CN107667168A - 用于破碎组织材料的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于破碎组织材料的组合物，所述组合物包含与至少一种用于酶裂解的酶和至少一种离液剂相组合的固体破碎粒子，本发明还涉及一种通过同时应用机械研磨或碾磨破碎和酶消化来破碎组织材料的方法。

Description

用于破碎组织材料的组合物和方法

描述：

前言：

本发明涉及用于破碎组织样品例如特别是固体组织的组合物，其中所述组合物包含与至少一种用于酶裂解的酶和至少一种离液剂相组合的固体破碎粒子，用于通过同时的机械研磨或碾磨破碎和酶消化进行的组合破碎处理。此外，本发明涉及通过同时应用机械研磨或碾磨破碎和酶消化来破碎固体组织材料的方法。本发明还涉及用于按照本发明进行固体组织破碎的试剂盒和系统。

背景技术：

在涉及从完整样品分开、分离和分析所需组分(被分析物)的分析性研究中，特别是在细胞组分例如核酸、RNA、DNA、蛋白质和其他生物化学被分析物的分离/收获和分析中，样品材料的破碎步骤是首先和基础性步骤之一。

原则上，化学和机械/物理方法两者都可用于生物样品的破碎。对于许多样品类型例如大肠杆菌(E.coli)和培养的细胞来说，化学方法通常是优选的。依赖于研磨、剪切、击打和冲击的机械/物理方法一般用于不能通过化学处理有效破碎的生物样品，例如许多微生物、固体组织、固体样本(例如种子)。

已知的化学破碎方法通常利用在去污剂、表面活性剂、裂解酶或离液剂基础上的所谓的裂解溶液或裂解缓冲剂，其破坏生物样品或细胞的结构以释放出细胞内含物或被分析物。

机械或物理破碎方法通常利用均质机、研钵和研杵、超声发生器、混合器、磨机和涡旋振荡器，其通过研磨、剪切、击打和冲击力来机械破坏生物样品的结构，以释放出细胞内含物或被分析物。

破碎和均质化方法的选择强烈依赖于待处理的生物样品的种类以及待分离和分析的细胞组分，并且工具、化学品和它们的使用方法的选择可能对分析结果具有显著影响。

到目前为止，固体组织材料通常通过应用上面提到的几个机械破碎技术步骤或通过在长时间段内应用化学(即酶)消化(通常为过夜消化)进行均质化或破碎。然而，这些方法耗时且需要特殊的高性能混合装置才能实现适合的均质化和充分裂解，因此常常使分离到的敏感被分析物劣化。已发现，使用低功率混合器例如涡旋振荡器的研磨对于研磨固体组织材料来说不太有效。

使用化学破碎方法例如裂解缓冲剂与机械破碎方法的组合已被非常一般性地提到，例如在D.W.Burden的“生物样品破碎指南——2012年(Guide to the Disruption ofBiological Samples–2012)”(Random Primers,Issue No.12,pages 1-25,2012)中，所述文献提供了关于应用于各种不同生物样品的破碎的各种不同的化学和机械破碎方法的广泛综述。该出版物没有解决所述各种不同的化学和机械方法中的哪些特定破碎方法可以被组合或对于特定生物样品类型来说如何组合(例如在后续的处理步骤中或同时)。提到了使用研磨球和涡旋振荡器来破裂组织，但是指出了由于性能不良，涡旋振荡器不太适合于研磨组织材料(不太有效)。

在对生物样品进行预处理以释放出所需被分析物的领域中，各种不同的均质化组合物或裂解试剂是已知的。例如，在WO 2014/096136 A2、EP 2447352 A1或WO 1999/33559A1中提到了均质化介质，其可以包含裂解酶和机械碾磨粒子。所有这些介质被描述为用于单细胞、细胞培养物、微生物、细菌、病毒或孢子的破碎。

本申请人的国际申请WO 2002/00600 A1涉及一种用于分离和稳定微生物例如原核生物、真菌、原生动物或藻类中的核酸或来自于所述微生物的核酸的方法。其中，一般性提到了通过使用机械、化学、物理或酶方法可以均质化或破碎紧实的生物样品。在实施例5中描述了细菌样品的细胞破碎，并且在其中提到了使用酶裂解(溶菌酶介导的细胞破碎)，在以30Hz的混合速度使用带有直径为150至600μm的玻璃珠的珠磨机5分钟的支持下，来破碎细菌的细胞壁。

国际申请WO 2011/144304 A1涉及用于身体样品的裂解的裂解缓冲剂和方法。其中要求保护的裂解缓冲剂除了包含至少一种离液剂和至少一种还原剂之外，还包含至少一种蛋白水解酶。所述裂解缓冲剂还可以包含珠磨粒子，并且其中描述的用于处理身体样品的方法包括对包含所述身体样品和具有至少一种蛋白水解酶的裂解缓冲剂的混合物进行珠磨。所述申请具体涉及与呼吸疾病的诊断相关的身体样品，并且其中所述身体样品被定义为包含体液或半流体样品例如痰液、脓、分泌物、吸出物、灌洗液、拭子，或非呼吸系统样品例如血液、脓、胸膜液、胸膜穿刺物、胃液、胃吸出物、引流物或穿刺液。所述裂解缓冲剂主要旨在用于破碎呼吸系统样品，并且强制性包含用于溶解这些样品中的粘液成分的还原剂。

本申请人的EP 2 166 335 A1描述了一种高性能珠磨装置和使用这种装置破碎固体组织样品的方法。实施例提到，将机械破碎的组织样品随后按照DNeasy流程(可以从Qiagen获得)用蛋白酶K和核糖核酸酶A处理，用于进一步分析。

WO 2005039722 A2和相应的US 8,020,790描述了通过使用特定碾磨粒子和未进一步指定的裂解缓冲剂来破碎生物样品。

Ciccone等人在他们的科学出版物“B细胞靶向病毒通过提高整体5-羟甲基胞嘧啶水平破坏淋巴组织中潜在保护性的基因组甲基化模式(A B-cell targeting virusdisrupts potentially protective genomic methylation patterns in lymphoidtissue by increasing global 5-hydroxymethylcytosine levels)”(VeterinarysResearch 2014,45,108)中描述了用于DNA印迹分析的组织破碎，其使用10mm玻璃珠和10mMtris,pH 8.0,100mM NaCl,10mM EDTA,0.5％SDS。在其中添加100ug蛋白酶K并在50℃下静置过夜，用于蛋白质消化。

Mann和Babb在他们的科学出版物“妊娠大鼠中的神经甾类激素受体基因表达(Neural steroid hormone receptor gene expression in pregnant rats)”(MolecularBrain Research 2005,142,39-46)中描述了一种脑组织样品均质化方法，其使用含有蛋白酶K的裂解缓冲剂和两个4mm研磨珠，并且在56℃下进行蛋白质消化30分钟，然后在-20℃下进行30分钟。

