CN107847612A

CN107847612A - 递送Smad7基因作为治疗剂

Info

Publication number: CN107847612A
Application number: CN201680036140.1A
Authority: CN
Inventors: B·D·罗杰斯; P·格雷戈雷维克
Original assignee: Baker IDI Heart and Diabetes Institute Holdings Ltd; Washington State University WSU
Current assignee: Baker IDI Heart and Diabetes Institute Holdings Ltd; Washington State University WSU
Priority date: 2015-04-23
Filing date: 2016-04-22
Publication date: 2018-03-27
Also published as: EP3285813A4; CA2983808A1; AU2016252887A1; KR20180002706A; CA2983808C; EP3285813B1; WO2016172608A1; US11268107B2; US20180112232A1; AU2016252887B2; PT3285813T; JP2018519250A; ES2856936T3; BR112017022621A2; EP3285813A1

Abstract

本文描述了载体，如腺相关病毒(AAV)载体以及表达Smad7的重组AAV(rAAV)。所公开的AAV载体和rAAV可用于在治疗和改善肌肉萎缩、与癌症恶病质相关的心肌和/骨骼肌萎缩的医疗应用。具体地，rAAV构建体为血清型6(rAAV6)、血清型8(rAAV8)或血清型9(rAAV9)。

Description

递送Smad7基因作为治疗剂

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年4月23日提交的申请号为62/151,547的美国临时申请的权益，其全部内容通过引用并入本文。

感谢联邦资金

本发明的特定方面至少部分地得到国家科学基金会(IOS1147275)、肌肉营养不良协会(216602)和澳大利亚国家健康和医学研究理事会(1046782)的支持。

通过引用并入序列表

序列表以ASCII文本文件提交，名为96554-01_SeqList.text，创建于2016年4月22日，～12KB，其通过引用并入本文。

背景技术

肿瘤源性因素在高达80％的晚期癌症病人中诱发恶病质，一种明显的体重减轻、虚弱和疲劳的状态，其特征在于肌肉和脂肪的严重萎缩(Tisdale,Physiol Rev 89,381-410,2009；Fearon等,Cell Metabolism 16,153-166,2012)。大多数的关注点都集中于抑制这些病人中IIB型激活素受体配体(ActRIIB)的治疗前景，因为该通路刺激肌肉分解代谢，而这些配体的表达常常随着肌肉萎缩而升高(Fearon等，Cell Metabolism 16，153-166,2012；Lee&Glass，Skelet Muscle 1，2，2011，doi：10.1186/2044-5040-1-2)。事实上，修饰的ActRIIB或其他“配体陷阱”(例如，可溶性ActRIIB、ACE-031、免疫中和等)的循环形式可逆转肌肉萎缩并增加寿命(Klimek等，Biochem Biophys Res Commun 391,1548-1554，2010；Zhou等，Cell 142，531-543，2010)，尽管其他的促恶病质细胞因素仍居高不下。因此，选择性防止肌肉中的ActRIIB信号传导的干预可证明在治疗癌症恶病质中是有帮助的(Zhou等，Cell 142，531-543，2010)。然而，在循环或胞外环境中的靶向ActRIIB配体可产生不良而严重的脱靶效应，因为这些配体对包括生殖和血管再生的许多器官系统来说是至关重要的(Massague，Nat Rev Mol Cell Biol 13，616-630，2012)。

例如，ACE-031，一种主要由ActRIIB的胞外结构域构成的肽体配体陷阱的临床研究被提前终止，因为诱导了常常在患有遗传性出血性毛细血管扩张(HHT)的病人中见到的病症，其包括从粘膜出血和皮肤血管舒张(Smith&Lin，Curr Opin Support Palliat Care7，352-360，2013)。因此，在循环中靶向ActRIIB配体的其他方法可产生相似的脱靶效应。这种疾病是由在两个信号传导蛋白，内皮糖蛋白或激活素样激酶-1中的最终损害内皮细胞中的TGFβ受体信号传导的突变导致的。类似地，血管完整性在患有HHT的病人和疾病的小鼠模型中受到损坏(Bourdeau等，J Clin Invest 104，1343-1351，1999；Bourdeau等，Am JPathol 156，911-923，2000；Bourdeau等，Trends Cardiovasc Med 10，279-285，2000；Bourdeau等，Am J Pathol158，2011-2020，2001；Satomi，等，Stroke 34，783-789，2003；Torsney等，Circulation 107，1653-1657，2003)。事实上，这些模型在鼻、耳和尾巴中发生大出血，所有这些通过外部检查就容易地看到并且甚至可引起部分尾部缺失。大出血也可发生在各个身体内部器官中，并且在肝和肺中是组织学上最明显的，尽管通过一般检查，大出血的病灶部位会再次清楚明显。一些小鼠甚至会经受在脑中动静脉畸形引起的中风，并且这表现为肌肉松弛和上睑下垂，这也是容易被检测到的。

一旦被激活，ActRIIB就会召集(recruit)I型激活素受体(如激酶(ALK)4/5的激活素)以形成使Smad2/3磷酸化的激活的ActRIIB:ALK4/5复合物(Massague，Nat Rev MolCell Biol 13，616-630，2012)。然后，这些受体Smad结合Smad4，从而使所述复合物进入细胞核并改变上调E3泛素连接酶、MuRF1和MAFbx的蛋白降解转录程序以及去磷酸化Akt(Amirouche等，Endocrinology 150，286-294，2009；Trendelenburg等，Am J Physiol CellPhysiol 296，C1258-1270，2009)。这条通路还可作为胞内负反馈的形式上调Smad7表达，这阻止Smad2/3磷酸化并促进ActRI降解(Chen等，Genes Dev 12，2144-2152，1998)。

发明内容

我们旨在开发通过衰减胞内ActRIIB信号传导通路而不是配体(肌肉生长抑制素、激活素&GDF-11)来治疗恶病质的改进的策略，因为这可能会避免配体陷阱的脱靶效应。我们已经表明通过衰减ActRIIB信号传导，特别在横纹肌中增加Smad7表达能够改善肌肉萎缩。为达成该目的，在避免配体陷阱的可能的脱靶效应的同时，我们利用具有横纹肌特异性取向的重组腺相关病毒载体(血清型6，rAAV6)(Gregorevic等，Nat Med 10，828-834，2004；通过引用并入本文)。事实上，我们的研究表明Smad7的过表达(特别是在横纹肌中)不仅能提高肌肉质量和功能，而且还能防止在不同肌肉萎缩病症下的萎缩，包括但不限于癌症恶病质、糖尿病、肥胖、心血管疾病和老化。

具体的方面显示患有晚期癌症的病人常常死于严重的横纹肌萎缩。ActRIIB的激活被认为是这种分解代谢潜在的主要机制，尽管对通过拮抗循环的ActRIIB配体来防止它的干预已经受到脱靶效应的阻碍。通过用具有明确横纹肌取向的重组腺相关病毒载体(血清型6，rAAV6)[rAAV:Smad7]过表达Smad7来衰减ActRIIB信号传导提高了健康的小鼠中的骨骼肌质量和功能，同时在携带C-26肿瘤的小鼠中，防止了骨骼肌和心肌的萎缩，不受肿瘤负荷和原恶病质配体的血清水平的影响。

根据另一方面，rAAV:Smad7还防止肌肉生长抑制素或激活素A过表达的抑制素-a基因敲除小鼠中的萎缩。未检测到脱靶效应，因为Smad7表达仅限制于横纹肌，如同Smad7活性的生物标记一样。从机理上讲(mechanistically)，Smad7消除了Smad2/3信号传导并抑制了与萎缩有关的泛素连接酶MuRF1和MAFbx的表达。

根据又一方面，这些发现表明Samd7的载体介导的肌肉特异性表达不仅是一种用于防止肌肉萎缩甚或是过度的ActRIIB信号传导的新方法，而且也是一种提高肌肉质量和功能的手段，严重脱靶效应的风险有限。

因此，本文提供了一种组合物，包含重组腺相关病毒(rAAV)构建体中的Smad7基因或cDNA，其中所述rAAV构建体提供Smad7基因或cDNA在肌肉细胞中的表达(组成型或其他方式)。以此类组合物的非限制性示例的方式，在某些实施方案中，所述rAAV构建体是血清型6(rAAV6)、血清型8(rAAV8)或血清型9(rAAV9)。以此类组合物的非限制性示例的方式，在某些实施方案中，所述Smad7基因或cDNA来源于人、鼠、马、牛、犬或猪。

在另外的实施方案中，所述rAAV构建体包含指导Smad7基因或cDNA在肌肉细胞中表达的组织特异性启动子或增强子。或者，所述rAAV构建体提供Smad7基因或cDNA在心肌细胞、骨骼肌细胞或二者中的表达。并且在另外的实施方案中，所述rAAV构建体包含将Smad7基因或cDNA的表达限制在肌肉细胞或心脏细胞的组织特异性沉默子。

另外的实施方案是提高受试者中的肌肉质量和/或强度的方法，包括将包含本文提供的重组腺相关病毒(rAAV)构建体中的Smad7和cDNA的治疗有效量的组合物施用于受试者。在此类方法的示例中，受试者未被诊断患有肌肉萎缩病症或疾病。例如，此方法中的受试者一般可以是健康的。因此，本文中设想的是本文所述组合物和方法的美容或选择性(elective)用途以提高受试者的上述基线或“正常”的肌肉质量和/或强度。

另一个实施方案是一种治疗被诊断为患有癌症恶病质的受试者中的肌肉萎缩(例如，心肌萎缩、骨骼肌萎缩或二者)的方法，包括选择患有癌症恶病质的受试者并将包含重组腺相关病毒(rAAV)构建体中的Smad7基因或cDNA的治疗有效量的任一组合物施用于受试者，其中所述rAAV构建体提供Smad7基因或cDNA在肌肉细胞中的表达(组成型或其他方式)。还提供了采用此组合物治疗肌肉萎缩以增加肌肉强度和/或肌肉体积的方法。进一步的实施方案是抑制或防止受试者中肌肉萎缩的方法，包括将治疗有效量的此种组合物施用于受试者。

通过治疗方法实施方案中的示例，一些情况下的肌肉萎缩是由慢性病症引起的。非意在限制，在多种情况下，慢性病症包括癌症、老化(少肌症)、肌营养不良、肌肉病变、肾脏疾病、慢性阻塞性肺病、慢性感染、AIDS、废用性萎缩、神经肌肉损伤、神经病变、肥胖、心血管疾病或其两种或多种的组合。或者，肌肉萎缩是由微重力应激引起的。

