CN107828855B - 一种精浆中性α-葡糖苷酶检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种精浆中性α‑葡糖苷酶检测试剂盒及其应用，该试剂盒包括R1试剂、R2试剂和非定值质控品；所述R1试剂为包含SDS的磷酸盐缓冲液；所述的R2试剂为包含尿素、水杨酸钠和PNPG的磷酸盐缓冲液；所述非定值质控品为精浆冻干粉。本发明试剂盒与全自动生化分析仪配套使用检测精浆中性α‑葡糖苷酶，试剂盒组分简单，没有终止液，生产和使用都相对简单；在检测精浆中性α‑葡糖苷酶时，反应时间约为5min，需要试剂量和样本量少，线性范围宽，结果的准确度和精密度高，同时可与精浆生化的其他项目联检。本发明试剂盒适用于临床上大批量样本的检测；可以通过反应曲线的变化监测整个反应过程。

Description

一种精浆中性α-葡糖苷酶检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及第二类体外诊断试剂，具体涉及一种精浆中性α-葡糖苷酶检测试剂盒及其应用。

背景技术

附睾是精子成熟的重要器官，精浆中中性α-葡糖苷酶来源于附睾，是附睾的特异性酶和标志性酶。在附睾本身发生病变时，如附睾炎、附睾结节等，中性α-葡糖苷酶分泌减少，精浆中此酶的活力降低，因而测定精浆中性α-葡糖苷酶活性，对附睾炎和男性不育的早期诊断、治疗和随访具有重要意义。另外，附睾和输精管的梗阻会导致精浆中性α-葡糖苷酶活性明显下降，故检测精浆中性α-葡糖苷酶活性为准确、无创性诊断梗阻性无精子症提供了新的方法。

目前临床上采用的检测精浆中性α-葡糖苷酶的方法为改良Cooper法，文献报道的最短的反应时间约为25min，且所有操作均为手工法，因此不能满足临床大批量样本的检测，也不能对检测过程进行实时监测。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种精浆中性α-葡糖苷酶检测试剂盒，该试剂盒组分简单，没有终止液，在检测精浆中性α-葡糖苷酶时，检测速度快，时间短，线性范围宽，结果的准确度和精密度高。

本发明还提供一种精浆中性α-葡糖苷酶检测试剂盒的应用，该试剂盒可以在全自动生化分析仪上应用。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的一种精浆中性α-葡糖苷酶检测试剂盒，其特征在于，包括R1试剂、R2试剂和非定值质控品；所述R1试剂为包含十二烷基硫酸钠(SDS)的磷酸盐缓冲液；所述的R2试剂为包含尿素、水杨酸钠和4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)的磷酸盐缓冲液；所述非定值质控品为精浆冻干粉。

其中，所述R1试剂中SDS的浓度为0.2％～0.5％g/mL。

所述R2试剂中PNPG的浓度为0.25％～0.6％g/mL、尿素浓度为0.1～1％g/ml、水杨酸钠浓度为0.8～3.0％g/ml。

作为优选，所述R1试剂和R2试剂的磷酸盐缓冲液均由0.1～0.4mol/L十二水合磷酸氢二钠和0.1～0.4mol/L二水合磷酸二氢钠互调pH值为6.0～7.0得到。

所述R1试剂和R2试剂中含有防腐剂青霉素、链霉素、青链霉素、硫酸庆大霉素和叠氮化钠中的一种或几种，含量为0.01～0.05％g/ml或者0.01～0.05％ml/ml。

进一步地，所述非定值质控品是由精浆冻干形成冻干粉，所述精浆含有防腐剂青霉素、链霉素、硫酸庆大霉素和叠氮化钠中的一种或几种。所述精浆已被检定HBsAg、HCV抗体、HIV1+2抗体和梅毒均为阴性。

其中，所述混合精浆中防腐剂浓度为0.01～0.05％g/ml或者0.01～0.05％ml/ml。

进一步地，所述精浆中性α-葡糖苷酶检测试剂盒包括R1试剂、R2试剂、非定值质控品、说明书和内衬。

本发明所述的精浆中性α-葡糖苷酶检测试剂盒在全自动生化分析仪上应用。

其中，所述应用的检测步骤为

(1)样本准备：手淫法采集禁欲2～7天的精液于采样杯中，置37℃水浴箱中液化，3000～12000rpm离心5～10min分离精浆，即刻用于检测；试剂盒准备：试剂盒从2～8℃取出后，于室温下平衡30～35min，然后R1再于35～37℃放置5～10min，使R1溶液变澄清，即可上机检测；