如上所示，用于生物样品的同时破碎的裂解酶与机械破碎粒子的特定组合，只是被描述用于表现出以相对小的尺寸(微生物、细胞、病毒等)为特征或结构上“脆弱”(单细胞、细胞培养物、体液)的生物结构的生物样品材料。相反，固体组织材料通常以相对稳定的细胞构造或纤维状或膜状结构为特征，并且与例如流体或半流体样品相比，紧实得多。因此，与在上面的现有技术中所描述的较小和“较脆弱”的样品材料(例如细胞、细胞培养物、微生物、细菌、病毒或孢子)相比，固体组织材料表现出提高的机械强度或完整性，更高的密度，并且常常以大得多的完整/紧密连接的或紧实的样品碎片的形式提供或取样。不言而喻，这些固体组织材料原则上需要以完全不同的方式处理，以破碎并释放出所需被分析物。与破碎流体样品或细胞培养物样品相比，破碎相对紧密的细胞结构要求更强的力和更长的消化时间。于是，施加强的机械或化学破碎力带来使通常非常敏感的所需被分析物例如核酸、DNA、RNA和其他细胞组分损坏或劣化的风险。

发明目的：

本发明的目的是提供一种用于有效破碎和均质化固体组织材料，以分离并收获敏感的生物化学被分析物例如核酸、RNA、DNA和其他细胞组分的新的改进的方法，其避免了现有技术方法的缺点。优选地，所述用于破碎固体组织的新的改进的方法应该是特别温和的。更优选地，所述新方法应该提供固体组织样品的温和的破碎和均质化，提高分离的被分析物的质量，工作更快并且简化样品制备，特别是对于高通量的自动化分析来说。甚至更优选地，所述新的改进的方法应该通过对组织样品施加温和的机械和/或温和的化学冲击，特别是通过施加减小的机械力和/或减少的化学冲击来进行。甚至更优选地，应该减少离液剂的化学冲击。此外，优选地提高裂解酶的活性并避免它失活，以在组织样品的组合的机械和化学(即酶)裂解处理中提供它的最佳功效。此外，优选地提供具有缩短的破碎/消化时间的更快速的方法。

令人吃惊地发现，使用本发明的组合物、试剂盒、系统和方法，这一目的得以实现。与到目前为止应用于完整组织材料的均质化方法相比，本发明的组合物、试剂盒、系统和方法允许在显著更短的时间段内有效地破碎固体组织材料，甚至是具有高度密实或紧密组织结构的非常坚韧的组织样品例如啮齿动物尾(例如小鼠尾)，即使是在使用常用的实验室设备例如低功率涡旋振荡器时，并在同时实现所需被分析物的更高得率和被分析物的更好质量。

令人吃惊地证明，与单独的酶消化或使用珠磨机的机械破碎相比，本发明特别地改进从组织样品提取出DNA。单独的化学、即酶消化通常不能最大化从组织样品提取的得率。单独的机械珠磨破碎通常需要特殊的大型设备(珠磨机)以便高效地均质化组织样品用于高效DNA提取。在本发明中已显示，优化的裂解化学与优化的研磨粒子选择的组合允许高效、快速且完全破碎并均质化组织样品，即使是在常见的桌面涡旋振荡器上，从而与单独使用化学、即酶消化相比大大提高得率，此外令人吃惊的是，碾磨程序不使提取的核酸的质量(特别是尺寸)劣化，并被证明优于通过常用珠磨处理所实现的。

特别令人吃惊地发现，与单独地应用机械碾磨条件或特定化学裂解条件相比，使用本发明的机械碾磨条件和特定化学裂解条件的特定组合，可以在一种协同效应的意义上实现超过累加的效应。

发明描述：

本发明的主题内容是用于组织材料的破碎和均质化的新的组合物和方法。

在本发明的情形中，术语“组织材料”或“组织”具体来说是指人类和动物来源的固体组织样品，例如特别是全组织或完整组织样品。术语“组织材料”或“组织”包括在细胞与完整器官之间的细胞组织水平中间体，以及人类或动物体的包含这些细胞组织水平中间体的样品。在本发明的意义上，固体组织材料通常以相对稳定的细胞构造或细胞组织或者纤维状或膜状结构为特征。通常，与例如单细胞培养物或流体或半流体样品相比，这类组织材料更坚韧并且紧实得多或紧密连接。因此，与在上面的现有技术中所描述的小且“脆弱”的样品材料(例如单细胞、细胞培养物、微生物、细菌、病毒或孢子)相比，在本发明的意义上的固体组织材料表现出更高的机械强度或完整性，更高的密度，并且常常以大得多的完整/紧密连接或紧实的样品碎片的形式取样。特别是，本发明的组织材料包括但不限于结缔组织、肌肉组织、神经组织、上皮组织和矿化组织。因此，在本发明的意义上，组织包括但不限于组织化的(相连的)细胞构造，纤维状和/或膜状组织，包括例如皮肤、肌肉、肌腱、微丝、神经、软骨、骨骼，器官例如肠、胃、肝、脾、脑、淋巴、骨髓、肾、心以及尾(例如啮齿动物尾如小鼠尾)等。优选地，本发明中所使用的组织材料是活组织检查的结果。更优选地，与流体或半流体样品例如血液、粘膜相比，本发明中所使用的组织材料是固体组织。此外，优选的是，与脆弱的单细胞或细胞培养物相比，本发明中所使用的组织材料是坚韧的固体组织。

在本发明的情形中，术语“破碎”包括被取样和处理的组织材料的所有水平的破碎，其允许细胞组分或所需被分析物以高于相应被分析物的个体检测限的量或以允许使用适合的分析技术进行分离、收获和检测的量，从所述组织样品释放。其中，高程度的破碎包括组织样品的完全或至少部分的均质化。均质化意味着将所述组织样品带到这样一种状态，使得组合物中样品的所有(或至少被均质化的部分)的级分基本上相等。这意味着均质化的样品被分解、磨碎或切碎，然后非常好地混合，使得除去某些样品不改变剩余样品的整体分子组成，并且与被除去的级分一致。优选地，本发明的组合物、试剂盒和系统以及方法涉及组织材料的破碎和/或均质化。

本发明的用于破碎组织材料的组合物包含：

-一种或多种固体破碎粒子；以及

-至少一种用于酶裂解的酶。

优选地，本发明的用于破碎组织材料的组合物包含：

-一种或多种固体破碎粒子；

-至少一种用于酶裂解的酶；以及

-至少一种缓冲剂。

更优选地，本发明的用于破碎组织材料的组合物包含：

-一种或多种固体破碎粒子；

-至少一种用于酶裂解的酶；

-至少一种缓冲剂；以及

-至少一种离液剂，优选地离液剂的总浓度低于或等于1M。

更优选地，本发明的用于破碎组织材料的组合物包含：

-一种或多种固体破碎粒子；

-至少一种用于酶裂解的酶；

-至少一种缓冲剂；以及

-至少一种消泡剂。

更优选地，本发明的用于破碎组织材料的组合物包含：

-一种或多种固体破碎粒子；

-至少一种用于酶裂解的酶；

-至少一种缓冲剂；

-至少一种离液剂，优选地离液剂的总浓度低于或等于1M；以及

-至少一种消泡剂。

在进一步优选的实施方式中，本发明的用于破碎组织材料的组合物还包含选自下述的一种或多种试剂：

-至少一种离液剂；

-至少一种去污剂；

-至少一种核酸酶抑制剂；

-至少一种消泡剂；

-至少一种渗透压稳定剂；

-至少一种还原剂，

及其任何混合物。

进一步优选的实施方式涉及如上所定义的用于破碎组织材料的组合物，其包含一种或多种固体破碎粒子、至少一种用于酶裂解的酶、至少一种缓冲剂、至少一种离液剂(优选地离液剂的总浓度低于或等于1M)和/或至少一种消泡剂，以及选自下述的一种或多种试剂：