在提供的任一方法实施方案中，所述组合物在某些情况下通过肌内或静脉内注射来递送。

在提供的任一方法实施方案中，在某些情况下，施用rAAV包括施用单剂rAAV。在其他情况下，所述方法包括施用多剂rAAV。

从下文对若干实施方案的详细说明并参考附图，前述和其他特性与优点将变得更加明显。

附图简要说明

图1A-1I示出，根据具体方面，增加Samd7的表达促进骨骼肌肥大。(图1A-1B)用rAAV:Smad7注射小鼠四肢肌肉在7至28天之间增加了肌肉质量。(图1C-1D)肌肉肥大与增加的肌纤维直径有关(*，p＝0.03vs对照，每次治疗三种肌肉中计算～500根肌纤维，t-检验)。比例尺，100μm。(图1E-1F)小鼠IV注射rAAV6:Smad，并在28天后，导致了TA(*，p＝0.02vs对照,n＝3，t-检验)、四头肌(*，p＝0.004vs对照，n＝3，t-检验)和三头肌(*，p＝0.003vs对照，n＝3，t-检验)的肥大并且提高了在TA、四头肌和心脏中的Smad7蛋白表达。(图1G)在给药后的所有三个时间点，rAAV6:Smad7抑制了Smad3的磷酸化(*，p＝0.006vs对照,n＝4,T-检验)。(图1H)治疗后28天，对注射有rAAV6:Smad3-CA(n＝3)、rAAV6:Smad7(n＝5)或rAAV6:Smad7和rAAV6:Smad3-CA(n＝5)的小鼠进行检查，检查了对TA质量和蛋白表达的作用(^，p<0.001vs对照，#，p<0.001vs对照，+，p<0.001vs Smad7，采用单因素方差分析)。(图1I)苏木精和伊红染色的冷冻切片表明与仅接受rAAV6:Smad7相比，接受rAAV6:Smad7和rAAV6:Smad3-CA后28天检查的肌肉中的肌肉纤维更小。比例尺，100μm。

图2A-2D示出，根据具体方面，全身性rAAV6:Smad7施用的特异性和骨骼肌肥大的诱导。(图2A)rAAV6:Smad7的静脉内施用后，在小鼠的骨骼肌和心脏中而不是在肝、肾、肺、脾或脂肪中检测到Smad7蛋白表达(如Western印迹所确定的)。(图2B)Smad2/3基因靶在有C26肿瘤的野生型小鼠(假治疗(sham))和注射有rAAV6:Smad7的C26小鼠的非肌肉组织中的基因表达(CTGF，结缔组织生长因子；COL1A1，胶原蛋白1a1型；PAI1，血纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂1；FN，纤连蛋白)。检测到C26与C26+Smad7之间无显著差异(*p<0.05，与假治疗相比)。(图2C)采用Van Gieson染料得到的完整血管的组织学证据和给予rAAV6:Smad7的小鼠的组织中无大出血。(图2D)rAAV6:Smad7使肌纤维直径增加，通过代表性的苏木精和伊红染色的冰冻切片证明(比例尺，100μm)。

图3A-3G示出，根据具体方面，Smad7不依赖于Akt和mTOR信号传导调节骨骼肌生长。(图3A)肌内注射rAAV6:Smad7后14天所检查的肌肉表明蛋白质合成的分速率(fractional rate)上调(n＝5-6,t-检验)。(图3B)给小鼠注射rAAV6:Smad7，28天后，AktS⁴⁷³或其底物GS3β^S9/21和TSC2^S939的磷酸化没有增加(ND＝无差异，n＝6-7，t-检验)。rAAV6:Smad7增加了S6RP^S235/236(n＝6,t-检验)和4EBP1^T37/42(n＝4-5，每次治疗，t-检验)的磷酸化。(图3C)rAAV6:Smad7递送后的28天，Akt激酶活性没有改变。Neg＝未添加ATP的阴性对照。pAkt被归一化至总Akt水平(n＝4-5，t-检验)。(图3D)施用雷帕霉素抑制了S6RP^S235/236(n＝4-5，双因素方差分析)和4EBP1^T37/43(n＝4-5，双因素方差分析)的磷酸化。(图3E)将雷帕霉素每天施用于用rAAV6:Smad7治疗的动物(n＝6)。胫骨前肌(TA)质量表示为相对于对侧的对照肌肉的百分比变化。(图3F)rAAV6:Smad7抑制了MAFbx(n＝9-11，t-检验)和MuRF1(n＝9-11，t-检验)的转录，而治疗后14天，rAAV6:Smad3-CA使二者都增加(n＝4，t-检验)。(图3G)rAAV6:Smad3-CA与rAAV6:Smad7的共同施用防止了Smad7对MAFbx(n＝5)和MuRF1(n＝5)转录的抑制作用(n＝5，t检验)。

图4A-4G示出，根据具体方面，Smad7防止肌肉生长抑制素和激活素诱导的肌肉萎缩。(图4A-4B)局部rAAV6:Smad7施用后14天(^，p<0.001vs Mstn+/+对照，#，p＝0.003vsMstn-/-对照，+，p<0.001vs Mstn-/-对照，n＝5-6，双因素重复测量方差分析)和28天(*，p<0.001vsMstn+/+对照，#，p＝0.001vs Mstn-/-对照，+，p＝0.01Mstn-/-vs Mstn+/+，n＝6-8，双因素重复测量方差分析)，检查野生型和肌肉生长抑制素-缺失型小鼠中的肌肉质量和肌纤维。比例尺＝100μm。(图4C)28天后，Smad7在肌肉生长抑制素缺失型小鼠中诱导的肥大相对较小(^，p＝0.03vs对照，双因素方差分析)。(图4D)与野生型小鼠(*，p＝0.001vs对照，n＝4，双因素重复测量方差分析)相比，Smad7对Smad3^s432/435磷酸化的抑制在肌肉生长抑制素-缺失型小鼠(*，p＝0.006vs对照，n＝4，双因素重复测量方差分析)中是保守的。(图4E-4F)rAAV6:Smad7单独施用或与rAAV6:肌肉生长抑制素一起施用(*，p<0.001vs对照,#，p<0.001vs对照，+，p＝0.004vs Smad7，n＝7-15，单因素方差分析)或与rAAV6:激活素A一起施用(*，p<0.001vs对照，#，p＝0.003vs对照，n＝3-6，单因素方差分析)，治疗28天后。(图4G)肌肉中的Smad3^S432/435磷酸化，所述肌肉单独表达肌肉生长抑制素(*，p＝0.015vs对照，#，p<0.001vs对照，+，p<0.001vs肌肉生长抑制素治疗，n＝4-9，单因素方差分析)或激活素A(*，p＝0.01vs对照，#，p<0.001vs对照,治疗，+，p<0.001vs激活素A治疗n＝5-7，单因素方差分析)以及存在Smad7。

图5A-5C示出，根据具体方面，在单独施用或与rAAV6:Smad7共同施用期间肌肉生长抑制素和激活素A表达相当。施用rAAV6后的28天，由RT-PCR确定(图5A)激活素A和(图5B)肌肉生长抑制素转基因的基因表达。与单独的激活素A或肌肉生长抑制素的表达水平相比，当与Smad7共表达时，激活素A或肌肉生长抑制素基因表达没有差异(ND＝无差异，n＝3-6，t-检验)。(图5C)相似地给予rAAV6:Smad7和/或rAAV6:Mstn的小鼠的胫骨前肌中的肌肉生长抑制素蛋白水平。还在给予rAAV6:ActA的小鼠中测量了激活素A蛋白水平，但没有检测到，因为激活素A经分泌且在胞内或胞外却没有储存。

图6A-6I示出，根据具体方面，由C-26肿瘤植入诱导的癌症恶病质。(图6A)检查前～21天植入C-26肿瘤诱导体重降低了25％(^，p<0.001vs对照，无肿瘤质量，n＝13-14，t-检验)。(图6B-6C)携带C-26肿瘤的小鼠中四头肌和心脏质量降低(*，p<0.001vs对照，n＝13-14，t-检验)。(图6D)携带C-26肿瘤的小鼠中附睾脂肪质量降低(*，p<0.001vs对照，n＝6-7，t-检验)。(图6E)增加的Smad7表达防止由携带C-26肿瘤小鼠的原位TA肌肉产生的最大收缩力的减少(^，p<0.001vs对照，#，p＝0.03vs对照，n＝8-9，双因素方差分析)。(图6F)用层粘连蛋白(红色)和MHCIIa(IIa型，绿色)双标记TA肌肉的横截面以评估IIa型和IIx/b型纤维(未反应)的面积。(图6G)Smad7防止了携带肿瘤小鼠的肌肉中IIa型(^，p<0.001vs对照，#，p<0.001vs对照，+，p<0.001vs C-26，n＝8，双因素方差分析)和IIx/b型(*，p＝0.002vs对照，+，p＝0.001vs C-26，n＝8，双因素方差分析)纤维的面积的减少。(图6H-6I)健康小鼠和接受rAAV6:Smad7或假治疗载体的携带肿瘤的小鼠的肌肉按纤维类型成比例(*，p＝0.02vs对照组，n＝8，双因素方差分析)。

图7A-7K示出，根据具体方面，增加Smad7表达防止癌症恶病质。(图7A)递送到接受C-26肿瘤的小鼠的四肢肌肉中的rAAV6:Smad7维持了质量(*，#，p<0.001vs对照+，p<0.001vs C-26，n＝ll-14)、(图7B)力产生能力(*，#，p<0.001vs对照，+，p<0.001vs C-26，n＝11-14)和(图7C)肌纤维横截面积(CSA，*，#，p<0.001vs对照，+，p<0.001vs C-26，n＝8)。(图7D)在来自健康和携带肿瘤小鼠的肌肉中的Smad7表达(western印迹)。(图7E)肿瘤植入(肿瘤负荷增加时，右幅)后的7天(^，p<0.001vs对照，#，p＝0.01vs对照，+，p<0.001vs C-26对照，n＝5-7)和14天(*，p＝0.03vs对照，#，p＝0.004vs对照，+，p＝0.02vs C-26对照，n＝5-6)递送的rAAV6:Smad7维持了质量(^，p<0.001vs 7天，n＝10，t-检验)。(图7F)全身rAAV6:Smad7治疗减轻了体重的损失(*，p＝0.005vs对照，#，p<0.001vs对照)，并(图7G)防止了肌肉质量的损失(腓肠肌-Ga,p<0.001vs对照，#，p<0.001vs对照，+，p＝0.04vs C-26，n＝4-7；四头肌-Qd，*，p<0.001vs对照，#，p<0.001vs对照，+，p＝0.01vs对照，n＝4-14；三头肌-Tr，p<0.001vs对照，#，p＝0.002vs对照，+，p＝0.007vs C-26，n＝4-14)。(图7H)接受了假治疗或rAAV6:Smad7的对照和携带肿瘤小鼠的图像。(图7I)来自接受了假治疗或rAAV6:Smad7的对照和携带肿瘤小鼠的TA肌肉的苏木精和伊红染色的冰冻切片。注射rAAV6:Smad7后4周抑制素缺失型小鼠(inha-KO)中的(图7J)TA肌肉质量(^，p<0.001vs 10组，n＝4)和(图7K)肌纤维直径(*，p＝0.02vs对照，#，p＝0.004vs对照，+，p＝0.006vs inha-KO)。除非另外指明，数据由双因素方差分析得到。比例尺，100μm。

