[go: up one dir, main page]

CN107746837A - 山羊伪结核棒状杆菌pld重组蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents

山羊伪结核棒状杆菌pld重组蛋白及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107746837A
CN107746837A CN201711066074.5A CN201711066074A CN107746837A CN 107746837 A CN107746837 A CN 107746837A CN 201711066074 A CN201711066074 A CN 201711066074A CN 107746837 A CN107746837 A CN 107746837A
Authority
CN
China
Prior art keywords
goat
pld
pseudotuberculosis
corynebacterium
recombinant protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201711066074.5A
Other languages
English (en)
Inventor
高华峰
李志明
郑国英
马玉馨
邵庆勇
洪琼花
李华春
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kunming Xishan Animal Husbandry And Veterinary Station
Yunnan Animal Science and Veterinary Institute
Original Assignee
Kunming Xishan Animal Husbandry And Veterinary Station
Yunnan Animal Science and Veterinary Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kunming Xishan Animal Husbandry And Veterinary Station, Yunnan Animal Science and Veterinary Institute filed Critical Kunming Xishan Animal Husbandry And Veterinary Station
Priority to CN201711066074.5A priority Critical patent/CN107746837A/zh
Publication of CN107746837A publication Critical patent/CN107746837A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/04—Phosphoric diester hydrolases (3.1.4)
    • C12Y301/04004—Phospholipase D (3.1.4.4)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种山羊伪结核棒状杆菌PLD重组蛋白及其制备方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明通过全基因合成方法获得山羊伪结核棒状杆菌磷脂酶D（PLD）基因除去信号肽的序列，亚克隆入原核表达载体pET28a，经IPTG诱导获得可溶性表达蛋白，经两次纯化后得到纯度在95%以上的表达蛋白，该蛋白经免疫印迹分析表明具有生物学活性，经一系列优化，完成整套ELISA检测试剂盒的组装。经敏感性、特异性分析后对山羊完成血清学检测及免疫预防监测，检测及监测结果表达本发明的试剂盒具有较好的准确性、灵敏性及可重复性，适应山羊伪结核棒状杆菌引起感染的诊断及免疫监测。

Description

山羊伪结核棒状杆菌PLD重组蛋白及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及山羊伪结核棒状杆菌PLD重组蛋白及其制备方法与应用。
背景技术
伪结核棒状杆菌是一种兼性胞内寄生菌，主要感染绵山羊和山羊，引起的疾病称为干酪样淋巴结炎，在疾病的临床表现方面，其主要特点是化脓的淋巴结，本病目前在世界范围内广泛流行，国内也有很多本病的报道，山羊伪结核是国际公认的难以净化的动物疫病，难于防治的重要原因是脓肿表面包有一层厚而致密的纤维性肉芽肿性包囊，致使药物难以通过这层包囊渗入其内发挥作用，因而全身用药效果不佳，局部用药手续繁琐，难于根除。迫切需要更有效的疫病的综合防制策略而不仅是局限于对病山羊的治疗，才能减少或防止疾病的流行和在山羊群中传播，由于伪结核棒状杆菌具有较高的发病率，因而对绵山羊和山羊伪结核菌开发新型高效菌苗就尤为必要，此外，开发新型疫苗的必要条件是具备相应疫苗免疫效力的评估方法，基于以上因素，我们开发了这一血清学检测方法。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种山羊伪结核棒状杆菌P LD重组蛋白及其制备方法与应用。本发明通过分子生物学方法，建立伪结核棒状杆菌抗体检测的方法，能快速监测山羊群中感染的比例及危害严重性，配合疫苗的使用，可用于免疫抗体的监测及免疫水平评价。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
山羊伪结核棒状杆菌PLD重组蛋白为由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成的蛋白。
编码上述山羊伪结核棒状杆菌PLD重组蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
所述山羊伪结核棒状杆菌PLD重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：
步骤(1)，以SEQ ID No.3、SEQ ID No.4为上下游引物，以SEQ ID NO.2所示的基因为模板进行PCR扩增，将扩增产物连接到pET28a载体中，得到pET-28a-PLD重组载体；