-至少一种去污剂；

-至少一种核酸酶抑制剂；

-至少一种还原剂；

及其任何混合物。

特别优选地，如上所定义的用于破碎组织材料的组合物不包含引起所述至少一种裂解酶的变性并因此失活的浓度的有机溶剂，例如特别是醇。例如，在本发明的组合物中，乙醇、丙醇和/或异丙醇不应以使酶(例如特别是如下所定义的裂解酶，特别是蛋白酶例如特别是蛋白酶K)变性或失活的量存在。最优选地，本发明的组合物不包含有机溶剂，特别是没有醇，非常特别是没有甲醇、乙醇、丙醇和/或异丙醇。

在本发明的情形中，固体破碎粒子包含固体粒子，特别是固体珠子、球体、圆球、圆锥体、圆柱体、立方体、三角形、矩形的形式和类似的适合几何形式，以及不规则形状例如所谓的球锥和卫星(形状类似于土星、行星或UFO)，用于在向本发明的组合物中的组织样品施加混合或碾磨力时执行所述组织材料的破碎。然而，所述固体破碎粒子应该考虑到不劣化或破坏释放出的细胞组分或被分析物进行选择。

为了实现组织材料的充分破碎和均质化并且不损害所需被分析物的释放以用于进一步分离、收获和分析，本发明的固体破碎粒子优选为固体惰性粒子，即由不与所述组织材料、组合物的任何试剂并且在任何情况下不与要在破碎后释放的所需被分析物反应的材料制成的粒子。特别优选地，分离的被分析物不被所述惰性固体破碎粒子吸附或不粘附于所述惰性固体破碎粒子。适合的惰性材料包括例如惰性金属、钢、不锈钢、金属氧化物、玻璃(二氧化硅)、塑料和陶瓷。惰性材料的实例包括ZrO₂、SiO₂、Al₂O₃、Fe₂O₃、TiO₂、硅酸锆、来自于钽、铂的金属和合金等。其他适合的惰性破碎材料已知来自于可商购的惰性破碎粒子。也可以使用一种或多种破碎粒子的混合物，即，使用不同形式和/或由不同惰性材料制成的破碎粒子。

进一步优选的是，所述破碎粒子表现出足够的硬度，使得在碾磨或研磨过程中不发生磨损。

优选的是珠子、球体或圆球(所谓的碾磨珠)，优选为不锈钢珠、陶瓷珠例如特别是锆珠。更优选的是不规则形状的碾磨粒子例如球锥或卫星，特别是由钢或不锈钢制成的。

为了获得足够的破碎力以有效地破碎并特别是均质化被处理的组织样品，所述破碎粒子应该优选地表现出与在现有技术中用于破碎微生物或细胞培养物的珠子相比相对大的尺寸，后者具有100μm至约600μm的尺寸。增加小尺寸珠子(100μm至约600或800μm的珠子)的量以提高破碎力不是适合的方法，因为大量的这种小粒子损坏或甚至破坏敏感的被分析物例如特别是DNA。

因此，优选的是，本发明的破碎粒子表现出至少1mm、优选地超过1mm的尺寸。更优选地，所述粒子表现出至少1.5mm、更优选地超过2mm(>2mm)、优选地超过2.5mm的尺寸。此外，所述破碎粒子可以优选地表现出至少3mm(≥3mm)、更优选地至少4mm、更优选地至少5mm的尺寸。

进一步优选的是，本发明的破碎粒子表现出至多15mm、优选地至多12mm、更优选地至多11.5mm的尺寸。

本发明的破碎粒子可以表现出1mm或超过1mm至15mm、1.5mm至15mm、超过2mm至15mm、2.5mm至15mm、3mm或超过3mm至15mm、4mm至15mm的尺寸。所述粒子还可以表现出1mm或超过1mm至12mm、1.5mm至12mm、超过2mm至12mm、2.5mm至12mm、3mm或超过3mm至12mm、4mm至12mm的尺寸。此外，所述破碎粒子可以表现出1mm或超过1mm至11.5mm、1.5mm至11.5mm、超过2mm至11.5mm、2.5mm至11.5mm、3mm或超过3mm至11.5mm、4mm至11.5mm的尺寸。所述粒子还可以表现出1mm或超过1mm至7mm、1.5mm至7mm、超过2mm至7mm、2.5mm至7mm、3mm或超过3mm至7mm、4mm至7mm的尺寸。最优选的是3mm或超过3mm至7mm或4mm至7mm的尺寸。

所述破碎粒子的定义的尺寸指示了相应粒子的两个相对点之间的最长距离。因此，在圆形或基本上圆形粒子(珠子、圆球、球体)的情况下，所定义的尺寸是指直径。在不规则形状的粒子例如卫星或球锥的情况下，两个相对点之间的最长距离通常是围绕这些粒子的圆球或球锥部分的“土星状环”的直径。

取决于破碎粒子的尺寸，可以使用一种或多种破碎粒子。在粒子非常大的情况下，所需的破碎结果和被分析物的保护可以使用仅仅一种粒子(特别是一种球或球锥)来实现。优选地使用一种破碎粒子。

适合的破碎粒子包括1.0至1.7mm珠子、2.8至3.0mm珠子、7/64”研磨球(约2.8mm)(特别是不锈钢研磨球)、5/32”研磨球(约6.0-7.0mm)、6mm粒子(特别是锆卫星)、3/8”研磨球(约9.5mm)和7/16”研磨球(约11.1mm)。优选的是5/32”珠子和基本上圆形的5mm粒子(例如珠子、圆球、球体)。也是优选的可商购的不规则形状的粒子，即，球锥或卫星形状的粒子的其他实例表现出下述尺寸：

其中，所述钢球锥的一半是半球体(球(A))，另一半是圆锥，并且两者被倾斜的中央法兰(环(B))分隔开。

也可以使用不同尺寸的破碎粒子的混合物。此外，可以混合本文中所定义的任何形式、材料和尺寸的破碎粒子。

本发明的用于酶裂解的酶选自水解酶(符合酶的EC编号分类中的EC3组)。具体来说，所述至少一种用于酶裂解的酶选自蛋白酶(EC3.4)，其通常也被称为肽酶、蛋白酶或蛋白水解酶。优选地，所述至少一种用于酶裂解的酶选自蛋白酶K、胶原酶、分散酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶，最优选的是蛋白酶K。

除了所述至少一种用于酶裂解的酶(蛋白水解酶)之外，可以添加所述用于酶裂解的酶之外的至少一种其他酶。优选地，这些其他酶选自符合酶分类EC 3.1的作用于酯键的水解酶。优选地，作为这种其他酶，可以添加核糖核酸酶，优选地添加核糖核酸酶A。