图8A-8K示出，根据具体方面，全身rAAV6:Smad7施用不影响内脏器官质量或脂肪质量。(图8A-8B)在来自健康和携带肿瘤小鼠的心脏(*，p＝0.001vs对照，n＝3，单因素方差分析)、四头肌(*，p＝0.02vs对照，n＝3，单因素方差分析)和TA肌肉(+，p＝0.008vs对照，n＝3，单因素方差分析)中检查Smad7蛋白和基因表达。(图8C)通过全身rAAV6:Smad7施用维持了TA肌肉质量(^，p<0.001vs对照，#，p<0.001vs对照，+，p<0.001vs C-26，n＝8-14，双因素方差分析)。(图8D)代表性图像表明rAAV6:Smad7维持了三头肌和四头肌的肌肉质量。(图8E)肿瘤质量在接受了假治疗载体或rAAV6:Smad7之间无差异(ND＝组间无差异，n＝8-14，t-检验)。(图8F-8G)全身rAAV6:Smad7施用不能防止肿瘤诱导的肝(*，p＝0.004vs对照，n＝8-14，双因素方差分析)、肾(*，p<0.001vs对照，n＝4-7，双因素方差分析)或附睾脂肪质量(*，p<0.001vs对照，n＝3-7，双因素方差分析)的损失。(图8H-8U)全身rAAV6:Smad7施用防止了携带肿瘤小鼠中的心肌萎缩(质量归一化，相对于胫骨长度)(^，p<0.001vs对照#,p<0.001vs对照，+，p<0.001vs C-26，n＝7-ll，双因素方差分析)。苏木精&伊红，比例尺，100μm。照片刻度，0.2cm。(图8J)相对于胫骨长度归一化心房重量。(图8K)Smad7不影响心房重量或肺质量(相对于胫骨长度归一化，ND＝无差异，n＝4-1l，双因素方差分析)。

图9A-9C示出，根据具体方面，抑制素缺失型小鼠体现出瘦体重和脂肪质量(leanand fat mass)的渐进性损失。(图9A)从6周龄开始，评估了抑制素缺失小型鼠及其的同窝出生对照中的脂肪质量(*，p＝0.001vs 11周龄WT对照，+，p<0.001vs.12周龄WT对照)、瘦体重(*，p＝0.04vs 9周龄WT对照，+，p＝0.005vs 10周龄WT对照，#，p<0.001vs 11-12周龄WT对照)和总体重(*，p＝0.008vs 10周龄WT对照，+，p<0.001vs 11-12周龄WT对照)(n＝4，双因素方差分析的数据)。(图9B)与野生型同窝仔畜相比，抑制素-α缺失型小鼠中的性腺肿瘤质量增加(^，p＝0.008vs WT对照，t-检验，n＝4)。(图9C)与WT对照相比，抑制素-α缺失型小鼠的四头肌质量降低(^，p＝0.001vs WT对照，t-检验，n＝4)。

图10A-10F示出，根据具体方面，Smad7调节规范化的TGFyβ信号传导通路和E3连接酶表达以防止癌症恶病质中的肌肉萎缩。(图10A)在恶病质小鼠中测量激活素A和激活素B的血清水平(UD＝未确定*，p<0.001vs对照，n＝4-1l，t-检验)。(图10B)植入肿瘤并注射rAAV6:Smad7后21天收集血清并与C2C12细胞一起用于激活的Smad2/3报告基因测定(^，p＝0.01vs对照，n＝3，重复三次，双因素方差分析，ND＝无差异)。(图10C)在来自携带C-26肿瘤的小鼠(*，p＝0.01vs对照，#，p＝0.005vs对照，+，p<0.001vs C-26,n＝8-13，双因素方差分析)和用rAAV6:Smad7治疗的抑制素-α缺失型小鼠(^，p＝0.03vs对照，#，p<0.001vs对照，+，p<0.001vs抑制素-α缺失，n＝4，双因素方差分析)的TA肌肉中测量Smad3^S432/435磷酸化。(图10D)在健康小鼠和携带肿瘤的小鼠中，通过Western印迹Foxo1(^，p<0.001vs对照，#，p＝0.04vs C-26，n＝5-6每个治疗，双因素重复测量方差分析)和Foxo3(*，p<0.001vs对照，#，p＝0.04vs C-26,n＝5-6每个治疗，双因素重复测量方差分析)来确定总Foxo蛋白水平。(图10E-10F)Smad7抑制了Foxo1(^，p<0.001vs对照，#，p＝0.001vs C-26，n＝5-8每个治疗，双因素方差分析)和Foxo3(*，p＝0.002vs对照，#，p＝0.004vs C-26,n＝5，每次治疗，双因素方差分析)以及MuRF1(*，p<0.001vs对照，#，p<0.01vs C-26,n＝4-8，双因素方差分析)和MAFbx(*，p<0.001vs对照，#，p<0.001vs C-26，n＝4-8，双因素方差分析)的转录。

图11A-11E示出，根据具体方面，Smad7没有改变恶病质中的Foxo磷酸化或NF-κB信号传导。(图11A)植入肿瘤并注射rAAV6:Smad7或假治疗载体后21天通过ELISA来测量血清激活素A水平(*，p<0.001vs对照，#，n＝4，每队列，双因素方差分析)。(图11B)通过ELISA来测量用rAAV6:Smad7或假治疗载体治疗的携带肿瘤小鼠中的血清IL-6水平(n＝4-5)。在携带C-26肿瘤并用rAAV6:Smad7治疗的小鼠的TA骨骼肌中的(图11C)Stat3、(图11D)p65和(图11E)Foxo1/3磷酸化(*，p<0.02vs对照，n＝5-11，双因素方差分析)。

图12示出Smad7AAV载体，pAAV-MCS_smad7stp 081809.cep的图谱；SEQ ID NO:3(6108碱基对)中提供了相应的序列。

序列表

用表示核苷酸碱基的标准字母缩写来表明随附的序列表中列出的核酸和氨基酸序列，如37C.F.R.1.822所定义的，三个字母代码表示氨基酸。仅示出每个核酸序列的一条链，但应理解为对所显示链的任何引用包括互补链。

SEQ ID NO:1和2是用于检测激活素A的代表性正反向引物(F:GGAGTGTGATGGCAAGGTCAACA，R:GTGGGCACACAGCATGACTTA)。

SEQ ID NO:3和4是用于检测肌生成抑制素的代表性正反向引物(F:CCCAGAGGTTCAGCAGGCCCT，R:TCATGAGCACCCACAGCGGTC)。

SEQ ID NO:5是Smad7AAV载体pAAV-MCS_smad7stp 081809.cep的序列。

I.缩写

AAV 腺相关病毒

ActRIIB IIB型激活素受体

ALK 激活素样激酶

IEE 整合效率元件

ITR 反向末端重复序列

CTGF 缔结组织生长因子

COL1A1 胶原蛋白1a1型

FN 纤连蛋白

ND 无差异

ORF 开放阅读框

PAI1 血纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂1

rAAV 重组腺相关病毒

SEM 平均值标准误差

TA 胫骨前肌

TRS 末端解离位点

WT 野生型

II.术语和方法

除非另有说明，根据常规用法使用技术术语。分子生物学中通用术语的定义可在Oxford University Press,1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等(eds.),TheEncyclopedia of Molecular Biology,published by Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN 0-632-02182-9)；和Robert A.Meyers(ed.),Molecular Biology andBiotechnology:a Comprehensive Desk Reference,published by VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8)中找到。

为帮助审视(review)本公开各个实施方案，提供了以下术语的具体解释。

腺相关病毒(AAV)：一种感染人和一些其他灵长类物种的小的复制缺陷型非包膜病毒。尚不知晓AAV致病，以及会产生轻微的免疫反应。利用AAV的基因治疗载体能感染正在分裂的细胞和休眠的细胞并能在染色体外的状态下持续存在，而不需整合到宿主细胞的基因组中。这些特性使得AAV成为一种有吸引力的基因治疗用病毒载体。目前，有11种已知的AAV血清型(AAV1-AAV11)。

施用(administration)/施用(administer)：通过任意有效途径向受试者提供或给予物质(agent)，如治疗剂(例如，重组AAV)。示例性施用途径包括但不限于注射(如皮下、肌肉内、皮内、腹膜内和静脉内)、口服、导管内、舌下、直肠、经皮、鼻内、阴道和吸入途径。

密码子优化的：一种“密码子优化的”核酸是指已被更改从而使密码子优化以在特定的系统(如特定物种或物种群)中表达的核酸序列。例如，核酸序列被优化以在哺乳动物细胞或在特定的哺乳动物物种(如人细胞)中表达。密码子优化不会改变所编码的蛋白质的氨基酸序列。

增强子：一种通过增强启动子的活性来增加转录速率的核酸序列。

感染性的：当病毒或载体转导细胞、复制并将与原始转导病毒或载体类型相同的后代载体或病毒扩散到生物体或细胞培养物中的其他细胞时，病毒或载体是“感染性的”，其中所述后代载体或病毒具有相同的在整个生物体或细胞培养物中复制和扩散的能力。因此，例如，如果核酸不能被包装(例如，如果腺病毒颗粒缺少包装位点)，即使核酸可用于转染细胞，则编码腺病毒颗粒的核酸不是感染性的。类似地，如果由腺病毒颗粒包装的腺病毒核酸不编码其内包装有该核酸的腺病毒衣壳蛋白，则它是无感染性的。

内含子：不含有蛋白编码信息的基因中的一段DNA。在翻译信使RNA前去除内含子。

反向末端重复序列(ITR)：有效复制所需的腺相关病毒的基因组中的对称核酸序列。ITR序列位于AAV DNA基因组的各个末端。ITR用作病毒DNA合成的复制起点，并且是生成AAV整合载体的至关重要的顺式组分。

分离的：“分离的”生物组分(如核酸分子、蛋白质、病毒或细胞)基本上已经与生物体的细胞或组织或生物体本身(所述组分天然存在于其中)中的其他生物组分分离或纯化，如其他染色体和染色体外的DNA和RNA、蛋白质和细胞。已经分离的核酸分子和蛋白质包括由标准纯化方法纯化的那些。该术语还包含通过在宿主细胞中重组表达制得的核酸分子和蛋白质以及化学合成的核酸分子和蛋白质。

哺乳动物：该术语包括人和非人哺乳动物。类似地，术语“受试者”包括人和兽医学受试者。

可操作地连接：当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能性关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，那么启动子与编码序列可操作地连接。一般地，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且必要时，在同一阅读框架内连接两个蛋白编码区。