(2)设置全自动生化分析仪的主、副波长分别为400～420nm、600～700nm，R1/样本/R2加样量的体积比为15︰1︰15，范围为(75～151μl)︰(5～10.1μl)︰(75～151μl)。

(3)检测方法：速率法，加入R1和样本后混匀，37℃孵育4～6min；加入R2后混匀，37℃孵育2～5min；连续测定2～5min内的吸光度，仪器计算吸光度变化率△A/min，具体过程见表1；

表1精浆中性α-葡糖苷酶检测流程

(4)计算样本中中性α-葡糖苷酶活性；

(5)取纯化水复溶非定值质控品，通常取2～5mL纯化水复溶冻干前4mL/瓶非定值质控品，混匀后，分装成300μL/支，-25～-20℃保存；每天取出一支复溶，用试剂盒检测此复溶的非定值质控品(检测方法和仪器的设定同上述样品的检测)，重复检测5-20天，每天重复5-10次，将检测结果进行统计分析，求平均值

和标准差(s)，以

为质控线绘制质控图；此后将质控品随着样本一起检测(检测方法与上述相同)，根据质控品的检测结果是否在质控线内判断样本检测结果是否在控。

其中，步骤(4)所述中性α-葡糖苷酶活性的计算公式为(U/L)＝△A/min×F，其中

F：相应全自动生化分析仪上的理论因子；

V_T：试剂针和样本针吸取的R1试剂、R2试剂和样本的体积之和，单位：μl；

ε：摩尔吸光系数，单位：L/(mol·cm)；

l：光径，单位：cm；

V_s：样本体积，单位：μl；

△A/min通过全自动生化分析仪自动测定样本得到。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明提供一种与全自动生化分析仪配套使用的检测精浆中性α-葡糖苷酶的试剂盒，试剂盒组分简单，没有终止液，生产和使用都相对简单；在检测精浆中性α-葡糖苷酶时，反应时间约为5min，单个样本检测时间需要10-15min，需要试剂量和样本量少，线性范围宽，结果的准确度和精密度高，同时可与精浆生化的其他项目联检。

(2)该试剂盒在全自动生化分析仪上配套使用，通过反应曲线的变化监测整个反应过程；使用速率法，通过监测吸光度的变化率计算酶的活性，样本的检测结果由仪器直接给出，不需要做标准曲线；通过质控品的检测可以反映检测系统的稳定性和检测结果的准确性，同时可与精浆生化的其他项目联检。

(3)本发明的试剂盒中含有尿素和水杨酸钠可以有效地提高整个试剂盒的准确度和重复性。

附图说明

图1为本发明试剂盒1的线性参数确认的线性关系图；

图2为本发明实施例1试剂盒与对比例的准确性检测关系图；

图3为本发明实施例2试剂盒与对比例的准确性检测关系图；

图4为本发明实施例3试剂盒与对比例的准确性检测关系图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

精浆中性α-葡糖苷酶检测试剂盒，包括如下组分：

R1试剂：含SDS和防腐剂的磷酸盐缓冲液；磷酸盐缓冲液溶液由0.25mol/L二水合磷酸二氢钠调节0.25mol/L十二水合磷酸氢二钠，使其pH＝6.5，每升磷酸盐缓冲液溶液中含有3.5g SDS、0.5ml青链霉素(Sigma公司，每毫升含10000单位青霉素和10mg链霉素)。

R2试剂：含PNPG和防腐剂的磷酸盐溶液；磷酸盐缓冲液溶液由0.25mol/L二水合磷酸二氢钠调节0.25mol/L十二水合磷酸氢二钠，使其pH＝6.5，每升磷酸盐缓冲液溶液中含有4.25g PNPG、0.5ml青链霉素、5g尿素、20g水杨酸钠。