所述的上游引物F：5’-atgagggagaaagttgtttta-3’
所述的下游引物R：5’-tcaccacgggttatccgc-3’；
步骤(2)，将pET-28a-PLD重组载体转入大肠杆菌中进行融合蛋白的诱导表达；
步骤(3)，将步骤(2)中经诱导表达融合蛋白的大肠杆菌裂解后离心，然后将离心后收集的上清液采用镍柱亲和层析进行分离纯化，得到山羊伪结核棒状杆菌PLD重组蛋白。
本发明提供含有所述核苷酸序列的重组菌。
优选，所述重组菌采用的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明提供山羊伪结核棒状杆菌PLD重组蛋白作为制备山羊伪结核杆菌抗体检测试剂、试剂盒的应用。
本发明同时提供包含所述山羊伪结核棒状杆菌PLD重组蛋白的山羊伪结核杆菌抗体检测试剂盒。
具体地，所述的山羊伪结核杆菌抗体检测试剂盒，包括山羊伪结核棒状杆菌PLD重组蛋白包被ELISA板、阳性对照血清、阴性对照血清、脱脂奶、底物TMB、25×PBS、吐温20、辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊抗体和终止液；
所述的阴性对照血清为经检测无山羊伪结核棒状杆菌感染的山羊阴性血清；
所述的阳性对照血清为经检测经山羊伪结核棒状杆菌重复感染的山羊阳性血清；
所述的终止液为1M H2SO4。
进一步优选的是，所述的山羊伪结核棒状杆菌PLD重组蛋白包被ELISA板的制备方法是：用碳酸盐缓冲液将山羊伪结核棒状杆菌PLD重组蛋白稀释至2-10μg/mL，之后每孔加入100μl包被酶标板，4℃过夜，即得山羊伪结核棒状杆菌PLD重组蛋白包被ELISA板。
本发明开发的检测试剂是基于毒力基因山羊伪结核棒状杆菌磷脂酶D(PL D)开发的，PLD的基因产物是伪结核棒状杆菌主要毒力因子，PLD基因编码磷脂酶D-PLD的外毒素，催化鞘磷脂酶解离，增加血管的通透性，从而导致细菌在细胞内寄生，因此由吞噬细胞向局部淋巴结的身体和运输，虽然不引起直接溶血，但能够产生协同溶血，其他重要的毒力因子包括完整的膜蛋白(FagA)，铁肠菌素的转运蛋白(FagB)、ATP结合胞膜蛋白(FagC)和铁素结合蛋白(F agD)。几个基因组成操纵子参与铁的吸收，形成伪结核菌对山羊持续性感染。这个操纵子位于从PLD基因的下游，有助于伪结核毒力维持。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明通过构建原核表达质粒pET-28a-PLD，转化入E.coli BL21(DE3)后，成功诱导表达了山羊伪结核棒状杆菌PLD重组蛋白。经SDS-PAGE及Western blot鉴定，纯化后的该重组蛋白具有免疫反应原性。同时，本发明以山羊伪结核棒状杆菌PLD重组蛋白作为抗原建立间接ELISA，通过优化试验条件及多组检测试验分析，本发明方法具有良好的敏感性、特异性及稳定性。ELISA检测方法操作简单，检测量大，无需活体动物试验，也避免了C.p分离鉴定方法在采样是可能造成的环境污染、病原体散播以及对于无明显临床症状的内脏型感染的漏检情况、有较高的可行性，可用于山羊伪结核病抗体的检测。
附图说明
图1是融合蛋白SDS-PAGE分析图；其中，M：Protein marker；1：诱导前上清；2：20℃诱导后收集的上清；3：20℃诱导后收集的沉淀；4：37℃诱导后收集的上清；5：37℃诱导后收集的沉淀；
图2为第一次镍琼脂糖亲和层析纯化SDS-PAGE分析图；其中，M：Protein marker；1：上样(经超声裂解的重组大肠杆菌)；2：流出(未通过镍琼脂糖亲和层析纯化的样品对照)；3-4：50mM Imidazole洗脱组分；5：100mM Imidazole洗脱组分；6-7：500mM Imidazole洗脱组分；
图3为第二次镍琼脂糖亲和层析纯化SDS-PAGE分析图；其中，M：Protein marker；1：切前(未切除组蛋白标签的纯化蛋白)；2：切后(切除组蛋白标签的纯化蛋白)；3：20mMImidazole洗脱组分；4：50mM Imidazole洗脱组分；5：500mM I midazole洗脱组分；
图4为纯化蛋白Western blot分析图；M：Protein Marker；1和2均为山羊伪结核棒状杆菌PLD重组蛋白。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
本发明除非另有说明，通常固体配制于液体中，百分号为质量百分浓度，
比例为质量比；液体配制于液体中，百分号为体积百分浓度，比例为体积比。
否则百分号代表体积百分数；比例为体积比。
一、pET-28a-PLD重组载体的构建
以SEQ ID No.3、SEQ ID No.4为上下游引物，以SEQ ID NO.2所示的基因为模板进行PCR扩增，将扩增产物连接到pET28a载体中，得到pET-28a-PLD重组载体；
上游引物F：5’-atgagggagaaagttgtttta-3’；(SEQ ID No.3)
下游引物R：5’-tcaccacgggttatccgc-3’；(SEQ ID No.4)
具体方法如下：
本发明根据山羊伪结核棒状杆菌磷脂酶毒力基因PLD信息，本发明通过全基因合成方法获得山羊伪结核棒状杆菌磷脂酶D(PLD)基因除去信号肽部分的序列，用于后续可溶性表达蛋白的基因工程菌表达。
根据毒力基因PLD参考序列，设计一对引物用于扩增及分析酶切蛋白。上游引物，PLD_F：atgagggagaaagttgtttta；下游引物PLD_R：tcaccacgggttatccgc，扩增。
常规PCR
(1)取一200ul PCR薄壁管，依次加入以下试剂：
(2)混匀后离心；
(3)反应参数设置：
1)94℃预变性3min
2)94℃，40Sec
3)50℃，40Sec
4)72℃，90Sec
5)步骤2)～4)循环30次
6)72℃，延伸5min
(4)反应完毕后取5μL 1％琼脂糖凝胶上电泳检测，凝胶成像仪观察852bp阳性条带。
PCR产物纯化(DNA凝胶回收法，按照现有技术)
(1)普通1％琼脂糖凝胶电泳，割下目的条带，移至1.5mL eppendorf中；
(2)按每400μL/100mg琼脂糖凝胶的比例加入Binding buffer，55℃水浴10min，确保凝胶完全融化；