包装细胞：一种为用转移载体导入细胞中的基因提供反式包装功能，但是不包封其自身基因组的细胞。

包装载体：包装载体核酸缺少将与包装载体核酸对应的DNA包装入腺病毒衣壳中所必须的核酸。也就是说，包装载体核酸本身并不包封在它们所编码的病毒颗粒中，即它们不是感染性的。包装载体任选地包括生产病毒颗粒所必需的所有组分，或任选地包括病毒包装所必需的组分的一部分。例如，包装细胞可以用多于一个的包装载体转化，每个包装载体在腺病毒颗粒的生产中发挥互补作用。

当两个(或多个)基于腺病毒的包装载体一起编码腺病毒包装所必需的所有功能并且它们各自不编码包装所必需的所有功能时，它们是“互补的”。例如，当两个载体转导单一细胞并且它们一起编码生产腺病毒包装颗粒的信息时，这两个载体是“互补的”。通过减少重组事件将产生感染性病毒的可能性，使用互补载体增加用包装载体进行转化制得的任意包装细胞的安全性。

药学上可接受的载体：在本公开中使用的药学上可接受的载体(运载体)是常规的。Remington's Pharmaceutical Sciences(E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,PA,15th Edition(1975))中描述了适于一种或多种治疗化合物、分子或物质的药物递送的组合物和制剂。

一般地，载体的性质取决于所采用的具体施用模式。例如，肠胃外制剂通常包括可注射液体，所述可注射液体包括药学上和生理学上可接受的液体如作为运载体的水、生理盐水、平衡盐溶液、水性葡萄糖(aqueous dextrose)、甘油等。对于固体组合物(例如，粉末、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的无毒固体载体可包括，例如，药物等级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学上中性的载体之外，待施用的药物组合物可含有少量的无毒辅料，如润湿或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如醋酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。

预防、治疗或减轻疾病：“预防”疾病(如癌症)或与疾病有关联的症状(如癌症恶病质)是指抑制疾病或症状的完全发展。“治疗”是指疾病或病理状况已经开始发展后减轻其体征或症状的治疗性干预。“减轻”是指疾病体征或症状的数量或严重性的降低。

启动子：指导/启动核酸(例如，基因)转录的DNA区域。启动子包括转录起始位点附近的必要核酸序列。通常，启动子位于它们所转录的基因附近。启动子还任选地包括可位于离转录起始位点几千个碱基对处的远端增强子或抑制子元件。

纯化的：术语“纯化的”不要求绝对的纯度；确切地说，它是相对的术语。因此，例如，纯化的肽、蛋白质、病毒或其他活性化合物是与天然相关的蛋白质和其他污染物全部或部分分离的化合物。在某些实施方案中，术语“基本上纯化的”是指肽、蛋白质、病毒或其它活性化合物已经与细胞、细胞培养基或其它粗制品分离并进行分级分离以去除初始制剂的多种成分如蛋白质、细胞碎片及其他成分。

重组的：重组核酸分子是具有非天然存在的序列或具有通过对序列的两个(如果不组合，是分离的)序列区段进行人工组合制得的序列的分子。该人工组合可以通过化学合成或通过对分离的核酸分子区片段进行人工处理如通过基因工程技术来完成。

类似地，重组病毒是包含非天然存在的或通过对至少两个不同来源的序列进行人工组合制得的序列的病毒。术语“重组的”还包括已经仅通过对部分天然核酸分子、蛋白质或病毒的添加、取代或缺失来改变的核酸、蛋白质和病毒。如本文所使用的，“重组AAV”是指其内已经包装有重组核酸分子的AAV颗粒。

序列相同性：以序列之间的相同性或相似性来表达两个或多个核酸分子或者两个或多个氨基酸序列之间的相同性或相似性。以百分比相同性来度量序列相同性；百分比越高，序列越相同。以百分比相似性来度量序列相似性(考虑保守性氨基酸取代)；百分比越高，序列越相似。当采用标准方法进行比对时，核酸或氨基酸序列的同源物或直系同源物具有比较高程度的序列相同性/相似性。与关系疏远的物种(如人和线虫序列)相比，源自关系更密切的物种直系同源蛋白或cDNA的同源性更显著。

用于比较的序列对比的方法在本领是公知的。以下文献中描述了各种程序和比对算法：Smith&Waterman,Adv.Appl Math.2:482,1981；Needleman&Wunsch,J.Mol Biol 48:443,1970；Pearson&Lipman,Proc.Natl Acad.Sci.USA 85:2444,1988；Higgins&Sharp,Gene,73:237-44,1988；Higgins&Sharp,CABIOS 5:151-3,1989；Corptt等,Nuc.AcidsRes.16:10881-90,1988；Huang a/.Computer Appls.in the Biosciences 8,155-65,1992；以及Pearson等,Meth.Mol Bio.24:307-31,1994。Altschul等,J.Mol Biol215:403-410,1990提出了序列比对方法和同源性计算的详细考虑。

NCBI基本局部比对检索工具(BLAST)(Altschul等，J.Mol Biol.215:403-10,1990)可从多种来源获得，包括美国国家生物技术中心(NCBI)和互联网，用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx连接。更多有关信息请访问NCBI网站。

血清型：一组关系密切的微生物(如病毒)，区别在于抗原的特征性集合。

Smad(SMAD)蛋白：在脊椎动物、昆虫和线虫中发现的转录因子家族。SMAD是将胞外信号配体转导至细胞核的胞内蛋白质，其在细胞核激活下游基因转录。一般地，SMAD形成两个受体调节的SMAD和一个co-SMAD的三聚体。

Smad7是果蝇基因Mothers against decapentaplegic的同源物7。它是TGFβ1型受体拮抗物。它阻断与受体相关的TGFβ1和激活素，阻断接近SMAD2。它是抑制性SMAD(I-SMAD)并由SMURF2增强。

编码Smad7的代表性核苷酸序列包括：人(NM_005904.3)；小鼠/鼠(NM_001042660.1)；牛(cattle)/牛(bovine)(NM_001192865.1)；狗/犬(XM_005623131.1)；猪(pig)/猪(porcine)(NM_001244175.1)；绵羊/羊(XM_012120929.1)；以及马(horse)/马(equine)(XM_001499061.5)。这些基因库登录码的内容通过引用并入本文，于2016年4月22日可获得。

受试者：活的多细胞脊椎动物生物体，包括人和非人哺乳动物的一类。例如，可调整本文所描述的治疗组合物或治疗中使用的Smad7序列以匹配用其治疗的物种(例如，用于人受试者的治疗的人序列；狗受试者上的狗序列，等)。

合成的：在实验室中以人工手段进行生产，例如，合成的核酸可在实验室化学合成。

治疗有效量：足以在用物质治疗过的受试者中或细胞中达到所需效果的特定药物剂或治疗剂(例如，重组AAV)的量。物质的有效量取决于若干因素，包括但不限于正被治疗的受试者或细胞，以及治疗组合物的给药方式。

治疗(treating)或治疗(treatment)：包括将组合物应用或施用于受试者，或者将组合物应用或施用于有肌肉萎缩症状如癌症恶病质的受试者的细胞或组织，目的在于治疗、治愈、缓解、减轻、改变、补救、改善、提高或影响疾病或病症，疾病或病症的症状或疾病或病症的风险。

载体：载体是允许外源核酸插入而不干扰载体在宿主细胞中复制和/或整合的能力的核酸分子。载体可包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，如复制起点。载体还可包括一个或多个可选择的标志基因和其他遗传因子。表达载体是含有允许插入基因或基因的转录和翻译的必要调控序列。在本文的一些实施方案中，载体是AAV载体。

除非另有解释，本文所使用的所有技术和科学术语都具有与本公开所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。单数术语“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数参照物，除非上下文另有明确的指示。“包括A或B”意指包括A或B或A和B。应进一步理解的是针对核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值都是近似的，并提供用于说明。尽管与本文描述相似或等同的方法和材料可用于本公开的实践或测试中，但是适宜的方法和材料在下文有说明。本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考都通过引用整体并入。为避免冲突，将控制本说明书，包括术语的解释。此外，材料、方法和示例仅是示例性的，并不旨在限制。

发明详述

肌肉质量和强度的损失是许多癌症病人中预后不良的主要指标(Tisdale,Physiol Rev 89,381-410,2009；Fearon等,Cell metabolism 16,153-166,2012；Dodson等.Annu Rev Med 62,265-279,2011)。本文中我们首次表明基于基因疗法的靶向AcrRIIB信号传导的干预(Llovera等,Biochem Biophys Res Commun 221,653-655,1996；Llovera等,Mol Cell Endocrinol 142,183-189,1998；Cai等,Cell 119,285-298,2004；Wykt等,BrJ Cancer 91,1742-1750,2004；Watchorn等,Int J Oncol 27,1105-1111,2005；Wyke&Tisdale,Br J Cancer 92,711-721,2005)是防止与肿瘤进程相关的肌肉萎缩的有效手段。由于目前正在发展针对神经肌肉紊乱和非肌肉疾病(Mingozzi&High，Nat Rev Genet 12，341-355，2011)的基于基因的疗法，所以我们主张本文所述的策略可转化为能够减少与癌症恶病质的背景和有过度AcrRIIB信号传导的其他疾病中的肌肉萎缩相关的发病率和死亡率的干预。

根据具体的方面，考虑到肌肉生成抑制素和激活素的循环浓度升高可引起骨骼肌萎缩，并且与癌症、老化和发生肌肉萎缩的慢性疾病的病症有关(Fearon等，Cellmetabolism 16，153-166,2012；Zimmers等，Science 296，1486-1488，2002；Coerver等，MolEndocrinol 10，534-543，1996；Harada等，J Clin Endocrinol Metab 81，2125-2130，1996；Costelli等，Eur J Clin Invest 38，531-538，2008；Heineke等，Circulation 15121，419-425，2010；Penna等，PLoS One 5，el3604,2010；Ju&Chen等，Respir Med 106，102-108，2012；Otani等，Gynecol Oncol 83，31-38，2001；Seder等，Neoplasia 11，388-396，2009；Wildi等，Gut 49，409-417，2001；Han等，Int JBiochem Cell Biol，45:2333-2347，2013)，已经投入了相当大的努力以开发能够减轻过度AcrRIIB信号传导的有害效应的干预，所述干预通过靶向循环中引起所述有害效应的配体进行(Fearon等，Cell metabolism16，153-166，2012；Benny Klimek等，Biochem Biophys Res Commun 391，1548-1554，2010；Zhou等，Cell 142，531-543，2010)。