质控品由已被检定HBsAg、HCV抗体、HIV1+2抗体和梅毒均为阴性的精浆加0.05％(ml/ml)防腐剂青链霉素混合，混匀后分装4mL/瓶、冻干制得的冻干粉组成。

实施例2

精浆中性α-葡糖苷酶检测试剂盒，包括如下组分：

R1试剂：含SDS和防腐剂的磷酸盐缓冲液；磷酸盐缓冲液溶液由0.4mol/L二水合磷酸二氢钠调节0.4mol/L十二水合磷酸氢二钠，使其pH＝7.0，每升磷酸盐缓冲液溶液中含有5g SDS、0.1g硫酸庆大霉素。

R2试剂：含PNPG和防腐剂的磷酸盐溶液；磷酸盐缓冲液溶液由0.4mol/L二水合磷酸二氢钠调节0.4mol/L十二水合磷酸氢二钠，使其pH＝7.0，每升磷酸盐缓冲液溶液中含有6g PNPG、0.1g硫酸庆大霉素、10g尿素、30g水杨酸钠。

质控品由已被检定HBsAg、HCV抗体、HIV1+2抗体和梅毒均为阴性的精浆加0.01％(g/ml)防腐剂硫酸庆大霉素混合，混匀后分装4mL/瓶、冻干制得的冻干粉组成。

实施例3

精浆中性α-葡糖苷酶检测试剂盒，包括如下组分：

R1试剂：含SDS和防腐剂的磷酸盐缓冲液；磷酸盐缓冲液溶液由0.1mol/L二水合磷酸二氢钠调节0.1mol/L十二水合磷酸氢二钠，使其pH＝6.0，每升磷酸盐缓冲液溶液中含有2g SDS、0.1g叠氮化钠。

R2试剂：含PNPG和防腐剂的磷酸盐溶液；磷酸盐缓冲液溶液由0.1mol/L二水合磷酸二氢钠调节0.1mol/L十二水合磷酸氢二钠，使其pH＝6.0，每升磷酸盐缓冲液溶液中含有2.5g PNPG、0.1g叠氮化钠、1g尿素、8g水杨酸钠。

质控品由已被检定HBsAg、HCV抗体、HIV1+2抗体和梅毒均为阴性的精浆加0.01％(g/ml)防腐剂叠氮化钠混合，混匀后分装4mL/瓶、冻干制得的冻干粉组成。

实施例4

实施例1-3的精浆中性α-葡糖苷酶检测试剂盒各组分采用如下步骤制得，其中不同实施例的各物质的质量或体积根据最终的浓度分别计算配制：

(1)磷酸盐缓冲溶液的制备工艺

称定二水合磷酸二氢钠于纯化水中溶解得到0.1-0.4mol/L磷酸二氢钠溶液，称定十二水合磷酸氢二钠于纯化水中溶解得到0.1-0.4mol/L磷酸氢二钠溶液，用同样浓度的磷酸二氢钠溶液调节磷酸氢二钠溶液，使其pH值为6.0～7.0，置于2～8℃保存，待用。

(2)R1试剂的制备工艺

称定一定量的SDS于盛有磷酸盐缓冲溶液的烧杯中，加入防腐剂，搅拌至混匀，用磷酸盐缓冲溶液定容、混匀，分装，贴标签，检验，置于2～8℃保存。

(3)R2试剂的制备工艺

称定一定量的尿素、水杨酸钠、PNPG于盛有磷酸盐缓冲溶液的烧杯中，加入防腐剂，搅拌至混匀，用磷酸盐缓冲溶液定容、混匀，分装，贴标签，检验，置于2～8℃保存。

(4)质控品的制备工艺

收集已完全液化且HCV抗体、HIV1+2抗体、HBsAg和梅毒检测均为阴性的男性新鲜精液，液化，离心后取上层精浆、混合，加入防腐剂，搅拌、溶解、混匀、分装4mL/瓶、冻干。

