脂固定聚四氟乙烯框架，聚四氟乙烯框架内部添加液相，在制备有一层磷脂膜的ITO玻璃电极上加交流电制备GUV溶液；
步骤三：含类囊体人造细胞的制备：将步骤二制备的GUV溶液与步骤一储备有类囊体颗粒的溶液混合，制得含类囊体人造细胞。
一种上述制备的含类囊体人造细胞进行光合作用的模拟方法，所述方法的具体步骤为：吸取含类囊体的人造细胞溶液14mL，其中的叶绿素浓度为2.6mg/mL，在20℃、250W氙灯下照射2 h，进行光合作用，光合作用后，向混合溶液中加入0.7mL的2wt.% Triton X-100在25℃下保持10min，然后加入10mL质量浓度为10%的三氯乙酸溶液终止氧化还原反应；随后3000rpm离心10min，取1.5mL上清液加入1.5mL的蒸馏水及0.1mL质量浓度为0.1%的氯化铁溶液在25℃水浴中保持10min；随后，用紫外吸收分光光度计测试其680nm处的吸收值即可。
本发明相对于现有技术的有益效果是：
本发明从菠菜中提取出类囊体颗粒，同时利用电形成方法制备GUV，泡囊外通过添加含类囊体溶液，在渗透压的作用下，大囊泡包小囊泡的含类囊体的人造细胞，并在该细胞模型中实现了光驱动电子转移过程，完成了对自然界中植物细胞中叶绿体的结构和功能的双层模拟。该模型的建立，将复杂的细胞结构和功能简单化，单一的研究了光反应中的电子转移过程。
本发明受自然界植物细胞结构和功能启发，在渗透压作用下，制备出了含类囊体的人造细胞，该模型在人造太阳光照射下能够实现光驱动电子转移过程。该模型的建立从结构和功能上双重模拟了自然界中叶绿体的属性。将复杂细胞简单化研究，推动了仿生化学的发展与进步。
附图说明
图1为本发明制备的含类囊体人造细胞的结构图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
本发明首先从新鲜的菠菜中提取出进行光合作用的关键成分类囊体颗粒，随后使用磷脂作为原料，利用经典的电形成方法制备巨型磷脂囊泡（GUV），将类囊体颗粒溶液与GUV溶液混合，在渗透压的作用下，类囊体颗粒被凹陷到GUV内部的小囊泡中，形成了一种大囊泡内部包裹很多小囊泡的结构，从结构上模拟了植物细胞中进行光合作用的关键细胞器----叶绿体，制备出了含类囊体人造细胞，其次，在人造太阳光的照射下，完成了该细胞模型光合作用中光反应的模拟，此发明无论从构建含类囊体人造细胞结构上，还是功能上都是目前没有报道研究的内容。
还原能力测定实验被采用来研究含类囊体的人造细胞在参与光反应时其中电子转移情况；实验中，光合作用中伴随转移的电子能够将铁氰化钾中的三价铁还原为二价铁（亚铁氰化钾），二价铁（亚铁氰化钾）进一步再和三氯化铁反应生成在680nm处有最大吸收度的普鲁士蓝，因此，测定680nm处的吸收值的高低能够反映出含类囊体的人造细胞在光照下转移电子的数量；680nm处的吸收值越高代表生成的普鲁士蓝的量越多，也代表着光照产生的转移电子越多，光合作用效果越好。
具体实施方式一：本实施方式记载的是一种含类囊体人造细胞的制备方法，所述方法步骤如下：
步骤一：提取类囊体颗粒：从新鲜的菠菜叶中提取类囊体颗粒，并保存在缓冲溶液中备用；
步骤二：GUV溶液的制备：将磷脂溶液涂抹在ITO玻璃电极上，待溶剂挥发后形成一层磷脂膜，用真空脂固定聚四氟乙烯框架，聚四氟乙烯框架内部添加液相，在制备有一层磷脂膜的ITO玻璃电极上加交流电制备GUV溶液；
步骤三：含类囊体人造细胞的制备：将步骤二制备的GUV溶液与步骤一储备有类囊体颗粒的溶液混合，在渗透压的作用下，制得结构完整，尺寸均一的含类囊体人造细胞，如图1所示。