然而，由于与在胞外水平抑制多效性配体相关的潜在副作用，基于此类配体陷阱的疗法的可行性仍存在问题(Massague,Nat Rev Mol Cell Biol 13,616-630,2012)。为了避免这些问题，我们研究了在肌肉纤维内抑制ActRIIB信号传导是否是一种不直接结合配体就抑制萎缩的策略。我们发现当受到肌肉生长抑制素和激活素A的实验性过表达的挑战时，用rAAV6:Smad7治疗的肌肉避免了萎缩。我们还确定了，rAAV6:Smad7可减轻全身肌肉萎缩，不受肿瘤负荷和原恶病质配体的持续升高的循环水平的影响。这些结果表明，我们的方法用于使维持肌肉质量的关键胞内信号传导过程中涉及的活性与利用这些通路促进肌肉萎缩的配体的作用去关联(dissociating)的效用。此外，rAAV6:Smad7的效能实质上与说明恶病质小鼠中的可溶性ActRIIB配体陷阱的效能相同(Zhou等，Cell 142，531-543，2010)，然而，rAAV6:Smad7对横纹肌更有特异性，并且基于我们的结果，不可能产生脱靶效应。

根据具体的方面，最重要的是，在用rAAV6:Smad7治疗的任意小鼠中都没有检测到与ACE-031(主要由ActRIIB的胞外结构域构成的肽体配体陷阱)相关的脱靶标志。在非肌肉组织或Samd7生物活性的标记中也没有Smad7表达。后者包括内部标记如肺部重量和形态的变化或被破坏(compromised)的微血管的证据以及显而易见的外部标记如耳朵、鼻子和尾巴上的瘀伤。尽管可假定此类标记断断续续地出现，但是我们的方法的组合特异性和没有任何可检测HHT标志强烈地表明，作为ActRIIB配体陷阱的替代，rAAV6:Smad7是一种安全并可能是更加有效的选择。

根据具体的方面，从机理上讲(mechanistically)，ActRIIB信号传导可通过抑制肌肉蛋白的合成并促进蛋白质降解来促进肌肉分解代谢(Amirouche等，Endocrinology150，286-294，2009；Trendelenburg等，Am J Physiol Cell Physiol 296，C1258-1270，2009；Durieux等，Endocrinology 148，3140-3147，2007；Lokireddy等，Mol Endocrinol25，1936-1949,2011)。本文所描述的我们的研究表明Smad7的过表达增加了与蛋白质合成相关的S6K/S6RP信号传导，但不是通过根据Akt和mTOR的激活而定的机制。我们还观察到Smad7在恶病质肌肉中的过表达降低了E3泛素连接酶MuRFl和Atrogin-1的转录，其活性帮助骨骼肌中的蛋白酶体降解。Smad7对合成代谢和分解代谢信号传导的作用取决于Samd2/3磷酸化的抑制，但是在所研究的所有小鼠模型中Smad7易于防止与增加的肌肉生成抑制素和激活素水平相关的过度Smad2/3磷酸化。这些结果支持Smad7表达增加代表抑制过度的ActRIIB:ActRI介导的Smad2/3磷酸化的有效方法的假设，否则这会带来显著的肌肉分解代谢。

根据具体的方面，施用了rAAV6:Smad7的携带肿瘤的小鼠中骨骼肌萎缩的改善与先前报道的用可溶性ActRIIB的反复治疗相似的小鼠模型的抗分解代谢作用相媲美(Zhou等，Cell 142，531-543，2010)，尽管肿瘤扩增，但这仍延长了生存期。与恶病质小鼠接受可溶性ActRIIB的研究(Zhou等，Cell 142，531-543，2010)相似，与假手术处理的携带肿瘤的对应小鼠(counterpart)相比，采用如本文所述的用rAAV6:Smad7的全身施用治疗的携带肿瘤的小鼠没有显示出提高的脂肪质量保存。通过共同靶向其它与恶病质相关的细胞因子如TNFα(Llovera等，Biochem Biophys Res Commun 221，653-655，1996；Llovera等，Mol CellEndocrinol 142，183-189，1998)可更有效地实现改善恶病质中的脂肪分解。然而，结果表明瘦体重的守恒应该是旨在延长生存期的干预的主要目的(Fearon等，Cell Metabolism16，153-166，2012；Lee&Glass，Skelet Muscle 1，2，2011；Zhou等，Cell 142，531-543，2010)。

根据具体的方面，静脉内施用rAAV6:Smad7还防止了携带肿瘤的小鼠中的心肌萎缩，因为通过循环的rAAV6载体能转导心肌。肌肉生成抑制素和激活素A的表达增加与心脏病相关(Heineke等，Circulation 121，419-425，2010；Yndestad等，Circulation 109，1379-1385，2004；Rodgers等，JPhysiol587，4873-4886，2009)，生理性肥大和增强的心肌收缩力以及Ca²⁺处理都会发生在肌肉生成抑制素缺失型心脏中(Rodgers等，J Physiol 587，4873-4886，2009；Jackson等，J Endocrinol 213，263-275，2012；Jackson等，Endocrinology 155，1771-1785，2014)，心脏可相对地避免损伤(Bish et al.,PLoS One5,e10230,2010；Artaza et al.,J Endocrinol 194,63-76,2007)。因此，具有心肌取向性的rAAV6:Smad7载体的全身给药也构成了抑制心脏中ActRIIB介导的萎缩信号传导及保持恶病质病人中的心脏功能的诱人前景。

由于ActRIIB在许多非肌肉组织中表达并且若干TGFβ超家族配体使该受体发挥不同的组织特异性作用，配体捕获方法具有显著的引起脱靶效应的风险(Koncarevic等，Endocrinology 153，3133-3146，2012)。本文提出的数据引入rAAV6:Smad7作为优先在横纹肌中衰减ActRIIB信号传导的新方法(Gregorevic等，Nat Med 10，828-834，2004；Gregorevic等，Nat Med12，787-789，2006)。能够在骨骼肌和/或心肌中独特地指导Smad7表达的组织特异性启动子的内含物将进一步地增强特异性并已经被开发(Salva等，Mol Ther15，320-329，2007)。它们的内含物更有可能通过提供更好的控制和有可能更强的Smad7表达来提高特异性。因此，另外的研究主张优化我们的方法并在其他肌肉萎缩甚或是心力衰竭的情况下确定其效能。

AAV属于细小病毒科，依赖病毒属。AAV是一种包装线性的单链DNA基因组的小的非包膜病毒。AAV DNA的正反义链都以相同的频率包装入AAV衣壳中。

AAV基因组的特征在于位于两个开放阅读框架(ORF)侧面的两个反向末端重复序列(ITR)。在AAV2基因组中，例如，ITR的前125个核苷酸是回文，其自身折叠以最大化碱基配对并形成T形发夹结构。称为D序列的ITR的其他20个碱基保持不配对。ITR是对AAV DNA复制来说重要的顺式作用序列；ITR是复制起点并作为通过DNA聚合酶进行的第二链合成的引物。在该合成期间形成的称为复制形式的单体的双链DNA用于第二轮自启动复制并形成复制形式的二聚体。通过链置换机制处理这些双链中间体，从而产生了用于包装的单链DNA和用于转录的双链DNA。Rep结合元件和末端解析位点(TRS)位于ITR内。病毒调节蛋白Rep在AAV复制期间，这些特征被病毒调节蛋白Rep利用以处理双链中间体。除了它们在AAV复制中的作用，ITR对AAV基因组包装、转录、在非许可条件下的阴性调节和位点特异性整合来说也是必需的(Daya和Bems，Clin Microbiol Rev 21(4)：583-593，2008)。

AAV的左ORF含有Rep基因，该基因编码四个蛋白质-Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。右ORF含有Cap基因，该基因产生三个病毒衣壳蛋白(VP1、VP2和VP3)。AAV病毒衣壳含有60个排列成二十面体对称的病毒衣壳蛋白。VP1、VP2和VP3以1:1:10的摩尔比存在(Daya和Bems，Clin Microbiol Rev 21(4):583-593，2008)。

目前，AAV是基因治疗中最经常使用的病毒之一。尽管AAV感染人和其他一些灵长类物种，但不知道会引起疾病，并且它会引起非常轻微的免疫应答。利用AAV的基因治疗载体能感染分裂和静止细胞，并在不整合入宿主细胞的基因组的情况下持续以染色体外状态存在。由于AAV的有益特性，本公开考虑了用于本文公开的重组核酸分子和方法的AAV的使用。

AAV具有几个基因治疗载体理想特性，包括结合并进入靶向细胞、进入细胞核的能力、在细胞核中长时间表达的能力和低毒性。然而，AAV基因组的小尺寸限制了掺入的异源DNA的尺寸。为尽量减少这个问题，已构建不编码Rep和整合效率元件(IEE)的AAV载体。保留了ITR，因为它们是包装所需的顺式信号(Daya和Berns，Clin Microbiol Rev 21(4)：583-593，2008)。

生产适于基因治疗的rAAV的方法在本领是公知的(参见，例如，美国专利申请2012/0100606、2012/0135515；2011/0229971和2013/0072548；以及Ghosh等，Gene Ther 13(4)：321-329，2006)，并可与本文公开的重组核酸分子、载体和方法一起使用。

提供以下实施例以说明具体特性和/或实施方案。这些实施例不应解释为将所公开的内容限制于所描述的具体特性或实施方案。

实施例1：材料和方法

抗体-除了抗Samd7(Imgenex，San Diego，CA)、pSmad3(Epitomics，Burlingame，CA)和GAPDH(Santa Cruz Biotechnology，Dallas，TX)抗体，所有使用的抗体都是获得自Cell Signaling(Danvers，MA)。

rAAV载体的生产-编码Smad7(Genbank参考号NM_001042660.1)的cDNA构建体，其是从小鼠cDNA文库PCR扩增的，采用标准克隆技术将激活素A、肌肉生长抑制素和Smad3-CA(都是由GenScript，Piscataway，NJ合成的)克隆到由侧面是AAV2末端重复序列的CMV启动子/增强子和SV40聚-A区组成的rAAV表达质粒中。SEQ ID NO:5中提供了合成的载体的序列；图12提供了图谱；这些质粒与pDGM6包装质粒(其含有AAV6cap基因、AAV2rep基因并且还含有腺病毒辅助基因；Gregorevic等，Nat.Med.10，828-834，2004；通过引用并入本文)一起转染至HEK293细胞，生成了6型假型病毒载体，所述载体经收获和纯化(Gregorevic等，NatMed10，828-834，2004)。简而言之，在10cm培养皿上以3.2-3.8*10⁶的细胞密度对HEK293进行铺板，8-16小时后，用10μg含载体基因组的质粒和20μg包装/辅助质粒pDGM6进行转染，以生成假型6载体。转染后72小时，收集培养基和细胞(Merck Millipore，Billerica，MA)通过微射流机(Microfluideics，Westwood，MA)进行均质化，然后0.22μm澄清。载体在肝素亲和柱(HITRAPTM，GE Healthcare，Pittsburgh，PA)上通过亲和色谱法从澄清的溶解产物中纯化，并进行过夜超声离心，然后在无菌生理林格氏溶液中重悬。用定制的序列特异性的基于PCR的反应(Life Technologies,Grand Island,NY)滴定纯化的载体制剂。