(3)将UN IQ-5柱子放入2mL收集管中，把融化的凝胶溶液转移至此，室温放2min，室温8000rpm离心1min；
(4)取下UN IQ-5柱子，倒掉收集管中的废液，将柱子放回收集管，加入500μL WashSolution，室温8000rpm离心1min；
(5)重复(4)；
(6)取下UN IQ-5柱子，倒掉收集管中的废液，将柱子放回收集管，让离心管盖敞开，室温12000rpm离心1min；
(7)将UN IQ-5柱子放入一新的1.5mL eppendorf中，在柱子中央加15～30μLElution Buffer，55℃放置5min；
(8)12000rpm离心1min，1.5mL eppendorf中的液体即为回收的DNA片段。
DNA双酶切及酶切产物纯化
(1)20μL双酶切体系：
(2)振荡混匀，离心，37℃反应2小时；
(3)对重组质粒DNA割胶回收目的片段方法回收。
PCR产物与克隆载体的连接
将连接有基因的pMD18T vector和表达载体pET28a，按下述方法进行：
按下列组成配制酶切产物连接反应液，建立20μL反应体系。
其中载体pET28a和酶切产物的量按照1：3的摩尔比加入，混合，16℃连接10h，全量转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。
转化及细菌培养
(1)100μL的感受态细胞，冰上解冻至刚好融化；
(2)5μL连接反应液，加至感受态细胞中，轻弹管壁使其混匀，冰上30min；
(3)42℃水浴90秒，冰淬灭10min；
(4)加入37℃预热LB液体培养基1mL，混匀，200rpm，37℃振荡培养1.5小时；
(5)4000rpm，室温离心5min，吸去1mL上清，剩200μL，吹打混匀细菌沉淀；
(6)100μL/平板，涂于两个含卡那霉素LB平板上，37℃静置过夜培养。
注：如果是用质粒直接转化，则在步骤(1)加入2μL；质粒至200μL感受态细胞中，步骤(5)不用离心，直接取100μL涂于平板上。
(7)16～24h后，挑单菌落接种于5mL含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。
(8)调取单菌落进行鉴定(按照PCR扩增的方法鉴定)，阳性克隆小量培养，提取质粒，送上海生工生物工程有限公司测定核酸序列。
上述使用卡那霉素的浓度一般为50ug/ml，但不作为具体限制。
二、诱导表达
将pET-28a-PLD重组载体转入大肠杆菌中进行融合蛋白的诱导表达，具体方法如下：
取1ul pET-28a-PLD重组载体转化BL21(DE3)，42℃热击90s后，冰上静置2min，后涂布含有终浓度为30μg/mL卡那霉素的LB固体平板上(LB Bo rth Agar由生工提供，货号A507003-0250，使用时4g粉末用100mL dd wat er溶解)，37℃培养过夜。
小试培养选择最佳的诱导条件：挑取表达菌株BL21(DE3)的单菌落于三角瓶中(10mL LB培养基，LB Borth由生工提供，货号A507002-0250，使用时25g用1L dd water溶解，并加入卡那霉素至终浓度为30μg/mL)，于37℃，220rpm过夜培养。将过夜培养的菌液按1:100比例分别接种于10mL LB培养基中，添加终浓度30μg/mL卡那霉素，37℃，220rpm培养。
当菌液的OD值达到0.6时，添加IPTG至终浓度为0.5mM，220rpm，分别20℃诱导过夜或37℃诱导4h，未加IPTG诱导剂的作为阴性对照。
之后，4000rpm离心10min收集菌体，弃上清，菌体用500μL PBS(pH7.4)缓冲液悬浮，超声破碎6min(超声0.5s停1.5s为一个循环)，分别离心收集上清和沉淀，沉淀用500μL包涵体溶解液(8M Urea，50mM Tris-HCl，300mM NaCl，PH8.0)溶解，分别取40μL收集上清、沉淀，然后分别和10μL5×protein loading buffer混匀，沸水浴10min。
SDS-PAGE检测，准备12％的SDS-PAGE，Tris-Gly电泳缓冲液(Tris 3.0g，甘氨酸14.4g，SDS 1.0g，定容至1L)，上样量10μL，浓缩胶80V 20min，分离胶120V 60min，凝胶电泳结束考染20min，脱色；结果如图1所示。
将培养的菌液按1:100比例接种于3L的LB液体培养基中(含30μg/mL卡那霉素)，37℃，220rpm培养，当OD值达到0.6时，添加IPTG至终浓度为0.5mM，30℃，220rpm，诱导过夜，离心收集细胞菌体。
三、融合蛋白的分离纯化
超声破碎菌体：将收集的细菌菌体用破碎Buffer(50mM Tris，300mM NaCl，pH8.0)溶解，之后加PMSF至终浓度为0.5mM，同时加入TritonX-100至其体积百分浓度为0.1％，冰浴中超声破碎菌体，功率400W、20min(超声2S暂停6S为一个循环)。超声完毕，15000rpm、4℃下离心20min，收集上清进行下一步纯化。
第一次镍琼脂糖亲和层析：取5mL Ni-NTA，用10倍柱床体积的Binding buffer清洗平衡柱子，流速5mL/min。上柱，流速为2mL/min，收集穿透液。10倍柱床体积的Bindingbuffer清洗柱子，流速5mL/min。Wash buffer洗杂，流速5mL/min，收集洗脱液。Elutionbuffer洗脱(其中，采用咪唑含量为50mM、100mM、500mM三种浓度的Elution buffer做三个并列的试验)，流速2mL/min，收集洗脱液。将收集到的组分进行SDS-PAGE检测，见图2，将3组分(50；100；500咪唑洗脱组分)经25mM Tris，150mM NaCl，pH8.0，4℃缓冲液透析过夜。
Binding buffer：50mM NaH2PO4，300mM NaCl pH＝8.0；
Wash buffer:50mM NaH2PO4，300mM NaCl,10mM咪唑pH＝8.0，用前加1％tritonx-100，1mM PMSF；
Elution buffer:50mM NaH2PO4，300mM NaCl加入不同浓度的咪唑pH＝8.0。