本发明的至少一种缓冲剂可以是适合于接收所述组织样品、至少一种用于酶裂解的酶(蛋白水解酶)和本发明的组合物中的一种或多种任选的其他试剂的任何缓冲剂。特别是，所述缓冲剂必须与所述用于酶裂解的酶相容，并且不可以完全抑制所述蛋白水解酶或组合物的任何其他试剂的活性。优选地，可以选择使分离的被分析物例如分离的核酸、DNA、RNA或其他细胞组分稳定的缓冲剂。适合的缓冲剂包括TRIS缓冲剂、PBS缓冲剂、Good’s缓冲剂、SSC、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸盐缓冲剂和生物缓冲剂，所述生物缓冲剂选自包含例如以下的名单：MES、Bis-Tris、ADA、ACES、PIPES、MOPSO、Bis-Tris丙烷、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、MOBS、TAPSO、Trizma、HEPPSOPOPSO、TEA、EPPS、Tricine、Gly-Gly、Bicine、HEPBS、TAPS、AMPD、TABS、AMPSO、CHES、CAPSO、AMP、CAPS、CABS。优选的是pH≥6(等于或高于6)的缓冲剂。如果将要从组织材料释放的所需被分析物是DNA，则pH≥7(等于或高于7)的缓冲剂是优选的。如果将要从组织材料释放的所需被分析物是RNA，则pH≥6(等于或高于6)的缓冲剂是优选的。特别优选的是选自上述生物缓冲剂名单的缓冲剂。更优选地，所述至少一种缓冲剂选自TRIS缓冲剂、PBS缓冲剂。

离液剂有效地支持或提高化学消化，可以有助于降低核酸酶活性并有助于使可以严重破坏新鲜均质化的样品的蛋白质变性。根据本发明，在原则上可以使用所有常用离液剂，例如碘化钠、盐酸胍(GuHCl)、硫氰酸胍(GTC)、异硫氰酸胍和脲。在本发明中，盐酸胍是优选的。当破碎的组织材料打算用于后续的核酸分离程序，特别是使用基于二氧化硅的树脂/凝胶来纯化分离的核酸被分析物的程序时，添加离液剂是特别适合的。此外，当所需的释放的被分析物是RNA时，离液剂是特别优选的。

通常，离液剂以相对高的摩尔浓度使用。例如，胍盐通常以6M的浓度使用，特别是对于RNA分离来说。碘化钠通常也以6M使用。脲通常以9.5M使用。本发明的发明人令人吃惊地发现，本发明的新的组合物、试剂盒和系统以及方法允许显著降低离液剂的浓度，因此优选地，所述至少一种离液剂的浓度(离液剂的总浓度)最高约1M，优选地等于或低于1M(≤1M)。具体来说，优选地使用(总)浓度为0.5M至1M的离液剂。使用不超过1M的浓度降低的离液剂是有利的，因为离液剂例如GuHCl和GTC是有毒的，因此，出于安全性原因并且为了保护这些组合物的使用者，离液剂浓度的降低是所希望的。此外，由于它们的蛋白质变性效果，高浓度的离液剂将降低蛋白酶K的有效性。因此，降低离液剂的浓度，特别是降低到不超过1M，降低了对组织样品的化学冲击，并允许提供更轻柔或温和的裂解组合物。

表面活性剂(通常也被称为去污剂)可以支持组织样品的裂解并支持均质化物的溶解。对于多脂肪组织例如肝或脑的破碎来说，添加至少一种表面活性剂是特别优选的。表面活性剂包括离子型表面活性剂例如阴离子型和阳离子型表面活性剂、两性表面活性剂和非离子型表面活性剂。

阴离子型表面活性剂类包括例如十二烷基硫酸钠(SDS)、脱氧胆酸钠、月桂基醚硫酸钠(SLES，月桂醇醚硫酸钠)和肉豆蔻醇醚硫酸钠，其中SDS是优选的。

阳离子型表面活性剂类包括例如鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB)、鲸蜡基三甲基氯化铵(CTAC)、鲸蜡基氯化吡啶(CPC)、苯扎氯铵(BAC)、苄索氯铵(BZT)、5-溴-5-硝基-1,3-二烷、二甲基双十八烷基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵、双十八烷基二甲基溴化铵(DODAB)。

非离子型表面活性剂类包括例如Triton X-100、吐温20(聚山梨醇酯20，聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单月桂酸酯)、Brij-35(聚亚烷基乙二醇醚)、NP-40(壬基苯氧基聚乙氧基乙醇)、Nonidet P-40(辛基苯氧基乙氧基乙醇)，其中Triton X-100和吐温20是优选的。

两性表面活性剂类包括例如磷脂、磷酯酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱和神经鞘磷脂。

优选地，所述至少一种表面活性剂选自如上所定义的非离子型表面活性剂。更优选地，所述至少一种表面活性剂选自SDS、吐温20和Triton X-100。甚至更优选地，所述至少一种表面活性剂选自吐温20和Triton X-100，非常特别优选地使用吐温20和Triton X-100两者的组合。

本发明的核酸酶抑制剂包括例如EDTA、PMSF、胃蛋白酶抑素A、亮抑酶酞、抑肽酶。优选地，所述至少一种核酸酶抑制剂是EDTA。

此外，可以添加至少一种消泡剂，它可以减少和防止在反应混合物中形成泡沫，并因此进一步提高可加工性。消泡剂可用于防止泡沫形成，或者可以添加消泡剂以打破已经形成的泡沫。原则上，可以使用所有常用消泡剂，例如不溶性油、聚二甲基硅氧烷和其他硅酮、某些醇、硬脂酸酯和二醇，只要它们对反应试剂、组织样品、分离的被分析物中的任一种都没有负面影响或者不扰乱任何后续的分离、收获和分析方法即可。优选的消泡剂是聚二甲基硅氧烷。

可以添加渗透压稳定剂以帮助锁住水并防止相关溶质的解离。渗透压稳定剂包括例如蔗糖或山梨糖醇。

由于渗透压稳定剂可能干扰细胞裂解，因此渗透压稳定剂的存在不太优选，并且甚至更优选地不添加渗透压稳定剂并因此进一步改进使用本发明的组合物的组织破碎和均质化。

根据本发明，还可以添加至少一种还原剂。当将要从破碎的组织分离的所需被分析物是RNA时，可以特别地添加还原剂，因为还原剂还原核糖核酸酶。还原剂包括例如谷胱甘肽、二硫苏糖醇和β-巯基乙醇。

非常特别地，如果所需被分析物是RNA，则本发明的组合物优选地包含还原剂，并且在这种情况下，所述组合物不包含核糖核酸酶。

然而，由于还原剂可能引起不想要的副反应并且在工作过程中令人不适(例如由于异味)，因此优选地不向本发明的组合物、试剂盒和系统或不在本发明的方法中添加还原剂。特别是当将要从破碎的组织分离的所需被分析物是DNA时，避免或优选地甚至排除还原剂的添加。