动物实验-所有实验都是根据科学护理和动物使用的有关实践规范进行的(美国国立卫生研究院，1985；澳大利亚国家健康与医疗委员会，2013)。

针对局部载体递送，用异氟烷或氯胺酮(100mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg；腹腔注射，VM供应品，Chelsea Heights，VIC，AU)进行深度麻醉。在30μL Hank缓冲盐溶液中将给定载体的1-10*10⁹个载体基因组直接施用于下肢的前室(anterior compartment)中，其由胫骨前肌(TA)和趾长伸肌(EDL)占据。对侧肢体的对照注射使用没有功能基因的载体(rAAV6:MCS)(Han等，Int JBiochem Cell Biol,45:2333-2347，2013)。对于全身递送研究，将3-5*10¹²个载体基因组于200μL体积的HBSS中通过尾静脉施用。对于雷帕霉素实验，雷帕霉素在含有如前所述的0.2％羧甲基纤维素钠盐(Sigma，St.Louis，MO)和0.25％聚山梨醇酯-80(Sigma，St.Louis，MO)的水溶液中溶解过夜(Bourdeau等，Am J Pathol 156，911-923，2000)。在这些实验中，小鼠在rAAV6:Smad7注射前3小时开始接受每天腹腔内注射2mg/kg/天的雷帕霉素(Merck Millipore,Darmstadt,Germany)或运载体，并持续14天(包括第14天)。对于组织收获，通过颈椎脱位人为杀死小鼠，并在后续处理前迅速切下肌肉并称重。用CD2F1或BALB/c小鼠进行C-26来源的肿瘤组织的植入。将细胞或组织植入前文所述的背部的侧面(Bourdeau,等，Trends Cardiovasc Med 10，279-285，2000；Bourdeau等，Am J Pathol 158，2011-2020，2001)。简而言之，在10％DMEM培养基中传代并复原(reconstitute)细胞，传代后立即植入，同时，肿瘤块从液氮中解冻。然后，使用套管针，通过小切口将细胞或1mm³的块植入背部的侧面并在21天后杀死(terminate)小鼠。用Echo-MRI技术(Echo Medical Systems，Houston，TX)分析抑制素-α缺失型小鼠的脂肪质量、瘦体重和总体重。

实时PCR-用Trizol(Life Technologies，Thermo Fisher Scientific，Wa ltham，MA)从TA肌肉细胞中收集总RNA。用High Capacity RNA-to-cD NA试剂盒(LifeTechnologies)逆转录500-1000ng RNA。然后，在需要的试剂盒和检测软件上采用Taqman^TM聚合酶测定法通过RT-PCR分析Smad7、Foxol、Foxo3、MAFbx和MuRFl的cDNA(LifeTechnologies)。使用18S标准化cDNA浓度。采用ΔΔC_T分析法分析数据。通过Green实时PCR检测法检测激活素A(F:GGAGTGTGATGGCAAGGTCAACA,SEQ ID NO:1；R:GTGGGCACACAGCATGACTTA,SEQ ID NO:2)和肌肉生成抑制素(F:CCCAGAGGTTCAGCAGGCCCT,SEQ ID NO:3；R:TCATGAGCACCCACAGCGGTC,SEQ ID NO:4)。

ELISA-根据生产商的说明书(Oxford Bio-innovations，Oxfordshire，UK)，采用先前描述的修饰(Satomi，等，Stroke 34，783-789，2003)，通过EISA来确定小鼠血清中激活素A的浓度。根据生产商的说明书(R&D Systems，Minneapolis，MN)测量来自对照和恶病质小鼠的血清IL-6。

荧光素酶实验-采用脂质体2000(Life Technologies)在每孔含有0.35μg Smad7质粒、0.25μg pCAGA-luc质粒或0.25μg LacZ质粒的24孔板内转染C2C12细胞。16小时后，更换培养基并用来自对照或C-26携带肿瘤的小鼠的血清补充24小时。然后，用细胞裂解缓冲液(Promega，Madison,WI)裂解细胞并用光度计(Berthold，Bad Wildbad，Germany)测量荧光素酶活性。荧光素酶活性以pCAGA-荧光素酶活性与β-半乳糖苷酶受体活性的比值表示，数据代表三个独立的实验。用商业β-gal检测法检测β-半乳糖苷酶。简而言之，裂解产物在37℃用2*β-半乳糖苷酶缓冲液培养长达1小时。随后，在420nm测量β-gal表达。

组织学-将收获的肌肉置于OCT冷冻保护剂中并在液氮冷却的异戊烷中冷冻。随后，冷冻的样品以10μm的厚度冷冻切片并用苏木精和伊红染色来检查形态。使用DePeX封片剂(mounting medium)(BDH，VWR International，Radnor，PA)封装切片，用安装在1X71显微镜上的U-TV1X-2相机和PlanC 10x/0.25物镜(Olympus)拍摄染色切片的图像。DP2-BSW采集软件(Olympus)用于获取图像。对于纤维类型分析，由TA肌肉的中腹部获得连续横向冷冻切片(-20℃，CTI Cryostat；IEC，Needham Heights，MA)。截面用层粘连蛋白(#L9393，Sigma-Aldrich)染色以确定肌纤维直径与横截面(CSA)和/或用N2.261(由Dr.H.M.Blau开发，获自发展研究杂交瘤库，其在NICHD的资助下开发，并由爱荷华州爱荷华市爱荷华大学生物系维护的)染色以分别评估I型(Torsney等，Circulation 107，1653-1657，2003)和IIa型(Durieux等,Endocrinology 148,3140-3147,2007)肌球蛋白亚型的百分比。如前所述(Lokireddy等，Mol Endocrinol 25，1936-1949，2011)，假定小鼠TA肌肉中的所有非N2.261反应性纤维代表I1x/b型纤维。数字图像采用带有相机的立式显微镜(Axio Imager Dl，Carl Zeiss，Wrek，Germany)来获得，通过AxioVision AC软件(AxioVision ACRel.4.7.1，Carl 10Zeiss)进行控制和定量。采用ImageJ软件(美国国立卫生研究院，Bethesda,MD)通过测量每个小鼠TA肌肉的至少500个肌纤维来确定最小Feret’s直径和肌纤维面积，并且每组使用至少3只小鼠来量化这些变量。

Western印记-在具有COMPLETE^TM无EDTA蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Roche，巴塞尔，瑞士)的基于RIPA的裂解缓冲液(Merck Millipore)中均质化。裂解后，在4℃以1300g离心10分钟，在95℃使样品变性5分钟。用Pierce蛋白质测定试剂盒(Thermo Scientific，罗克福德，伊利诺州)确定蛋白质浓度。随后采用预制的4-12％Bis-Tris凝胶(LifeTechnologies)通过SDS-PAGE分离蛋白质组分，印记到硝酸纤维素膜(Bio-Rad,Hercules,CA)上并用适当的抗体温育过夜。采用ImageJ像素分析(美国国立卫生研究院)对标记的Western印记进行量化，数据归一化为对照值1。Western印记的密度分析以归一化为加载对照的带密度表示，并代表至少三次独立的实验。

Akt激酶测定-根据生产商的说明书进行非放射性Akt激酶测定(Cell Signaling，Danvers，MA)。收集、均质化注射有rAAV6:Smad7或rAAV6:MCS的TA肌肉，然后用针对Akt的Ser473位点的抗体对蛋白质样品进行过夜免疫沉淀。留出部分蛋白质裂解产物作为总细胞裂解产物。然后使免疫沉淀珠沉淀(pellet)，洗涤并在30℃与激酶缓冲液、ATP和GSK3a融合蛋白一起温育30分钟。然后使反应失活并通过Western印记分析样品。针对总Akt水平对Akt激酶活性标准化。

离体蛋白合成-与完整的肌腱一起摘下EDL肌肉并在2.0mL温热的(30℃)改良的(modified)Kreb's-Henseleit缓冲液(KHB)中预温育30分钟，所述缓冲液由4.5％NaCl、5.75％KC1、6.1％CaC12、10.55％KH₂PO₄,、19.1％MgSO4.7H2O，16％v/v NaHCO3(pH＝7.4)，补充有4％牛血清蛋白(Bovostar，Bovogen，East Keilor，VIC，澳大利亚)和5mM葡萄糖组成，然后用95:5％的O2:CO2通气。通过将EDL肌肉转移至含有2.0mL脉冲(放射性)缓冲液的小瓶标记胞内蛋白质池1小时，所述脉冲(放射性)缓冲液包含5μCi/mL的3H-酪氨酸(GEHealthcare)和500mM L-酪氨酸。标记后，在非放射性KHB中冲洗肌肉，干燥印记，称重，在液氮中急速冷冻并在-80℃存储。冷冻的肌肉在500μL 10％三氯乙酸中均质化，并以10,000g离心15分钟(4℃)。在500μL 1M NaOH中重悬与不溶性蛋白质部分对应的沉淀并使其在室温溶解过夜。为估计酪氨酸并入，将100μL每个再悬浮样品添加至5mL闪烁液中，并在闪烁计数器(Beckman Coulter，Brea，CA)中测量每个样品的三倍体的3H放射活性。

肌肉功能的评估-如前(Han等，Int J Biochem Cell Biol，45:2333-2347，2013；Lokireddy等，Mol Endocrinol 25，1936-1949，2011)所述，通过经皮电极将一系列的电刺激物传递至胫骨运动神经并且通过用手术丝线系于远端肌腱的力传感器记录收缩期间产生的张力来对小鼠TA肌肉进行原位评估。在测试前，通过腹腔注射，用戊巴比妥钠(60mg/kg；Sigma-Aldrich)麻醉小鼠并在评估结束后在仍处于深度麻醉的同时通过心脏切除对其进行人为杀死。在方案结束时，快速切除肌肉，分离肌腱和缔结组织，并称重。

统计分析-采用单因素或双因素方差分析试验在多种条件下评估统计学差异，Student-Newman-Keuls事后检验用于组间比较。两个条件之间的比较仅仅利用了学生的t检验。对于p<0.05的值，差异有统计学意义。数据以平均值±SEM表示。