第二次镍琼脂糖亲和层析：取5mL Ni-NTA，用1倍柱床体积的Binding buffer清洗平衡柱子，流速5mL/min。上柱，流速为2mL/min，收集穿透液。10倍柱床体积的Bindingbuffer清洗柱子，流速5mL/min。Wash buffer洗杂，流速5mL/min，收集洗脱液。Elutionbuffer洗脱(其中，采用咪唑含量为20mM、50mM、500mM三种浓度的Elution buffer做三个并列的试验)，流速2m L/min，收集洗脱液。将收集到的组分进行SDS-PAGE检测，见图3，将切后3组分(TEV酶切后20；50；500咪唑洗脱组分)经25mM Tris，150mM NaCl，pH8.0，4℃缓冲液透析析1h后，在胶盒中加PEG 20000浓缩，15000rpm、4℃下离心20min，0.45μm CA滤膜过滤分装1mL/tube，-80℃保存
Binding buffer：50mM NaH2PO4,300mM NaCl pH＝8.0；
Wash buffer：50mM NaH2PO4，300mM NaCl，10mM咪唑pH＝8.0，用前加1％tritonx-100，1mM PMSF；
Elution buffer:50mM NaH2PO4，300mM NaCl加入不同浓度的咪唑pH＝8.0。
纯化蛋白的检测——SDS-PAGE检测：准备12％的SDS-PAGE，Tris-Gly电泳缓冲液，上样量1μg，浓缩胶80V 20min，分离胶120V 60min，凝胶电泳结束后进行考马斯亮蓝染色20min，脱色，结果见图4。
Western blot检测：制胶：制备聚丙烯酰胺凝胶：浓缩胶5％分离胶12％制样：上样量：1ug。电泳：浓缩胶80V，30min；分离胶120V，60min。转膜：湿转，250mA 90min。封闭：5％的脱脂奶粉，37℃缓慢振荡2h。孵育一抗：一抗为兔抗his标签(抗体公司：Sangon Biotech,编号：D110002)，1:500稀释，37℃缓慢振荡60min。孵育二抗：二抗为山羊抗兔(抗体公司：Sangon Biotech,编号：D110058)，1:8000稀释，37℃缓慢振荡60min。显色：TMB显色，结果表明重组融合蛋白大小为29kDa。
Western blot分析蛋白活性：以山羊伪结核阳性血清作为一抗进行Western blot检测(见图4)。在PVDF膜上有一条大小为33KDa的特异性条带。由此表明，pET-28a-PLD质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达后，所获得的山羊伪结核棒状杆菌PLD重组蛋白能够被山羊伪结核阳性血清识别。并且根据所发生的特异性免疫印迹反应表明，该重组蛋白具有良好的抗原反应原性。
四、试剂盒的组装及使用
本试剂盒采用酶联免疫吸附试验检测样品中山羊血清抗体。在96孔板上预先包被好山羊伪结核棒状杆菌PLD重组蛋白，将待检样品加入到包被孔中孵育，若待检样品中含有伪结核抗体，包被的抗体与抗原与特异性地结合形成复合物。经过洗涤，再加入抗兔抗山羊酶标抗体，作用后洗去未结合的酶标抗体。最后加入底物溶液后显色，反应孔中颜色呈现的深浅与样品中抗体的含量呈正相关。
试剂盒包装：
数量1.山羊伪结核毒力基因PLD纯化蛋白96孔包被板可拆2块
2.阳性对照 2ml
3.阴性对照 2ml
4.脱脂奶 5g
5.Tween 20 2ml
6.交联剂二抗 50μL
7.底物TMB 10ml
8.25×洗液 35ml
9.终止液 20ml
所有试剂均需保存在2-8℃避光保存。
已拆封未使用的酶联板可抽真空后2-8℃保存或在-20℃条件下冻存。
试剂盒组分：
1.96孔ELISA板：抗原包被ELISA板，采用优化的蛋白浓度包被于4℃保存。
2.阴性对照血清：经检测无山羊伪结核棒状杆菌感染的山羊阴性血清。
3.阳性对照血清：经检测经山羊伪结核棒状杆菌重复感染的山羊阳性血清。
4.脱脂奶：DifcoTM Skim Milk生产，封闭时以5％(质量浓度)过夜封闭。
5.25×洗液：Ph7.2PBS配制而成，使用时用蒸馏水稀释成1倍浓度。
6.Tween 20：使用时每1L洗液中加入1mL，终浓度为1‰。
7.交联剂二抗：辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊抗体，使用时以1：50000浓度稀释。
8.底物TMB：BIOFX TMB one component HRP Microwell Substrate,使用时每孔加入100μL，避光保存。
9.终止液：1M H2SO4，使用时每孔加入100μL。
采用山羊伪结核杆菌抗体检测试剂盒检测山羊伪结核杆菌抗体的操作步骤：
1.加样前先将试剂盒中所有组分恢复到室温。
2.封闭：加入质量浓度为5％脱脂奶到ELISA板中过夜封闭；
3.洗涤弃去脱脂奶每孔加300μL工作洗涤液(1倍的洗液PBS)，将25×PBS用纯化水稀释25倍进行洗板，方便保存共洗涤5次，每次洗板要尽量弃尽洗涤液，且在洁净的纱布上拍打酶标板以去除残余洗涤液。
4.加样：每孔加100μL被检样品，每个样品加两孔，同时设阳性、阴性对照孔各两孔(阳性对照孔加入阳性对照血清，阴性对照孔加入阴性对照血清)；用封口膜封板后，放置22±5℃下作用1小时。
5.洗涤：弃去样品每孔加300μL工作洗涤液(1倍的洗液PBS)进行洗板，共洗涤5次，每次洗板要尽量弃尽洗涤液，且在洁净的纱布上拍打酶标板以去除残余洗涤液。
6.加酶标抗体：每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊抗体，用封口膜封板后放置22±5℃下作用1小时。
7.洗涤“同3”。
8.加显色液：每孔加入100μL底物TMB，室温闭光作用10分钟。
9.加终止液：每孔加入100μL终止液。
10.读数：终止反应后，迅速在酶联读数仪上用450nm波长读取各孔OD值。
结果判断：
当阴性对照OD值(450nm)小于0.2且阳性对照OD值(450nm)大于0.6时试验结果成立。
待检样品OD值(450nm)大于0.5判为阳性；0.3≤OD值(450nm)≤0.5判为可疑；OD450值小于0.3判为阴性。对可疑样品应进行重检，重检仍为可疑判为阴性。
五、试剂盒及其检测条件优化试验
(一)间接ELISA方法的建立
1、抗原包被浓度及血清稀释度的优化
采用方阵滴定法，用碳酸盐缓冲液将重组蛋白PLD稀释至2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg/mL，每孔加入100μl稀释后的液体包被酶标板，4℃过夜。