具体实施方式二：具体实施方式一所述的一种含类囊体人造细胞的制备方法，步骤一的具体步骤为：将菠菜叶片清洗干净，控水；将菠菜叶与B1缓冲溶液混合并在搅拌机中将菠菜粉碎，其中，菠菜叶与B1缓冲溶液的质量体积比为1:4g/mL，粉碎时间为20min；随后用6-8层纱布对混合液进行过滤，滤液在4℃条件下6000rpm离心机中离心15min以收集完整的和破碎的叶绿体；向沉淀物中加入B2缓冲溶液并在细胞破碎仪中处理20min以打破叶绿体膜，其中，沉淀物与B2缓冲溶液的质量体积比是1:50g/mL；随后，在4℃条件10000rpm离心机中离心15min，并向沉淀物中加入B3缓冲溶液，其中，沉淀物与B3缓冲溶液的质量体积比是1:50g/mL，最终获得的类囊体颗粒溶液在4℃冰箱中保存备用。
具体实施方式三：具体实施方式二所述的一种含类囊体人造细胞的制备方法，所述的B1缓冲溶液由蔗糖、pH=7.8的三甲基甘氨酸、氯化钠和牛血清组成，其中，各自的浓度为：蔗糖：0.4M，pH=7.8的三甲基甘氨酸：20mM，氯化钠：40 mM，牛血清：0.2wt.%；所述的B2缓冲溶液由pH=7.8的三甲基甘氨酸、氯化钠和牛血清组成，其中，各自的浓度为：pH=7.8的三甲基甘氨酸：20mM，氯化钠：10 mM，牛血清：0.2wt.%；所述的B3缓冲溶液由蔗糖、pH=6.5的2-吗啉乙磺酸和15 mM氯化钠组成，其中，各自的浓度为：蔗糖：0.4M，pH=6.5的2-吗啉乙磺酸：20mM，氯化钠：15 mM。
具体实施方式四：具体实施方式一所述的一种含类囊体人造细胞的制备方法，步骤二的具体步骤为：按照4:1的质量比取磷脂（二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC）和胆固醇，并用氯仿溶解，配制成浓度为5mg/mL的磷脂溶液；在长×宽=45mm×25mm的ITO玻璃电极表面滴加5μL磷脂溶液，并用针状棒将磷脂溶液均匀涂抹在ITO玻璃电极上，待氯仿挥发后，用真空脂将聚四氟乙烯框架固定在涂好磷脂的ITO玻璃电极上，并在聚四氟乙烯框架内部灌注B4溶液，最后在ITO玻璃电极上外加交流电5V，10Hz，4 h后得到大小均一、结构完整的GUV溶液。
具体实施方式五：具体实施方式四所述的一种含类囊体人造细胞的制备方法，B4溶液由B3缓冲溶液与铁氰化钾组成，其中，铁氰化钾的浓度为1wt.%。
具体实施方式六：具体实施方式一所述的一种含类囊体人造细胞的制备方法，步骤三的具体步骤为将类囊体颗粒溶液和GUV溶液按照2:5的体积比在室温条件下混合8min，即获得含类囊体的人造细胞，GUV形变后的形貌在荧光显微镜下进行观察。
具体实施方式七：一种利用具体实施方式一制备的含类囊体人造细胞进行光合作用的模拟方法，所述方法的具体步骤为：吸取含类囊体的人造细胞溶液14mL，其中的叶绿素浓度为2.6mg/mL，在20℃、250W氙灯下照射2 h，进行光合作用，光合作用后，向混合溶液中加入0.7mL的2wt.% Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）在25℃下保持10min以打破磷脂膜释放出囊泡内的液体，然后加入10mL质量浓度为10%的三氯乙酸溶液终止氧化还原反应；随后3000rpm离心10min，取1.5mL上清液加入1.5mL的蒸馏水及0.1mL质量浓度为0.1%的氯化铁溶液在25℃水浴中保持10min；随后，用紫外吸收分光光度计测试其680nm处的吸收值即可。

Claims (7)

1.一种含类囊体人造细胞的制备方法，其特征在于：所述方法步骤如下：
步骤一：提取类囊体颗粒：从新鲜的菠菜叶中提取类囊体颗粒，并保存在缓冲溶液中备用；