实施例2：Smad7的表达增加促进骨骼肌肥大

在该实施例中，用携带Smad7表达盒(rAAV6:Smad7)的rAAV载体(Gregorevic等，Nat Med 10，828-834，2004；Gregorevic等，Nat Med 12，787-789，2006)对小鼠的胫骨前肌(TA)后肢肌肉进行注射后在注射28天内引起肌肉质量增加45％(图1A)，同时伴随有Smad7蛋白表达(图1B)和肌纤维直径的增加(图1C-1D)。通过rAAV6:Smad7的尾静脉施用，小鼠肌肉组织的系统转导促进了全身骨骼肌的肥大(图1E-1F)。由于rAAV6载体显示横纹肌的取向(Gregorevic等,Curr Opin Mol Ther 6，491-498，2004)，所以我们随后确定了Smad7蛋白易于在横纹肌而不是内脏器官或脂肪中表达，以及在包括肾、肝和肺的非肌肉组织的样品中Smad2/3基因靶的表达也没有改变(图2A-2B)。也对血管整体性进行了评估，因为采用全身“配体陷阱”拮抗ActRIIb信号传导能产生遗传性出血毛细血管扩张(HHT)的病征(Smith&Lin,Curr Opin Support Palliat Care 7，352-360，2013；Bourdeau等，J Clin Invest104:1343-1351，1999)。重要地，全身rAAV6:Smad7施用在我们的组织学分析或从大体形态学评估中没有产生HHT的病征，尽管它重现了与通过肌肉内注射获得的那些相当的肌肉纤维尺寸的增加(图2C-2D)。

在另外的示例中，我们检查了rAAV6:Smad7施用的作用是否是由于对Smad2/3信号传导的抑制，并发现了Smad3S432/435磷酸化有可能在表达Smad7肌肉中受到抑制(图1G)。此外，在Smad3组成型活性形式的存在下，Smad7的作用被消除(Liu等，Proc Natl Acad SciUSA 94，10669-10674，1997)(CA-Smad3，图1H-1I)。我们评估了Smad7信号传导是否影响Akt和mTOR下游的信号传导，一种促进蛋白合成的关键机制(Bodine等,Nat Cell Biol 3，1014-25，1019，2001)。肌肉中的Smad7过表达增加了蛋白质合成分速率(fractionalprotein synthesis rate)，伴随着包括S6RPS235/236和4EBP1T37/46的mTOR下游的靶的磷酸化增加，但我们未能检测到Akt磷酸化或活性(图3A-3C)的变化，并且雷帕霉素(Akt靶，mTOR的抑制剂)的施用不抑制肌肉对rAAV6:Smad7的肥大响应(图3D-3E)。这并不特别令人惊讶，因为我们之前表明了尽管完全去除了mTOR信号传导，但是抑制Smad3信号传导只是部分地抑制蛋白质合成(Winbanks等，J Cell Biol 197，997-1008，2012)。其他人也表明了可以mTOR依赖或不依赖的方式通过上游MEK/ERK信号传导来调节S6RP(Wu等，BiochemBiophys Res Commun400，679-683，2010；Iijima等，JBiol Chem 277，23065-23075，2002)。因此，我们研究了rAAV6:Smad7的合成代谢作用是否与抑制蛋白水解机制有关并且发现了Smad7衰减了E3泛素连接酶MuRF1和MAFbx的基础的和Smad3诱导的表达(图3F-3G)。因此，Smad7不通过增强Akt/mTOR信号传导但通过抑制E3连接酶活性和随后的蛋白质降解来调节肌肉质量(图3F)，这改变了蛋白质合成与降解之间的平衡以有利于肌肉合成代谢。

实施例3：Smad7防止肌肉生成抑制素和激活素诱导的肌肉萎缩

在该实施例中，我们比较了野生型和肌肉生成抑制素缺失的(mstn-/-)小鼠中的rAAV6:Smad7效能。

尽管rAAV6:Smad7诱导了肌肉质量的相似绝对变化，增加了纤维横截面以及衰减了Smad3磷酸化，但是肌肉质量的相对变化在mstn-/-小鼠中较不明显(图4A-4D)。这与之前通过组合衰减ActRIIB活性(Lee，PLoS ONE 2，e789，2007)的方法和将mstn-/-小鼠和牛(Tellgren等,Mol Phylogenet Evol33，782-790，2004)的相对高肌力作比较时表明的肌肉组织中的固有限制相似，因为牛中的阳性选择导致现代物种“部分缺失”。然而，在mstn-/-小鼠中的rAAV6:Smad7的肥大作用支持之前的表明ActRIIB配体(激活素&GDF-11)冗余作用的研究并得到我们最近的建议激活素A和肌肉生成抑制素相似地能够刺激肌肉萎缩(Chen等，FASEB 28(4)：1711-1723，2014)的研究的支持。事实上，用rAAV6:激活素或rAAV6:肌肉生成抑制素转导小鼠可同时诱导肌肉肥大和增加Smad3磷酸化。通过rAAV6:Smad7的共同施用可完全阻止这些作用，这对肌肉生成抑制素或激活素A表达没有影响(图4E-4G；图5A-5C)。因此，Smad7能抑制肌肉中多个ActRIIB配体的冗余作用。

实施例4：增加Smad7防止与癌症恶病质相关的肌肉萎缩

在该实施例中，由于假设ActRIIB信号传导有助于癌症恶病质的发展和进展(Benny Klimek等，Biochem Biophys Res Commun 391，1548-1554，2010；Zhou等，Cell142，531-543，2010；Zimmers等，Science 296，1486-1488，2002；Coerver等，MolEndocrinol 10，534-543，1996；Lokireddy等，Biochem J 446，23-36，2012)，我们检查了rAAV6:Smad7是否能防止携带诱导恶病质的C-26克隆癌源肿瘤的小鼠中的肌肉萎缩。

在携带肿瘤的小鼠中，体重、骨骼肌质量与心脏和脂肪质量都降低了(图5A-5D)。相反，将rAAV6:Smad7注射入携带肿瘤的小鼠的TA肌肉完全防止了肌肉质量(图7A)、最大等长收缩力(图7B、图6E)和肌肉纤维横截面的减少(CSA，图7C)。癌症恶病质还降低了IIa型纤维分布和增加了IIx/IIb型纤维分布，而rAAV6:Smad7恢复了这些比例(图6F-6G)。肌肉纤维数目没有随着恶病质或rAAV6:Smad7治疗而变化(图6G-6I)，这表明肿瘤介导的肌肉质量损失是由于萎缩而不是细胞凋亡。由于不可能总是在肌肉萎缩发展前对恶病质进行治疗，我们检查了在肿瘤出现后的7天或14天注射rAAV6:Smad7是否还是有防止性的。接受延迟rAAV6:Smad7施用的动物的检查揭示了治疗仍能显著改善肌肉萎缩(图7E)。

在另外的示例中，由于癌症恶病质引起全身的肌肉萎缩，我们测试了rAAV6:Smad7是否能在全身水平防止肌肉萎缩。rAAV6:Smad7的肌肉注射强力增加了携带肿瘤的小鼠的整个横纹肌肌肉组织中的Smad7表达(图8A-8B)。尽管肿瘤持续发展，治疗没有完全防止体重的降低，但保持了整个身体的骨骼肌的质量(图7F-7I、图8C-8D)。我们将肌肉萎缩的防止与体重的不完全守恒之间的矛盾归因于对其他组织(Fearon等,Cell Metabolism16,153-166,2012)，主要是脂肪的恶病质作用(图8F-8G)。由于癌症恶病质还影响心脏，令人鼓舞的是注意到全身rAAV6:Smad7施用还防止了携带肿瘤小鼠中心肌萎缩(图8H-8I)并且不引起通常与心力衰竭相关的心房质量或总体肺重量的增加(Bernardo等，Proc Natl Acad SciUSA 109，17615-17620，2012)。为证实rAAV6:Smad7在恶病质环境中的疗效不是所采用模型所独有的，我们测试了我们的rAAV6:Smad7干预在抑制素-α敲除小鼠中的效能，所述小鼠显示出严重的性腺肿瘤发展后的恶病质(图9A-9C)(Zhou等，Cell142，531-543，2010；Coerver等，Mol Endocrinol 10，534-543，1996；Matzuk等，Nature 360，313-319，1992)。与从携带C-26肿瘤小鼠获得的结果一致，我们发现了将rAAV6:Smad7施用于抑制素-α缺失型小鼠的肌肉防止了肌肉萎缩(图7J-7K)，从而表明rAAV6:Smad7能防止恶病质，不受肿瘤源的影响。

实施例5：Smad7通过部分抑制ActRIIB信号传导的泛素连接酶激活下游来防止肌肉萎缩

在恶病质模型中，Smad7保护横纹肌肌肉组织免于萎缩，尽管激活素A和B的循环水平仍保持升高(来自携带C-26肿瘤的小鼠的血清仍能够激活C2C12肌源性细胞中的Smad3响应型荧光素酶报告基因，图10A-10B、图11A)。我们将恶病质小鼠中的rAAV6:Smad7的保护作用归因于对横纹肌中Smad3转录和磷酸化的抑制(图10C-10D)。然而，由于肿瘤和宿主源的白细胞介素-6(IL-6)也与恶病质的病因(Fearon等，Cell metabolism 16，153-166，2012；Strassmann等，J Clin Invest 89，1681-1684，1992；Fujita等，Int J Cancer 68，637-643，1996；Bonetto et aL，Am J Physiol Endocrinol Metab 303，E410-421,2012)有关，我们检查了Smad7的保护作用是否与改变的IL-6信号传导相关。rAAV6:Smad7的施用不会改变携带肿瘤小鼠的肌肉中IL-6的循环水平或白细胞介素响应的Stat3的磷酸化(图11B-11C)，也不会影响p65(原恶病质细胞因子接合NFkB信号传导的关键调节剂)磷酸化(图11D)。有趣的是，我们发现尽管Smad7的过表达不会改变磷酸化的与总的Foxo1或3(MuRF1和MAFbx的转录调节剂(Sandri等，Cell 117，399-412，2004；Stitt等，Mol Cell 14，395-403，2004)，FIG.11E)的比例，但是治疗减少了携带肿瘤的小鼠中Foxo1/3的丰度，这导致了总磷酸化形式的水平的降低(图10E-10F)。由于抑制Foxo1/3转录能通过抑制MuRF1和MAFbx转录来改善肌肉萎缩(Reed等，FASEB J 26，87-1000，2012)，我们检查了携带肿瘤的小鼠的肌肉的治疗对MuRF1和MAFbx转录的影响。我们观察到与接受对照载体相比，rAAV6:Smad7的施用抑制了携带肿瘤的小鼠的肌肉中的MuRF1和MAFbx表达(图10G)。

实施例6：用Smad7治疗肌肉萎缩

该实施例描述了编码Smad7的rAAV载体在治疗肌肉萎缩中的临床应用的示例性方法。

选择诊断患有肌肉萎缩(如癌症恶病质)的受试者进行治疗。将治疗有效量的表达Smad7的重组AAV如包括能够表达Smad7的SEQ ID NO:5或其等价物(如本文所述)施用于受试者。在实施方案中，Smad7选自与受试者相同的物种。重组AAV可以静脉内施用。可由医生选择适当的治疗剂量。在一些情况下，治疗有效剂量的范围是1*10¹⁰至1*10¹⁴病毒颗粒(vp)/kg，如大约1*10¹¹或1*10¹²vp/kg。在大多数情形下，可施用单剂组合物。在不存在免疫调节的情况下，病人仅可承受rAAV的单次注射。如果受试者预暴露于免疫调节，可施用两或多剂。随时间监控受试者的健康以确定治疗的有效性。