真空冷冻干燥机的冻干步骤：设置冻干程序，如表2。启动真空冷冻干燥机，-30℃预冻6h后，启动冻干程序。冻干结束，放气取出，封盖，得到干粉状的质控品。

表2非定值质控品冻干程序

温度(℃)	时间(min)
		-20	900
-15	360
		-10	360
-5	180
		0	180
10	180
		15	180
20	240

实施例5

用精浆中性α-葡糖苷酶检测试剂盒检测精浆中中性α-葡糖苷酶活性，具体步骤为：

一、样本准备及要求

手淫法采集禁欲2天的精液于采样杯中，置37℃水浴箱中液化，3000r/min离心10min分离取上层得到精浆，即刻用于检测。精浆量2.5mL，液化良好，不能立即检测的精浆样本于-20℃可保存1个月，避免反复冻融。

二、试剂准备

选取实施例1-3中任意一组试剂盒。

将R1试剂、R2试剂和质控品从2～8℃冰箱中取出，室温下平衡30min，然后R1试剂再置于37℃5min，使R1溶液变澄清。

三、检测方法

(1)基本参数：

采用迈瑞BS330E型全自动生化分析仪，主/副波长：420nm/600nm；温度：37℃；方法：速率法；反应方向：上升。

(2)操作步骤：

(3)计算公式：

样本中中性α-葡糖苷酶活性(U/mL)＝F×△A/min

式中：

V_T：312.1μl；

ε：用磷酸盐缓冲液将4-硝基酚分别配成浓度为2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L、32μmol/L、64μmol/L和100μmol/L的溶液，使用分光光度计在420nm处检测其吸光度，根据朗伯比尔定律计算出4-硝基酚的摩尔吸光系数为7.3×10³L/(mol·cm)；

l：1cm；

V_s：10.1μl；

△A/min通过迈瑞BS330E型全自动生化分析仪自动测定样本得到。

酶单位定义：在37℃下每分钟催化生成1μmol 4-硝基酚的酶量定义为一个活力单位；

F：在此条件下F＝4247。

(4)质控品的赋值和检测：取2ml纯化水复溶冻干前4mL/瓶非定值质控品，混匀后，分装成300μL/支，-20℃保存；每天从-20℃中取出一支分装后非定值质控品，复溶，用该实施例的试剂盒检测此复溶的非定值质控品，检测方法和仪器的设定同本实施例样本的检测，每天重复检测20次，共5天，统计分析5天共100个数据，求平均值

和标准差(s)，以

为质控线绘制质控图；以后质控品随着样本一起检测，检测方法相同，根据质控品的检测结果是否在质控线内判断样本检测结果是否在控。

四、该试剂盒的主要性能指标

(1)试剂空白吸光度变化率(ΔA/min)≤0.06；

(2)线性范围：[5～65]U/L，r≥0.9900；

(3)重复性：CV≤7％；

(4)批间差：R≤10％。

五、报告结果

样本检测结束后，以汇总报告的形式输出。

六、参考区间

根据至少200例正常生育男性精浆中性α-葡糖苷酶检测结果成偏态分布和精浆中性α-葡糖苷酶的临床意义，以第5百分位数确定正常参考值范围，精浆中性α-葡糖苷酶的正常参考值范围为≥10.12U/L。

七、临床适用症状

本试剂盒用于体外检测精浆中性α-葡糖苷酶的活性，对附睾炎和男性不育的早期诊断、治疗和随访具有重要意义。中性α-葡糖苷酶是临床使用的附睾标志物，可作为附睾的功能性指标。

实施例6

用精浆中性α-葡糖苷酶检测试剂盒检测精浆中性α-葡糖苷酶活性，具体步骤为：

一、样本准备及要求

手淫法采集禁欲7天的精液于采样杯中，置37℃水浴箱中液化，10000r/min离心5min分离取上层得到精浆，即刻用于检测。精浆量0.5mL，液化良好。不能立即检测的精浆样本于-20℃可保存1个月，避免反复冻融。