因此，本发明的优选实施方式涉及一种本发明的组合物，其由下述组分构成：

-一种或多种固体破碎粒子；

-至少一种用于酶裂解的酶；

-至少一种缓冲剂，优选地选自TRIS和PBS缓冲剂；

-至少一种离液剂，优选为盐酸胍；

以及任选地，选自下述的一种或多种试剂：

-至少一种表面活性剂，优选地选自非离子型表面活性剂，优选地选自吐温20和Triton X-100；

-至少一种核酸酶抑制剂，优选为EDTA；

-至少一种消泡剂，优选为聚二甲基硅氧烷；

-至少一种渗透压稳定剂，优选地选自蔗糖和山梨糖醇；以及

-选自核糖核酸酶的至少一种其他酶，优选为核糖核酸酶。

本发明的另一个优选实施方式涉及一种本发明的组合物，其由下述组分构成：

-一种或多种固体破碎粒子；

-至少一种用于酶裂解的酶；

-至少一种缓冲剂，优选地选自TRIS和PBS缓冲剂；

-至少一种离液剂，优选为盐酸胍；

-至少一种表面活性剂，优选地选自非离子型表面活性剂，优选地选自吐温20和Triton X-100；

-至少一种核酸酶抑制剂，优选为EDTA；以及

-选自核糖核酸酶的至少一种其他酶，优选为核糖核酸酶。

本发明的另一个优选实施方式涉及一种本发明的组合物，其由下述组分构成：

-一种或多种固体破碎粒子；

-至少一种用于酶裂解的酶；

-至少一种缓冲剂，优选地选自TRIS和PBS缓冲剂；

-至少一种离液剂，优选为盐酸胍；

-至少一种表面活性剂，优选地选自非离子型表面活性剂，优选地选自吐温20和Triton X-100；以及

-至少一种核酸酶抑制剂，优选为EDTA。

本发明的另一个优选实施方式涉及一种本发明的组合物，其由下述组分构成：

-一种或多种固体破碎粒子；

-至少一种用于酶裂解的酶；

-至少一种缓冲剂，优选地选自TRIS和PBS缓冲剂；

-至少一种离液剂，优选为盐酸胍；

-至少一种表面活性剂，优选地选自非离子型表面活性剂，优选地选自吐温20和Triton X-100；以及

-选自核糖核酸酶的至少一种其他酶，优选为核糖核酸酶。

本发明的另一个优选实施方式涉及一种本发明的组合物，其由下述组分构成：

-一种或多种固体破碎粒子；

-至少一种用于酶裂解的酶；

-至少一种缓冲剂，优选地选自TRIS和PBS缓冲剂；

-至少一种离液剂，优选为盐酸胍；以及

-至少一种表面活性剂，优选地选自非离子型表面活性剂，优选地选自吐温20和Triton X-10。

本发明还涉及一种用于破碎组织材料的试剂盒，所述试剂盒包含：

-一种或多种固体破碎粒子；

-至少一种用于酶裂解的酶；

-至少一种缓冲剂，优选地选自TRIS和PBS缓冲剂；

-至少一种离液剂，优选为盐酸胍；

以及任选地，选自下述的一种或多种试剂：

-至少一种表面活性剂，优选地选自非离子型表面活性剂，优选地选自吐温20和Triton X-100；

-至少一种核酸酶抑制剂，优选为EDTA；

-至少一种消泡剂，优选为聚二甲基硅氧烷；

-至少一种渗透压稳定剂，优选地选自蔗糖和山梨糖醇；

-至少一种还原剂，优选地选自谷胱甘肽、二硫苏糖醇和β-巯基乙醇；

-选自核糖核酸酶的至少一种其他酶，优选为核糖核酸酶；

以及

-任选地，用于接收所述组织材料的容器；以及

-至少一种有机溶剂，优选地选自醇，优选为乙醇和/或异丙醇；

-和具有用于处理所述组织材料的说明书的小册子。

特别优选地，如果所述被分析物是RNA，则所述试剂盒包含还原剂，并且在这种情况下，更优选地所述试剂盒不包含核糖核酸酶。

用于接收所述组织材料的容器可以是任何适合的容器或反应容器，其对于所述破碎处理中使用的试剂来说是惰性的，表现出足够的机械稳定性以抵抗破碎粒子的碾磨或研磨力而不被损坏或磨损，表现出适用于接收所述样品材料、裂解溶液和一种或多种所选破碎粒子的尺寸，并仍提供适合的空间以允许插入部件的搅拌和移动以执行组织破碎，并且可以适合地与用于通过所述破碎粒子来执行组织材料的碾磨或研磨的装置一起使用。适合的容器或反应容器(管)是已知并且通常可商购的。

向容易破碎和/或均质化的组织样品添加有机溶剂例如特别是至少一种醇，对于在后续的纯化、分离和收获步骤中提供释放出的被分析物在二氧化硅表面上的出色结合条件来说是有利的，正如在下文中更详细描述的。试剂盒中包含的适合的醇包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇等。优选地，添加乙醇和/或异丙醇。正如上文解释的，有机溶剂执行变性并因此可能抑制所述组合物中用于破碎组织样品的至少一种裂解酶。因此，将这些试剂盒中的有机溶剂与用于组织破碎的化合物分隔开，并在已进行组织破碎后添加。

本发明的试剂盒的其他实施方式包含下述组合：与如上所定义的用于组织破碎的任何组合物相对应的组分(试剂)；任选地，用于接收所述组织材料和至少一种有机溶剂(优选地选自醇，优选为乙醇和/或异丙醇)的容器；以及带有用于处理所述组织材料的说明书的小册子。

本发明的试剂盒还可以包含适合用于执行上面提到的后续结合、纯化、分离和收获步骤的组分。提供上面提到的本发明的用于执行组织破碎的试剂盒与包含离液剂和异丙醇的结合缓冲剂的组合，是特别优选的。然而，也可以使用并提供上面提到的本发明的用于执行组织破碎的试剂盒与已知的可商购的用于执行DNA或RNA结合的测试试剂盒的组合，以及上面提到的本发明的用于执行组织破碎的试剂盒与可商购的用于执行DNA或RNA纯化和分析的测试试剂盒的组合。因此，上面提到的试剂盒还可以包含与可用的测试试剂盒例如DNeasy或RNeasy试剂盒(可以从Qiagen获得)相对应的化合物或相应的测试试剂盒本身和/或用于吸附和纯化的材料，例如适合的基于二氧化硅的膜、柱子(例如可以从Qiagen获得的QIAamp柱)或二氧化硅磁珠。

本发明还涉及一种系统(组合、部件套装(kit-of-parts))，其包含如上所定义的组合物或试剂盒和用于通过所述破碎粒子来执行组织材料的机械碾磨或研磨的装置。

这些用于执行机械碾磨或研磨的装置可以是在研磨或珠磨技术中使用的任何常用装置，包括例如高功率混磨机、高性能混合器或磨机、高速混合器、常用珠磨机，以及低功率混合器例如常用的实验室涡旋振荡器、台式涡旋振荡器或常用的实验室摇床(例如水平摇床)。

正如上面提到的，从现有技术已经知道将碾磨珠和珠磨机用于破碎完整组织材料。然而，为了实现组织材料的高效均质化，通常必须使用特殊的大型碾磨设备例如珠磨机或高功率/高性能混合器。本发明现在令人吃惊地提供了高效、快速且完全地破碎或均质化组织材料的可能性，即使是使用低功率混合器例如属于几乎每个实验室的标准设备的常用桌面涡旋振荡器。因此，作为用于执行组织的碾磨或研磨的装置，低功率混合器、包括特别是涡旋振荡器或水平摇床，是优选的。特别优选的是涡旋振荡器。

高功率或高性能混合器或磨机通常以15至60Hz的频率工作。

低功率混合器例如特别是常用的涡旋振荡器，通常以150直至3200rpm的力工作。

从例如低功率混合器或涡旋振荡器施加降低的机械功率有利于保护释放的被分析物的质量和避免由大量机械冲击造成的被分析物的损坏或劣化。

本发明的另一个目的涉及一种系统(组合、部件套装)，其包含如上所定义的组合物、试剂盒或系统，并且还包含打算通过本发明的组合物、试剂盒或系统进行破碎的组织材料。关于这种系统的组织材料，可以参考上文对“组织材料”的定义。