将已知伪结核阳性血清和阴性血清以1：100、1：200、1：400三个梯度稀释，每孔加入100μl，37℃孵育1h，进行间接ELISA试验，酶标仪于OD450nm读数，将阳性血清(P)与阴性血清(N)比值(P/N)最大且OD450nm值最接近1.0的一组作为最佳抗原浓度和最佳血清稀释度，以此进行后续试验。
2、封闭试剂的选择
选用质量浓度为1％的BSA、质量浓度为5％脱脂奶作为封闭试剂，每孔加入100μl，4℃封闭过夜。测定OD450nm值，分析P/N的大小，选择比值较大一组的封闭试剂作为最终封闭试剂。
3、二抗工作浓度和工作时间的优化
在上述优化条件下，将辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊抗体分别稀释至1：20000、1：50000、1：100000，每孔加入100μl，37℃孵育，测定OD450nm值，分析得出最佳工作浓度。在此基础上进行工作时间的优化。分别于37℃孵育30min、45min、60min，通过酶标仪读数，分析得出最佳工作时间。
4、显色时间的优化
应用确定的最佳实验条件进行试验，使用TMB显色，每孔加入100μl，避光分别显色5min、10min、15min后加入1M H2SO4终止反应，分析OD450nm读数，确定最佳显色时间。
(二)间接ELISA重复性试验
1、批内重复试验
在同一块山羊伪结核棒状杆菌PLD重组蛋白包被ELISA板进行试验。取山羊伪结核阳性血清1份，阴性血清1份，待检血清2份并设置1组空白对照(空白对照为不加血清)。每份样品重复5孔，记录OD450nm值，并计算出平均数、标准差、变异系数(CV值)，判断批内重复性。
2、批间重复试验
选择5个不同时间包被的ELISA板，取山羊伪结核阳性血清、阴性血清各1份，待检血清2份并设置一组空白对照(空白对照为不加血清)，进行间接ELISA试验。记录OD450nm值，计算平均数、标准差及CV值，判断批间重复性。
(三)间接ELISA特异性试验
以山羊伪结核阳性血清和阴性血清作为对照组，检测山羊口疮、山羊痘、山羊布氏杆菌病的阳性血清，根据OD450nm读数，判定所建立的间接ELISA的特异性。
(四)临界值的确定
实验室保存的25份山羊伪结核阳性血清，按优化的最佳条件进行间接ELISA试验。记录OD450nm值，计算平均数和标准差(SD)。根据统计学原理，当样品的OD450nm值≥时，将其定义为阳性，当样品的OD450nm值≤时，定义为阴性，介于二者之间为可疑样品需重新检测。
(五)临床样品的检测
对实验室保存的91份山羊伪结核血清样品进行检测。其中已知有30份血清样品采自有明显体表病变的山羊，15份血清样品为阴性血清样品，其余46份为随机采样。
(六)间接ELISA方法的建立
1、最佳抗原包被浓度和血清稀释度的确定
当抗原包被浓度为4μg/mL，血清稀释倍数为1：100时，P/N值较大且OD450nm值最接近1.0(见表1)。因此将其定为最佳条件。
表1最佳抗原包被浓度和血清稀释度
2、最佳封闭试剂的确定
使用质量浓度为1％BSA作为封闭试剂时，其P值为0.952，N值为0.2267，P/N为4.2。在使用质量浓度为5％脱脂奶作为封闭试剂时，P值为0.9858，N值为0.2176，P/N为4.53。因此，最终选择用质量浓度为5％脱脂奶作为封闭试剂。
3、最佳二抗工作浓度及工作时间的确定
当酶标二抗以1：50000稀释时，P/N值较大且OD450nm最接近于1.0，以此将此浓度最为二抗的最佳工作浓度。虽然在1：20000稀释时，P/N值最大，但是由于此时OD450nm值大于2，超出了酶标仪敏感之1.0～1.5的区间，故舍弃(见表2)。最佳工作时间确定在45min(见表3)。
表2酶标抗体最佳工作浓度
表3酶标抗体最佳工作时间
4、最佳显色时间的确定
使用TMB显色，避光显色10min的P/N最大，鉴于此时OD450nm值为1.1956，可通过缩短时间让其更接近于1.0。因此，认为显色时间在8-10m in最佳(见表4)。
表4最佳显色时间
5间接ELISA重复性试验结果分析
5.1批内重复性试验结果分析
通过四组血清和一组空白对照试验结果(见表5)，得到阳性血清CV值为8.1％，阴性血清CV值为9.2％，待检血清CV值分别为4％、1.4％，空白对照C V值为6.6％，均低于10％。表明批内重复性良好。
表5批内重复性试验结果
5.2批间重复性试验结果分析
使用五个不同时间包被的酶标板进行试验，五组样品分别为伪结核阳性血清、阴性血清、待检血清1、待检血清2、空白对照。通过计算得出CV值分别为7.8％、8.4％、5.8％、5.7％、4.2％，都小于10％(见表6)。以上结果表明，以重组蛋白PLD作为包被抗原所建立的间接ELISA方法具有良好的批间重复性。
表6批间重复性试验结果
(七)特异性试验结果分析
根据酶标仪读数得到，OD450nm值分别为山羊口疮0.942、山羊痘0.0782、山羊布氏杆菌病0.054，均为阴性。表明该方法具有良好的特异性。
(八)临界值的确定
根据25份伪结核阴性血清检测结果(见表7)，计算出平均值为0.1595，标准差为0.0482。因此，当OD450nm值≥0.3398时，判定为阳性；OD450n m值≤0.2916时，判定为阴性；0.2916≤OD450nm≤0.3398时，判定为可疑样品，需重新检测。
表7临界值试验数据
A B C D E
1 0.189 0.2018 0.2017 0.1875 0.1993
2 0.2434 0.1444 0.1834 0.1179 0.1747
3 0.2792 0.2832 0.1707 0.2993 0.1967
4 0.2698 0.1517 0.1262 0.1708 0.1718
5 0.2011 0.1705 0.1918 0.2357 0.1491
临床样品的检测结果分析：91份血清样品的检测，已知的30份阳性样品和15份阴性样品全部准确检出，可见其敏感性良好。其余的46份样品的检测结果为，阳性样品26份、阴性样品20份，阳性率为56.5％。由此，可疑了解到山羊伪结核病的感染情况较为严重，且有很多未出现临床症状或内脏型感染的山羊只，做好检测工作十分必要。