二、试剂准备

选取实施例1-3中任意一组试剂盒。

将R1试剂、R2试剂和质控品从2～8℃冰箱取出，室温下平衡35min，然后R1再置于35℃10min，使R1溶液变澄清，待用。

三、检测方法

(1)基本参数：

采用奥林巴斯全自动生化分析仪，主/副波长：400nm/700nm；温度：37℃；方法：速率法；反应方向：上升。

(2)操作步骤

(3)计算公式：

样本中中性α-葡糖苷酶活性(U/L)＝F×△A/min

式中，如实施例5所述，F＝4247；

△A/min通过奥林巴斯全自动生化分析仪自动测定样本得到。

酶单位定义：在37℃下每分钟催化生成1μmol 4-硝基酚的酶量定义为一个活力单位。

(4)质控品的赋值和检测：取5mL纯化水复溶冻干前4mL/瓶非定值质控品，混匀后，分装成300μL/支，-25℃保存；每天从-25℃中取出一支分装后的冻干精浆质控品，复溶，用该实施例的试剂盒检测此复溶的非定值质控品，检测方法和仪器的设定同本实施例样本的检测，重复检测20天，每天重复5次，统计分析20天共100个数据，求平均值

和标准差(s)，以

为质控线绘制质控图；以后质控品随着样本一起检测，检测方法与上述相同，根据质控品的检测结果是否在质控线内判断样本检测结果是否在控。

试验例1

采用实施例5的检测方法，采用实施例1所制备的试剂盒确认该试剂盒的线性范围。线性范围确认：用生理盐水把精浆中性α-葡糖苷酶高值样本稀释为0、5、10、20、30、40、50、60、65U/L9个不同理论活性的中性α-葡糖苷酶精浆样本，然后上机检测，每个理论活性样本测试3次，分别求出每个理论活性检测结果的均值。以稀释样本理论活性为自变量，以每个理论活性检测结果均值为因变量求出线性回归方程，并计算线性回归的相关系数。用上述方法中理论活性代入线性回归方程，计算理论活性的估计值及检测均值与估计值的相对偏差，结果如表3。

表3试剂盒线性范围参数确认检测结果

由表3可知，通过该试验例说明试剂盒在[0-65]U/L内稀释样本的检测活性与理论活性呈现很好的线性关系，但检测理论活性为0U/L时，相对偏差较大，所以规定该试剂盒的线性范围为[5-65]U/L。鉴于该试剂盒的参考区间为：≥10.12U/L，说明该试剂盒在检测正常和异常样本的结果方面都是可靠的。同时采用实施例2和3的试剂盒或者实施例6的检测方法，结果与上述类似。

试验例2

采用实施例5的检测方法，分别采用实施例1-3所制备的试剂盒进行试剂盒的重复性检测。重复性检测方法：样本收集、准备后上机测试，分别用试剂盒测定同一份精浆，重复检测10次，取平均值

按下列公式计算重复性变异系数(CV)，

式中，

重复检测10次所得结果的平均值；s：重复检测10次所得结果的标准差；CV：变异系数。其结果如表4所示。

表4试剂盒的重复性检测结果

试验例3

采用实施例5的检测方法，分别采用实施例1-3所制备的试剂盒进行试剂盒的准确性检测，用40例在检测活性范围内的不同活性的精浆样本，以已上市公司生产的试剂盒(深圳市博锐德生物科技有限公司生产的精浆中性α-葡萄糖糖苷酶定量检测试剂盒(改良Cooper法)，批号：20140401；产品注册号：粤食药监械(准)字2010第2400800号)作为比对方法，每份样本按实施例1-3的试剂盒及比对方法分别进行检测，以比对方法的检测结果(xi)为自变量，以实施例1-3试剂盒检测结果(yi)为因变量求出线性回归方程，并计算线性回归的相关系数(r)。

把比对方法的检测结果(xi)代入线性回归方程，计算yi的估计值及xi与xi的相对偏差。

相对偏差＝(yi的估计值-xi)/xi×100％

结果如图2、图3、图4和表5所示。

表5试剂盒准确度实验检测结果

实施例1试剂盒测定结果(图2)：相关系数r＝0.9900，线性方程：y＝0.9618x+0.6885；

实施例2试剂盒测定结果(图3)：相关系数r＝0.9887，线性方程：y＝0.9412x+1.1623；

实施例3试剂盒测定结果(图4)：相关系数r＝0.9917，线性方程：y＝0.9359x+1.2425。

综合图2、图3、图4和表5的结果可知，试剂盒的测试准确度好，同时采用实施例6的检测方法，结果与上述类似。

结论：通过以上的试验结果表明，该试剂盒在检测精浆中性α-葡糖苷酶活性时，线性范围宽、结果的准确度和精密度高，检测时间短，适合于临床上大批量样本的检测；同时可对样本的检测过程进行实时追踪。