本发明还涉及一种用于破碎或均质化组织材料的新方法，其中通过在包含至少一种用于酶裂解的酶的裂解溶液中对组织材料进行研磨、碾磨或击打，使所述组织材料同时经受下述处理：

-通过研磨、碾磨或击打进行的机械破碎，以及

-通过酶裂解进行的化学破碎。

本发明的方法的特征在于所述组织材料的研磨、碾磨或击打通过如上所定义的一种或多种固体破碎粒子来执行。关于优选的实施方式和选择，可以参考如上所定义的实施方式和选择。

优选地，本发明的方法的特征在于所述组织材料的破碎使用如上所定义的用于执行组织的碾磨或研磨的装置来进行或执行，所述装置例如优选为高功率混磨机、高速混合器或低功率混合器，包括涡旋振荡器，特别是使用如上所定义的低功率混合器或涡旋振荡器。

本发明的方法优选地通过使用如上所定义的任何组合物、试剂盒或系统(组合、部件套装)来进行。

特别优选地，当执行本发明的方法时，有机溶剂例如特别是醇，不以引起至少一种裂解酶变性并因此失活的浓度存在于所述用于组织材料破碎的组合物中。如上所定义的，例如乙醇、丙醇和/或异丙醇不应以使所述酶变性或失活的量存在。最优选地，当执行破碎组织材料的方法时，不存在有机溶剂，特别是不存在醇，非常特别地不存在乙醇、丙醇和/或异丙醇。

特别地，本发明的方法的特征在于包含下述步骤：

(i)向在适合的容器(例如上面在试剂盒的背景中所定义的)中的组织材料添加：

a)一种或多种固体破碎粒子，至少一种缓冲剂，至少一种用于酶裂解的酶，至少一种离液剂，任选地核糖核酸酶，以及任选地，选自表面活性剂、还原剂、核酸酶抑制剂、消泡剂或其混合物的一种或多种试剂，或

b)如上所定义的任何组合物；

(ii)任选地封闭所述容器；

(iii)使用高功率混磨机、高速混合器或包括涡旋振荡器的低功率混合器，优选地通过使用涡旋振荡器来破碎所述容器中的所述组织材料；

(iv)将步骤(iv)的混合物在优选地高于24℃、更优选地在25至70℃之间的升高的温度下温育；

(v)任选地重复步骤(iii)和(iv)；

(vi)任选地提供得到的混合物用于后续的纯化、分离、提取和/或分析处理步骤；或者可选地储存得到的混合物，优选地在例如通过添加适合于失活的试剂和/或通过冷却或冷冻得到的混合物以将裂解试剂、特别是裂解酶失活后。

步骤(iii)的优选的碾磨时间为约1分钟，优选为约30秒至约15分钟，优选为约30秒至约5分钟。当使用高功率或高性能混合器或磨机时，所述碾磨时间优选为约30秒。当使用低功率混合器例如特别是涡旋振荡器时，所述碾磨时间优选为约5分钟。

步骤(iv)的裂解时间优选地不超过4小时，更优选为3小时，甚至更优选为2小时，更优选为1小时，甚至更优选少于1小时，例如特别是少于30分钟。如果步骤(iv)被重复(步骤(v))，则总裂解时间应该不超过4小时，优选为3小时，更优选为2小时，更优选为1小时，甚至更优选少于1小时，例如特别是少于30分钟。优选地，步骤(iv)的裂解时间(或相应地总裂解时间)为至少5分钟，更优选地至少10分钟。优选地，使用本发明的方法，可以在15分钟内完全获得充分的组织破碎。

特别是，当所述方法被用于DNA提取时，所定义的裂解时间是优选的。

特别优选地，所述组织材料不与本发明的裂解溶液接触超过4、优选地3、更优选地2小时、更优选地超过1小时、甚至更优选地超过30分钟。非常特别地，应该避免过夜消化(至少8小时的消化)。特别是当所述方法用于DNA提取时。

使用本发明的组合物、试剂盒、系统(组合、部件套装)和方法，破碎和均质化时间可以被显著减少到1或2小时，甚至更优选地减少到30分钟或甚至更少，例如特别是不超过约15分钟。相反，常用技术需要至少150分钟(2.5小时)的最小平均消化时间，而过夜消化(至少8小时的消化)是常见的。

本发明特别适用于从如上所定义的组织材料提取核酸、DNA、RNA、miRNA(microRNA)、mRNA、tRNA、rRNA等。

特别优选的是，使用本发明从组织样品提取出DNA、RNA和miRNA，DNA的提取是非常特别优选的。

因此，本发明的方法可以在上述步骤(vi)之后包含一个或多个其他步骤，所述其他步骤包括：

-加工过的材料的收集；

-所述加工过的材料的稳定化；例如，通过例如冷冻所述混合物使裂解剂，特别是裂解酶失活；

-储存所述加工过的(和稳定化的)材料；

-所述被分析物的结合，例如通过添加其他离液剂和/或有机溶剂例如醇，特别是乙醇和/或异丙醇；

-所述被分析物的纯化，例如使用基于二氧化硅的膜、柱子或基于二氧化硅磁珠的技术；

-所述被分析物的分离，例如使用洗脱技术；

-所述被分析物的浓缩；

-所述被分析物的收集；

-纯化/分离的被分析物的稳定化；

-所述纯化/分离的被分析物的储存；

-分析，例如PCR分析。

具体来说，可以在已知且可商购的纯化、分离和分析测试中使用从上述步骤(vi)得到的加工过的组织材料作为起始原料，或者使用可商购的测试试剂盒用于进一步加工。

本发明还涉及本文中所定义的组合物、试剂盒和系统(组合、部件套装)的用途，其用于处理如上所定义的(固体)组织材料。其中处理优选地涉及如上所定义的破碎和/或均质化，但是也可以包括将所述组织样品释放或添加到本发明的组合物或混合物。

具体来说，本发明涉及下述实施方式：

1.一种用于破碎组织材料的组合物，所述组合物包含：

-一种或多种固体破碎粒子；

-至少一种用于酶裂解的酶；以及优选地

-至少一种缓冲剂；

并且所述组合物不包含使所述酶变性或失活的量的醇。

2.实施方式1的组合物，其还包含选自下述的一种或多种试剂：

-至少一种离液剂，优选为盐酸胍；

-至少一种表面活性剂，优选地选自非离子型表面活性剂；

-至少一种核酸酶抑制剂；

-至少一种消泡剂；

-至少一种渗透压稳定剂；

-至少一种还原剂；

及其混合物。

3.实施方式1或2的组合物，其还包含所述用于酶裂解的酶之外的至少一种其他酶，优选为核糖核酸酶。

4.前述实施方式任一项的组合物，其中所述至少一种用于酶裂解的酶选自蛋白酶，优选为蛋白酶K。

5.前述实施方式任一项的组合物，其中所述组织材料选自人类和动物来源的固体组织。

6.前述实施方式任一项的组合物，其包含总浓度等于或小于1M的至少一种离液剂。

7.前述实施方式任一项的组合物，其中所述固体破碎粒子表现出至少1mm的尺寸。

8.一种用于破碎组织材料的试剂盒，所述试剂盒包含：

-一种或多种固体破碎粒子；

-至少一种用于酶裂解的酶；

-至少一种缓冲剂；

以及任选地，选自下述的一种或多种试剂：

-至少一种离液剂；

-至少一种表面活性剂；

-至少一种核酸酶抑制剂；

-至少一种消泡剂；

-至少一种渗透压稳定剂；

-至少一种还原剂；

-所述用于酶裂解的酶之外的至少一种其他酶，优选为核糖核酸酶；

-至少一种有机溶剂，优选为醇；以及

-任选地，用于接收所述组织材料的容器；

-以及带有用于处理所述组织材料的说明书的小册子。

9.一种系统，其包含实施方式1至7任一项中所定义的组合物、实施方式8中所定义的试剂盒以及用于执行所述组织材料的碾磨的装置，所述装置优选为高功率混磨机、高速混合器或低功率混合器，包括涡旋振荡器。