本发明通过构建原核表达质粒pET-28a-PLD，转化入E.coli BL21(DE3)后，成功诱导表达了PLD蛋白。经SDS-PAGE及Western blot鉴定，纯化后的重组蛋白具有免疫反应原性。并以重组蛋白PLD作为抗原建立间接ELISA，通过优化试验条件及多组检测试验分析。此方法具有良好的敏感性、特异性及稳定性。ELISA检测方法操作简单，检测量大，无需活体动物试验，也避免了C.p分离鉴定方法在采样是可能造成的环境污染、病原体散播以及对于无明显临床症状的内脏型感染的漏检情况、有较高的可行性，可用于山羊伪结核病抗体的检测。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 云南省畜牧兽医科学院
昆明市西山区畜牧兽医站
<120> 山羊伪结核棒状杆菌PLD重组蛋白及其制备方法与应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 284
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 1
Met Ala Pro Val Val His Asn Pro Ala Ser Thr Ala Asn Arg Pro Val
1 5 10 15
Tyr Ala Ile Ala His Arg Val Leu Thr Thr Gln Gly Val Asp Asp Ala
20 25 30
Val Ala Ile Gly Ala Asn Ala Leu Glu Ile Asp Phe Thr Ala Trp Gly
35 40 45
Arg Gly Trp Trp Ala Asp His Asp Gly Ile Pro Thr Ser Ala Gly Ala
50 55 60
Thr Ala Glu Glu Ile Phe Lys His Ile Ala Asp Lys Arg Lys Gln Gly
65 70 75 80
Ala Asn Ile Thr Phe Thr Trp Leu Asp Ile Lys Asn Pro Asp Tyr Cys
85 90 95
Arg Asp Ala Arg Ser Val Cys Ser Ile Asn Ala Leu Arg Asp Leu Ala
100 105 110
Arg Lys Tyr Leu Glu Pro Ala Gly Val Arg Val Leu Tyr Gly Phe Tyr
115 120 125
Lys Thr Val Gly Gly Pro Ala Trp Lys Thr Ile Thr Ala Asp Leu Arg
130 135 140
Asp Gly Glu Ala Val Ala Leu Ser Gly Pro Ala Gln Asp Val Leu Asn
145 150 155 160
Asp Phe Ala Arg Ser Glu Asn Lys Ile Leu Thr Lys Gln Lys Ile Ala
165 170 175
Asp Tyr Gly Tyr Tyr Asn Ile Asn Gln Gly Phe Gly Asn Cys Tyr Gly
180 185 190
Thr Trp Asn Arg Thr Cys Asp Gln Leu Arg Lys Ser Ser Glu Ala Arg
195 200 205
Asp Gln Gly Lys Leu Gly Lys Thr Phe Gly Trp Thr Ile Ala Thr Gly
210 215 220
Gln Asp Ala Arg Val Asn Asp Leu Leu Gly Lys Ala Asn Val Asp Gly
225 230 235 240
Leu Ile Phe Gly Phe Lys Ile Thr His Phe Tyr Arg His Ala Asp Thr
245 250 255
Glu Asn Ser Phe Lys Ala Ile Lys Arg Trp Val Asp Lys His Ser Ala
260 265 270
Thr His His Leu Ala Thr Val Ala Asp Asn Pro Trp
275 280
<210> 2
<211> 853
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
atgcttccgg tagggaatgc agctgcagcg cctgttgtgc ataacccagc ttctacagca 60
aatcggccag tctatgcgat tgcccaccgc gttttaacca ctcaaggcgt ggatgacgca 120
gttgcgatcg gtgcgaatgc gttagaaatt gacttcactg cgtggggtcg tggctggtgg 180
gcagatcatg atggtattcc tactagcgca ggtgctactg cagaggaaat ttttaagcat 240
atagctgata agcgtaagca gggagcaaat attactttca cctggcttga catcaagaat 300
ccagactact gcagggatgc tcgtagtgtg tgctccataa atgcgttgcg tgatttggca 360
cgtaaatatc ttgagccggc aggggttcga gttctctatg ggttctataa gacagtcggc 420
ggacctgcct ggaagacaat caccgctgat cttcgggatg gcgaggcggt agctcttagc 480
ggcccggcgc aggacgtatt aaatgatttt gcaaggtctg aaaataagat ccttactaaa 540
caaaaaatcg ctgactatgg ttactacaac attaaccaag ggtttggtaa ctgctatgga 600
acctggaatc ggacttgtga tcaactccgt aagtccagcg aagctcgtga ccaaggaaaa 660
ctcggtaaaa cttttgggtg gacaatcgct acaggtcagg acgcgcgagt taatgatctt 720
ttaggaaaag ccaacgtaga tggactgatc tttggcttta agattactca cttctaccgt 780