试验例4

与其他项目联检

采用实施例5的检测方法以及使用实施例1的试剂盒对一精浆样本中精浆中性α-葡糖苷酶(简称NAG)活性进行检测；

同时使用南京欣迪生物药业工程有限责任公司已上市的四个全自动试剂盒：精浆果糖检测试剂盒(己糖激酶法)(注册证号：苏械注准20172400748)(简称FHK)、精浆锌定量检测试剂盒(PAN法)(注册证号：苏食药监械(准)字2014第2400711号)(简称ZN)、精浆超氧化物歧化酶检测试剂盒(速率法)(注册证号：苏械注准20172400749)(简称SOD)和精浆γ-L-谷氨酰转肽酶定量检测试剂盒(速率法)(注册证号：苏食药监械(准)字2014第2400710号)(简称GGT)在全自动生化分析仪上对该精浆样本中精浆果糖、精浆锌、精浆超氧化物歧化酶和精浆γ-L-谷氨酰转肽酶进行检测，检测方法参考四种试剂盒的使用说明书。

在全自动生化分析仪上将精浆中性α-葡糖苷酶检测项目与精浆果糖、精浆锌、精浆超氧化物歧化酶和精浆γ-L-谷氨酰转肽酶项目同时申请检测同一精浆样本，重复10次，检测结果如表6。

表6项目联检的结果

由表6的结果能看出，该试剂盒与其他几个试剂盒可以同时检测同一样本，该试剂盒的重复性满足性能指标中要求；同时采用实施例2和3的试剂盒或者实施例6的检测方法，结果与上述类似。

试验例5

检测本发明试剂盒中尿素和水杨酸对整个试剂盒的影响。

其中，对比例2与实施例1的试剂盒的试剂相同，不同之处在于不含尿素；

对比例3与实施例1的试剂盒的试剂相同，不同之处在于不含水杨酸钠；

对比例4与实施例1的试剂盒的试剂相同，不同之处在于不含尿素和水杨酸钠；

采用实施例5的检测方法，分别检测对比例1、对比例2和对比例3的试剂盒的线性范围、重复性和准确度，同时与本发明实施例1的试剂盒进行对比，结果见表7。

表7尿素和水杨酸对试剂盒检测结果影响

由表7所知，本发明实施例1的试剂盒与对比例2～4相比，试剂盒的线性范围、重复性和准确度都明显优于对比例，说明R2试剂中的尿素和水杨酸钠在准确度和重复性方面起到重要作用。

Claims (4)

1.一种精浆中性α-葡糖苷酶检测试剂盒，其特征在于，包括R1试剂、R2试剂和非定值质控品；所述R1试剂为包含SDS的磷酸盐缓冲液；所述R2试剂为包含尿素、水杨酸钠和PNPG的磷酸盐缓冲液；所述非定值质控品为精浆冻干粉；所述R1试剂中SDS的浓度为0.2%~0.5%g/mL；所述R2试剂中PNPG的浓度为0.25%~0.6%g/mL、尿素浓度为0.1~1%g/ml、水杨酸钠浓度为0.8~3.0% g/ml；所述R1试剂和R2试剂的磷酸盐缓冲液均由0.1~0.4mol/L十二水合磷酸氢二钠和0.1~0.4mol/L二水合磷酸二氢钠互调pH值为6.0~7.0得到。

2.根据权利要求1所述的精浆中性α-葡糖苷酶检测试剂盒，其特征在于，所述R1试剂和R2试剂中含有防腐剂青霉素、链霉素、青链霉素、硫酸庆大霉素和叠氮化钠中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的精浆中性α-葡糖苷酶检测试剂盒，其特征在于，所述非定值质控品是由精浆冻干形成的冻干粉，所述精浆中含有防腐剂青霉素、链霉素、青链霉素、硫酸庆大霉素和叠氮化钠中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的精浆中性α-葡糖苷酶检测试剂盒，其特征在于，包括R1试剂、R2试剂、非定值质控品、说明书和内衬。

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