10.一种系统，其包含实施方式1至7任一项中所定义的组合物或实施方式8中所定义的试剂盒或实施方式9中所定义的系统，还包含用于破碎的组织材料。

11.一种用于破碎组织材料的方法，其中通过将所述组织材料在裂解溶液中研磨、碾磨或击打，使所述组织材料同时经受下述处理：

-通过研磨、碾磨或击打进行的机械破碎，以及

-通过酶裂解进行的化学破碎，

所述裂解溶液包含一种或多种固体破碎粒子和至少一种用于酶裂解的酶，并且所述裂解溶液不包含使所述酶变性或失活的量的醇。

12.实施方式11的方法，其中所述裂解溶液还包含总浓度等于或小于1M的至少一种离液剂。

13.实施方式11或12的方法，其中破碎通过使用包括涡旋振荡器的低功率混合器，优选地通过使用涡旋振荡器来进行。

14.实施方式11至13任一项的方法，其通过使用实施方式1至7任一项中所定义的组合物、实施方式8中所定义的试剂盒或实施方式9和10中所定义的系统来进行。

15.实施方式11至14任一项的方法，所述方法包括下述步骤：

(i)向在适合的容器中的组织材料添加

a)一种或多种固体破碎粒子，至少一种缓冲剂，至少一种用于酶裂解的酶，任选地核糖核酸酶，以及任选地，选自离液剂、表面活性剂、渗透压稳定剂、还原剂、核酸酶抑制剂、消泡剂或其混合物的一种或多种试剂，或

b)实施方式1至7任一项中所定义的组合物；

(ii)任选地封闭所述容器；

(iii)使用高功率混磨机、高速混合器或包括涡旋振荡器的低功率混合器，优选地通过使用涡旋振荡器来破碎所述容器中的所述组织材料；

(iv)将步骤(iv)的混合物在升高的温度下温育；

(v)任选地重复步骤(iii)和(iv)；

(vi)任选地提供得到的混合物用于后续的纯化、分离、提取和/或分析处理步骤。

在不限制本发明的范围的情形下，下述实施例将说明本发明：

实施例：

从大鼠组织样品提取DNA

组织材料：

大鼠，用RNALater(可以从Qiagen获得)稳定化

肝25mg，肌肉25mg，肺10mg，肾20mg，心10mg

设备：

用于接收组织样品的容器

管：2ml螺旋盖管(PP，Sarstedt–底部具缘)

破碎粒子

珠子：5/32″球锥(ABBOTTBall)，

圆形5mm不锈钢珠，

具有小面的锆珠

用于执行碾磨/研磨的装置

A)涡旋振荡器Genie 2(Scientific Industries SI-V524)，具有各种不同的接头：泡沫插件，水平和竖直微量管架(VortexD)

B)组织裂解仪II(可以从Qiagen获得)

C)组织裂解仪LT(可以从Qiagen获得)

裂解：

20μl蛋白酶K

4μl核糖核酸酶A

200μl AVE缓冲剂和

40μl VXL缓冲剂(可以从Qiagen获得)

结合和洗涤：

265μl MVL缓冲剂,

500μl AW1缓冲剂,

500μl AW2缓冲剂,

50-100μl ATE缓冲剂(可以从Qiagen获得)

化学试剂的注意事项：

●蛋白酶K在这种离液盐浓度下活性非常高，但是可能可以使用从1M直至0.5M胍的任何浓度。

●吐温20和TritonX-100作为表面活性剂(去污剂)存在，尽管其他表面活性剂也会是有效的。表面活性剂不是对所有组织都是必需的，但对于任何组织的处理来说都是无害的，并且当使用特别是多脂肪组织例如肝和脑时改进结果。

●化学方法不限于基于柱子的程序，基于二氧化硅磁珠的程序同等有效。

流程：

1.切下组织样品或将其从储存处取出；

2.将所述组织样品称重并切成尺寸适合的薄片(5-25mg)，然后将所述碎片放置在2ml螺旋盖管(Sarstedt 72.608+蓝盖65.716.001)中，添加上面提到的一种或多种破碎粒子，例如一个5/32″球锥(ABBOTTBall)或几个圆形5mm珠或具有小面的锆珠；

3.添加上面列出的裂解试剂和酶，并关闭盖子。

200μl AVE/40μl VXL/1μl DX试剂/20μl蛋白酶K/4μl核糖核酸酶A(100mg/ml)

并关闭盖子。

为了处理多个样品，可以制备主消化缓冲剂混合物。

4.继续进行均质化：

A)带有适合的2ml管接头的涡旋振荡器Genie2：全速(3200rpm)下5分钟

B)带有2x 24个2ml微量离心管接头的组织裂解仪II：24Hz下30秒

C)组织裂解仪LT：30-45Hz下1-2分钟

5.在Thermo摇床中，在56℃和1200rpm下温育10分钟

注意：在破碎后进行温育，不论是否有可见的残留组织。

如果在温育后仍存在剩余的残留组织，则第二次进行组织的均质化：

A)带有竖直微量管架的涡旋振荡器Genie2：全速(3200rpm)下3分钟

B)组织裂解仪II：20Hz下15秒

C)组织裂解仪LT：30-40Hz下45秒

然后，将所述样品在Thermo摇床中，在56℃和1200rpm下再次温育10分钟。

6.打开管并添加265μl MVL缓冲剂(可以从Qiagen获得)，通过吸打或涡旋振荡进行混合

7.将来自于步骤6的混合物施加到QIAamp Mini Spin柱(可以从Qiagen获得)，关闭盖子，然后以全速(不超过20000x g)离心1分钟，将Spin柱放置在新的2ml收集管中，并舍弃含有滤液的收集管

8.打开Spin柱并添加500μl AW1缓冲剂(可以从Qiagen获得)，关闭盖子，然后以全速(不超过20000x g)离心30秒，将Spin柱放置在新的2ml收集管中，并舍弃含有滤液的收集管

9.打开Spin柱并添加500μl AW2缓冲剂(可以从Qiagen获得)，关闭盖子，然后以全速(不超过20000x g)离心30秒，将Spin柱放置在新的2ml收集管中，并舍弃含有滤液的收集管