catgcagaca ccgaaaattc tttcaaagcc atcaagaggt gggtggataa gcactccgct 840
actcaccatc tga 853
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
atgagggaga aagttgtttt a 21
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
tcaccacggg ttatccgc 18

Claims (10)

1.山羊伪结核棒状杆菌PLD重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白为由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成的蛋白。
2.编码权利要求1所述的山羊伪结核棒状杆菌PLD重组蛋白的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.权利要求1所述的山羊伪结核棒状杆菌PLD重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（1），以SEQ ID No.3、SEQ ID No.4为上、下游引物，以SEQ ID NO.2所示的基因为模板进行PCR扩增，将扩增产物连接到pET28a载体中，得到pET-28a-PLD重组载体；
上游引物F：5’-atgagggagaaagttgtttta-3’；
下游引物R：5’-tcaccacgggttatccgc-3’；
步骤（2），将pET-28a-PLD重组载体转入大肠杆菌中进行融合蛋白的诱导表达；
步骤（3），将步骤（2）中经诱导表达融合蛋白的大肠杆菌裂解后离心，然后将离心后收集的上清液采用镍柱亲和层析进行分离纯化，得到山羊伪结核棒状杆菌PLD重组蛋白。
5.含有权利要求2或3所述核苷酸序列的重组菌。
6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌采用的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
7.权利要求1所述山羊伪结核棒状杆菌PLD重组蛋白作为制备山羊伪结核杆菌抗体检测试剂、试剂盒的应用。
8.包含权利要求1所述山羊伪结核棒状杆菌PLD重组蛋白的山羊伪结核杆菌抗体检测试剂盒。
9.根据权利要求8所述的山羊伪结核杆菌抗体检测试剂盒，其特征在于：包括山羊伪结核棒状杆菌PLD重组蛋白包被ELISA板、阳性对照血清、阴性对照血清、脱脂奶、底物TMB、25×PBS、吐温20、辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊抗体和终止液；
所述的阴性对照血清为经检测无山羊伪结核棒状杆菌感染的山羊阴性血清；
所述的阳性对照血清为经检测经山羊伪结核棒状杆菌重复感染的山羊阳性血清；
所述的终止液为1M H2SO4。
10.根据权利要求9所述的山羊伪结核杆菌抗体检测试剂盒，其特征在于：所述的山羊伪结核棒状杆菌PLD重组蛋白包被ELISA板的制备方法是：用碳酸盐缓冲液将山羊伪结核棒状杆菌PLD重组蛋白稀释至2~10µg/mL，之后每孔加入100µl包被酶标板，4℃过夜，即得山羊伪结核棒状杆菌PLD重组蛋白包被ELISA板。
CN201711066074.5A 2017-11-02 2017-11-02 山羊伪结核棒状杆菌pld重组蛋白及其制备方法与应用 Pending CN107746837A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711066074.5A CN107746837A (zh) 2017-11-02 2017-11-02 山羊伪结核棒状杆菌pld重组蛋白及其制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711066074.5A CN107746837A (zh) 2017-11-02 2017-11-02 山羊伪结核棒状杆菌pld重组蛋白及其制备方法与应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107746837A true CN107746837A (zh) 2018-03-02

Family

ID=61253495

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711066074.5A Pending CN107746837A (zh) 2017-11-02 2017-11-02 山羊伪结核棒状杆菌pld重组蛋白及其制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107746837A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110456078A (zh) * 2019-09-17 2019-11-15 石河子大学 检测羊mvv及所引起的传染病的蛋白及其试剂和试剂盒
CN113759111A (zh) * 2021-08-24 2021-12-07 深圳芬德生物技术有限公司 检测伪结核棒状杆菌抗体的检测卡及其应用和试剂盒
CN113999304A (zh) * 2021-10-13 2022-02-01 北京市农林科学院 抗肠菌素单克隆抗体mAb4及其在肠菌素检测中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5637303A (en) * 1990-10-25 1997-06-10 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Use of a phospholipase D mutant of Corynebacterium pseudotuberculosis for vaccination