实施例7：用Smad7增加肌肉质量和/或强度

该实施例描述了用于编码Smad7的rAAV载体的整形应用以增加或提高肌肉质量和/或强度的示例性方法。本文已经表明了rAAV6:Smad7增加健康小鼠中的肌肉质量和强度，可在期望增加的肌肉质量、强度或二者的健康受试者的择期手术/整形过程中使用本文所述的方法和组合物。选择期望增加的肌肉质量和/或强度的受试者来治疗。

将治疗有效量的表达Smad7的重组AAV如包括能够表达Smad7的SEQ ID NO:5或其等同物(如本文所述)的rAAV施用于受试者。在实施方案中，Smad7选自与受试者相同的物种。重组AAV可静脉给药。由医生选择适当的治疗剂量。在一些情况下，治疗有效剂量的范围是1*10¹⁰至1*10¹⁴病毒颗粒(vp)/kg，如大约1*10¹¹或1*10¹²vp/kg。在大多数情形下，可施用单剂组合物。在不存在免疫调节的情况下，病人仅可承受rAAV的单次注射。如果受试者预暴露于免疫调节，可施用两或多剂。随时间监控受试者的健康以确定治疗的有效性。

鉴于采用本发明原理的许多可能的实施方案，应认识到示出的实施方案仅是本发明的优选示例，不应被认为是限制本发明的范围。相反，本发明的范围由下文所述的权利要求限定。因此，我们要求保护作为我们的发明的所有落入这些权利要求的范围和精神的内容。

序列表

<110> 华盛顿州立大学

贝克心脏与糖尿病研究所

P·格雷戈雷维克

<120> 递送Smad7基因作为治疗剂

<130> 4630-96554-01

<150> US 62/151,147

<151> 2015-04-23

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Oligonucleotide

<400> 1

ggagtgtgat ggcaaggtca aca 23

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Oligonucleotide

<400> 2

gtgggcacac agcatgactt a 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Oligonucleotide

<400> 3

cccagaggtt cagcaggccc t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Oligonucleotide

<400> 4

tcatgagcac ccacagcggt c 21

<210> 5

<211> 6018

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Smad7 AAV vector, pAAV-MCS_smad7stp 081809.cep; contains murine

Smad7 encoding sequence

<400> 5

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120

actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgtggagc tagttattaa tagtaatcaa 180

ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa 240

atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 300

ttcccatagt aacgtcaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 360

aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg 420

tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc 480

ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc 540

agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca 600

ttgacgtcaa tgggagtttg ttttgcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa 660

caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag 720

cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct gttttgacct 780

ccatagaaga caccgggacc gatccagcct ccgcggattc gaatcccggc cgggaacggt 840

gcattggaac gcggattccc cgtgccaaga gtgacgtaag taccgcctat agagtctata 900

ggcccacaaa aaatgctttc ttcttttaat atactttttt gtttatctta tttctaatac 960

tttccctaat ctctttcttt cagggcaata atgatacaat gtatcatgcc tctttgcacc 1020

attctaaaga ataacagtga taatttctgg gttaaggcaa tagcaatatt tctgcatata 1080

aatatttctg catataaatt gtaactgatg taagaggttt catattgcta atagcagcta 1140

caatccagct accattctgc ttttatttta tggttgggat aaggctggat tattctgagt 1200

ccaagctagg cccttttgct aatcatgttc atacctctta tcttcctccc acagctcctg 1260

ggcaacgtgc tggtctgtgt gctggcccat cactttggca aagaattggg attcgaacat 1320

cgattgaatt cgcccttgtc atgttcgctc cttagccggc aaacgacttt tctcctcgcc 1380

tcctcgcccc gcatgttcag gaccaaacga tctgcgctcg tccggcgtct ctggaggagc 1440

cgtgcgcccg gcggcgagga cgaggaggag ggcgtggggg gtggcggcgg aggaggcgag 1500

ctgcggggag aaggggcgac ggacggccgg gcttatgggg ctggtggcgg cggtgcgggc 1560

agggctggct gctgcctggg caaggcagtc cgaggtgcca aaggtcacca ccatccccat 1620

cccccaacct cgggtgccgg ggcggccggg ggcgccgagg cggatctgaa ggcgctcacg 1680

cactcggtgc tcaagaaact caaggagcgg cagctggagc tgctgcttca ggccgtggag 1740

tcccgcggcg gtacgcgcac cgcgtgcctc ctgctgcccg gccgcctgga ctgcaggctg 1800

ggcccggggg cgcccgccag cgcgcagccc gcgcagccgc cctcgtccta ctcgctcccc 1860

ctcctgctgt gcaaagtgtt caggtggccg gatctcaggc attcctcgga agtcaagagg 1920

ctgtgttgct gtgaatctta cgggaagatc aaccccgagc tggtgtgctg caacccccat 1980

caccttagtc gactctgtga actagagtct ccccctcctc cttactccag atacccaatg 2040

gattttctca aaccaactgc aggctgtcca gatgctgtac cttcctccgc ggaaaccggg 2100

ggaacgaatt atctggcccc tggggggctt tcagattccc aacttcttct ggagcctggg 2160

gatcggtcac actggtgcgt ggtggcatac tgggaggaga agactcgcgt ggggaggctc 2220

tactgtgtcc aagagccctc cctggatatc ttctatgatc tacctcaggg gaatggcttt 2280

tgcctcggac agctcaattc ggacaacaag agtcagctgg tacagaaagt gcggagcaag 2340

atcggctgtg gcatccagct gacgcgggaa gtggatggcg tgtgggttta caaccgcagc 2400

agttacccca tcttcatcaa gtccgccaca ctggacaacc cggactccag gacgctgttg 2460

gtgcacaaag tgttccctgg tttctccatc aaggcttttg actatgagaa agcctacagc 2520

ctgcagcggc ccaatgacca cgagttcatg cagcaaccat ggacgggttt caccgtgcag 2580

atcagctttg tgaagggctg gggccagtgc tacacccgcc agttcatcag cagctgcccg 2640

tgctggctgg aggtcatctt caacagccgg tagtcggtcg tgtggtgaag ggcgaattcc 2700

ccggggatcc tctagagtcg acctgcagaa gcttgcctcg agcagcgctg ctcgagagat 2760

ctacgggtgg catccctgtg acccctcccc agtgcctctc ctggccctgg aagttgccac 2820

tccagtgccc accagccttg tcctaataaa attaagttgc atcattttgt ctgactaggt 2880

gtccttctat aatattatgg ggtggagggg ggtggtatgg agcaaggggc aagttgggaa 2940

gacaacctgt agggcctgcg gggtctattg ggaaccaagc tggagtgcag tggcacaatc 3000

ttggctcact gcaatctccg cctcctgggt tcaagcgatt ctcctgcctc agcctcccga 3060

gttgttggga ttccaggcat gcatgaccag gctcagctaa tttttgtttt tttggtagag 3120

acggggtttc accatattgg ccaggctggt ctccaactcc taatctcagg tgatctaccc 3180

accttggcct cccaaattgc tgggattaca ggcgtgaacc actgctccct tccctgtcct 3240

tctgattttg taggtaacca cgtgcggacc gagcggccgc aggaacccct agtgatggag 3300

ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 3360

cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag ctgcctgcag 3420

gggcgcctga tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatacgt 3480

caaagcaacc atagtacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta 3540

cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc 3600

cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt 3660

tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat ttgggtgatg 3720

gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca 3780

cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct atctcgggct 3840

attcttttga tttataaggg attttgccga tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga 3900

tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca aaatattaac gtttacaatt ttatggtgca 3960

ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca gccccgacac ccgccaacac 4020

ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga 4080

ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgagac 4140

gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat aggttaatgt catgataata atggtttctt 4200

agacgtcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct 4260

aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat 4320

attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg 4380

cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg 4440

aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc 4500

ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat 4560

gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact 4620

attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca 4680

tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact 4740

tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg 4800

atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg 4860

agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg 4920

aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg 4980

caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag 5040

ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc 5100

gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga 5160

tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat 5220

atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc 5280

tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag 5340

accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct 5400

gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac 5460

caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc 5520

tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg 5580

ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt 5640

tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt 5700

gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc 5760

tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca 5820

gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata 5880

gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg 5940

ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct 6000

ggccttttgc tcacatgt 6018

Claims

1.组合物，包含重组的腺相关病毒(rAAV)构建体中的Smad7基因或cDNA，其中所述rAAV构建体提供Smad7基因或cDNA在肌肉细胞中的表达。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述rAAV构建体为血清型6(rAAV6)、血清型8(rAAV8)或血清型9(rAAV9)。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述Smad7基因或cDNA来自人、小鼠、马、牛、羊、犬或猪。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所表达的Smad7基因或cDNA是具有组成型活性的突变体。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述rAAV构建体包含指导所述Smad7基因或cDNA在肌肉细胞中表达的组织特异性启动子或增强子。

6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述rAAV构建体提供所述Smad7基因或cDNA在心肌细胞、骨骼肌细胞或二者中的表达。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述rAAV构建体包含限制所述Smad7基因或cDNA对肌肉细胞或对心脏细胞表达的组织特异性沉默子。

8.一种提高受试者中肌肉质量和/或强度的方法，包括给受试者施用治疗有效量的权利要求1-6中任意一项所述的组合物。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述受试者未被诊断患有肌肉萎缩病症或疾病。

10.一种治疗被诊断患有癌症恶病质的受试者的肌肉萎缩的方法，包括选择患有癌症恶病质的受试者并给所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-6中任意一项所述的组合物。

11.一种用权利要求1-6中任意一项所述的组合物治疗肌肉萎缩以增加肌肉强度和/或肌肉体积的方法。

12.一种抑制或防止受试者肌肉萎缩的方法，包括给所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-6中任意一项所述的组合物。

13.根据权利要求10、11或12所述的方法，其中所述肌肉萎缩是由慢性病症引起的。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述慢性病症包括癌症、老化(少肌症)、肌营养不良、肌肉病变、肾病、慢性阻塞性肺病、慢性感染、AIDS、废用性萎缩、神经肌肉损伤、神经病变、肥胖、心血管疾病或其两种或更多种的组合。

15.根据权利要求10、11或12所述的方法，其中肌肉萎缩是由微重力应激引起的。

16.根据权利要求10、11或12所述的方法，其中所述肌肉萎缩包括心肌、骨骼肌或二者的萎缩。

17.根据权利要求8-16中任意一项所述的方法，包括通过肌内或静脉内注射递送所述组合物。

18.根据权利要求8-16中任意一项所述的方法，其中施用所述rAAV包括施用单剂rAAV。

19.根据权利要求8-16中任意一项所述的方法，其中施用所述rAAV包括施用多剂rAAV。