10.以全速离心2分钟(以消除可能的AW2遗留的机会)，将Spin柱放置在干净的1.5ml微量离心管中

11.打开Spin柱并添加100μl ATE缓冲剂(可以从Qiagen获得)，在室温下温育1分钟，然后以全速(不超过20000x g)离心1分钟

12.重复步骤11。

A.与经典的蛋白酶K消化相比在多种样品类型上的得率的测定

得率的测定

UV-VIS-分光光度计(Nanodrop)/DNA特异性荧光测定法(Qubit 2.0)；

0,6％TAE凝胶：

18h 20伏特，

模板：相同体积的洗脱物

QFPathogenmitICDNA测定法使用12000个拷贝的ICDNA/反应和1μl/6μl洗脱物添加。

与标准的蛋白酶K消化相比，来自于组织类型的核酸的得率提升高达20倍。与单独的蛋白酶K消化相比，总体消化时间也减少5倍(在两种情况下，消化进行到样品看起来均匀)。

平均蛋白酶K消化时间(不使用机械碾磨)为150分钟，而新方法通常在不到30分钟内实现均质化。

实验还显示，在常用的实验室涡旋振荡器(低功率装置)上和在昂贵的高功率珠磨机中可以实现等同的得率。

此外，已显示通过使用涡旋振荡器，DNA质量(DNA尺寸)也得以改进。

B.与经典的蛋白酶K消化相比的实验时间尝试

使用如上所给出的试验条件，从时间尝试的角度，评估了本发明的方法与经典的蛋白酶K消化相比的有效性。

试验结果

表6的附加信息：IC DNA：ct值＝27,37；ct值＝27,85(MV,n＝4)

与单独使用酶消化过夜(o/n)(超过8小时)所实现的相比，所述新方法可以在10分钟破碎+10分钟蛋白酶K消化中实现更高的得率。

实验还显示了使用非常困难的组织材料例如小鼠尾时，所述新方法的有效性。

C.使用不同破碎粒子的性能的评估

使用如上所给出的试验条件，从不同破碎粒子的角度，评估了本发明的方法的有效性。

试验结果

新的化学方法不限于特定形式的破碎粒子。

已显示，使用本发明的组合物，当使用圆形5mm珠或5/32″球锥时，DNA质量同等高。

与5/32″球锥破碎相比，当使用圆形5mm珠时，破碎倾向于减少，并且剩有更多或更大的组织残留物。

裂解时间是基本上相同的，然而取决于所使用的组织材料，使用涡旋振荡器的破碎获得略微更低的得率。

D.不同组织类型的评估

使用如上所给出的试验条件，从不同组织材料的角度，评估了本发明的方法的有效性。

试验结果

使用不同种类的组织材料例如软组织材料并且甚至使用坚韧的组织材料例如小鼠尾，可以实现本文中所描述的改进。

E.协同效应的评估

使用如上所给出的试验条件，评估了机械和化学(酶)裂解的组合与单个处理相比的有效性。

试验结果：

得率以毫克为单位，正如通过DNA特异性荧光测定法(Qubit 2.0)所测量的。

可以看到协同效应(与两种单独方法的总和相比提高x倍)：

肝10mg 肌肉10mg

3,87 2,12

F.与可商购测试试剂盒相比的改进的评估

评估了与几种可商购的测试试剂盒相比本发明的组合物的有效性。

试验结果：

Claims (17)

1.一种用于破碎固体组织材料的组合物，所述组合物包含：

-一种或多种固体破碎粒子；

-至少一种用于酶裂解的酶；

-总浓度等于或小于1M的至少一种离液剂；以及优选地

-至少一种缓冲剂；

并且所述组合物不包含使所述酶变性或失活的量的醇。

2.权利要求1的组合物，其还包含选自下述的一种或多种试剂：

-至少一种表面活性剂，优选地选自非离子型表面活性剂；

-至少一种核酸酶抑制剂；

-至少一种消泡剂；

-至少一种渗透压稳定剂；

-至少一种还原剂；

及其混合物。

3.前述权利要求任一项的组合物，其还包含所述用于酶裂解的酶之外的至少一种其他酶，优选为核糖核酸酶。

4.前述权利要求任一项的组合物，其中所述至少一种用于酶裂解的酶选自蛋白酶，优选为蛋白酶K。

5.前述权利要求任一项的组合物，其中所述组织材料选自人类和动物来源的固体组织。

6.前述权利要求任一项的组合物，其中所述至少一种离液剂是盐酸胍。

7.前述权利要求任一项的组合物，其中所述固体破碎粒子表现出至少1mm的尺寸。

8.权利要求7的组合物，其中所述固体破碎粒子表现出>2mm的尺寸。

9.权利要求7或8的组合物，其中所述固体破碎粒子表现出≥3mm的尺寸。

10.一种用于破碎组织材料的试剂盒，所述试剂盒包含：

-一种或多种固体破碎粒子；

-至少一种用于酶裂解的酶；

-至少一种缓冲剂；

-总浓度等于或小于1M的至少一种离液剂；

以及任选地，选自下述的一种或多种试剂：

-至少一种表面活性剂；

-至少一种核酸酶抑制剂；

-至少一种消泡剂；

-至少一种渗透压稳定剂；

-至少一种还原剂；

-所述用于酶裂解的酶之外的至少一种其他酶，优选为核糖核酸酶；

-至少一种有机溶剂，优选为醇；以及

-任选地，用于接收所述组织材料的容器；

-以及带有用于处理所述组织材料的说明书的小册子。

11.一种系统，其包含权利要求1至9任一项中所定义的组合物或权利要求10中所定义的试剂盒以及用于执行所述组织材料的碾磨的装置，所述装置优选为高功率混磨机、高速混合器或低功率混合器，包括涡旋振荡器。

12.一种系统，其包含权利要求1至9任一项中所定义的组合物、权利要求10中所定义的试剂盒或权利要求11中所定义的系统，还包含用于破碎的组织材料。

13.一种用于破碎组织材料的方法，其中通过将所述组织材料在裂解溶液中研磨、碾磨或击打，使所述组织材料同时经受下述处理：

-通过研磨、碾磨或击打进行的机械破碎，以及

-通过酶裂解进行的化学破碎，

所述裂解溶液包含一种或多种固体破碎粒子、至少一种用于酶裂解的酶和总浓度等于或小于1M的至少一种离液剂，并且所述裂解溶液不包含使所述酶变性或失活的量的醇。

14.权利要求13的方法，其中所述至少一种离液剂是盐酸胍。

15.权利要求13或14的方法，其中破碎通过使用包括涡旋振荡器的低功率混合器，优选地通过使用涡旋振荡器来进行。

16.权利要求13至15任一项的方法，其通过使用权利要求1至9任一项中所定义的组合物、权利要求10中所定义的试剂盒或权利要求11和12中所定义的系统来进行。

17.权利要求13至16任一项的方法，所述方法包括下述步骤：

(i)向在适合的容器中的组织材料添加

a)一种或多种固体破碎粒子，至少一种缓冲剂，至少一种用于酶裂解的酶，至少一种离液剂，任选地核糖核酸酶，以及任选地，选自表面活性剂、渗透压稳定剂、还原剂、核酸酶抑制剂、消泡剂或其混合物的一种或多种试剂，或

b)权利要求1至9任一项中所定义的组合物；

(ii)任选地封闭所述容器；

(iii)使用高功率混磨机、高速混合器或包括涡旋振荡器的低功率混合器，优选地通过使用涡旋振荡器来破碎所述容器中的所述组织材料；

(iv)将步骤(iv)的混合物在升高的温度下温育；

(v)任选地重复步骤(iii)和(iv)；

(vi)任选地提供得到的混合物用于后续的纯化、分离、提取和/或分析处理步骤。