CN105181963A (zh) * 2015-07-30 2015-12-23 西北农林科技大学 一种山羊伪结核杆菌抗体的elisa检测试剂盒的制备方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5637303A (en) * 1990-10-25 1997-06-10 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Use of a phospholipase D mutant of Corynebacterium pseudotuberculosis for vaccination
CN105181963A (zh) * 2015-07-30 2015-12-23 西北农林科技大学 一种山羊伪结核杆菌抗体的elisa检测试剂盒的制备方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ADRIAN L. M. HODGSON ET AL.,: ""Cloning, Nucleotide Sequence, and Expression in Escherichia coli of the Phospholipase D Gene from Corynebacterium pseudotuberculosis"", 《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》 *
J. GLENN SONGER ET AL.,: ""Cloning and Expression of the Phospholipase D Gene from Corynebacterium pseudotuberculosis in Escherichia coli"", 《INFECTION AND IMMUNITY》 *
JILL A. HAYNES ET AL.,: ""Production of an enzymatically inactive analog of phospholipase D from Corynebacterium pseudotuberculosis"", 《GENE》 *
匿名: ""GenBank：CP001809.2：24159..25010"", 《GENBANK》 *
匿名: ""P20626（PLD_CORPS）"", 《UNIPROTKB》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110456078A (zh) * 2019-09-17 2019-11-15 石河子大学 检测羊mvv及所引起的传染病的蛋白及其试剂和试剂盒
CN113759111A (zh) * 2021-08-24 2021-12-07 深圳芬德生物技术有限公司 检测伪结核棒状杆菌抗体的检测卡及其应用和试剂盒
CN113999304A (zh) * 2021-10-13 2022-02-01 北京市农林科学院 抗肠菌素单克隆抗体mAb4及其在肠菌素检测中的应用
CN113999304B (zh) * 2021-10-13 2023-10-24 北京市农林科学院 抗肠菌素单克隆抗体mAb4及其在肠菌素检测中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104181301B (zh) 基于磁性分离和多色量子点标记的抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体快速共检的方法和试剂盒
CN102532281B (zh) 一种猪瘟病毒重组E2蛋白及其IgM抗体ELISA检测试剂盒
CN110376384B (zh) 检测中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜的elisa检测试剂盒
CN101881770A (zh) 猪圆环病毒2型胶体金抗体快速检测试纸条的制备方法
CN109001450A (zh) 一种检测鸡滑液囊支原体抗体的试剂盒及制备方法
CN110133284A (zh) 蛋白抗原及其编码基因和它们在鉴别猪肺炎支原体灭活疫苗抗体和自然感染抗体中的应用
CN107746837A (zh) 山羊伪结核棒状杆菌pld重组蛋白及其制备方法与应用
CN101538578B (zh) 三基因融合的重组牛结核特异性抗原蛋白及制备方法
CN111551750A (zh) 猪星状病毒间接elisa检测试剂盒
CN102221616B (zh) 一种鸡毒支原体间接elisa诊断试剂盒
CN110208518A (zh) 基于Fiber1蛋白检测鸭3型腺病毒抗体的间接ELISA检测方法及其检测试剂盒
CN113588946B (zh) 一种猪肺炎支原体抗体间接elisa检测用的重组蛋白和方法
US8389678B2 (en) Protein fragments of virB10 and sero-detection of Anaplasma phagocytophilum
CN108059683A (zh) 梅毒重组多价融合抗原、梅毒重组抗原质粒和梅毒重组抗原菌株及其制备方法及试剂盒
CN102707054B (zh) 大肠埃希氏菌OmpT抗体间接ELISA检测方法
CN107664694A (zh) 一种基于e2蛋白检测猪非典型瘟病毒抗体的elisa试剂盒
US8859722B2 (en) Hemolysin and its protein fragments in sero-detection of anaplasma phagocytophilum
CN105907770A (zh) 重组基因、其编码的重组蛋白、其应用及牛副结核杆菌的检测试剂盒和检测方法
CN116768984A (zh) 一种牛结节性皮肤病病毒重组p32蛋白制备方法及其应用
CN104651379A (zh) 一种重组猪流行性腹泻病毒n蛋白及其制备方法
CN106188249B (zh) 用于检测pedv变异株抗体的抗原及方法和试剂盒
CN116284431A (zh) 一种新型冠状病毒多克隆抗体的制备及其应用
CN101979406B (zh) 南非ⅱ型口蹄疫多抗原表位蛋白、其制备方法及应用
CN110437319B (zh) 一种阿龙山病毒vp2蛋白及其抗体间接elisa检测试剂盒
CN117288947B (zh) 一种牛坏死杆菌抗体间接elisa检测试剂盒及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20180302