步骤二：GUV溶液的制备：将磷脂溶液涂抹在ITO玻璃电极上，待溶剂挥发后形成一层磷脂膜，用真空脂固定聚四氟乙烯框架，聚四氟乙烯框架内部添加液相，在制备有一层磷脂膜的ITO玻璃电极上加交流电制备GUV溶液；
步骤三：含类囊体人造细胞的制备：将步骤二制备的GUV溶液与步骤一储备有类囊体颗粒的溶液混合，制得含类囊体人造细胞。
2.根据权利要求1所述的一种含类囊体人造细胞的制备方法，其特征在于：步骤一的具体步骤为：将菠菜叶片清洗干净，控水；将菠菜叶与B1缓冲溶液混合并在搅拌机中将菠菜粉碎，其中，菠菜叶与B1缓冲溶液的质量体积比为1:4g/mL，粉碎时间为20min；随后用6-8层纱布对混合液进行过滤，滤液在4℃条件下6000rpm离心机中离心15min；向沉淀物中加入B2缓冲溶液并在细胞破碎仪中处理20min，其中，沉淀物与B2缓冲溶液的质量体积比是1:50g/mL；随后，在4℃条件10000rpm离心机中离心15min，并向沉淀物中加入B3缓冲溶液，其中，沉淀物与B3缓冲溶液的质量体积比是1:50g/mL，最终获得的类囊体颗粒溶液在4℃冰箱中保存备用。
3.根据权利要求2所述的一种含类囊体人造细胞的制备方法，其特征在于：所述的B1缓冲溶液由蔗糖、pH=7.8的三甲基甘氨酸、氯化钠和牛血清组成，其中，各自的浓度为：蔗糖：0.4M，pH=7.8的三甲基甘氨酸：20mM，氯化钠：40 mM，牛血清：0.2wt.%；所述的B2缓冲溶液由pH=7.8的三甲基甘氨酸、氯化钠和牛血清组成，其中，各自的浓度为：pH=7.8的三甲基甘氨酸：20mM，氯化钠：10 mM，牛血清：0.2wt.%；所述的B3缓冲溶液由蔗糖、pH=6.5的2-吗啉乙磺酸和15 mM氯化钠组成，其中，各自的浓度为：蔗糖：0.4M，pH=6.5的2-吗啉乙磺酸：20mM ，氯化钠：15 mM。
4.根据权利要求1所述的一种含类囊体人造细胞的制备方法，其特征在于：步骤二的具体步骤为：按照4:1的质量比取磷脂和胆固醇，并用氯仿溶解，配制成浓度为5mg/mL的磷脂溶液；在长×宽=45mm×25mm的ITO玻璃电极表面滴加5μL磷脂溶液，并用针状棒将磷脂溶液均匀涂抹在ITO玻璃电极上，待氯仿挥发后，用真空脂将聚四氟乙烯框架固定在涂好磷脂的ITO玻璃电极上，并在聚四氟乙烯框架内部灌注B4溶液，最后在ITO玻璃电极上外加交流电5V，10Hz，4 h后得到GUV溶液。
5.根据权利要求4所述的一种含类囊体人造细胞的制备方法，其特征在于：B4溶液由B3缓冲溶液与铁氰化钾组成，其中，铁氰化钾的浓度为1wt.%。
6.根据权利要求1所述的一种含类囊体人造细胞的制备方法，其特征在于：步骤三的具体步骤为将类囊体颗粒溶液和GUV溶液按照2:5的体积比在室温条件下混合8min，即获得含类囊体的人造细胞。
7.一种利用权利要求1制备的含类囊体人造细胞进行光合作用的模拟方法，其特征在于：所述方法的具体步骤为：吸取含类囊体的人造细胞溶液14mL，其中的叶绿素浓度为2.6mg/mL，在20℃、250W氙灯下照射2 h，进行光合作用，光合作用后，向混合溶液中加入0.7mL的2wt.% Triton X-100在25℃下保持10min，然后加入10mL质量浓度为10%的三氯乙酸溶液终止氧化还原反应；随后3000rpm离心10min，取1.5mL上清液加入1.5mL的蒸馏水及0.1mL质量浓度为0.1%的氯化铁溶液在25℃水浴中保持10min；随后，用紫外吸收分光光度计测试其680nm处的吸收值即可。
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